Correction juin 2010
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître l'évolution de la mitochondrie et un peu de biologie de la levure.
- Pour montrer que l'expression de la protéine cox2 à partir d'un gène localisé dans le noyau ne complémente pas le défaut de croissance d'une souche délétée pour le gène cox2 (qui chez la levure Saccharomyces cerevisiae se trouve uniquement dans la
mitochondrie), il faut construire in vitro un gène chimère constitué d'un promoteur qui fonctionne dans le noyau suivi d'une fusion traductionnelle d'une séquence MTS en NH2 terminale et de la séquence codante de cox2 en C-terminal (corrigée pour le code génétique), puis d'un terminateur de transcription. Ce gène sera cloné sur un vecteur intégratif portant un marqueur permettant la sélection de transformants. Le plasmide est ensuite introduit dans la levure par transformation, ce qui conduit à l'intégration du gène chimère dans génome nucléaire. Note: des souches délétées pour cox2 obtenues par mutagenèse classique sont disponibles depuis longtemps. La description de la construction d'une souche mutante pour cox2 apportait des points bonus. (2 points + 2 points bonus si un protocole juste d'obtention d'une souche cox2 était décrit)
- L'expression de la protéine ainsi produite peut être suivie par Western Blot sur extrait total de protéines des souches transformées en utilisant des anticorps spécifiques de cox2. (2 points)
- La mutagenèse sur le gène chimère peut se faire in vivo ou in vitro. In vivo, la souche est soumise à un agent mutagène (U.V. ou agent chimique type E.M.S.) et les souches poussant rapidememnt sont sélectionnées. In vitro, il est possible d'amplifier le plasmide portant le gène chimère par PCR en utilisant des conditions qui conduisent à l'insertion de nucléotides non-cognate (en utilisant une Taq polymérase peu fidèle par exemple). Le mélange est ensuite introduit par transformation dans une souche délétée du gène cox2 et les transformants poussant rapidement sont sélectionnés. Pour identifier la mutation W56R, l'ADN du gène cox2 est amplifiée avec des amorces spécifiques et en utilisant
l'ADN des souches à croissance rapide comme matrice. Le produit PCR est ensuite séquencé par la méthode de Sanger. (2 points pour l'une ou l'autre des méthodes)
- Pour montrer l'expression d'une protéine de taille compatible avec le clivage de la MTS, il suffit de faire un Western Blot en utilisant un anticorps anticox2 et en estimant la taille de la protéine révélée grâce à un marqueur de poids moléculaire. (1 point)
- Pour montrer la restauration de la croissance sur milieu glycérol (source de carbone qui ne fournit de l'énergie que par la respiration), il suffit de faire croître les levures sur du milieu ne contenant que du glycerol comme source de carbone (et une source d'azote et de sels minéraux!). (1 point)
- Pour mesurer la capacité à respirer, il suffit de mesurer la disparition de l'oxygène (par une mesure à l'oxygraphe par exemple) lorsque des levures sont mises à croitre dans une enceinte fermée. (1 point)
- Pour montrer que la séquence codante de l'allèle mutant cox2W56R fusionnée avec les MTS des protéines mitochondriales hydrophobes OXA1 et SU9 permet l'acquisition des trois caractéristiques, il fallait construire deux nouveaux gènes chimères identiques à celui de la première question en remplaçant la MTS par celle des gènes OXA1 ou SU9.
Les mêmes expériences que ci-dessus sont ensuite réalisées sur les transformants obtenus après introduction de ces gènes dans la levure. (2 points)
- Pour montrer que ce n'est pas le cas avec (1) l'absence de MTS, (2) la fusion avec la MTS de la protéine mitochondriale hydrophile Cox4, (3) l'adjonction de la séquence 3' non traduite (3'-UTR) du gène ATP2, il fallait faire 3 constructions, toujours dérivées du plasmide de la question 1: dans le cas (1), il fallait supprimer la MTS, dans le cas (2) remplacer la MTS par celle de cox4 et dans le cas (3) ajouter après le codon stop de cox2 la séquence 3'UTR du gène ATP2. Les constructions sont ensuite analysées comme précédemment (1 point par construction)
L'ensemble de ces expériences montrent donc que la protéine cox2 peut être codée dans le noyau et importée dans la mitochondrie chez S. cerevisiae, moyennant quelques prérequis!
Que pouvait-on conclure de ces expériences:
- La relocalisation d'un gène mitochondrial dans le noyau nécessite le transfert de l'ADN mitochondrial vers le noyau et la "capture" d'une séquence d'adressage MTS. Le transfert est en fait assez fréquent, (cf. cours sur l'évolution de la mitochondrie). Les séquences MTS ont des caractéristiques assez lâches: il faut un profil d'hydrophobicité adéquat avec peu de contrainte sur la séquence. La conjonction de ces deux phénomènes ne doit pas être très rare. Ceci explique que de nombreux gènes mitochondriaux ont pu être relocalisés au cours du temps dans le noyau. Dans le cas du gène cox2, la situation semble plus complexe car outre ces deux caractéristiques, il y a deux contraintes supplémentaires: il faut une séquence précise du premier segment transmembranaire (seul la protéine codée par l'allèle cox2W56R peut être importée correctement) et une séquence MTS particulière (seule les séquences des protéines hydrophobes marchent).
Cette association de contrainte doit être exceptionnelle, expliquant donc que cox2 a été transféré plus rarement dans le noyau, d'où le fait que certains organismes l'ont toujours dans leur mitochondrie comme la levure. (3 points)
- Il semble donc que la mitochondrie ne soit pas encore complètement intégrée à la cellule chez tous les organismes! Ce phénomène poursuit donc son évolution encore actuellement. Il semble que l'aboutissement ultime de l'intégration est atteint lorsqu'il ne reste que les deux ARN ribosomaux et les gènes cox1, cox3 et cob, comme chez les apicomplexa. En effet, l'étape suivante est la perte totale de l'ADN mitochondrial associé à un déficit respiratoire. (3 points)
