Étude de propriétés photophysiques de protéines fluorescentes par dynamique moléculaire

(1)

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Étude de propriétés photophysiques de protéines

fluorescentes par dynamique moléculaire

Jeremy Verdiere

To cite this version:

Jeremy Verdiere.

Étude de propriétés photophysiques de protéines fluorescentes par dynamique

moléculaire. Chimie théorique et/ou physique. Université Paris Saclay (COmUE), 2016. Français.

�NNT : 2016SACLS450�. �tel-01445891�

(2)

NNT : 2016SACLS450

T

HESE DE DOCTORAT

DE

L’U

NIVERSITE

P

ARIS

-S

ACLAY

PREPAREE A

“L’

UNIVERSITE

P

ARIS

S

UD

”

E

COLE

D

OCTORALE N

° 571

Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes

Spécialité de doctorat: Chimie

Par

Jérémy Verdière

Etude de propriétés photophysiques de protéines fluorescentes par

dynamique moléculaire

Thèse présentée et soutenue à Orsay, le 19 décembre 2016 :

Composition du Jury :

M Gerald MONARD Professeur, Université de Lorraine

Président

M Florent BARBAULT Maitre de conférences, Université Paris Diderot Rapporteur

Mme Isabelle NAVIZET

Professeure, Université-Paris-Est-Marne-La-Vallée Rapporteur

Mme Helène PASQUIER

Maitre de conférences, Université Paris Sud Examinatrice

M Gerald MONARD Professeur, Université de Lorraine

Examinateur

Mme Isabelle DEMACHY

Professeure, Université Paris-Sud

Directrice de thèse

(3)

Remerciements

Avant de commencer cette thèse, je souhaite remercier toutes les personnes grâce auxquelles ce

travail a pu être réalisé et ce, dans des conditions très agréables.

Tout d’abord, je remercie Mehran Mostafavi et Philippe Maitre, les deux directeurs qui se sont

succédé au cours de ma thèse, ainsi que David Lauvergnat, animateur de l’équipe Théosim pour

m’avoir permis d’effectuer ce travail au laboratoire de Chimie Physique d’Orsay, et m’avoir bien

accueilli.

Deuxièmement, je tiens à remercier tout particulièrement Isabelle Navizet et Florent Barbault, pour

le travail de rapporteur qu’ils ont effectué sur ma thèse, ainsi qu’aux autres membres du jury qui ont

accepté d’examiner mon travail de thèse: Hélène Pasquier et Gérald Monard.

Ensuite, je tiens à remercier tout particulièrement Isabelle Demachy, Bernard Lévy et Jacqueline

Ridard qui m’ont encadré au jour le jour sur ce travail et sans qui rien de tout cela n’aurait été

possible. Ces trois années ont été riches en apprentissage et je le dois beaucoup, d’une part aux

discussions que nous avons eues mais surtout aux encouragements que vous m’avez toujours

prodigués. Vous avez fait de ces trois années un moment agréable.

Je remercie également Fabien Caillez, Aurélien de la Lande, Pascal Pernot pour les nombreuses

discussions et explications que nous avons pu partager.

Je tiens également à dire un grand merci aux autres doctorants et post-doctorants avec lesquels j’ai

pu discuter au cours de cette thèse que ce soit autour d’un repas ou d’un morceau de chocolat je

pense notamment à Natacha, Cecilia et Thiago et à ceux avec qui nous partagions le petit déjeuner

du vendredi comme Germain et Xiaojing.

Merci également à Joël et Merciano De Azevedo du service logistique pour leur aide, ainsi qu’à Anne

Morel, Delphine Lelievre, Elodie, Eve Ranvier, Marie-Françoise Lecanu et Séverine Bourguignon du

service administratif qui ont toujours été souriantes et prêtes à m’aider à compléter les documents

officiels.

Pour finir, je remercie ma famille et mes proches de m’avoir toujours soutenu dans ce travail. Je tiens

surtout à remercier Mélanie pour sa patience et sa compréhension durant tout le temps qu’a duré ce

travail de thèse.

(4)

(5)

I Introdu tion 3

I.1 La famille desprotéines uores entes . . . 3

I.2 Généralitéssurla uores en e . . . 7

I.3 Utilisationdesprotéines uores entes . . . 9

I.4 Lesprotéines étudiées . . . 10

I.5 Appro he despropriétés photophysiquespar simulation . . . 12

II Transfert de proton dans Padron 14 II.1 Introdu tion . . . 14

II.2 Energie du hromophore neutre ou anionique dans diérentes géométries dansle vide . . . 17

II.2.1 Dénition de l'anitéprotonique . . . 17

II.2.2 Anitéprotonique du hromophore dansdiérentes géométries.Choix de laméthode de al ul.. . . 17

II.2.3 Corre tion desanités protoniques al ulées . . . 21

II.2.4 Anitéprotonique du hromophore danssesdiérentesgéométries. . . 24

II.2.5 Con lusion . . . 28

II.3 Transfert deproton entre le hromophoreetlatyrosine danslevide . . . 29

II.4 Eet del'environnement . . . 32

II.4.1 ModèleH

2

O- HO

−

. . . 32

II.4.2 Modèleave une molé uled'eau spe tatri e . . . 34

II.4.3 Représentation de lamolé ule d'eauspe tatri e . . . 36

II.4.4 Con lusion . . . 37

II.5 Transfert de protondepuis Tyr159 vers le hromophoreen onformation trans et is au sein delaprotéine Padron . . . 37

(6)

II.5.2 Dynamique dePadronave le hromophoreisomérisé en onformation is. 45

II.6 Voisinagedu hromophoreen onformation is et trans . . . 51

II.7 Con lusion. . . 57

IIIEtude de la protéine EosFP 59 III.1Introdu tion . . . 59

III.2Dynamique del'état fondamental . . . 61

III.2.1 Préparation dessimulations molé ulaires . . . 61

III.2.2 Analyse desréseauxde liaison hydrogènedans l'étatfondamental . . . 64

III.3Cal ul desspe tresd'absorption de EosFP . . . 66

III.3.1 Méthode : . . . 66

III.3.2 Spe tresde EosFP . . . 71

III.4Dynamiques de l'étatex ité deEosFP . . . 73

III.4.1 Rledelamolé uled'eausurladynamiqueinternedu hromophoreàl'état ex ité . . . 73

III.4.2 Analyse desdynamiquesde l'état ex ité . . . 75

III.5Intégrationdire te . . . 77

III.6S héma inétique . . . 85

III.7Con lusiondu hapitre . . . 93

IVCon lusionGénérale 95 A Dynamiques molé ulaires 104 A.1 Proto ole de minimisation etde miseà l'équilibre . . . 104

A.2 Protonation deshistidines . . . 105

A.2.1 Dans Padron . . . 105

A.2.2 Protonation deshistidinesde EosFP . . . 106

A.3 Champ de for e . . . 106

A.3.1 Champ de for edesrésidus nonstandard . . . 107

(7)

Introdu tion

Cette thèseporte surl'étudethéorique de protéines uores entes. Ces protéines sont très

large-ment étudiéesdu fait deleur intéret en biologie. Bien que les protéines uores entes soient très

utilisées, les mé anismes molé ulaires sont en ore largement mé onnus. Mieux omprendre es

mé anismespeutpermettredelesaméliorer,notamment enorientantdes hoixdemutationsqui

permettront de modier leurs propriétés photophysiques. Dans ette thèse, nous her herons à

élu ider deux asparti uliers.

I.1 La famille des protéines uores entes

Lesprotéinesuores entessontunevastefamilledeprotéines.Lapremièreàavoirétédé ouverte

est la GFP (Green Fluores ent Protein) en 1962 dans la méduse Aequorea vi toria[1℄. Depuis,

de nombreuses autres l'ont été dans diérents organismes tel que des oraux[2 , 3, 4 ℄ ou des

anémones[5 ℄. L'isolement du gène odant pour la protéine de la GFP en 1992 par Prasher[6 ℄

ainsi que la répli ation de la protéine dans d'autres organismes vivants[7 ℄, ont montré que la

maturation de la protéinese fait sans ofa teur, que e soit son repliement, ou laformation de

son hromophore. Cet élément en faitunoutil de hoix pour les étudesin-vivo.

La première ristallisation de laGFP en 1974 par Morise et al[8 ℄ puisla résolution simultanée

desastru tureen1996par leséquipesdeYang[9 ℄ etOrmö[10 ℄ontpermisdemettreenéviden e

l'existen e d'un tonneau omposé de 11 brins

β

et une héli e

α

au entre de e tonneau. C'est

sur ette héli eque le hromophore est a ro hé. Dansla GFP,il est formé après lerepliement

en présen ed'oxygène àpartirdesrésidus Ser,Tyr, Gly.

(8)

héli e entrale qui porte le hromophore. En doré : revasse entre deux brins qui expose le

hromophoreau solvant.

D'apresCubittetal[11 ℄laformationdu hromophoredelaGFPsefaitselonlemé anismedé rit

(9)

-H

2 +H

-H

HO

O

N

H

O

Val68

HN

O

OH

N

H

Phe64

Ser65

Tyr66

Gly67

HO

O

N

O

Val68

HN

OH

N

H

Phe64

Ser65

Tyr66

Gly67

-H

2 O

HO

O

N

O

Val68

N

OH

N

H

Phe64

Ser65

Tyr66

Gly67

HO

O

N

O

Val68

N

OH

N

H

Phe64

Ser65

Tyr66

Gly67

-

_O

O

N

O

Val68

N

OH

N

H

Phe64

Ser65

Tyr66

Gly67

O

2

Fig. I.1.2 Cy lisation du hromophore dela GFP,d'aprèslemé anismeproposé par Cubit et

al[11 ℄.

Le hromophoreest omposédedeux y lesaromatiques,l'imidazolinoneetlephénol,reliésentre

euxparungroupementCH. Lapartie onjuguédu hromophoreestprésentéesurlagureI.1.3.

N

CA2

CB2

CG2

O-O

τ

HB2

ϕ

Fig. I.1.3 Partie onjuguéedu hromophoreresponsable delauores en e

Lestorsionsautourdesdeuxliaisonsquirelient les y les(lepont entrelesdeux y les)seront

nommées torsion

τ

s'il s'agit de l'angle de torsion entre les atomes CA2 etCB2 (nomen lature

surlagureI.1.3) et

ϕ

s'ils'agitdel'angledetorsionentrelesatomesCB2etCG2. Lestorsions

lelong de e pont jouent un rle lé danslespropriétés photophysiques du hromophore.

Dans les diérentes protéines de la famille, on trouve le hromophore dans deux états de

pro-tonation : une forme neutre, ave un proton sur l'oxygène du phénol et une forme déprotonée

anionique. Ces deux états de protonation ont des propriétés d'absorption diérentes. Sous sa

(10)

Le hromophore étant enfoui dans le tonneau

β

, il n'est pas en onta t dire t ave le solvant.

On peut néanmoins remarquer que fa e au hromophore, il y a une ouverture du tonneau

β

(représentéeendorésurlagureI.1.1).Cetteouverturequel'onretrouvedanstouteslesprotéines

uores entes est importante ar des molé ules d'eau du solvant peuvent s'introduire dans le

tonneau

β

à travers elle.

La mutagénèse dirigée appliquée à la GFP ou à d'autres protéines uores entes naturelles a permis d'agrandir la famille des protéines uores entes, et d'étendre la gamme des longueurs d'onded'émissionsurtoutlespe trevisibledel'infrarougeàl'ultraviolet.Cesmutationstou hent à lafoisle hromophore etlesrésidus pro hes.

Parmi ette famille, il existe des protéines dans lesquelles on peutfaire passer le hromophore

d'une forme a tive (uores ente) à une forme ina tive (non-uores ente) ou l'inverse, à l'aide

d'une ex itationà une longueur d'ondedonnée. Ces protéines sont dites photo-a tivables. Dans

ette thèse,nousétudierons l'une de esprotéines :Padron.

Uneautrevariétédeprotéineuores enteest elledesprotéinesphoto onvertibles.Dans es

der-nières, il estpossiblede hangerla ouleur d'émission du hromophoreà l'aided'une ex itation

de longueur d'onde diérente de ellede l'absorption induisant l'émissionde uores en e. Dans

le as de EosFP, le hromophore est omposé des résidus His62, Tyr63 et Gly64. Il absorbe et

émetinitialement danslevert[4 ℄.Uneirradiationdanslepro he ultraviolet entraine unerupture

deliaison peptidique entrele hromophoreetlerésiduPhe61 quilepré ède.Lesréarrangements

induitspar ette rupturede liaison onduisent à uneextension de lapartie aromatique du

hro-mophoreau y leimidazoledel'histidine62(premierrésiduqui omposele hromophore), equi

entraine un dé alage des longueursd'onde d'absorption et d'émission dansle rougede manière

irréversible.Dans ettethèse,nous étudieronslaforme verte deEosFP.

Les stru tures du hromophore dans ses formes verte et rouge sont représentées sur la gure

I.1.4.

N

C

O

N

C

O

Phe61

C

O

Asn65

O

-H

N

O

-O

N

NH2

C

O

Phe61

C

O

Asn63

H

Fig. I.1.4 S héma du hromophore dans ses formes verte (à gau he) et rouge (à droite). Les

hydrogènesont étéomispour plusde larté.

Le rle physiologique des protéines uores entes dans les organismes marins où elles sont

(11)

longueur d'onde[14,15 ,16℄, laphotoré eption[17℄ou en ore le amouage[18℄.

Les protéinesdéveloppéespar mutagénèsedirigée sont optimiséespour desappli ationsen

ima-gerie ellulaire. Les protéines photoa tivables sont parti ulièrement intéressantes pour le

déve-loppement de méthodesd'imagerie superrésolues.

I.2 Généralités sur la uores en e

Une molé ule peut absorber un photon pour passer de son état fondamental (

S

0

) à un état

ex ité (

S

1

). Cette transition est verti ale si elle se fait sans réarrangement de géométrie. La géométrie d'arrivée à l'état S

1

est appelée géométrie Fran k-Condon (FC). Une fois dans l'état ex ité, lamolé ule va ee tuer une relaxationvibrationnelle. C'est dans ette géométrie qu'elle

vapouvoirsubirune désex itationradiative,etdon retourneràl'étatfondamental enémettant

un photon. Un autre mé anisme possible est elui de la onversion interne (CI), si la molé ule

ex itée est dansune géométrie qui présenteun fort ouplage vibronique ave l'étatéle tronique

del'étatfondamental, e ouplagepermetàlamolé ulederetourneràl'étatfondamentalparune

transitionnonradiative.Cesdeuxphénomènessonten on urren e.LagureI.2.1représenteles

mé anismes quipermettentladésex itationdu hromophoreunefoisqu'ilaabsorbéunphoton.

La uores en e peut-être ara térisée par diérents paramètres : lalongueur d'onde d'émission

de uores en e, lerendement quantique de uores en e

φ

f luo

etla duréede vie de uores en e

τ

f luo

.

Leslongueursd'ondesd'absorptionetd'émissionsontinversementproportionnellesàladiéren e

d'énergie entre les états S

0

et S

1

. De plus, du fait de la relaxation vibrationnelle qui abaisse l'énergiede l'état S

1

,nousavons :

λ

absorption

< λ

´

emission

Le rendement quantique de uores en e

φ

f luo

est égal au rapport du nombre de photons émis

etdu nombredephotons absorbés.Le temps devie de uores en e,

τ

f luo

,est ladurée moyenne d'émission de uores en e. Les deux grandeurs dépendent de l'e a ité despro essus radiatifs

etnonradiatifs.Dansle assimple,oùàtoutinstantle hromophorepeutsedésex iterparl'une

des deux voies, ave des onstantes de vitesse de désex itation radiative (k

r

) et non radiative (k

nr

),on trouve danslalittérature[19℄que :

dS

₁

dt

= −(k

r

+ k

nr

)S

1

En intégrant ette équation surletemps, onobtient :

(12)

L'expression du rendement quantique(

φ

f luo

) estalors :

φ

f luo

=

k

r

(k

r

+ k

nr

)

et elledu temps devie de uores en e(

τ

f luo

), quise onfond alors ave letemps devie moyen de l'étatex ité est:

τ

_{f luo=}

1 k

r

+ k

nr

Dansle asdesprotéinesuores entes, le hromophorequ'ilsoitneutreouanioniqueadopteune

géométrie d'équilibre plane, dans laquelle les deux angles du pont (

ϕ

et

τ

) sont pro hes de 0

et les géométries présentant desvaleursimportantes de es angles sont défavorables[20,21 ,22 ℄.

Maisdansle asdu hromophoreanioniquedanssonétatex ité, en'estplusvrai.Lagéométrie

planedu hromophoreestunétatmétastableetontrouve 4minimasd'énergies,lo alisésen

τ

Don , suivant sagéométrie,le hromophore pourra soit subir une onversion radiative,soit une

onversion non radiative. On peut noter dèsà présent quel'on s'é arte alors du modèle simple

présenté i-dessus, où les deuxpro essussont supposés avoirlieu ave lamême vitesse,quelque

soit letemps, don quelquesoit lagéométrie.

Lesbarrières entrelagéométrie planeetlesgéométriestwistéessont trèsfaiblesdansle

hromo-phore anioniqueisolé, soumis à sesseules for esinternes, il va subir très viteune torsionqui va

l'amener aux géométriesnon uores entes etiln'est don pratiquement pasuores ent[23℄. Les

protéinessontuores entes arellesfournissentau hromophoreunenvironnementsusamment

rigide pour bloquer ou ralentir ses mouvements de torsion et le maintenir dans une géométrie

pro he dela géométrie planeoù ilpeutuores er.

Ainsi, la GFP sauvage possède unrendement quantiquede uores en e expérimental,

φ

f luo

,de 0.79[24 ℄, et une durée de vie de uores en e,

τ

f luo

,de 3.2ns[25 ℄. Si on dénature la protéine, le rendement quantiquede uores en e devient quasiment nul[26 ℄, etsa duréede vie est alors de

(13)

S

0

:étatfondamental

S

₁

:premierétat ex ité

FC :géométrie Fran k-Condon

I.3 Utilisation des protéines uores entes

La prin ipale utilisation des protéines uores entes est le marquage ellulaire. En introduisant

legène odantpourlaprotéineuores ente àlasuited'uneprotéinequel'onsouhaiteétudier, il

est possible de faire exprimerà un organisme une protéine himère, qui sera uores ente. Dans

le meilleur des as, ette protéine himère ne perdra pas son rle premier dans la ellule et la

protéine uores ente rajoutée à sa suite permettra de la lo aliser dans la ellule au ours du

temps.

Une autre utilisation possible des protéines uores entes est le Transfert d'Energie par

Réson-nan e detype Förster(FörsterResonnan eEnergy Transfer)[28 ℄,quiaétérendupossiblepar la

multipli ation desprotéines uores entes esdernières années. Pour l'utiliser, ilfaut avoir deux

protéines uores entes que nous nommerons A et B. Le spe tre d'absorption de la protéine B

doit re ouvrir au moins partiellement le spe tre d'émission de la protéine A, e qui limite le

hoixdesdeuxprotéines.Dans e as,silesprotéines Aet Bsont pro hesdansl'environnement

ellulaire, 'est-à-dire àune distan e inférieure à 10 nm et orre tement orientées([28℄, hapitre

9), uneex itation delaprotéine A onduit à untransfertd'énergie non radiatifvers laprotéine

(14)

sielles sontenintera tion danslemilieu ellulaire etégalementavoirun suivitemporel de ette

intera tion[29℄.

Lesprotéinesphotoa tivables sontdesoutilsparti ulièrement adaptésauxte hniquesd'imagerie

de très haute résolution, notamment à l'aide de la méthode RESOLFT[30℄ (REversible

Satu-rable Opti alLinearFluores en eTransitions).Cettete hnique onsisteàmarquer uneprotéine

d'intérêt à l'aided'une protéinephotoa tivable. Dansun se ondtemps, ons anne l'é hantillon,

de manièreàéteindre lauores en edetoutes les protéinesuores entes saufen unpoint eton

fait une a quisition d'images. On pro ède ainsi sur l'ensemble de l'é hantillon et on peut ainsi

obtenir une image dite superrésolue.

Les protéines photo onvertibles sont surtout utilisées pour analyser les diérents milieux

ellu-laires, notamment à travers les te hniques de FLIM[31 ℄ (Fluores en e-Lifetime Imaging

Mi ro-s opy)et de FRAP (Fluores en e Re overy After Photoblea hing). Dans es études,on irradie

les protéines pour les faire hanger de ouleur, et on étudie dans le as du FLIM l'extin tion

de uores en e après ex itation, etdansle as duFRAP[32℄ lafaçon dont évolue lafra tionde

protéine dont on ainduit laphoto onversion.

I.4 Les protéines étudiées

Dans ette étude, nous étudierons 2 protéines uores entes qui appartiennent à deux familles

diérentes :Padron, qui est une protéine photoa tivable, puis EosFP qui estune protéine

pho-to onvertible.

Padron :

LaprotéinePadron[33℄aétéobtenueparmutagénèseàpartirdelaprotéineDronpa[34 ℄,une

pro-téineuores ente issued'unevariétéde orailPe tiniidae.Ilyaentout10a idesaminésquiont

été rempla és : Thr59Met, Val60Ala, Asn94His, Ile100Ser, Pro141Arg, Gly155Ser, Val157Gly,

Met159Tyr, Phe190Ser, Lys222Asn. Seules les mutations Met159Tyr et Val157Gly sont

indis-pensables pour hanger les propriétés de uores en e de Padron, les autres ont été ee tuées

pour améliorerles propriétés de repliement etde stabilitéde Padron.Le hromophore desdeux

protéines estle même.Il estformé à partirdesrésidusCys62-Tyr63-Gly64.

Danssonétatnatif,Dronpaestuores ente(formeon),etuneirradiationintensedanssabande

d'absorption majoritaire la fait passer à un état non uores ent (forme o). L'irradiation la

faisant passer de sa forme on à sa forme o, on parle de protéine photoa tivable négative. A

l'inverse, Padron est non uores ente (état o) dans son état natif et quand on l'irradie elle

passe dansun étatuores ent (état on)[33 ℄. Onparle don deprotéine photoa tivable positive.

Les stru tures ristallographiques de Padron[3,35℄montrent quedansl'étaton le hromophore

esten onformation is etquedansl'étato ilesten onformationtrans.Lesformes is ettrans

(15)

N

O

-O

⇐⇒

N

O

-O

Fig. I.4.1 Chromophore de Padron, soussaforme anionique.Agau he en onformation is,à

droite en onformation trans. Les hydrogènes ont été omispour plus de larté. L'oxygène de la

is du

hromophore anionique a été ee tuée. Dans e adre, le travail mené au ours de ette thèse

avait pour obje tif d'étudier les probabilités de protonation du hromophore par transfert de

protonàpartirdespartenairesliésparliaisonhydrogèneau hromophoreàdiérentesétapesdu

pro essusd'isomérisation. Nousavonsdon étudié laprobabilité de etransfert pour diérentes

géométries du hromophore le long du pro essus d'isomérisation dans l'état fondamental. Les

résultatsde nosanalysessont dé rits danslapartie II.

EosFP

EosFPestuneprotéineissuedu orailLobophyllia hempri hii.Ellepossèdelamêmestru tureen

tonneau

β

quelesautres protéinesuores entes. Son hromophoreestforméàpartir desrésidus

His62, Tyr63 et Gly64. Dans ette forme, le hromophore absorbe des photons à la longueur

d'onde de 506 nm et ré-émet à la longueur d'onde de 516 nm, 'est-à-dire dans le vert, e qui

montre qu'il estsouslaforme anionique.

Le hromophore est également apable d'absorber des photons à 390 nm. L'absorption d'un

photon à ette longueur d'onde entraîne une série de réarrangement au sein de la protéine et

notamment la rupture du squelette peptidique entre le résidu Phe61 et le hromophore. Cette

rupture de liaison entraîne une réorganisation du hromophore etl'extension de la onjugaison

jusqu'àl'histidine dela hainelatérale.Dans ettenouvelle stru ture,le hromophoreabsorbe à

571 nm, etémet à581 nm, 'est-à-dire danslerouge.

Pour ette raison, la protéine EosFP est appelée une protéine photo- onvertible. Cette

pho-to onversion est un phénomène irréversible et son mé anisme exa t est toujours in onnu à e

(16)

N

C

O

N

C

O

Phe61

C

O

Asn65

O

-H

N

O

-O

N

NH2

C

O

Phe61

C

O

Asn63

H

Fig. I.4.2 S héma du hromophore dans sa forme verte (à gau he) et rouge (à droite). Les

hydrogènesont étéomispour plusde larté,sauf eluide l'histidine.

Dans sa forme verte, EosFP possède un rendement quantique de 0.7[4℄ et un temps de vie de

uores en e de 3.0 ns[36℄. Dans ette forme, le hromophore est in apable de s'isomériser et il

n'est don retrouvé quesoussa forme is,native. Dans saformerouge, lerendement quantique

est de0.55[4 ℄ etsontemps de viede uores en e de3.6 ns[36℄.

La protéineEosFP aété ristallisée sous formede tetramères. Elleest enregistréesoussaforme

verte, ave le hromophore anionique dans laPDB sous le ode 1ZUX. La stru ture des

mono-mèresvarie,notammentdufaitd'unemolé uled'eauprésenteoupasàproximitédu hromophore

et en liaison hydrogèneave l'oxygènede lamoitié imidazolinone.

Nous avons étudié deux aspe ts des propriétés photophysiques de EosFP dans sa forme verte.

D'une part, l'eet de la molé ule d'eau sur les spe tres d'absorption et sur la dynamique du

réseau de liaison hydrogèneau voisinage du hromophoreà l'étatfondamental.

D'autrepart,nousavonsanalyséladynamiquedu hromophoreàl'étatex itéquifaitapparaitre

plusieurs zones onformationnelles d'équilibre pour le hromophore. Leur prise en ompte est

indispensable pour reproduire orre tement le temps de vie de uores en e et le rendement

quantique.L'étude de EosFP estdé rite dansla partie III.

I.5 Appro he des propriétés photophysiques par simulation

Dans ette thèse,nousavonsee tué desdynamiques molé ulaires lassiquesde deuxprotéines

uores entes:PadronetEosFP.Cessimulationsmolé ulairessontbasées surleséquations dela

mé anique lassiqueenutilisant un hampdefor equipermetdereproduirelasurfa ed'énergie

potentielled'unemolé ule.Pourdé rireles propriétésdu hromophore, ilfaututiliserun hamp

de for e adapté à un état éle tronique donné, un état de protonation donné et à un isomère

donné.

A l'aide de es dynamiques, nous pouvons explorer les diérentes géométries que la protéine

(17)

impliquantdes hangementsd'étatséle troniques omme lauores en eetla onversioninterne

nidesruptures ouformations de liaison omme lestransferts de proton.

Ainsi,àl'aidededynamiquesmolé ulairesetde al ulsquantiques,nous her heronsàprédiresi

ertainesgéométriesadoptéesparle hromophoredelaprotéinePadron,liéparliaisonhydrogène

au résidu Tyr159 sont favorablesàun transfertde proton.

Dans le asde EosFP,nousanalyseronsladynamiquedu hromophore dansdeuxétats

éle tro-niques. A l'état fondamental, nous étudierons le réseau de liaison hydrogène, ainsi que le rle

d'unemolé ule d'eaupro he du hromophoresurles spe tresd'absorption.Dans l'étatS

1

,nous étudieronslestorsionsdu hromophoreetmettronsenpla edesmodèlesdeprédi tiondutemps

(18)

Transfert de proton dans Padron

II.1 Introdu tion

DanslaprotéinePadron,le hromophoreest présent dansdeux étatsdeprotonation :neutre ou

anionique etdansdeux onformations : is outrans.Ces deux onformationssont rappeléessur

lagure II.1.1.

N

C

N

C

OH

O

⇐⇒

N

C

N

O

OH

Fig. II.1.1 onformation is (à gau he) ettrans (à droite) dela partie onjuguée du

hromo-phore delaprotéine Padron.

Selon la onformation du hromophore, l'état de protonation dière. En onformation trans, le

spe tre d'absorption de la protéine montre que le hromophore est presque uniquement sous

sa forme anionique, alors que dans sa onformation is, il est retrouvé dans les deux états de

protonationdemanièreégale[3,35,37,38,39℄.Cetteétudenouspermettrad'avoirdesélémentsde

réponsesurle ara tèresimultanéousu essifdel'isomérisationtrans vers is etdu hangement

d'état de protonation.

Cettequestionadéjàreçudesréponsesdansle asdesprotéinesuores entesDronpa[40 ,41 ,42℄

etIrisFP[43 ℄.Ilaétémontréquedansunpremiertemps,ilyauneisomérisationphotoinduitepuis

unretouràl'étatfondamentaldansuneé helledetempsdel'ordredela entainedepi ose ondes.

(19)

de Aline Faro[37℄, proposeun modèle où l'isomérisation survient, puis dansun se ond temps le

hromophorearra he unproton àun résidu non déterminé.

Les stru tures ristallographiques de laprotéine Padron[3,44 ℄montrent que le hromophoreen

onformationtrans estenliaisonhydrogèneave unetyrosine(Tyr159),alorsquele hromophore

en onformation is estenliaisonave unesérine(Ser142).Desdynamiquesmolé ulairesréalisées

pré édemmentdanslegroupeontmontréesquedurantlepro essusd'isomérisationtrans vers is,

laliaisonentrele hromophoreetTyr159est onservée.Tyr159n'estrempla éeparSer142qu'une

fois en onformation is,au bout d'untemps del'ordre de lananose onde.De es observations,

nous avons déduit que Tyr159 était un donneurpotentiel de proton tout au long du pro essus

d'isomérisation etnousavonsétudié lapossibilitéd'avoir un transfertde proton depuis Tyr159

vers le hromophore au ours desdiérentes étapesde l'isomérisation. En parti ulier, lors de la

torsion du hromophoreautour desliaisons du pont du hromophore, lapartie phénolate

peut-être dé onjuguée du reste du hromophore. La apa ité à gagner ou perdre un proton devient

alors à priori similaire à elledu groupe phénol d'une tyrosine. La possibilité d'untransfert de

proton de la tyrosine vers le hromophore doit don être onsidérée dans les géométries planes

ainsique danslesgéométries twistées.

N3

C1

N2

CA2

C2

CB2

CG2

CD1

CE1

CZ

CE2

CD2

OH

-O

H

HD1

HE1

HD2

HE2

HB2

τ

ϕ

Fig. II.1.2 Chromophore anionique en onformation is etnomen lature

avons don é arté un transfert de proton vers le hromophore dans ette étape. Et nous avons

her hé à déterminer si le hromophore dans son état fondamental peut arra her le proton du

résidu Tyr159 avant qu'il ne soit rempla ée par le résidu Ser142, au début, au ours ou après

l'étape4.

Nousavonsdansunpremiertempsee tuédes al ulsdanslevide.Al'aided'unsystèmemodèle,

nous avons également évalué l'inuen e d'une molé ule d'eau spe tatri e sur un transfert de

protonentreundonneuretuna epteur.Enn,àl'aidedesimulationsdedynamiquemolé ulaire,

(21)

déprotonéauseindelaprotéinepourles hromophoresengéométrietwistéeen

τ

ouengéométrie

plane is ou trans.Lesrésultatssont dé rits danslasuite de e hapitre.

II.2 Energie du hromophoreneutreouanionique dansdiérentes

géométries dans le vide

II.2.1 Dénition de l'anité protonique

Pour déterminer si la tyrosine est un donneur potentiel de proton pour le hromophore, nous

avons omparé l'anitéprotoniquedu hromophoreetdelatyrosine.L'anité protonique,

E

AP

est dénie ommel'énergie produitepar laréa tion suivante:

A

−

+ H

+

→

AH

Don

E

AP

est dénie omme:

E

AP

= E

A

−

E

AH

Une anité protonique positive signie que l'espè eprotonée est plus stable que l'espè e

anio-nique. Contrairement aupK

a

,l'anité protonique estune propriété intrinsèque dela molé ule. Le signedeladiéren e d'anitéprotoniqueentredeuxmolé ulespermetde déterminerlesens

du possible transfert de proton. En omparant l'anité protonique du hromophore

E

AP

cro

à

elledelatyrosine

E

AP

tyr

,nouspourronsdon déterminersiuntransfertdeprotonestpossible.

Nouspouronségalement obtenirlavariationdel'anitéprotoniquedu hromophoreenfon tion

de sagéométrie.

Expérimentalement on ne onnait pas la valeur de l'anité protonique du hromophore. Pour

la déterminer, nous avons eu re ours à des al uls quantiques. Nous avons également alibré

l'in ertitude due à l'utilisation de al uls quantiques pour déterminer des anités protoniques

omparables aux donnéesexpérimentales.

Pour la tyrosine, nous avons estimé que l'anité protonique était identique à elle du phénol.

Expérimentalement, etteanité protonique estdéterminée à 347.5k al.mol

−

1

[46℄.

II.2.2 Anitéprotoniquedu hromophoredansdiérentesgéométries.Choix

de la méthode de al ul.

Les al ulsquantiquesont étéréalisésàl'aidedulogi ielGaussian09[47 ℄enutilisant laméthode

(22)

fuses.Les al uls quenousavonsréalisésimpliquent destorsions du hromophore. Ordansune

géométrie perpendi ulaire, la onjugaison entre les deux y les disparaît. Pour dé rire

orre -tement la stru ture éle tronique, il faut normalement re ourir à un al ul de type CAS-SCF

(CompletA tiveState,SelfConsistentField)[50 ℄ omplétéparun al uldeperturbationdetype

MP2. Ces al uls sont longs et oûteux. Nousavons réalisé des al uls R(Restri ted)B3LYP et

U(Unrestri ted)B3LYP et nous avons omparé les résultats de es deux modes de al ul, an

d'évaluer leproblème de des ription de géométries autour d'uneliaison

π

partielle. Dans le as

du hromophore, les torsions lelongdu pontentre lesdeux y lesaromatiques sont desliaisons

π

partielles, etle ara tère multi-déterminant n'est pasné essairement présent tout lelong des torsions.

La diéren e entre les méthodes RB3LYP etUB3LYP vient de la manière dont est al ulée la

sommedesdensités.DanslaméthodeRB3LYP,lasommedesdensitésdeprobabilitédeprésen e

des éle trons

α

et

β

estreprésentée par un seul terme, alors que dansla méthode UB3LYP,les

éle trons de spin

α

et

β

possèdent ha un leurterme dedensitépropre.

Au voisinage de 90°, la fon tion d'onde n'est pas orre tement dé rite par un déterminant de

Slater ou hefermée.Ilfautenprin ipeutiliseruneméthodemulti ongurationnelle pourdé rire

orre tement la stru ture éle tronique twistée. La méthode UB3LYP dé rit une onguration

singulet ou he ouverte quipermetde s'appro herde labonne des riptionénergétique.

Nous avons optimisé les géométries de la forme neutre et de la forme anionique pour haque

angle. Lors des torsions

ϕ

=

90° -645.278 -645.278 -645.767 -645.785

85° -645.283 -645.283 -645.837 -645.837

ϕ

=

90° -645.282 -645.282 -645.837 -645.837

Tab. II.1 Comparaison des énergies (en hartree) du hromophore le long des torsions

τ

(en

haut) et

ϕ

(enbas) sous ses formes anionique etneutre, à l'aide desfon tionnelles RB3LYP et

UB3LYP etdelabase 6-31+G(d).

Onvoit quedansle asdu hromophoreanionique,les méthodesUB3LYPet RB3LYPdonnent

les mêmes résultats. Il en est de même pour le hromophore neutre dans le as des torsions

ϕ

.

Par ontre, lesénergiesdu hromophoreneutre al ulées lelongde latorsion

τ

dièrent àpartir

de

τ

=45°.Nousavonsreprésentélesénergiesdu hromophoreneutre etanionique lelongdela

torsion

τ

surlagure II.2.1.

0

30

60

90

0

10

20

30

40

50

60 Variation d’énergie (en kcal.mol

-1

)

angle

τ

(en degrés)

Fig.II.2.1Variationdel'énergieenk al.mol

−

1

du hromophoreenfon tiondelatorsion

τ

(en

degrés). L'angle

ϕ

vaut 0°.Ennoir : hromophore anioniqueen UB3LYPetRB3LYP.En bleu:

hromophore neutre,en UB3LYP.En rouge : hromophore neutre en RB3LYP. Lesénergies de

référen es sont ellesdes hromophore trans optimisés (

τ

=

0°,

ϕ

=0°).

(24)

défavo-rable de 52 k al.mol

−

1

En utilisant la méthode UB3LYP, l'augmentation de l'énergie est de

41 k al.mol

−

1

.En utilisant laméthode UB3LYP,on trouve don une stru ture twistée à

τ

=90°

plus stable de 11 k al.mol

−

1

. Deplus, laméthode RB3LYP montre une progression linéaire de

l'énergie potentielle entre 60° et 90°. Ce itraduit une mauvaise représentation de l'énergie par

le al ulRB3LYP, arun al ulave un angleplusimportantque 90°ferait apparaitreun point

anguleux sur lavariation de l'énergie. Ce point anguleuxà 90°mettrait en éviden e l'existen e

d'un roisement entre étatsdégénérés, e qui n'est pasle as arle roisement est évité.

L'é art entre les méthodes RB3LYP et UB3LYP est une manifestation de l'impossibilité de

représenterlastru ture éle tronique par unseul déterminant.

Dans le as du neutre labarrière

τ

26 abs

Tab.II.2Comparaisondesbarrières(enk al.mol

−

1

)destorsions

τ

et

ϕ

du hromophoreneutre etanionique entrelalittérature etnos al ulsen UB3LYP/6-31+G(d)

(25)

hromophoreont étéee tués surdesgéométriestwistées optimiséespour l'étatS

0

.Dans le as des études de Polyakov et al[21 ℄ et de Olsen et al[53 ℄, les géométries twistées ont été al ulées surdesgéométriesoptimiséespourl'étatS

1

.Enndans elledeTonioloetal[22℄,tousles al uls du hromophore ontété ee tuéssur desgéométriesoptimisées pourl'état S

1

.

La omparaison quantitative entre nos résultatset eux de la littérature est don di ile. Par

ontre, on vérie que dans toutes les études itées, on retrouve les tendan es trouvées dans

e travail : les barrières

τ

sont plus grandes que les barrières

ϕ

. De plus, la barrière en

τ

du

hromophoreneutre est plusgrandeque elledu hromophoreanionique.

Au vue de es résultats, nous avons dé idé de retenir la méthode UB3LYP pour al uler les

anités protoniques. An de orriger le manque de orrélation éle tronique,nousavons alibré

les erreurs en utilisant un jeu de données pour lequel les valeurs expérimentales de l'anité

protonique sont onnues.

II.2.3 Corre tion des anités protoniques al ulées

Pour alibrer les erreurs induites par l'utilisation de al uls quantiques ave la méthode de la

DFT, nous avons utilisé un jeu de données de omposés pour lesquels les anités protoniques

expérimentales, E

AP

exp

sont onnues. Ce jeu est omposé de deux types de molé ules : d'une

part desphénols substituésetd'autre partdesa ides benzoïques substitués. Ces deuxtypesde

omposéssontreprésentésdansletableauII.3.Lalistedes omposésetlesvaleursexpérimentales

et al uléesd'anitéprotoniquesontdonnéesdanslestableauxII.4(pourlesdérivésduphénol)

etII.5(pour les dérivésde l'a ide benzoïque).

omposédetype phénol

omposéde typea ide

benzoïque

Tab. II.3 Stru ture des deux types de omposés utilisés pour estimer l'erreur sur les valeurs

E

AP

al ulées.les sitessubstituéssont eux nomméssur lesgures.

Les al ulsd'anité protoniquedujeude omposésont étéee tués enRB3LYP.Deplus,dans

ette étude, nous avons hoisi de omparer deux bases : la base 6-31G+(d), qui ontient des

orbitales diuses, et la base 6-31G(d), qui n'en ontient pas, de manière à déterminer l'eet

3 )

3

363.1 351.0 348.5[46 ℄ 8

N

(CH

3 )

2

364.0 351.6 351.3[46 ℄

Tab. II.4 Comparaison des anités protoniques (k al.mol

−

1

) al ulées et les valeurs

3

357.4 344.3 341.1[55 ℄ 9 méta

OH

356.6 342.8 339.0[55 ℄ 10 para

OH

357.9 344.0 336.1[55 ℄ 11 a ideni otinique 351.5 337.9 333.7[55 ℄ 12 parani otinique 349.1 335.5 333.0[55 ℄ 13 ortho

OCOCH

3

349.3 332.9 336.1[55 ℄ 14 méta

OCOCH

3

353.8 338.3 334.7[55 ℄ 15 para

OCOCH

3

350.4 337.4 335.2[55 ℄ 16 a ide 1-naphtoïque 347.0 341.2 337.1[55 ℄ 17 a ide 2-naphtoïque 354.1 341.0 338.0[55 ℄

Tab. II.5 Comparaison des anités protoniques (k al.mol

−

1

) al ulées et les valeurs

expéri-mentalespour les omposés dérivésde l'a ide benzoïque.

diusesdansle hoixdelabase.Sonénergieestdon plussurrestiméeque elledel'espè eneutre

lorsque es orbitales sont absentes. Nous avonsdon hoisi de ne retenirque les al uls réalisés

ave labase 6-31+G(d). De plus, les énergies al ulées à l'aide de la base6-31+G(d) sont plus

pro hesdesanités protoniquesexpérimentales.

En omparant les valeurs al ulées aux valeurs expérimentales, on onstate que la diéren e

E

AP

calc

- E

AP

exp

est généralement supérieure à 0 sauf pour le as du omposé numéro 13 des

a ides benzoïques.

Pour ompléter notreétude, nousavonsdéterminé l'énergiedepoint zéro(ZPE pour ZeroPoint

Energy) du hromophore et du phénol et d'un omposé de haque type (un pour les phénols

substituésetunpourlesa idesbenzoïquessubstitués)pourévaluerl'importan edelaZPEdans

le al ul del'anité protonique.

Les ZPE al ulées sont regroupées dansletableau II.6.

ZPE

∆E

ZP E

=

ZP E

anion

−

ZP E

neutre

hromophore is,anionique 95.8

-8.5

hromophore is,neutre 104.3

hromophore trans,anionique 95.8

-8.6

hromophoretrans,neutre 104.4

phénolate 56.8 -8.8 phénol 65.6 dérivé phénolate 2 81.1 -8.7 dérivéphenol 2 89.8 dérivé dubenzoate 4 74.3 -8.5

dérivé de l'a idebenzoïque4 82.8

Tab.II.6 Valeurs desZPEetdiéren esde ZPE (k al.mol

−

1

)dans l'anitéprotonique.

Premièrement, on peut voir dans le tableau II.6 que la ZPE des espè es neutres est toujours

plus importante,du faitde l'atome supplémentaire, e quiinduit une vibration supplémentaire.

De plus, on voit que l'eet de la ZPE surl'anité protonique des 5 omposés présents dans e

tableau varie entre -8.8 k al.mol

−

1

et-8.5 k al.mol

−

1

.Cette variation de 0.3 k al.mol

−

1

esttrès

faible par rapportaux variations desanités protoniques al ulées. Nousavonsdon onsidéré

(28)

entre

E

AP

calc

obtenue ave la base 6-31+G(d) et

E

AP

exp

de nos omposés substitués. Elle est

représentéesurlagureII.2.2.

320

325

330

335

340

345

350

355 E

_AP

calc

(kcal.mol

-1

)

320

325

330

335

340

345

350

355 E

AP

Exp

(kcal.mol

-1

)

13

11

12

5

6

14

16

17

10

5

7

1

7

8

4 1 3

4

8

2

6

9

2

3

15

Fig.II.2.2Droitederégression al uléeentre lesvaleurs

E

AP

calc

et

E

AP

exp

.Envioletpointillé: droite x=y.Enbleu:droite derégression. Entirets noir:droite derégression

±

é art-type.

×

: point orrespondant auxphénols,

×

:points orrespondant auxa ides benzoiques.Lesnuméros indiqués sont eux utilisésdans letableau II.4pour lesphénols, et dansle tableauII.5pour les

a ides benzoïques.

La droite x=y(enpointilléviolet)représente ladroite quenoustrouverionssinos al uls

prédi-saient une anitéprotonique exa te.

Ainsi,nouspouvonsobtenirdesvaleurs orrigéesdel'anitéprotoniquedu hromophoredansses

diérentesgéométriesàpartirdesvaleurs al uléesave laméthodedelaDFT/UB3LYPenbase

6-31+G(d). Ladroitederégressionfournitune orre tionsystématique,liée auxapproximations

etau hoixduniveaude al uldelavaleurE

AP

calc

.Ellenousdonneainsiunemeilleureestimation

de

E

AP

exp

.

II.2.4 Anité protonique du hromophore dans ses diérentes géométries.

Pourdéterminerl'anitéprotoniquedu hromophorelelongdesdeuxtorsions,nousavonsutilisé

des al uls à l'aidede laméthode UB3LYP,ave une base6-31+G(d) qui ontient desorbitales

diuses.Puisnousavons al uléla orre tion à apporter ànos al uls,ainsiquel'in ertitudeen

(29)

métrietrans.L'anité protonique al uléedu hromophoreestde329.9k al.mol

−

1

.Enutilisant

la droite de régression pour le hromophore trans, nous obtenons une valeur orrigée égale à

328.5 k al.mol

−

1

.

320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335

320

321

322

323

324

325

326

327

328

329

330

331

332

333

334

335 E

AP

exp

(kcal.mol

-1

)

E

_AP

calc

(kcal.mol

-1

)

Fig. II.2.3 Interpolationd'anité protonique du hromophore dansle asde la onformation

trans.Enrose:valeur al ulée.Envert:in ertitudehauteetbasse.Enbleu:droitederégression.

Tirets noir :droite derégression

±

é art-type.

En prenant omme in ertitude l'é art-type de la droite de régression nous obtenons ainsi une

anitéprotonique du hromophore trans égaleà 328.5

±

2.1k al.mol

−

1

.L'anité protonique du

hromophoreen onformation isdéterminée de lamêmefaçon estde 329.9

±

2.1k al.mol

−

1

.Le

hromophore ispossèdedon uneanitéprotoniqueunpeuplusimportantequele hromophore

trans.Néanmoins,ladiéren eestdel'ordre del'in ertitudededétermination quemontrenotre

méthode.

A noter que dans notre jeu de omposés utilisé pour alibrer l'erreur, la plus basse anité

protonique al ulée est de 332.6k al.mol

−

1

pour le omposé 5 desphénols (numérotation selon

le tableau II.4) et de 332.9 k al.mol

−

1

pour le omposé 13 des dérivés de l'a ide benzoïque

(numérotation selon letableau II.5). Lesvaleursdu hromophoreplan sont don légèrement en

dehors dujeu de omposés.

Lesvaleursdesanitésprotoniquesdu hromophorelelongdelatorsion

τ

déterminéesàpartir

de nos al uls et orrigées par notre droite de régression sont données dansle tableau II.2.4 et

(30)

E

AP

calc

Base6-31+G(d)

±

2.1

Fig.II.2.4Evolutiondel'anitéprotoniquedu hromophore(k al.mol

−

1

)lelongdelatorsion

τ

.(

ϕ

=0°)

E

AP

calc

Base 6-31+G(d)

±

2.1

Fig.II.2.5Evolutiondel'anitéprotoniquedu hromophoreenk al.mol

−

1

lelongdelatorsion

ϕ

.(

τ

=

0°)

Les valeurs orrigées de l'anitéprotonique,E

AP

,lelongdes deuxtorsions sont présentées sur lagure II.2.6.

(31)

0

30

60

90

120

150

180 Angle (en degrés)

315

320

325

330

335

340

345

350 E

AP

calc

E

_AP

exp

phénol

Fig. II.2.6 Valeurs de l'anité protonique du hromophore orrigées par notre régression.

En noir : valeur de l'anité protonique le long de la torsion

ϕ

. En rouge : valeur de l'anité protonique lelongde latorsion

τ

.Envert :Anité protonique expérimentale du phénol.

Pour rappel, l'anité protonique expérimentale du phénol est de 347.5 k al.mol

−

1

.Les valeurs

d'

E

AP

déterminées pré édement sont de 329.9

±

2.1 k al.mol

−

1

pour le hromophore is et

de 328.5

±2.1

k al.mol

peutvoir que latorsion

τ

montrequele transfert

de proton est alors en ore plus défavorable que dans les géométries planes. Au ontraire, lors

d'une torsion

ϕ

, la diéren e d'anité protonique du hromophore se rappro he de elle du

phénol, rendant un transfertde proton envisageable.

Les variations de l'anité protonique au ours des torsions s'expliquent par les ruptures de

onjugaison quisont diérentes entre les deuxtorsions.

On peutvoir surla gure II.2.1 que l'eet d'un twist

τ

jusqu'à 90° est plus déstabilisant pour

la forme neutre (40 k al.mol

−

1

) que pour la forme anionique (30 k al.mol

−

1

). Ce i s'explique

par desréorganisationsdiérentesdela onjugaison. S hématiquement,à l'aidede stru turesde

Lewis, on peut voir que la torsion

τ

né essite de asser la double liaison entre l'imidazolinone

et le pont, e qui déstabilise la forme neutre. Dans le as du hromophore anionique, ette

augmentationd'énergie estlimitéeparl'apparitiond'uneformerésonantedetypesemi-quinone,

représentéesurlagureII.2.7.Cetterésonan estabiliselaformeanionique du hromophorelors

(32)

N3

C1

N2

CA2

C2

CB2

CG2

CD1

CE1

CZ

CE2

CD2

O

-O

H

HD1

HE1

HD2

HE2

HB2

τ=

90°

ϕ

↔

C1

H

HD1

HE1

N3

C1

N2

CA2

C2

CB2

CG2

CD1

CE1

CZ

CE2

CD2

O

H

HD1

HE1

HD2

HE2

HB2

τ=

90°

ϕ

H

Fig. II.2.7 En haut :stru turesrésonnantes de laforme anionique du hromophore. En bas:

stru ture de Lewisprépondérante du hromophoreneutre.

Au ontraire,lorsd'untwist

ϕ

,larupturede onjugaisonintervientlelongdelaliaisonCB2-CG2.

Dans ette géométrie, la harge négative est répartie uniquement sur le phénolate du

hromo-phore, e qui est déstabilisant. De e fait, l'anité protonique du hromophore serappro he de

elledu phénol.

L'isomérisation du hromophore passe par une torsion

τ

. De e fait, durant l'isomérisation le

transfert deproton depuisle groupement phénold'unrésidu tyrosine verslephénolate du

hro-mophore est en oreplus défavorable quedansles géométriesplanes.

II.2.5 Con lusion

Dans ette partie, nous avons déterminé que l'anité protonique du hromophore plan vaut

329.9

±

2.1 k al.mol

−

1

pour le hromophore is et 328.5

±

2.1 k al.mol

−

1

pour le hromophore

trans,alorsque elleduphénolvaut347.5k al.mol

−

1

.Danssa onformationtwistéeen

τ

,l'anité

protonique du hromophore diminue à317.8 k al.mol

−

1

,alors quedansla onformation twistée

1

,

rendant plusprobable untransfert deproton.

Par ontre, au ours d'une torsion

τ

, la diéren e d'anité protonique entre le phénol et le

hromophore est plus importante que dans les onformations planes : elle est de l'ordre de

30 k al.mol

−

1

pour unetorsion

τ

de 90°.

Pour rappel, l'isomérisation du hromophore se déroule en 4 temps. Nous avons déjà é arté un

(33)

nousé artonsun transfertde protondepuisTyr159 vers le hromophore quisedéroulerait dans

la dernière étape de l'isomérisation, quand le hromophore est à l'état fondamental dans une

géométrie twistée en

τ

.

Tous es al uls ont été ee tués dans le vide, et pour des géométries optimisées du

hromo-phore. Ordu faitde l'environnement, lagéométrie d'équilibre ne représente pasl'ensemble des

géométriesadoptées parlesdeuxpartenaires.Deplus,l'environnement delaprotéinepeutjouer

un rlede dé len heur, notamment à traversles liaisonshydrogènes.

II.3 Transfert de proton entre le hromophore et la tyrosine dans

le vide

Dans ettepartie,nousdéterminonsl'énergiedu ouple( hromophore, tyrosine),lesdeux

parte-nairesétant onsidérés sansintera tionentreeux,dansdeuxétats deprotonation: hromophore

anionique, tyrosine neutre (que nous noterons Cro

−

- TyrH) et hromophore neutre, tyrosine

anionique (CroH - Tyr

−

). Nous onsidérons diérentes valeurs des angles

ϕ

et

τ

du

hromo-phore. Pour ha un des deux états de protonation du ouple, nous al ulons son énergie non

seulement dans sa géométrie d'équilibre propre, mais également dans la géométrie d'équilibre

qu'il adopte dans l'autre état de protonation, e i dansle but de pouvoir al uler desénergies

de transfert deproton ave ou sansrelaxation degéométrie au ours dutransfert.

Pour symboliser lagéométrie dans laquelle se trouve le ouple, nous noterons en indi e C

−

-TyrH)

CHT

−

-L'énergiedeCroH-Tyr

−

danslagéométrieoptimiséedeCroH-Tyr

−

,notée(CroH-Tyr

−

)

CHT

(34)

∆

E=(E

CroH

+E

T yr

−

) - (E

Cro

−

+E

T yrH

)

Cette diéren ed'énergie peutêtre al ulée dedeux façonsdiérentes :

- Soit en supposant un transfert verti al :letransfert est très rapide etlagéométrie des deux

−

T H

- Soit en supposant un transfert adiabatique : le transfert est a ompagné de l'adaptation

de lagéométrie de haquepartenaire à sonnouvelétat deprotonation (

∆

E

adiab

C

−

τ

et

ϕ

et selon leur géométrie C

−

TH ou CHT

−

. L'énergie de l'état le plus bas

(Cro

−

- TyrH)

cis, C

−

T H

est prise ommeréféren e.

Le tableau II.7fait apparaîtreplusieurs pointsimportants.

Premièrement, en partant du ouple (Cro

−

- TyrH) dans sa géométrie is optimisée (ligne 1)

pour diérentestorsions du hromophored'amplitude45°, letransfert sansrelaxation(transfert

verti al) desdeux partenaires onduit à lagéométrie (Cro

−

- TyrH)

CHT

−

.Ce transfert mène à une augmentation del'énergiede40k al.mol

−

1

pour le hromophoreplan,34k al.mol

−

1

lorsde

latorsion

ϕ

et44k al.mol