Dessalage par dialyse
L'utilisation de membranes semi-perméables qui autorisent la diffusion des petites molécules (ions minéraux, oses, diholosides, aminoacides ...) et pas celle des macromolécules comme les protéines permet de réaliser simplement des dessalages de solutions protéiques. La chromatographie d'exclusion- diffusion est évidemment une alternative souvent préférée ...
On se propose de mesurer la cinétique de dessalage d'une solution d'albumine bovine et de sulfate d'ammonium par dialyse.
Le montage expérimental est le suivant :
• Un boudin de dialyse sera chargé avec 10,00 mL de solution protéique à dessaler.
• Le boudin sera immergé dans un Bêcher contenant exactement 150 mL d'eau sous agitation par un barreau aimanté tournant. On déclenchera alors un chronomètre.
On demande de :
– Suivre l'évolution de la concentration en sulfate d'ammonium et en protéines à l'extérieur du boudin de dialyse (dans le Bêcher) pendant 2 heures.
– Vérifier la concentration en protéines et en ammonium de la solution à dessaler au départ (attendue à 50 g/L en protéines et 0,3 mol/L en sulfate d'ammonium).
– Mesurer la concentration en protéines de la solution à dessaler dans le boudin de dialyse en fin de manipulation.
– Évaluer le volume de solution protéique dans le boudin de dialyse en fin de manipulation.
Modes opératoires pour le suivi de la dialyse Mesures de volumes
Évaluer le volume du boudin de dialyse en fin de manipulation. Pour cela transférer la totalité de son contenu, en fin de manipulation, dans une éprouvette graduée.
Dosage des protéines
Utiliser la méthode du biuret. Adapter le protocole standard fourni à la manipulation de dessalage.
Travailler en microméthode en microplaques 96 puits à fond plat avec lecture au lecteur de microplaques.
On mesurera les concentrations en protéines suivantes : dans la solution à dessaler de départ (attendue vers 50 g/L) , dans le dialysât en fin de manipulation (attendue nulle) , dans le boudin de dialyse en fin de manipulation (attendue légèrement inférieure à 50 g/L).
Dosage du sulfate d'ammonium
On mettra en œuvre une réaction de Nessler: l'ammoniaque réagit en milieu alcalin avec l'iodomercurate (II) de potassium pour former un complexe rouge-orangé. La formation du complexe n'est pas instantanée et il se présente sous une forme colloïdale qui flocule peu à peu. Les lectures photométriques doivent être réalisées à des temps très précis d'incubation.
La composition d'une cuve de mesure est la suivante :
• Échantillon à doser (ou l'étalon) qsp 1000 µL ;
• 800 µLde NaOH à 0,5 mol/L;
• 500 µL de réactif de Nessler.
On lit chaque cuve après une incubation précise comprise entre 10 et 15 minutes, à 430 nm. (sur 5 minutes entre 10 et 15 minutes, les absorbances augmentent d'environ 10%). Il faut donc absolument minuter les pipetages et les temps d'incubation avant lecture !!!
On étalonne la méthode pour des mesures d'ammonium s'étalant de 0,10 à 0,50 µmole par cuve. On dispose de sulfate d'ammonium pur pour réaliser une solution étalon (NH4)2SO4 : ...g/mol, il y a deux NH4+ par molécule du sel solide pur).
On mesurera les échantillons suivants: dans la solution à dessaler de départ (attendue vers 0,3 mol/L) , dans le boudin de dialyse en fin de manipulation (valeur théorique au temps infini à calculer) dans dialysât aux temps 5, 10, 20, 30, 45, 60, 80, 100, 120 minutes (on mettra en œuvre des prises d'essai de 10µL).
Fanny Demay – BTS BioAnalyses & Contrôles 1/2
Compte rendu
Compte rendu exact des manipulations réalisées et des résultats obtenus. Tracé de la cinétique de diffusion de l'ion ammonium. Comparer la résultat expérimental final obtenu avec la résultat théorique à l'équilibre. Discuter quantitativement l'effet de l'osmose au cours de la manipulation.
Dosage des protéines par la méthode dite du biuret 1. Principe
Pour toute chaîne polypeptidiques contenant au moins 2 liaisons peptidiques, les liaisons peptidiques forment, en milieu très alcalin, un complexe coloré avec les ions Cu2+. Si on met en œuvre un réactif standardisé, en excès, on peut ainsi doser les protéines par colorimétrie à 540 nm.
Le réactif standardisé utilisé est appelé réactif de Gornall (sa concentration en Cu2+, en OH- est standardisée, il contient du Kl).
La molécule de biuret donne la même réaction que les liaisons peptidiques avec les ions Cu2+ c'est pourquoi la méthode a été appelée méthode du biuret.
2. Qualités de la méthode
Le réactif solubilise des protéines précipitées que l'on voudrait éventuellement doser...
Méthode de mise en œuvre très simple et très peu onéreuse.
La méthode possède une sensibilité qui n'est quasiment pas influencée par la nature (composition en aminoacides) des protéines à doser ce qui n'est pas le cas pour la quasi totalité des autres méthodes de dosage des protéines.
La méthode est malheureusement peu sensible. Elle n'est applicable qu'à des milieux très concentrés en protéines. C'est justement le cas du plasma sanguin ! D'où son utilisation en analyses médicales.
De nombreuses substances portant des fonctions aminés ou amides interfèrent avec la réaction d dosage (voir la littérature spécialisée). Cependant les interférants sériques sont négligeables, d'où l'utilisation possible en analyses médicales.
3. Protocole type
Les dilutions sont réalisées en NaCI à 9 g/L.
Le protocole type est le suivant :
- Échantillon à doser ou étalon qsp 1 mL avec une solution de NaCI à 9 g/L. 0,8 à 10 mg de protéines par tube.
- réactif de Gornall 4 mL ;
- homogénéiser, attendre 30 minutes à l'obscurité et lire au spectrophotomètre à 540 nm.
