Etude de la résistance au plomb des bactéries isolées à partir des eaux usées du complexe sidérurgique de Jijel Bellara.

(1)

ةيروهمجلا ةيطارقميدلا ةيرئازجلا

ةيبعشلا

يملعلا ثحبلاو يلاعلا ميلعتلا ةرازو

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique -

لجيج ىيحي نب قيدصلا محمد ةعماج

Université de Mohammed Seddik Ben Yahya- Jijel

Mémoire de fin d’études

En vue de l’obtention du diplôme : Master Académique en Biologie Option : Microbiologie appliquée

Thème :

Membres de Jury

Présidente : Dr. Ouled Haddar H.

Examinateur : Mr. Laib E.

Encadrant : M

^me

Benhamada W.

Année Universitaire 2017 – 2018

Numéro d’ordre :

ةعيبطلا مولع ةيلك ةايحلاو

مسق : لا م ي ايجولويبورك لا

ةيقيبطت و

ةيذغتلا مولع

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département: Microbiologie

Appliquée et Sciences Alimentaires

Etude de la résistance au plomb des bactéries isolées à partir des eaux usées du complexe sidérurgique de Jijel Bellara.

Présenté par :

Medjoudj Oum Keltoum Messiad Khadidja

(2)

Remerciements

I

Remerciements

Avant tout, nous remercions ״ Allah ״ Le tout puissant de nous avoir donné la santé, la force, le courage, la patience, la persistance et nous a permis d’exploiter les moyens disponibles à fin d’accomplir ce modeste travail ,merci de nous avoir éclairé le chemin de la réussite.

Nous tenons d’abord à remercier très chaleureusement notre promotrice M

^me

Benhamada W. qui nous a permis de bénéficier de son encadrement, ses conseils qu’elle nous a prodigués, sa patience, sa confiance qu’elle nous a témoignés et qui ont été déterminantes dans la réalisation de notre travail.

Nous voudrons également remercier les membres de Jury qui ont bien voulu juger ce travail : Dr. Ouled Haddar H. qui nous a fait l’honneur de présider ce jury, Mr. Laib E. qui accepté d’examiner ce travail.

Nos remerciements vont plus particulièrement à nos familles qui ont su

nous soutenir tout au long de nos études, Merci à touts les personnes du

laboratoire de microbiologie, ainsi que toutes personnes de près ou de loin, qui

ont contribué à la réalisation de ce travail.

(3)

II

Dédicaces

Je m’incline devant Dieu Tout - Puissant qui m’a ouvert la porte du savoir et m’a aidé à la franchir.

Je dédie ce travail A mes parent, la femme la plus patiente, ma très chère mère, source d’affectation de courage et d’inspiration qui a autant sacrifié

pour me voir atteindre ce jour.

Mon idéal, l’être le plus généreux, mon chère père, source de respect, en témoignage de ma profonde reconnaissance pour tout l’effort et le soutien.

Merci beaucoup Papa et Maman je vous aime beaucoup.

A mes frères: Boubeker, Omar, Khaled , Ayoub, et mes sœurs : Nawal, Aya.

A toute la famille Medjoudj.

Une spéciale dédicace à mes amies surtout à ma très belle binôme Khadidja et mes collègues

A tous ceux que je porte dans mon cœur.

Medjoudj Oum Keltoum

(4)

Dédicaces

III

Dédicaces

Je m’incline devant Dieu Tout - Puissant qui m’a ouvert la porte du savoir et m’a aidé à la franchir.

Je dédie ce travail A mes parent, la femme la plus patiente, ma très chère mère, source d’affectation de courage et d’inspiration qui a autant sacrifié

pour me voir atteindre ce jour.

Mon idéal, l’être le plus généreux, mon chère père, source de respect, en témoignage de ma profonde reconnaissance pour tout l’effort et le soutien.

Merci beaucoup Papa et Maman je vous aime beaucoup.

A mes sœurs Salima, Fatiha, Sabah et à mon frère Hamza et mes oncles et mes tantes et toute la famille Messiad et Soukkou.

A mes amis et mes collègues surtout ma belle binôme Oum Keltoum.

A tous ceux que je porte dans mon cœur.

Khadidja Messiad

(5)

Liste des abréviations

IV

Liste des abréviations

k Da kilo Dalton

ADN Acide désoxyribonucléique ATP Adénosine-triphosphate CDF Cation Diffusion Facilitator CMI Concentration minimal inhibitrice mM millimol

Na Cl Chlorure de sodium DO Densité optique E. coli Escherichia coli

EPS Exopolysaccharides

FTAM Flore Totale Aérobie Mésophile SFB Selenite F Broth

GN Gélose nutritive H2S Hydrogène sulfureux

MM Masse Molaire PCA Plate Count Agar pH Potentiel hydrogène Ppm Partie par million

RND Resistance nodulation- cell-Division UFC Unité formante colonie

(6)

Liste des figures

V

Liste des figures

Figure 01 Mécanismes bactériens de résistance aux métaux toxiques ……….. 11 Figure 02 Représentation de sites de l’accumulation des métaux lourds chez les

bactéries………... 12 Figure 03 Représentation schématique des cinq familles de pompes à efflux

bactériennes……… 15

Figure 04 Complexe sidérurgique de la Wilaya de Jijel Bellara……… 17 Figure 05 Site de prélèvement………... 19 Figure 06 Croissance de la FTAM sur milieu liquide en présence de plusieurs

concentrations de nitrates de plomb………... 32 Figure 07 Croissance de streptocoque sur milieu liquide en présence de plusieurs

concertations de nitrates de plomb………. 32 Figure 08 Croissance de la souche 1 des entérobactéries sur milieu liquide en

présence de plusieurs concentrations de nitrates de plomb……… 32 Figure 09 Croissance de la souche 2 des entérobactéries sur milieu liquide en

présence de plusieurs concentrations de nitrates de plomb ……….. 32 Figure 10 Croissance de la souche d’Escherichia coli sur milieu liquide en

présence de plusieurs concentrations de nitrates de plomb ……….. 32

(7)

Liste des photos

VI

Liste des photos

Photo 01 Résultat de recherche de la flore aérobie mésophile sur milieu PCA….... 27 Photo 02 Résultat positif de recherche du coliforme sur milieu BLBVL…………. 28 Photo 03 Test positif d’indole………... 29 Photo 04 Observations microscopiques d’E. coli avec en grossissement (G :

10x100)……….. 29

Photo 05 Résultat positif de recherche des streptocoques sur milieu EVA Litsky. 29 Photo 06 Repiquage de colonies de streptocoque sur le milieu Columbia ………. 30 Photo 07 Observations microscopiques de streptocoque avec en grossissement (G

: 10x100) ………... 30

Photo 08 Entérobactéries sur le milieu Héktone……….. 31 Photo 09 Observations microscopiques d’entérobactéries avec en grossissement

(G : 10x100) ……….. 31

(8)

Liste des tableaux

VII

Liste des tableaux

Tableau I Concentration en microorganismes des eaux usées…………... 6

Tableau II Exemples des métaux lourds accumulés par les bactéries…... 14

Tableau III Résultats de dénombrement de la FTAM………. 27

Tableau IV Résultats de dénombrement des coliformes totaux…………... 28

Tableau V Résultats de dénombrement de streptocoque………... 30

(9)

i

Table des Matières

Remerciements………..……… I Dédicaces……...……..……… . ... . II Liste des abréviations………...……….. IV Liste des figures………... V Liste des photos………VI Liste des tableaux ………...………...…….VII

Introduction……….………1

Première partie: Partie bibliographique Chapitre I : Généralités sur les eaux usées Chapitre II: Généralités sur le plomb

II.1.Définition………..……... 8

II.2. Propriétés physico –chimiques du plomb ……… 8

II.3. Effets toxiques du plomb ………. 8

II.3.1. Effets toxiques sur l'environnement ………. 8

II.3.2. Effets toxiques sur la santé humaine ………... 9

Chapitre III : Procédés de dépollution métallique

I.1. Définition des eaux usées………. 3

I.2. Origines des eaux usées………... 3

I.2.1. Eaux usées domestiques……….. 3

I.2.1.1. Eaux ménagères ………..……... 3

I.2.1.2. Eaux vannes………..……… 3

I.2.3. Eaux usées industrielles ………..………... 4

I.2.4. Eaux de pluie (pluviale)………... 4

I.2.5. Eaux usées agricoles ……….……... 4

I.3. Principaux polluants de l’eau………... 5

I.3.1. Polluants physiques ……….……….. 5

I.3.1.1. Polluants thermiques ………... 5

I.3.1.2. Polluants radioactifs ………... 5

I.3.2. Polluants microbiens…….………... 5

I.3.3. Polluants chimiques……….………... 6

I.3.3.1. Polluants chimiques organiques ………... 7

I.3.3.2. Polluants inorganiques……….... 7

III.1. Méthodes physico-chimiques……… 10

III.2. Biodépollution ………... 10

III.2.1. Phytoremédiation………... 10

III.2.2. Zooremédiation ………. 10

(10)

ii

Deuxième partie : Partie expérimentale Chapitre IV : Matériel et Méthodes

IV.1. Présentation de la zone d’étude………... 17

IV.2. Matériel et appareillage utilisé……….………... 18

IV.2.1. Matériel ………...…………... 18

IV.2.2. Appareillage ………..………... 18

IV.2.3. Milieux de culture………..………...……… 18

IV.2.4. Produits chimiques et réactifs ……… 18

IV.3. Méthodes……….. 19

IV.3.1. Prélèvement de l’eau à analyser………....……… 19

IV.3.2. Transport des échantillon………... 19

IV.3.3. Isolement des bactéries des eaux usées………. 19

IV.3.3.1. Préparation des dilutions………. 19

IV.3.3.2. Dénombrement de la flore aérobie mésophiles totale (FTAM)……. 20

IV.3 3.3. Recherche et dénombrement des coliformes en milieu liquide…….. 20

IV.3.3.4. Recherche et dénombrement des streptocoques………...… 21

IV.3.3.5. Recherche de spores d’Anaérobies Sulfito-Réducteurs de Clostridium……… 22

IV.3.3.6. Recherche de Staphylococus aureus ………..…………....………… 23

IV.3.3.7. Recherche de Pseudomonas……….. 23

IV.3.3.8. Recherche des entérobactéries ……….... 24

IV.3.4. Purification des souches………. 24

IV.3.4.1. Purification d’Escherichia coli ………... 24

IV.3.4.2. Purification des streptocoques ………. 24

IV.3.4.3. Purification des entérobactéries………... 24

IV.3.5. Conservation des souches ……….……....………. 24

IV.3.6. Identification des isolats……….……… 25

IV.3.6.1. Examen macroscopique……… 25

IV.3.6.2. Examen microscopique………. 25

IV.3.7. Étude de la résistance des bactéries au plomb………... 25

IV.3.7.1. Préparation des dilutions de nitrates du plomb (Pb(NO₃)₂)…………. 25

IV.3.7.2. Traitement des bactéries par différentes concentrations (Pb(NO₃)₂)... 25

Chapitre V: Résultats et discussions

III.2.3. Bioremédiation…....………... 11

III.2.3.1. Resistance des bactéries au plomb. .……… 11

III.2.3.2. Mécanismes de résistance………. 12

V.I. Résultats de l’isolement des souches bactériennes……….. 27

V.1.1. Résultats de la recherche de la flore aérobie mésophiles totale (FTAM)…… 27

V.1.1.1. Dénombrement de la FTAM………... 27

V.1.1.2. Aspects culturaux ………….……….. 27

V.1.2. Résultats de la recherche des coliformes totaux …... 28

V.1.2.1. Examen macroscopique ………. 28

V.1.2.2. Dénombrement des coliformes ………... 28

(11)

iii

V.1.3. Résultats de la recherche des Coliformes thermotolérants ou fécaux………. 29

V.1.3.1. Examen macroscopique………...….…... 29

V.1.3.2. Aspect microscopique………...………. 29

V.1.4. Résultats de la recherche des streptocoques………... 29

V.1.4.1. Examen macroscopique………. 29

V.1.4.2. Résultats du dénombrement des streptocoques fécaux…………... 30

V.1.5. Résultats de la recherche des Clostridies Sulfiro-réducteus, Staphylococcus aureus et de Pseudomonas……….. 31

V.1.6. Résultats de la recherche des entérobactéries………..……. 31

V.1.6.1. Examen macroscopique………. 31

V.1.6.2. Aspect microscopique……… 31

V.2. Résultats de l’effet du plomb sur les souches bactériennes isolées………... 32

V.2.1. Résultats de l’effet du plomb sur les souches bactériennes isolées sur milieu liquide………..……….. 32

V.2.2. Résultats de l’effet du plomb sur les souches bactériennes isolées sur milieu solide……….…………... 34

Conclusion………. 35

Références bibliographiques………. 36

Annexe ………. VIII

Résumé……….. XIX

(12)

Introduction

1

Avec la croissance de l'industrie, il y a une augmentation considérable du rejet de déchets industriels qui ont des effets secondaires néfastes comme la contamination des eaux, la dégradation de l’environnement, la modification des écosystèmes et donc la résistance des espèces en son sein. En terme de population, on observe des disparitions, des diminutions voire même des apparitions de certaines espèces (Doillon, 2010 ; Dixit et al., 2015).

Au cours des dernières années, la pollution par les métaux lourds est devenue l'un des problèmes environnementaux les plus graves. Les métaux sont des constituants naturels de la terre et certains d'entre eux à savoir Zn, Ni, Cu sont essentiels pour les organismes vivants, mais se révèlent toxiques aux microorganismes et macroorganismes à des concentrations plus élevées. Le plomb, le cadmium et le mercure sont non biodégradables et donc persistent dans l’environnement pendant de longues périodes et sont toxiques même à faible concentrations et les microorganismes sont les premiers organismes influencés par cette toxicité (Mills and Colwell, 1977 ; Giller et al., 1998 ; Popescu et Pasare, 2006 ; Huynh, 2009 ; Elkhawaga, 2011 ; Naik et Dubey, 2013).

De nombreux auteurs ont signalé que la présence de métaux lourds tel que le plomb diminuait la biomasse microbienne soit directement soit en inhibant certaines propriétés biochimiques du sol indispensables à sa survie. Cependant l’action des métaux est souvent spécifique, certaines bactéries résistantes peuvent survivre à un stress environnemental extrême, alors que d’autres plus sensibles disparaissent en présence de ces nouvelles contraintes (Doillon, 2010).

En raison de la complexité inhérente aux méthodes physicochimiques utilisées pour l’élimination de ces métaux lourds, l'utilisation des microorganismes pour la bioremediation;

plusieurs bactéries ne peuvent pas décomposer les métaux toxiques en métabolites inoffensifs, et ceux-ci ont des effets inhibiteurs sur l'activité microbienne (Kapoor et Viraraghvan, 1995). La modification des protéines de la membrane externe des bactéries ayant des propriétés potentielles de bioremediation pour améliorer les capacités de liaison des métaux est le moyen le plus probable d'améliorer leur capacité de biotransformation des métaux toxiques (Ahluwalia et Goyal, 2007).

L’objectif visé dans ce présent travail est d’isoler et identifier des bactéries à partir des eaux usées du complexe sidérurgique de Bellara et ensuite d’évaluer leur résistance au plomb.

Notre mémoire comprend en plus de d’introduction et la conclusion générale, deux parties : la première partie comprenant 03 chapitres, est une synthèse bibliographique qui rassemble des données générales sur les eaux usées, leurs origines et les principaux polluants de ses eaux.

(13)

Introduction

2

Aussi des informations sur le plomb comme un polluant des eaux, l’impact du plomb sur la l’environnement, la santé humaine et des mécanismes de résistance bactérienne au plomb. La deuxième partie comprend 02 chapitres, donne une description des protocoles expérimentaux utilisés d’une part pour l’isolement des bactéries des eaux usées du complexe sidérurgique de Bellara et l’étude de la résistance de ces bactéries vis-à-vis de différentes concentrations de plomb.

.

(14)

Chapitre I : Généralités sur les eaux usées

3 I.1. Définition des eaux usées

Les eaux usées appelées aussi les eaux résiduaires sont des déchets liquides provenant essentiellement d’activité humaine qu’elle soit domestique, industrielle ou même agricole, constituant donc un effluent pollué qui est rejeté dans les égout (Morlot, 1996; Barnich et al., 2003 ; Baumonts, 2004).

L’aspect des eaux résiduaires fraîches est celui d’un liquide brun gris avec une odeur typique, mais faible. Durant leur transport, ces eaux se modifient d’autant plus vite que la température est élevée ; elles deviennent noires et dégagent une odeur d’œufs pourris, signe de la présence d’hydrogène sulfureux (H₂S), dangereux pour les égoutiers et corrosifs pour le béton et les aciers des égouts. Environ un tiers des matières contenues est en suspension, le reste est en solution (Hamsatou, 2005).

I.2. Origines des eaux usées I.2.1. Eaux usées domestiques

Ce sont les eaux usées qui proviennent des établissements et services résidentiels, produites essentiellement par le métabolisme humain et les activités ménagères (eaux ménagères et eaux de vannes) (Barnich et al., 2003), à leurs tour, les eaux usées domestique sont de deux types :

I.2.1.1. Eaux ménagères : dites grises, qui ont pour origine les salles de bains et les eaux de lessive et les cuisines, des matières dissoutes organiques ou minérales, des graisses et des solvants et divers détergents (l’eau) elles contiennent des matières en suspension…

etc ( Morlot, 1996; Lagartette, 2009; El hachemi, 2012).

I.2.1.2. Eaux vannes : dites noires; les eaux vannes représentent environ le tiers des eaux usées domestiques. Issues des toilettes, elles sont constituées par les matières fécales et matières organiques azotées et les urines et contiennent notamment des matières minérales, de la cellulose, des glucides…etc. Elles sont riches en germes microbiens fécaux (Morlot, 1996; Mizi Abdelkader, 2006; Lagartette, 2009).

Les eaux usées domestiques gardent une composition relativement stable et prévisible, il n’en est pas de même pour les eaux usées industrielles. Les eaux usées domestiques sont dépourvues de métaux lourds, d’hydrocarbures, et de déchets radioactifs puisqu’elles proviennent des différents usages privés (Herteman, 2010).

(15)

4 I.2.2. Eaux usées industrielles

Très différentes des eaux usées domestiques ; leurs caractéristiques varient d’une industrie à l’autre. Ce sont les eaux usées qui proviennent de locaux utilisés à des fins industriels, commerciales, artisanales ou de services, leurs eaux de refroidissement de pompes à chaleur et de climatisation (Barnichet et al., 2003). Les eaux usées industrielles doivent faire l’objet, avant rejet vers le réseau publique, d’un traitement adapté à leur nature afin d’assurer la protection du milieu récepteur (Barnich et al., 2003). Elles sont caractérisées par leur grande diversité et comprennent :

- les eaux à charge minérale dominante représentées par les rejets des industries minières, carrières…etc. Ces eaux sont très chargées en matières en suspension (Couillard, 1979).

- les eaux à charge organique azotées ou phosphorées dominante issues des industries agro-alimentaires (abattoirs, tanneries, laiteries, brasseries). Elles sont chargées en matières organiques biodégradables (Lagartette, 2009).

- les eaux à caractère toxique rejetées par l’industrie chimique contiennent, des solvants, des métaux lourds, des micropolluants organiques, des hydrocarbures. Leur composition peut inhiber les processus d’épuration biologique en station intensive (boue activée, disques biologiques) ou extensive (lagunage) (Crini et Badot, 2007).

I.2.3. Eaux de pluie (pluviales)

Elles peuvent également constituer une cause de pollution importante, pouvant se charger d’impuretés au contact de l’air (fumées industrielles), puis en ruisselant, elles se chargent des résidus déposés sur les toits, les chaussées et les sols (poussières, huiles de vidange, carburant, résidus de pneus, métaux lourds, pesticides et matières minérales en suspension (Lagartette, 2009; Herteman, 2010 ; Briere , 2012).

I.2.4. Eaux usées agricoles

La pollution agricole résulte prioritairement d'une utilisation excessive de produits phytosanitaires. En Martinique, par exemple, ce sont chaque année près de 2 000 tonnes d'insecticides, de pesticides et de fongicides et plusieurs milliers de tonnes d'engrais qui sont utilisées (Saffache, 2001).

(16)

5 I.3. Principaux polluants de l’eau

I.3.1. Polluants physiques

Ils sont essentiellement industriels, secondairement domestiques. On peut distinguer deux types de polluant ayant un caractère physique : les polluants thermiques et les polluants radioactifs (Arouya, 2011).

3.1.1. Polluants thermiques

La pollution thermique est représentée par des rejets d’eaux chaudes (Arouya, 2011) provenant des systèmes de refroidissement des centrales nucléaires et électriques ce qui provoque un réchauffement considérable des eaux (Mazzuoli, 2012). Le réchauffement est toujours lorsque une augmentation de 6 à 7 au minimum et peut avoisiner 10 °C de l’état naturel. Cet échauffement modifie certaines propriétés physiques de l’eau et notamment une diminution de la densité (Arouya, 2011) et crée de graves perturbations sur les biocénoses. On peut noter :

-Une baisse de la teneur en oxygène.

-Une diminution de la teneur en gaz carbonique pouvant modifier le pH de milieu.

(Mazzuoli, 2012).

- L’élévation de la température entraine une substitution de la faune et de la flore : les espèces d’eau froide disparaissent au profit des espèces d’eau chaude.

Le réchauffement des eaux conduit aussi à une baisse de la teneur en oxygène dissout et une exacerbation de la toxicité de certaines substances, ainsi celle du cyanure de potassium est multipliée par deux pour un accroissement de température de 10 °C (Arouya, 2011).

I.3.1.2. Les polluants radioactifs

La source majeure réside dans les rejets chargés d’éléments radioactifs issus d’explosion d’armes nucléaires et des résidus des usines utilisant l’énergie atomique aussi les eaux usées des hôpitaux (Lefèvre et Andréassian, 2016). Les radio-isotopes peuvent exercer leurs effets nocifs directement par les rayonnements ionisant mais aussi par leur accumulation dans des organismes marins. Ainsi chez certaines algues, le facteur de concentration peut atteindre 10⁵à 10⁶ fois la radioactivité de l’eau.

I.3.2. Polluants microbiens

Les eaux usées sont des milieux favorables au développement d'un très grand nombre de microorganismes, dont des germes pathogènes souvent fécaux. On les trouve dans les

(17)

6

effluents hospitaliers, de lavage de linges et de matériels souillés, ou encore dans le déversement de nombreuses industries agro -alimentaires (abattoirs, élevage agricoles…) (Feachem et al., 1983). Le tableau I représente la concentration en microorganismes des eaux usées.

Tableau I : Concentration en microorganismes des eaux usées (Feachem et al., 1983 ; Mara et al., 1986 ; Oragui et al., 1987; Mazzuoli, 2012)

Microorganisme Nombres dans les eaux usées (par litre) Bactérie

coliforms Thermotolerants Campylobacter jejuni

Salmonella spp Shigella spp Vibrio cholerae

10⁸-10¹⁰ 10-10⁴

1-10⁵ 10-10⁴ 10²-10³ Helminths

Ascaris lumbricoides Ancylostoma duoenale

Necator americanus Trichuris trichiura Schistosoma mansoni

1-10³ 1-10³ 1-10³ 1-10² ND Protozoaires

Cryptosporidium parvum Entamoeba histolytica

Giardia intestinalis

1-10⁴ 1-10² 10²-10⁵ Virus

Virus entériques Rotavirus

10⁵-10⁶ 10²-10⁵

I.3.3. Polluants chimiques

Elle est due essentiellement aux rejets industriels qui apportent de grandes quantités de substances chimiques perturbant ainsi l’équilibre de l’écosystème aquatique (Arouya, 2011).

La pollution chimique d’une eau est autrement plus complexe et peut provenir de plusieurs sources, On distingue selon la nature de la pollution chimique (Arouya, 2011) :

• Les éléments chimiques inorganiques.

• Les éléments chimiques organiques.

(18)

7 I.3.3.1. Polluants chimiques organiques

Sont les plus nombreux et les plus dangereux. Certaines de ces substances sont même cancérigènes ou mutagènes, d’où l’importance de les éliminer. Ils peuvent être classés en phénols, hydrocarbures, colorants, détergents et pesticides qui sont les plus importants et les plus dangereux des polluants organiques rencontrés dans le milieu aquatique (Saffache, 2001; Arouya, 2011 ).

Ces matières organiques sont notamment issues des effluents mais également des rejets industriels. Elles provoquent l’appauvrissement en oxygène des milieux aquatiques, avec des effets bien évidents sur la survie de la faune. Ce sont aussi tous les déchets carbonés tels que la cellulose produite par les papeteries, le sucre ou le lactosérum des industries agro-alimentaires. À l’inverse des matières en suspension (MES), elles constituent une nourriture de choix pour les microorganismes de l’eau et provoquent leur prolifération (Saffache, 2001; Arouya, 2011).

I.3.3.2. Polluants inorganiques a. Sels minéraux

Les sels minéraux représentent des polluants majeurs de par les masses mises en jeu ainsi que par leurs effets biologiques. Ils affectent la potabilité des eaux superficielles, même pour usages industriels si leur concentration est assez importante (Abou-Elela et al., 2010).

b. Métaux lourds

La plupart des sources ponctuelles de polluants de métaux lourds sont les eaux usées industrielles provenant de l'exploitation minière, de la transformation des métaux, des tanneries, pharmaceutiques, pesticides, produits chimiques organiques, caoutchouc et plastiques, bois et produits du bois,…etc (Srivastava et Majumder, 2007) . Les métaux constituent des polluants qui ne se dégradent pas dans l'environnement. Ils s'accumulent dans les organismes vivants et peuvent contaminer l'ensemble d'une chaine alimentaire. Les effets toxiques des métaux lourds concernent le système nerveux, le sang ou la moelle osseuse. Ils sont généralement cancérigènes. Certains métaux lourds sont particulièrement toxiques comme le cadmium (Cd), le mercure (Hg), le plomb (Pb), le nickel (Ni), le chrome (Cr), et à un degré moindre le cuivre (Cu) et le zinc (Zn). Le fer (Fe) et l’aluminium (Al) le sont moins (Ahluwalia et Goyal, 2007).

(19)

Chapitre II : Généralités sur le plomb

8 II.1. Définition

Le Plomb du latin plumbum est un élément chimique (Pb) appartenant au groupe des métaux lourds hautement toxiques. C’est un contaminant de l’environnement, naturellement retrouvé dans la croûte terrestre. Les hauts niveaux mesurés proviennent pour la plupart des activités métallurgiques dès l'antiquité et redécouvert au moment de la révolution industrielle. Il est également un polluant environnemental, on le trouve surtout dans les sols et l'atmosphère au voisinage de sites industriels. Il provoque des intoxications massives aiguës et chroniques (Morlot, 1996).

II.2. Propriétés physico –chimiques du plomb

Le plomb est un élément trace métallique, d’une couleur grise bleuâtre, mou, malléable, flexible et facile à extraire ; il appartient au quatrième groupe de la classification périodique des éléments. Avec un nombre atomique Z : 82, MM : 207,21. De configuration électronique [Xe] 4f14 5d10 6s2 6p2, il possède 2 électrons non appariés sur la dernière couche. Cette configuration électronique autorise les degrés d’oxydation (+2) et (+4). Son point de fusion est de 327 °C sa température de fusion est d’environ 1700°C (Morlot, 1996; Cassidy, 2002; Oudghiri, 2011). Il n’est pas inerte chimiquement mais présente une remarquable résistance à la corrosion et une difficulté d’inflammation et d’explosion, sauf sous forme pulvérulente (poussières) exposée à la chaleur ou aux flammes (Ivanov, 2000). Il existe 20 isotopes ; dont 16 sont radioactifs et 4 naturels stables : 204Pb, 206Pb, 207Pb et 208Pb (Marcoux et Bril, 1986). Les isotopes stables ne changent pas au cours du temps, alors que les isotopes radioactifs se désintègrent en suivant un rythme prévisible (Atkins, 2017; Augenstein, 2018), il résiste bien aux acides (sauf en présence d’oxygène) (Morlot, 1996).

II.3. Effets toxiques du plomb

II.3.1. Effets toxiques sur l'environnement

Le plomb est présent naturellement dans l'environnement. Cependant, la plupart des concentrations en plomb que l'on trouve dans l'environnement sont le résultat des activités humaines c’est-à-dire d’origine anthropique. Le plomb est accumlé par les plantes et les animaux terrestres et aquatiques, mais il ne serait pas bioamplifié dans les chaines alimentaires terrestres ou aquatiques (Morlot, 1996).

L’absorption du plomb par les racines des plantes est une importante source de contamination, puisque il possède des effets indésirables sur la reproduction et la vie des

(20)

Chapitre II : Généralités sur le plomb

9

plantes quand il dépasse la dose de 2 à 6 ug/l, il possède aussi des effets indésirables sur les animaux, tel que la contamination des prédateurs de vers de terre à la proximité des réseaux routièrs (les concentration très élevées de plomb chez les vers des terre dans ces régions), les oiseaux aussi peuvent être contaminés en ingérant des petits animaux écrasés par les véhicules ou des végétaux proches de ces régions. Donc le plomb provoque des changements dans la composition de la communauté, pertes dans la biodiversité et les effets neurologiques chez les vertébrés et les arthropodes, des insectes, des poissons ...etc (Morlot, 1996; Tajudina et al., 2015).

II.3.2. Effets toxiques sur la santé humaine

L’intoxication par le Pb, ses vapeurs ou ses sels, qui pénètrent dans l'organisme par voie digestive ou respiratoire (exposition au plomb et aux produits chimiques contenant du plomb par l'air, l'eau potable et la nourriture) est dite le saturnisme, elle peut être aiguë ou chronique, professionnelle ou domestique (Morlot, 1996 ; Tajudina et al.,2015). Le plomb est distribué à travers le corps à travers le sang et est accumulé dans l’os (Flora et al., 2012). La toxicité est essentiellement hématologique (Perturbation de la biosynthèse de l'hémoglobine et anémie), neurologique (Perturbation du système nerveux, plus rencontrés chez les enfants) et rénale et peut nuire le système immunitaire, de reproduction (Déclin de la fertilité des hommes par des problèmes au niveau du sperme, Fausses couches) les systèmes de développement et le système cardiovasculaire (l'hypertension artérielle) (Morlot, 1996 ; Tong, 2000 ; Flora et al., 2012; Tajudina et al., 2015; Chanel et al., 2017) , il peut provoquer des dommages au cerveau et aussi des effets cancérogènes (cancer bronchique et du rein) (Chanel et al,2017).

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Chapitre III : Procédés de dépollution métallique

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Le traitement des eaux polluées par des métaux peut être réalisé par des procédés physico- chimiques classiques ex situ, auxquels s’ajoutent les procédés biologiques in situ comme la phytoremédiation, la bioremédiationet la zooremédiation (Kamnev, 2000).

III.1. Méthodes physico-chimiques

Il existe plusieurs techniques pour éliminer les métaux lourds, notamment la précipitation chimique, l'oxydation ou la réduction, la filtration, l'échange d'ions, l'osmose inverse, la technologie membranaire, l’évaporation, le traitement électrochimique, la coagulation et l’adsorption, mais la plupart de ces techniques deviennent inefficaces lorsque les concentrations en métaux lourds sont inférieures à 100 mg / L (Ahluwalia et Goyal, 2007 ; Velásquez et Dussan, 2009). La plupart des sels de métaux lourds sont solubles dans l'eau et se dissolvent dans les eaux usées, ce qui signifie qu'ils ne peuvent pas être séparés par des méthodes physiques de séparation (Hussein et al., 2004). De plus, les méthodes physico-chimiques sont inefficaces ou coûteuses lorsque la concentration en métaux lourds est très faible. Alternativement, des méthodes biologiques pour l'élimination des métaux lourds peuvent être une alternative intéressante aux méthodes physico-chimiques (Kapoor et Viraraghvan, 1995).

III.2. Biodépollution

La biodépollution regroupe un ensemble de méthodes biologiques visant à éliminer, dégrader ou stabiliser les polluants contenus dans les sols, les sédiments ou des effluents liquides. Elles s’appuient sur le métabolisme de certains micro-organismes et macroorganismes et leur capacité à dégrader la matière organique. Ces approches biotechnologiques sont des alternatives aux méthodes physico-chimiques classiques (Malik, 2004).

III.2.1. Phytoremédiation

La phytoremédiation de l'eau polluée, ou rhizofiltration, est une technologie relativement nouvelle, c’est une méthode qui consiste à utiliser les végétaux (herbacées, arbres) comme outils efficaces de dépollution partiellement ou complètement par l’élimination des métaux lourds de l’eau (Gardea- Torresdey et al., 2005 ; Dixit et al., 2015) .

III.2.2. Zooremédiation

Un certain nombre d’organismes aquatiques ont pourtant été décrits pour leurs propriétés d’hyperaccumulation, de stabilisation, de dégradation et de résistance aux métaux. Un intérêt croissant a été porté aux mollusques bivalves comme les huîtres perlières ou les moules et mollusques gastéropodes pour leur capacité à accumuler et dépolluer les métaux toxiques (Malik, 2004; Dada et al.,2015).

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11 III.2.3. Bioremédiation

La biorémédiation englobe toutes les techniques qui utilisent le potentiel métabolique des microorganismes, en particulier des bactéries, c’est une technologie innovante et prometteuse disponible pour l'élimination des métaux lourds et la récupération des métaux lourds dans les eaux et les terres polluées (Dixit et al., 2015).

III.2.3.1. Résistance des bactéries au plomb

Le plomb et les autres métaux lourds comme le mercure, le cadmium, ou l’argent sont toxiques et interagissent de façon covalente ou ionique avec les composants cellulaires essentiels. A des concentrations qui dépassent les capacités physiologiques des cellules, les métaux essentiels et toxiques peuvent endommager les membranes cellulaires ou la structure de l’ADN et altérer des enzymes spécifiques et les fonctions physiologiques sous-jacentes (Bruins et al., 2000). Pour survivre dans des environnements contaminés en métaux lourds, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance ce qui aide à la bioremédiation, y compris la biosorption, la bioaccumulation, la biominéralisation et la biotransformation, les systèmes d’efflux (Figure1) (Mejáreet Bülow, 2001 ; Dixit et al., 2015).

Figure 1 : Mécanismes bactériens de résistance aux métaux toxiques : Pb⁺² correspond dans ce schéma au métal sous forme cationique pris en charge par la bactérie (Naik et Dubey, 2013).

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12 III.2.3.2. Mécanismes de résistance

a. Bioaccumulation a1. Définition

La bioaccumulation est un mécanisme de résistance au plomb et aux autres métaux lourds, elle correspond à l’accumulation de métaux dans le cytoplasme pour en diminuer la biodisponibilité et préserver les composants cellulaires essentiels (Ahearn, 2004).

a2. Mécanisme de la bioaccumulation

Elle se fait par l’association des métaux comme le mercure, le cadmium, le plomb, le zinc, l’argent et le cuivre avec des protéines de haute affinité pour les ions métalliques de type métallothionéines (Gadd, 1990; Bruins et al., 2000). Les métallothionéines sont des molécules de faible poids moléculaire (6-7 kDa) riches en cystéines que l’on retrouve principalement chez les eucaryotes ainsi que chez quelques procaryotes (Figure 2). Bien que de nombreux génomes bactériens aient été séquencés, peu de métallothionéines ont été identifiées à ce jour. Elles ont principalement été trouvées chez des Cyanobacteria et des bactéries du genre Pseudomonas (Amiard, 2008). Bacillus sphaericus JG-A12 est une souche isolée de déchets miniers en Allemagne capable de piéger le Pb et différents métaux tels que U, Cu, Al et Cd.

Figure 2 : Représentation de sites de l’accumulation des métaux lourds chez les bactéries (Srivastava, 2003)/PPG : Poly phosphate granules, EDA : Electron dense aggregates, MT-

likeprotéin : Metallothionein likeprotein.

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13 b. Biosorption

b1. Définition

La biosorption correspond à l’utilisation de matériaux biologiques pour la fixation des polluants par adsorption (Desaunay,2012). Le plomb peut être biosorbé par les microbes aux sites de liaison présents dans la structure cellulaire sans l'implication de l'énergie (l'échange de protons et la micro- précipitation de plomb) (Iyer et al., 2005).

b2. Mécanisme de la biosorption

Elle se fait via l’interaction des métaux avec : divers composés réactifs associés aux parois cellulaires bactériennes, les substances polymères extracellulaires (EPS) qui sont d'une importance particulière et sont bien connus pour avoir des effets significatifs sur les propriétés acide-base et d'adsorption du métal. Des études sur le comportement de liaison du métal aux substances polymères extracellulaires (EPS) a révélé une grande capacité de métaux lourds complexes grâce à divers mécanismes, qui comprennent un échange de protons et de micro-précipitation des métaux (Dixit et al., 2015). Les acides teichoïque et téichuronique du peptidoglycane des cellules bactériennes Gram-positif ou les polysaccharides du peptidoglycane des cellules bactériennes Gram-négatif sont les principales substances qui expliquent la charge négative de la paroi cellulaire des bactéries, ainsi que sa capacité à piéger les polluants métalliques tels que le plomb. Les groupements anioniques de la paroi cellulaire (groupements thiol, hydroxyle, carboxyl, sulfonate, amine, amide, phosphonate), en particulier les groupements amines sont impliqués dans la chélation de cations métalliques, mais aussi l'adsorption d'espèces métalliques au moyen d’interactions électrostatiques ou de liaisons hydrogènes (Stengelet Gelin, 1998 ; Gutnick et Bach, 2000 ).

Plusieurs études et recherches ont examiné la possibilité d’absorber de plomb par les bactéries.

Parmi celles-ci, Chang et al. (1997) ont évalué la capacité d’adsorption de Pseudomonas aeruginosa pu21 vis-à-vis du plomb, du cuivre et du cadmium (Dixit et al., 2015) et le tableau (II) représente des exemples des métaux lourds et les bactéries qui les absorbent.

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Tableau II : Exemples des métaux lourds absorbés par les bactéries (Desaunay, 2011).

Souche bactérienne Métal sorbé Quantité, mg.g-1

EPS Bactérie marine réductrice

de sulfate

Mo(VI) Ni(II) Cr(III)

2.14 0.43 0.2 Methylobacterium

organophilum

Pb(II) Cu(II)

184.2 200.3 Alteromonas macleodii

subsp. fifiensis

Pb(II) Cd(II) Zn(II)

316 125 75 Pseudomonas aeruginosa

Cur

Cu(II) 320

Enterobacter cloaceae AK-I-MB-71a

Cr(VI) 8.3

Chryseomonas luteola TEM05

Cd(II) Co(II)

64.1 55.2 Paenibacillus polymyxa

P13

Cu(II) 1602

Paenibacillus ,jamilae CECT

5266

Pb(II) Cd(II) Cu(II) Zn(II) Ni(II) Co(II)

228 55 40 37 15 10

Pseudomonas putida Cd(II)

Pb(II)

-

c. Conversion enzymatique

La conversion par des enzymes oxydo-réductrices et métal-spécifiques consiste à transformer un cation métallique en un élément de niveau d’oxydation moins toxique ou sous une forme soluble qui peut être efficacement éliminée par la cellule. En effet, pour éviter la réoxydation des composés métalliques réduits, les métaux doivent pouvoir diffuser à l’extérieur de la cellule grâce à un système d’efflux (Williams, 1984; Silver et Phung, 1996).

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15 d. Systèmes d’efflux

L'efflux est un mécanisme par lequel les cellules rejettent à l'extérieur des composés toxiques : antibiotiques, métaux lourds, drogues... C’est est un mécanisme de transport actif, énergie-dépendant, assuré par des protéines transmembranaire appelées pompes d'efflux (Figure 3) (Aires, 2011). Le pompage par efflux est très spécifique (élimination des ions toxiques qui sont entrés dans la cellule au moyen de systèmes impliqués dans le transport de cations ou des anions) (Silver et Phung, 1996). Deux systèmes de transport actif ont été décrits chez les bactéries à Gram- négatif :

d1. Transporteurs primaires

Couplés à l’hydrolyse de l’ATP, les ATPases sont des enzymes qui utilisent l'énergie chimique de scission de la liaison haute énergie phospho-ester de l’ATP, conduisant à la formation d’un gradient de concentration (transporteurs ABC, ATPase de type p). Comme les systèmes ABC d’imports, les transporteurs ABC d’efflux sont composés de deux sous-unités ATPase associées à la membrane cytoplasmique, d’un canal membranaire formé par deux sous-unités transmembranaires, d’une protéine de liaison aux ions dans l’espace périplasmique et d’une porine dans la membrane externe (Aires, 2011).

d2. Transporteurs secondaires

Les transporteurs secondaires sont des transporteurs qui utilisent le gradient chimiosmotique au travers de la membrane comme source d’énergie afin d’expulser les métaux hors de la cellule (les systèmes RND et les systèmes CDF) (Aires, 2011). Du fait de l’absence de membrane externe, les systèmes d’efflux des bactéries à Gram positif ne sont constitués que d’une pompe d’efflux enchâssée dans la membrane cytoplasmique (Cattoir, 2004).

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Figure 3 : Représentation schématique des cinq familles de pompes à efflux bactériennes. ME, membrane externe ; EP, espace périplasmique ; MC, membrane cytoplasmique ; S, substrat (Aires,

2011).

e. Biominéralisation

La biominéralisation est considérée comme technique prometteuse ainsi qu'un phénomène intéressant pour la transformation des métaux lourds des espèces mobiles dans des minéraux très stables dans l'environnement. Elle pourrait être considérée comme une des stratégies les plus efficaces, abordables et respectueuses de l'environnement pour la réhabilitation du Pb (II). Cela ne conduirait pas seulement à diminuer significativement la biodisponibilité du Pb (II), mais aussi à recycler Pb (II) dans le système naturel comme la forme de minéraux. Parmi les espèces bactériennes qui sont capables de minéraliser le plomb, on peut citer Bacillus cereus12-2, Klebsiella aerogenes, Bacillus iodinium GP13, Vibrio harveyi et Providencia alcalifaciens (Chen et al., 2015).

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Chapitre IV : Matériel et méthodes

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Notre travail porte sur l’isolement et l’identification de quelques espèces isolées à partir des eaux usées du complexe sidérurgique Bellara de la Wilaya de Jijel et l’étude de la résistance de ces espèces vis–à-vis au plomb. Ce qui s’est étalée sur une période allant du mois de mai au mois de juin 2018 est réalisé au laboratoire de Microbiologie de la faculté SNV, université de Jijel.

IV.1. Présentation de la zone d’étude

Le complexe sidérurgique (Figure 4) de la Wilaya de Jijel Bellara, qui est situé loin de la capitale de l'Etat de 52 km, situé à droite de la ville d'Almilia, s'étendant sur 500 hectares reliée au port Djen Djen par l'autoroute et à 10 kilomètres par la voie ferrée du barrage de Boussaiba et à 20 km du plus grand barrage d'Algérie, le barrage de Beni Haroun à Mila, contribue à couvrir tous les besoins du pays en particulier en matière de rond à béton, Le complexe sidérurgique de Bellara assure, dans une première étape, une production de 2 millions de tonnes, dont 1,5 millions de tonnes de rond à béton et 700 000 tonnes de fil machine. Le complexe compte 10 unités dont une unité de réduction directe, trois laminoirs, deux fourneaux, une station de gaz naturel, un transformateur électrique, une usine de chaux et une unité de traitement de l’eau (Saou, 2015).

Figure 04: Complexe sidérurgique de la Wilaya de Jijel Bellara (Google Image, Google Maps)

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18 IV.2.Matériel et appareillage utilisé

IV.2.1. Matériel

 Bec benzène.

IV.2.2.Appareillages

 Microscope optique (OLYMPUS).

 Autoclave (PBIBRAND).

 Spectrophotomètre (SPECORD 50 PLUS ; ANALYTIK JENA).

 Bain-marie(GERHARDT).

 Etuves réglées à 37°C ; et 44°C.

 Balance (KERN 440-35A).

 Vortex (VWR/VV3).

IV.2.3. Milieux de culture

 Gélose PCA.

 Bouillon de Litsky.

 Gélose BLBVB.

 Gélose nutritive.

 Gélose Columbia.

 Gélose Chapman.

 Gélose Héktoen.

 Bouillon nutritif.

 Bouillon SFB.

 Gélose viande foie.

 Urée indole.

IV.2.4. Produits chimiques et réactifs

 Alun de fer.

 Erlish Kovacs.

 Violet de Gentiane.

 Lugol.

 Fuschine.

 Sulfite de sodium.

 Nitrate du plomb (Pb(NO₃)₂).

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 Eau physiologique.

IV.3. Méthodes

IV.3.1. Prélèvement de l’eau à analyser

Le prélèvement se fait à partir des eaux usées orientées à l’unité de traitement de l’eau dans le complexe (Figure 5). Ces eaux doivent être prélevées dans des flacons stériles de 250 ml. Ceux-ci sont immergés en position verticale en les tenant par le fond, l’ouverture soit légèrement plus haute que le fond et dirigée dans le sens contraire de courant (Chippaux et al., 2002 ; Coquery et al., 2011).

Figure 05: Site de prélèvement IV.3.2.Transport d’échantillon

Les analyses bactériologiques doivent être effectuées moins de 6 heures après le prélèvement. Si le transport dépasse 6 heures, ainsi si la température extérieure est supérieure à 10°C, le transport doit se faire obligatoirement en glacière à une température inférieure à 4°C. Enfin, les prélèvements sont placés aux froids dès leurs arrivées au laboratoire avant de commencer les analyses (Roudier et al., 2005).

IV.3.3. Isolement des bactéries des eaux usées IV.3.3.1. Préparation des dilutions

Conformément aux normes AFNOR NF VO8-010 et ISO 6887-1, on utilise l’eau physiologique pour préparer des dilutions décimales d’eau à analyser.

On met à partir de la solution mère 1ml dans un tube contenant 9ml d’eau physiologique stérile, ce tube représente la dilution 10^-1, à partir de ce dernier on met 1ml dans un nouveau tube contenant aussi 9ml d’eau physiologique, ce tube représente la dilution 10^-2 et ainsi de suite jusqu’à l’obtention de toutes les dilutions voulues (Delarras et al., 2010). Dans notre étude, on a retenu la gamme de 10^-4(Annexe II).

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IV.3.1.2. Dénombrement de la flore aérobie mésophiles totale (FTAM) a. Définition

La flore aérobie mésophile totale est l’ensemble des microorganismes capables de se multiplier en présence d’oxygène à une température située entre 25 et 40 °C (Joffin et Joffin, 2010).

b. Mode opératoire

A partir de chaque dilution décimales préparées (10^-1; 10 ^-2;10^-3 ;10^-4) ; on a porté aseptiquement 1 ml dans une boite de Pétri vide préparée à cet usage et numérotée. On a mis ensuite la gélose PCA fondue puis refroidie. On a fait ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient on forme de 8 pour permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose utilisée. On a laissé solidifier sur la paillasse (Aggad et al., 2009 ;Ahoussi-Edwige et al., 2010 ). Les ensemencements ont été réalisés en triple exemplaire. Les boites sont incubées couvercle en bas à 37°C pendant 72 heures, après incubation, les colonies sont dénombrées (Annexe II).

IV.3.1.3. Recherche et dénombrement des coliformes en milieu liquide

Après ensemencement de plusieurs dilutions de l’échantillon, chacune dans une série de tubes contenant un milieu de culture permettant de mettre en évidence la fermentation du lactose avec production de gaz (tubes positifs). La détermination de nombre caractéristique (nombre de tubes positifs pour chaque dilution) nous a permis de déterminer le NPP des coliformes en milieu liquide BLBVB par deux tests (Rodier et al., 2005 ; Ahoussi-Edwige et al., 2010). Les coliformes sont dénombrés en milieu liquide par la technique de NPP (le nombre le plus probable) à l’aide du bouillon BLBVB (Bouillon lactosé billé de vert brillant) réparti à raison de 10 ml par tubes munis d’une cloche du Durham. La technique fait appel à deux testes consécutifs à savoir :

Le test de présomption : réservé à la recherche des coliformes totaux.

Le test de confirmation : appelé encore test de MacKenzie et réservé à la recherche des coliformes fécaux à partir des tube positifs du test de présomption (Delarras et al., 2010).

a. Test présomptif

On a préparé dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif BLBVB à raison de 3 tubes pour chaque dilution à partir de dilution décimal 10^-1,10^-2 et 10^-3, on a porté aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes correspondant à une dilution donnée. On a chassé le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum (Annexe II).

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois : Un dégagement de gaz (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche), un

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trouble microbien dans le milieu. La lecture finale de fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady (Joffin et Joffin, 2010 ).

b. Test de confirmation ou test de MacKenzie (Identification)

Les tubes de BLBVB trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes totaux feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée à la fois dans un tube de BLBVBL muni d’une cloche, et sur un tube d’urée d’indole (Kihel et al., 2005). L’incubation se fait cette fois-ci au bain marie à 44°C pendant 24 heures. Sont considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois un dégagement gazeux dans les tubes de BLBVB et un anneau rouge en surfaces surface ; témoin de la production d’indole par Escherichia coli après addition de 2 à 3 gouttes du réactif de Kovacs dans le tube d’urée indole (Joffin et Joffin, 2010 ).

IV.3.1.4. Recherche et dénombrement des streptocoques a. Principe

Les principes généraux de cette méthode sont ceux décrits pour la colimétrie en milieu liquide.

Cependant, alors que le tube primaire contient déjà une certaine quantité d’Azide de sodium, le repiquage des tubes «positifs» sur un milieu inhibiteur favorise uniquement le développement des streptocoques fécaux (Delarras et al., 2010).

Les streptocoques du groupe D ou streptocoques fécaux sont recherchés et dénombrés en milieu liquide par la technique du NPP (nombre le plus probable). La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :

Le test de présomption : réservé à la recherche des streptocoques sur milieu de Rothe.

Le test de confirmation : réservé à la confirmation proprement dite sur milieu EVA Litsky, des tubes trouvés positifs au niveau des tests de présomption (Aggad et al., 2009 ;Ahoussi-Edwige et al., 2010 ).

On a préparé dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif Litsky à l’éthyle violet et l’azide de sodium à raison de trois tubes par dilution. A partir des dilutions décimales 10^-1, 10^-2, et 10^-3,10^-4, on a porter aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes correspondant à une dilution donnée (Aggad et al., 2009). On a bien mélangé le milieu et l’inoculum (Annexe II).

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. Sont considérés comme positifs, les tubes présentant un trouble microbien confirmant la présence d’un streptocoque fécal. Parfois, la culture s’agglomère au fond du tube en fixant le colorant et en formant une pastille violette de signification identique à celle du trouble. Après agitation des tubes de Litsky positifs, on a prélevé sur chacun

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d’eux successivement quelques gouttes à l’aide d’une pipette Pasteur et on a porté dans des tubes du même milieu, incuber à 44°C pendant 24 ou 48 heures afin de chercher des streptocoque thermotolérants (Delarras et al., 2010).

IV.3.3.5. Recherche de spores d’Anaérobies Sulfito-Réducteurs de Clostridium a. Principe

Après destruction des formes végétatives par chauffage à 80°C pendant 10 min, l’échantillon est incorporé à un milieu de base fondu, régénéré, additionné de sulfites de sodium et de sels de fer, en tenant compte d’un volume déterminé d’eau incorporée. Après solidification et incubation, la présence de germes sulfito-réducteurs se traduit par un halo noir autour des colonies (Delarras et al., 2010).

Au moment de l’emploi on a fait fondre un flacon de gélose Viande foie, on l’a mis dans un bain d’eau à 45°C puis on a ajouté une ampoule d’Alun de Fer et une ampoule de sulfite de sodium. On a mélangé soigneusement et aseptiquement (Annexe II). Le milieu est ainsi prêt à l’emploi, mais il faut le maintenir dans une étuve a 45 °C jusqu’au moment de l’utilisation (Delarras et al., 2010 ; Joffin et Joffin, 2010).

Un tube contient la solution mère sera soumis :

 d’abord à un chauffage à 80°C pendant 8 à 10 minutes,

 puis a un refroidissement immédiat sous l’eau de robinet, dans le but d’éliminer les formes végétatives et de garder uniquement les formes sporulées.

 A partir de ce tube, on a porté aseptiquement 1 ml dans un tube stérile, puis ajouter environ 15 ml de gélose Viande Foie prête à l’emploi dans le tube, On a laissé solidifier sur paillasse pendant 30 minutes.

 Ces tubes seront ainsi incubés à 37°C pendant 16, 24 ou au plus tard 48 heures.

 Les Clostridies sulfito-réducteurs apparaissent sous forme des colonies, entourés d'un halo noir. La première lecture doit se faire impérativement à 16 heures, car, d’une part les colonies de Clostridium Sulfito-reducteurs sont envahissantes auquel cas on se trouverait en face d’un tube complètement noir rendant alors l’interprétation difficile voire impossible et l’analyse est à refaire. D’autre part, il faut absolument repérer toute colonie noire ayant poussé en masse et d’un diamètre supérieur à 0,5 mm (Ahoussi-Edwige et al., 2010 ; Delarras et al., 2010 ; Joffin et Joffin, 2010).

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Dans le cas où il n’y a pas de colonie caractéristiques re-incuber les tubes et effectuer une deuxième lecture au bout de 24 heures voire 48 heures.

IV.3.3.6. Recherche des Staphylococcus aureus a. Principe

Le milieu Chapman est un milieu classique, il permet d’une part l'isolement sélectif des staphylocoques sur la base de leur tolérance à de fortes teneurs de Na Cl, et d’autre part à la différenciation de souche Staphylococcus aureus, par la mise en évidence de la dégradation du mannitol (Joffin et Joffin, 2010 ; Delarras et al., 2010).

Selon la norme NF T 90-421 et la norme NF ISO 7218, le milieu Chapman doit être considéré essentiellement comme le milieu d'isolement, l'ensemencement s'effectue par culture en masse (Annexe II). L'incubation à 37°C pendant 24-48 h (Delarras et al., 2010).

Un test positif se traduit par le fait que les colonies de Staphylococcus aureus s'entourent d'un halo jaune du à l'attaque du mannitol et élaborent souvent leur propre pigment dont la production s'accentue après la sortie de l'étuve (Delarras et al., 2010).

IV.3.3.7. Recherche de Pseudomonas a. Définition

Les Pseudomonas sont très répandus dans la nature (l’air, sol, le monde végétal), ils contaminent les produits alimentaires et peuvent les dégrader. C'est un bacille, coccobacille, Gram (-), asporulé, oxydase (+), ne fermente pas le glucose (métabolisme respiratoire), aérobie stricte, catalase (+), température de croissance est de 20°C à 30°C (Delarras et al., 2010).

b. Principe

Conformément à la norme NF EN 12780 et la norme NF V ISO 7218, on utilise un milieu sélectif : King A spécifique pour Pseudomonas aeruginosa.

c. Mode opératoire

A partir de bouillon nutritive on ensemence les milieux King A en surface à l’aide d’une anse de platine, et on incube pendant 24 à 48 h à 30° C (Delarras et al., 2010). Un résultat positif se traduit par la formation de colonies blancs-crème de diamètre de 1.5 à 2 mm avec un aspect muqueux et parfois il y a production de pigment bleu-vert.

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24 IV.3.3.7. Recherche des entérobactéries

a. Enrichissement

On met 1 ml de la solution mère dans un tube qui contient le milieu SFB, incubé à 37°C pendant 24 h.

b. Isolement

Deux boites de Pétri qui contiennent la gélose Héktoen sont ensemencées par stries à partir du bouillon d’enrichissement. L’incubation se fait à 37°C, pendant 24 heures.



Le principe de lecture est fondé sur la fermentation éventuelle des 3 glucides présents dans le milieu (lactose, saccharose, salicine). Les microorganismes qui fermentent au moins l’un d’entre eux forment des colonies de couleur “saumon”, les autres donnant des colonies bleues ou vertes. En présence de thiosulfate de sodium, les microorganismes producteurs de sulfure d’hydrogène donnent, avec le citrate ferrique, des colonies à centre noir (Biokar Diagnostics, 2012).

IV.3.4. Purification des souches

Afin d’obtenir des cultures pures à partir des populations bactériennes isolées, des repiquages successifs par la technique d’épuisement par stries sur des milieux gélosés sont réalisés. Les boites sont ensuite incubées à 37°C pour assurer de pureté d’une espèce ou d’un type de colonie, il est indispensable de répéter la procédure d’isolement par strie au moins une fois sur des fraichement préparés. Cette culture pure est alors appelée « souche bactérienne ».

IV.3.5. Purification d’Escherichia coli

A partir des tubes du milieu urée indole positif, 3 boites de gélose nutritive sont ensemencées.

VI.3.5.1. Purification des streptocoques

A partir des milieux EVA Litsky incubés à 44°C positif, on ensemence 3 boites de gélose Columbia (Smaoui et al., 2009) et on fait incubation à 37 °C pendant 24 heures.

IV.3.5.2. Purification des entérobactéries

A partir de milieu Héktoen positif, on fait le repiquage de tous les types de colonies obtenues.

IV.3.6. Conservation des souches

Les cultures sont conservées à 4 à 5°C au réfrigérateur après croissance des bactéries.

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25 VI.3.7. Identification des isolats

IV.3.7.1. Examen macroscopique

Une observation macroscopique permet de décrire l’aspect des colonies obtenues sur gélose solide (taille, pigmentation, contour, aspect…etc.).

IV.3.7.2. Examen microscopique a. Principe

Après l’examen macroscopique des colonies sur gélose, les isolats ont été soumis à la coloration de Gram (annexe II), celle - ci permet de différencier les bactéries à Gram positif de celles à Gram négatif, les bâtonnets, les coques et de nous renseigner sur le mode d’association (Guiraud, 2003).

IV.3.8.Etude de la résistance des souches purifiées vis-à-vis des nitrates du plomb (Pb(NO₃)₂) IV.3.8.1. Préparation des dilutions de nitrates du plomb (Pb(NO₃)₂)

On a préparé au début une solution de plomb de 1 M (1 mol par litre).

- Nous venons de voir que la masse molaire du Pb(NO₃)₂est égale à 223133g/mol. Si l'on dissout 223133grammes de Pb(NO₃)₂dans un volume d'eau égal au final à un litre, on aura préparé une solution de Pb(NO₃)₂dont la concentration molaire est égale à 1 mole par litre (1 mol/l ou 1 M).

A partir de cette solution mère des nitrates du plomb (1M), des solutions de 300mM, 100mM, 30mM, 10mM, 5mM ont été préparées.

IV.3.8.2. Traitement des bactéries par différentes concentrations de (Pb(NO₃)₂) a. Test sur milieu liquide

Chaque souche bactérienne est repiquée sur un tube du bouillon nutritif en présence de 100µl des concentrations de 300mM, 100mM, 30mM, 10mM et 5mM de nitrates de plomb (Pb(NO₃)₂) (annexe II). Après 24 h d’incubation à 37°C, la densité optique est mesurée par un spectrophotomètre à la longueur d’onde 630 nm, On a utilisé le bouillon nutritif comme un blanc.

b. Test sur milieu solide

Après l’incubation et a partir des bouillons nutritifs présentant un trouble, des milieux de gélose nutritif sont ensemencés par stries et incubés à 37°C pendant 24 heures.