UNIVERSITE DE NICE SOPHIA ANTIPOLIS FACULTE DES SCIENCES
UTILISATION DES OVOCYTES DE XENOPE
EXTRAIT DE LA THÈSE de Docteur en SCIENCES mention Sciences de la Vie
de Fabrice DUPRAT
Étude par Électrophysiologie des Relations Structure-fonction, de la Pharmacologie et des Régulations de Canaux Potassiques
Clonés.
Soutenue le 9 janvier 1998
Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire Sophia Antipolis
TABLE DES MATIÈRES
II MATÉRIELS ET MÉTHODES ... 19
II-A OVOCYTE DE XÉNOPE... 19
II-A-1 Généralités... 19
II-A-2 Maintenance des Xénopes ...20
II-A-3 Préparation des ovocytes... 20
II-A-4 Injection d’ARN et d’ADN... 20
II-A-5 Canaux ioniques endogènes à l'ovocyte...21
II-A-5-a Canal sodique... 21
II-A-5-b Canaux chlore... 21
II-A-5-c Canaux calciques... 22
II-A-5-d Canaux potassiques... 22
II-A-5-e Canaux cationiques... 24
II-A-5-f Canaux ioniques induit... 24
II-A-6 Récepteur de l'ovocyte... 26
II-A-7 Canal potassique des cellules folliculaires ...26
II-A-8 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant K+... 26
II-A-9 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant Cl-... 28
II-A-10 Conclusion : l'ovocyte comme modèle d'expression ... 28
II-A-11 Enregistrements en double microélectrodes...33
II-A-12 Enregistrement en "Ovocyte ouvert"... 33
II-A-13 Enregistrement avec des électrodes garnies d'agarose... 34
II-A-14 Enregistrements en patch-clamp... 34
ABRÉVIATIONS
ABC : ATP-binding cassette
9-AC : Acide anthracene-9-carboxylique
AC : Adénylate cyclase
ACh : Acétylcholine
ADP : Adénosine 5'-diphosphate ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
4-AP : 4-Aminopyridine7
AMPc : Adénosine monophosphate cyclique
ARN : Acide ribonucléique
ARNc : ARN complémentaire
ARNm : ARN messager
ATCC : American type cell collection ATP : Adénosine triphosphate
BAPTA : Acide 1,2bis(2-aminophénoxy) éthane-N,N,N',N' tétraacétique
CK : Caséine kinase
CFTR : Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CGRP : Calcitonin gene related peptide
CHO : Chinese hamster ovary
ChTX : Charybdotoxine
COS : CV-1 Origin SV40
8CPT-AMPc : 8-(4-chlorophenylthio) AMPc
CTX : Cholératoxine
DAG : Diacylglycérol
DEAE : Diéthylaminoéthyl
diC8 : 1,2-dioctanoyl-sn-glycérol
DHP : Dihydropyridines
DIDS : Acide 4-4'-diisothiocyanatostilbene-2-2'-disulphonique DMEM : Dulbecco modified eagle medium
DMSO : Diméthylsulfoxyde
DNP : Dinitrophénol
DTX : Dendrotoxine
EC50 : Concentration de demi effet (utilisé pour les activations)
ECG : Électrocardiogramme
EEG : Électroencéphalogramme
EGTA : Acide éthylène glycol-bis-(β-aminoéthyl éther) N,N,N',N'-tétraacétique
EMG : Électromyogramme
ENG : Électronystagmogramme
EOG : Électrooculogramme
epsp : Excitatory postsynaptic potential
ERG : Électrorétinogramme
FSH : Follicle stimulating hormone
GDP : Guanosine diphosphate
GMPc : Guanosine monophosphate cyclique GTP : Guanosine triphosphate
HCG : Human chorionic gonadotropin HEK : Human epithelial kidney
HEPES : Acide N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethanesulfonique HVA : High voltage activated
IBMX : 3-Isobutyl 1-methyl xanthine
IbTX : Ibériotoxine
IC50 : Concentration de demi inhibition IGF : Insulin growth Factor
IP3 : Inositol triphosphate
Kapamine : Canal K+ apamine-sensible
KATP : Canal K+ ATP-sensible KCa : Canal K+ Ca2+-sensible K2P : Canal K+ à 2 segments P KG : Canal K+ protéine G-sensible Kinward : CanalK+ à rectification entrante Kir : CanalK+ à rectification entrante KM : Constante de Michaelis
Koutward : CanalK+ à rectification sortante
Kv : CanalK+ voltage dépendant (6 segments transmembranaires) LVA : Low voltage activated
2MeSATP : 2-méthylthio ATP
MS : Méthylsulfonate
NDGA : Acide nordihydro guaiarétique
NPPB : Acide 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoique PBS : Phosphate buffered saline
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne de l'ADN ("polymerase chain reaction") PDA : 4α-phorbol-12,13-didecanoate
PGA : Prostaglandine A
PGE : Prostaglandine E
PKA : Protéine kinase A (AMPc sensible) PKC : Protéine kinase C (calcium sensible) PKG : Protéine kinase G (GMPc sensible) PKII : Protéine kinase II (calmoduline sensible)
PLC : Phospholipase C
PMA : Phorbol 12-myristate 13-acétate PO : Probabilité d'ouverture
PF : Probabilité de fermeture ROC : Receptor operated channel
RT-PCR : Reverse Transcriptase PCR (PCR sur de l'ADN complémentaire)
Sf9 : Spodoptera frugiperda 9
SITS : Acide 4-acetamido-4isothiocyanostilbene-2,2'-disulfonique SMOC : Second messenger operated channel
s/u : Sous-unité
SUR : Sulfonylurea receptor tBHP : tert-butyl hydropéroxyde
TEA : Tétraéthylammonium
TTX : Tétrodotoxine
TyrK : Tyrosine kinase
VOC : Voltage operated channel
II MATERIELS ET METHODES II-A O VOCYTE DE X ENOPE
II-A-1 Généralités
Le Xenopus laevis est un amphibien de l'ordre des anoures et de la famille des pipidés. Les ovocytes ont été utilisés pour l'expression d'ARN exogène dès 1971 (Gurdon et al., 1971) afin d'étudier les mécanismes de traduction de l'ARN messager de l'hémoglobine. En 1985, l'expression du récepteur à l'acetylcholine cloné marque le début de l'étude des propriétés fonctionnelles de protéines exogènes exprimées dans l'ovocyte (Sakmann et al., 1985). Ensuite, ce système permit le clonage par expression fonctionnelle de l'interleukine-4 (Noma et al., 1986). Ce système devint vite très populaire pour l'expression hétérologue et la caractérisation fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs et de transporteurs clonés (voir les revues de Dascal, 1987; Sigel, 1990).
Les ovocytes de Xénope comportent plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires pour l'expression hétérologue:
- Les Xénopes sont facile à entretenir, n'exigent pas trop de place, ne coûtent pas très cher et permettent l'obtention de plusieurs milliers d'ovocytes par opération.
- Le diamètre des ovocytes est d'environ 1 mm, ce qui facilite leur manipulation et l'injection de substances.
- Les conductances endogènes sont relativement faibles en amplitude (voir II-A-5, page 20).
- Les ovocytes sont capables de traduire l'ARN ou l'ADN injecté mais également dans certains cas d'effectuer des modifications post-traductionnelles nécessaire au fonctionnement de la protéine (Sigel, 1990).
- La manipulation des ovocytes est faite à température ambiante, en milieu non stérile, et ils peuvent être maintenus près de 12 jours dans un milieu adéquat.
Les ovocytes évoluent dans l'ovaire du Xénope et sont classés en six stades sur des critères morphologiques (Dumont, 1972), les ovocytes de stade 5 et 6 (les plus gros) sont ceux utilisés pour l'expression hétérologue.
Un ovocyte est entouré de plusieurs couches de cellules (Figure 3) :
- Membrane vitelline : couche non cellulaire fibreuse qui donne sa rigidité à l'ovocyte
- Cellules folliculaires : couche de cellules qui ont de nombreuses connections avec l'ovocyte via des jonctions de type Gap (Browne et al., 1979).
- Thèque : une couche de tissu de connexion composé de cellules musculaires lisses, de fibres nerveuses et de capillaires.
Chaque ovocyte est divisé en deux moitiés, le pôle "animal" de couleur foncé (forte concentration de pigments) et le pôle "végétatif" de couleur clair. Le noyau est très volumineux et se trouve du côté du pôle animal (Figure 3). Le diamètre moyen d'un ovocyte au stade 6 est de 1 mm, la surface géométrique apparente est donc de 3.106 µm2 et le volume de 5 µl. Due à de nombreux replis de la membrane, la surface totale de la membrane d'un ovocyte, mesurée d'après la capacité, est d'environ 20.106 µm2, plus de six fois supérieure à la surface calculée (Methfessel et al., 1986). La capacité spécifique d'un ovocyte au stade VI est d'environ 4 µF/cm2 (Dascal, 1987).
Les concentrations ioniques et les potentiels d'équilibre calculés d'un ovocyte défollicularisé sont indiqués dans le Tableau 1. Les potentiels d'équilibre sont calculés avec le milieu externe généralement utilisé, le ND96 (Nathan Dascal), contenant 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES avec un pH de 7,4 (NaOH).
Tableau 1 : Concentrations ioniques et potentiels d'équilibre Eion de l'ovocyte de Xénope.
Ovocyte follicularisé Ovocyte défollicularisé Ions
[Ion]int Eion [Ion]int Eion
K+ 120 mM -103 mV 150 mM -109 mV
Na+ 18 mM +42 mV 22,5 mM +37 mV
Cl- 62 mM -13 mV 62 mM -13 mV
Ca2+ 0,1-0,4 µM >106 mV 0,1-0,4 µM >106 mV Source : (Dascal, 1987), Eion calculés d'après l'équation 3 dans du ND96.
Le potentiel de repos des ovocytes follicularisé est de -41 mV et peut diminuer à -30 mV après le traitement à la collagenase (Kusano et al., 1982).
II-A-2 Maintenance des Xénopes
Les Xénopes sont achetés au Laboratoire de Biologie de la Régulation (Campus Beaulieu 35042 Rennes) ou au CRBM (BP 5051 34033 Montpellier) et élevés par douzaine dans des bacs contenant environ 15 litres d'eau. L'eau est préalablement ventilée dans des bacs à décantation en présence de bulleurs pour éliminer le chlore et la mettre à température ambiante (20°C). Les animaux sont nourris deux fois par semaine avec des granules Aquatic 3 (Special Diets Services PO Box 705 Witham CM83AD Angleterre) et la photopériode est 12h/12h pour pouvoir obtenir des ovocytes toute l'année.
II-A-3 Préparation des ovocytes
Les femelles Xénope sont anesthésiées dans la glace pendant 30 minutes puis positionnée en décubitus dorsal sur une table d'opération toujours en présence de glace. Une petite incision d'environ 8 mm est réalisée dans la zone iliaque pour accéder à l'ovaire où les ovocytes sont retirés par paquets de plusieurs milliers. Les ovocytes seront maintenus tous le long de leur utilisation dans le ND96. Le plan musculaire et la peau incisés sont recousus puis l'animal est sorti de la glace jusqu'à son réveil complet puis remis dans les bacs d'élevage.
Les sacs d'ovocytes prélevés sont individualisés avec des pinces fines puis subissent un traitement enzymatique de 2h30 (collagenase IA, Sigma 2 mg/ml et inhibiteur trypsique IIS, Sigma 0,8 mg/ml), ils sont ensuite maintenus à 19°C dans un incubateur dans du ND96 additionné d'antibiotiques (soit gentamycine 50 mg/l, soit pénicilline 10 mg/l + streptomycine 20 mg/l, soit ceftazidime 8 mg/l).
La défollicularisation semble endommager la membrane de l'ovocyte car le potentiel de membrane devient moins négatif, aussi est-il conseillé de n'utiliser les ovocytes que plusieurs heures après, voir le lendemain de leur préparation (Dascal, 1987).
II-A-4 Injection d’ARN et d’ADN
Dès le soir de leur prélèvement les ovocytes peuvent être injectés avec 50 nl d'ARN ou 10 nl d'ADNc, à l'aide d'un microinjecteur (Inject+matic, Genève) et de fin capillaires étirés. Les ARN sont injectés à une concentration de 1 ng à 1 µg/ml, l'ADN entre 1 et 10 ng/µl. L'ADN nécessite d'être
injecté dans le noyau aussi faut-il les injecter au centre du pôle animal (couleur foncée) et enfoncer la pipette environ au 1/6ème de l'ovocyte pour être quasiment certain d'injecter le noyau (Figure 3). Les canaux ioniques exprimés sont mesurables dès le lendemain ou 48h après l'injection selon les cas. Des ovocytes sains peuvent être maintenus jusqu'à 12 jours après l'opération.
II-A-5 Canaux ioniques endogènes à l'ovocyte
II-A-5-a Canaux sodiques
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♦♦ INa(V)
Un canal voltage-dépendant lent avec un seuil d'activation à -25 mV a été décrit en 1982. Ce canal est activé lorsque la membrane est maintenu dépolarisée à l'aide de pulses de plusieurs secondes (Figure 4). La relation courant-potentiel est une courbe en cloche dirigée vers le bas avec un pic à +50 mV et une amplitude de courant d'environ 300 nA (Baud et al., 1982).
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♦ INa(t)
Un canal sodique transitoire est également présent sur certains lot d'ovocytes (Figure 4). Le courant d'une amplitude d'environ 300 nA est bloqué par 0,5 mM de tétrodotoxine (Parker & Miledi, 1987).
II-A-5-b Canaux chlore
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♦ ICl(Ca)
Le canal chlore transitoire calcium-dépendant ICl(Ca) est la conductance endogène la plus fréquemment enregistrée dans les ovocytes de Xénope (Miledi, 1982; Barish, 1983), son amplitude est d'environ 30 à 500 nA (Figure 4). Toutes les stimulations aboutissant à une augmentation du calcium interne activent ce canal chlore c'est à dire des dépolarisations qui ouvrent le canal calcium voltage dépendant des ovocytes (s'il est présent) ou bien des agonistes des récepteurs endogènes couplés à la phospholipase C. Ce canal est bloqué par le gadolinium (50 µM) et par le lanthanum de façon irréversible, mais également par le cadmium, le cobalt, le nickel et le manganèse (tous à 50 µM) avec une faible réversibilité (30 à 80 %). Le zinc (100 µM) est sans effet sur ICl(Ca). L'amplitude du courant est stable pendant au moins 6 jours après l'opération du Xénope (Tokimasa & North, 1996).
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♦ ICl(h)
Le courant chlore activé par hyperpolarisation ICl(h) est un courant voltage- et temps-dépendant (Peres & Bernardini, 1983). Son amplitude varie beaucoup d'un lot d'ovocyte à l'autre mais il peut atteindre 12 µA pour une hyperpolarisation à -150 mV, la valeur moyenne étant 1,1 ± 2,1 µA. Son activation est lente et est caractérisée par deux constantes de temps d'activation 200 ± 96 ms et de 13 ± 8 ms (à -140 mV), ce courant ne présente pas d'inactivation (Figure 4). Sa sélectivité suit la séquence suivante I->NO3
->Br->Cl->propionate>acetate. Ce canal est insensible au calcium et aux variations de pH mais est bloqué par le baryum (IC50=180 µM) et partiellement bloqué par les inhibiteurs des canaux chlore: 37,7 % d'inhibition avec le SITS 1 mM, 15,9 % avec le bumétamide 1 mM et 14,1 % avec le 9-AC 1 mM (Kowdley et al., 1994).
Un blocage réversible par le lanthanum (IC50 = 8 µM) a été observé alors que des inhibitions partielles furent obtenues avec le zinc (56 % d'inhibition), le cadmium (37%), le cobalt (34%) et le nickel (7%). Le gadolinium, le manganèse, le baryum et le strontium sont inactifs à 100 µM.
L'amplitude de ICl(h) varie depuis le jour de l'extraction des ovocytes de l'ovaire, le courant est maximum un jour après l'opération puis diminue pour atteindre un minimum aux jours 3 et 4 puis augmente de nouveau au jour 5 (Tokimasa & North, 1996). Contrairement aux résultats de Kowdley, l'article de Tokimasa montre une sensibilité des courbes d'activation de ICl(h) vis à vis du
pH, avec des déplacements de -20 mV (pH 6,5) et de +15 mV (pH 8,5) et une absence d'inhibition par le baryum. Ces divergences sont expliquées par les auteurs par la différence des méthodes de défollicularisation (manuelle pour Kowdley et enzymatique pour Tokimasa).
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♦ ICl(swell)
Une réduction de 50 % de l'osmolarité du bain externe (de 220 mOsm à 110 mOsm) induit un courant chlore, ICl(swell), d'une amplitude d'environ 2 µA à +50 mV (Figure 4). Les mesures de sélectivité montrent que ce courant est différent du canal cationique mécanosensible Istretch. ICl(swell) est bloqué par plusieurs inhibiteurs des canaux chlore; NPPB (IC50=10 µM), DIDS (IC50=30 µM) et SITS (IC50=60 µM). Le lanthanum et le gadolinium sont également de bons bloqueurs de ce canal avec des IC50 de 60 µM et 250µM respectivement. L'acide niflumique qui est un bloqueur du canal chlore calcium sensible ICl(Ca) est inactif (à 50 µM) sur ICl(swell), et ce canal n'est pas sensible à l'incubation dans un chélateur du calcium (BAPTA-AM 50 µM pendant 5h) ce qui semble démontrer que c'est un autre canal que le chlore calcium dépendant (Ackerman et al., 1994).
II-A-5-c Canaux calciques
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♦♦ ICa(V)
Un canal calcique voltage-dépendant est mesurable en substituant le calcium par du baryum et en substituant la chlore par de l'acide méthane sulfonique pour éliminer le courant chlore calcium- dépendant (Figure 4). Dans des conditions physiologiques ce canal n'est pas mesurable car il est masqué par ICl(Ca) (Dascal et al., 1986). ICa(V) est de faible amplitude (33nA à +10mV), il présente une constante d'inactivation de 250 ms (à +10mV) et est observé dans 50% des lots d'ovocytes. Ce courant est insensible aux effecteurs suivants : BayK 8644 (1 µM), nicardipine (10 µM), ω conotoxine (1 µM), amiloride (10 µM), Ni2+ (10 µM). Une concentration plus importante de Ni2+
(1 mM) bloque ce courant endogène. Une augmentation de l'AMPc interne obtenue soit par injection directe d'AMPc (50 pmole) soit avec l'IBMX (1 mM) se traduit par une augmentation de ICa(V)
pouvant atteindre 300% à –10 mV. La stimulation de la PKC à l'aide d'OAG (2 µM) ou de PMA (300nM) augmente également ce courant d'environ 220% (à –10 mV) (Bourinet et al., 1992).
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♦ ICa(IP3)
Un récepteur à l'IP3 a été mis en évidence sur la membrane nucléaire d'ovocyte. Le meilleur fit de la relation courant potentiel fut obtenu avec l'équation de GHK et des perméabilités ioniques de 8 pour le Ca2+, 1 pour le K+ et 0,05 pour le Cl- (voir VI-B-4-e, page 95). Le canal a une conductance de 113 pS en K+ symétrique pour les courants faibles (± 2,5 pA) et une conductance beaucoup plus importante pour les courants plus grands. Les courants unitaires présentent trois sous-états, un principal M (90 % du temps ouvert), un second (conductance double de celle de M) et un troisième rarement observé (conductance moitié de M). L'héparine (100 µg/ml) bloque l'activité du canal (Mak
& Foskett, 1994).
II-A-5-d Canaux potassiques
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♦♦ IK(V)
Un canal potassique à rectification retardée a été décrit en 1990 (Figure 5). Le seuil d'activation est vers -50 mV, il présente une activation rapide (en 150 ms) et une inactivation lente (constante de temps de 16,5 s a -10 mV). Il est insensible au calcium, et bloqué par la quinine (Ki=35µM). Les amplitudes de courant sont très variables d'un lot de Xénope à l'autre (30 à 400 nA) (Lu et al., 1990).
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♦ IK(IsK)
L'ADNc codant pour la protéine IsK ou minK (126 à 130 acides aminés selon l'espèce) a été isolée à partir d'une banque de rein de rat (Takumi et al., 1988). IsK a également été cloné dans le cœur de rat nouveau-né (Folander et al., 1990), le cœur de souris (Honoré et al., 1991), les lymphocytes T humains (Attali et al., 1992) ainsi que dans l'utérus de rat (Pragnell et al., 1990). Son profil d'hydrophobicité ne prédit qu'un seul segment transmembranaire. La protéine IsK injectée dans l'ovocyte à une concentration inférieure à 100 ng/µl induit un courant potassique, IK(IsK), ressemblant au courant IKs du cœur (Takumi et al., 1988; Attali et al., 1993). La protéine IsK est très bien exprimée mais ne peut pas induire de courant potassique dans des lignées cellulaires tels que la lignée de muscle squelettique C2C12, les fibroblastes CHO, la lignée de lymphocyte T Jurkat ou bien la lignée d'insecte Sf9 (Lesage et al., 1993). Dans l'ovocyte, le courant IK(IsK) peut atteindre 2 µA (Figure 5) et résulte de l'interaction de la protéine IsK avec une sous-unité endogène à l'ovocyte, XKvLQT1, qui a été cloné et présente 88% d'identité en acide aminé avec un canal voltage dépendant à 6 segments transmembranaires humain KvLQT1 (Sanguinetti et al., 1996).
La pharmacologie de IK(IsK) a été très étudiée. Ce courant est inhibé par le clofilium (IC50=80 µM), le TEA (IC50= 20mM) et le vérapamil (IC50= 50µM) mais est insensible à la charybdotoxine et au 4-AP (Attali et al., 1992). 68% du courant (à +40 mV) est inhibé par un anesthésique général, l'halothane à 340 µM (Zorn et al., 1993). Les chromanols sont également de bons bloqueurs de IK(IsK) avec des IC50 allant de 5 µM pour le 434B à 59 µM pour le 360B (Suessbrich et al., 1996). IK(IsK) est activé par une augmentation du calcium interne (A23187 1 µM) et inhibé par l'activation de la protéine kinase C (PMA 30 nM) (Attali et al., 1992).
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♦♦ IK(Ca)
Des canaux potassiques voltage-dépendant activés par le calcium IK(Ca) ont été enregistrés en patch- clamp. Leur conductance est de 200 pS en potassium symétrique (110 mM), leur densité est faible avec 1 canal / 3000 µm2 soit environ 3000 canaux par ovocyte (Figure 5). Ces canaux sont insensibles à la 4-AP (1 mM) mais sont bloqués par le tétraethylammonium externe (50 % de blocage à 250 µM) et par la charybdotoxine (plus de 90% de blocage à 50 nM) (Krause et al., 1996).
♦♦
♦♦ IK(Na)
Un canal potassique activé par le sodium interne IK(Na) serait mesurable dans 50% des patch en configuration inside-out (Figure 5). Sa conductance est d'environ 140-170 pS en potassium symétrique et est complètement abolie en absence de sodium interne (Egan et al., 1992).
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♦♦ IK(IR)
Un canal potassique à rectification entrante est présent sur certains lots d'ovocytes de Xénopes. Ce courant est observé en milieu externe riche en potassium (118 mM), il s'inactive partiellement entre -20 et -80 mV et s'inactive complètement pour des potentiels plus négatifs (Figure 5). Ce courant est partiellement inhibé par le baryum, le césium ou la quinine (tous à 5 mM) et est compris entre 75 et 600 nA (à -120 mV en milieu hyperpotassique) selon la saison et les lots d'ovocytes (Bauer et al., 1996).
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♦♦ IXIR
Un canal présentant 78% d'identité en acides aminés avec le canal à rectification entrante CIR (Kir3.4) a été cloné dans l'ovocyte (Hedin et al., 1996). Ce canal, XIR (Xenopus Inwardly Rectifying K+ channel), n'est pas actif seul mais il permet l'expression des canaux de la famille Kir3.0 qui nécessitent la formation de complexes hétéromultimériques pour être fonctionnels (voir III-C-3, page 47).
II-A-5-e Canaux cationiques
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♦ Istretch
Des canaux mécanosensibles Istretch activés par des pressions positives ou négatives supérieures à 5 mbar ont été décrits dans l'ovocyte. Ce sont des canaux cationiques d'une conductance de 28 pS dans le Ringer. La densité de ces canaux est estimée à 0,5-2 par µm2 de membrane soit environ 107 canaux/ovocyte (Methfessel et al., 1986). Une étude détaillée au niveau du courant unitaire a été réalisée en patch clamp, des conductances de 30 à 78 pS ont été mesurées selon l'ion porteur de charge (Figure 6) (Yang & Sachs, 1990).
Le gadolinium est un excellent bloqueur du Istretch (à 10 µM) et permet de s'en affranchir pour étudier d'autres canaux. Son effet est de diminuer le temps moyen d'ouverture, le courant unitaire et la probabilité d'ouverture des canaux. Le calcium diminue également le temps moyen d'ouverture du canal mais il est perméant et son action atteint un plateau vers 10 mM contrairement au gadolinium (Yang & Sachs, 1989).
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♦ Ic et Icreep
La diminution de la concentration en cations divalents (Ca2+, Mg2+) du milieu externe des ovocytes révèle un courant cationique Ic (Na+, K+), entrant à -60 mV et non inactivant, d'une amplitude de 472 nA à +50 mV (Figure 6). Le blocage par le Ca2+ (IC50= 61 µM à -60 mV et 212 µM à 0 mV) et le Mg2+ (IC50= 201 µM à -60 mV et 710 µM à 0 mV) est voltage dépendant ce qui implique un site de fixation dans le pore du canal. Des dépolarisations de plusieurs minutes activent également un courant de même nature Icreep mais de plus faible amplitude (environ 113 nA à +50 mV). Ce canal ressemble beaucoup à Istretch mais ce dernier est perméant au Ca2+ contrairement à Ic. Istretch ne semble pas aussi sensible au retrait du calcium externe et il nécessite une variation de pression pour être activé (Arellano et al., 1995).
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♦ Ifond
Un courant de fond d'environ 60 nA (à -20 mV), Ifond, inhibé par les ouvreurs de canaux K+ ATP- sensible a été enregistré sur les ovocytes défollicularisé. Ce courant n'est probablement pas purement potassique car son potentiel d'inversion est de -51 mV au lieu de -95 mV pour un canal purement sélectif au potassium (Figure 6). Le lemakalim (BRL38227) est un ouvreur de canaux potassiques ATP-sensible et le BRL38226 est un énantiomère non actif. Ifond est inhibé par le BRL38226 (IC50 = 150µM) ainsi que par le baryum (500 µM) et le cromakalim (BRL34915). Ce courant est partiellement inhibé par 3 mM 4-AP (environ -40%) ainsi que par 1 mM Co2+, Ni2+ ou La3+, par contre il est insensible au glibenclamide, à l'apamine, la dendrotoxine I, le MCD peptide, la charybdotoxine ou la β bungarotoxine (100 nM) (Honoré & Lazdunski, 1991b).
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♦♦ Pompe Na+/K+
La pompe Na+/K+ de l'ovocyte génère un courant d'environ 20 nA, son activité est diminué de 40 % par un activateur de la protéine kinase C, le diC8 50 µM, et augmentée de 80 % par l'injection d'AMPc (concentration finale 50 µM) (Vasilets & Schwarz, 1992).
II-A-5-f Canaux ioniques induit
L'expression de certaines protéines (M2, phospholemman, Mat-8, CHIF, IsK) induit un courant dans l'ovocyte de Xénope. Les courants induits sont probablement endogènes car ces protéines n'ont pas des structures proches de celles des canaux ioniques, néanmoins à part le courant K+ induit par IsK (voir ci-dessus) aucune expérience ne montre clairement l'origine endogène des ces courants.
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♦ INa(M2)
Le virus influenza est constitué d'un ensemble de protéines dont M2 qui comprend 97 acides aminés et est largement exprimé sur les membranes plasmiques des cellules infectées par le virus. La protéine M2 traverse la membrane une fois et présente 23 résidus N-terminaux sur la face extracellulaire et 54 résidus C-terminaux sur la face cytoplasmique. L'amantadine est une drogue antivirale qui, utilisée dans la gamme du µM, inhibe spécifiquement la réplication du virus influenza. Après expression dans l'ovocyte de Xénope, cette protéine induit un courant entrant principalement sodique d'une amplitude de 80 à 200 nA à -130 mV (Figure 7). Ce courant est complètement inhibé par 10 µM d'amantadine et est activé par les H+ externes (1,7 µA à pH 5,8). Des mutants ont été fabriqués, ils induisent de fort courant (2,7 µA) insensibles à l'amantadine et certains sont insensibles au pH. Les propriétés des courants de déactivation obtenus avec les mutants sont différentes de celle du M2 sauvage. Ces résultats permettent de supposer que M2 participe directement au canal responsable du courant observé (Pinto et al., 1992).
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♦♦ ICl(PLM)
Le phospholemman est une protéine de 72 acides aminés provenant du sarcolemme cardiaque et composée d'un seul segment transmembranaire. L'injection de cette protéine dans l'ovocyte active un canal chlore ICl(PLM) qui s'ouvre en hyperpolarisation (Figure 7). Ce canal présente une activation très lente, ne s'inactive pas et est augmenté par une plus haute fréquence de stimulation, des potentiels de maintien plus dépolarisés et par un pH externe acide. L'injection de 9-AC à 200 µM final réduit le courant de plus de 50 %, par contre l'injection de calcium de modifie pas ce courant. Appliqué dans le bain, le baryum bloque complètement ICl(PLM) avec un IC50 de 360 µM, le cadmium (1 mM) ne bloque que 17 % du courant et le césium ou le TEA (10 mM) sont inactifs (Moorman et al., 1992).
Ce canal présente certaines similitudes avec ICl(h) (même sélectivité) mais leurs propriétés biophysiques et pharmacologiques sont différentes (Kowdley et al., 1994).
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♦♦ ICl(Mat-8)
Une autre protéine de 67 acides aminés, Mat-8 (Mammary tumor, 8 kDa), dont le domaine extracellulaire et l'unique domaine transmembranaire est homologue au phospholemman, est également capable d'activer un courant chlore dans l'ovocyte (Figure 7). Mat-8 a été isolé dans des tumeurs mammaires de souris (Morrison et al., 1995).
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♦♦ IK(CHIF)
Une autre protéine régulatrice, CHIF (CHannel Inducing Factor), est capable d'induire un courant K+ très similaire à IK(IsK) mais pas de courant chlore (Figure 7). CHIF ne présente pas d'homologie de séquence avec IsK mais présente près de 50% d'homologie avec certaines régions du phospholemman (Attali et al., 1995).
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♦♦ ICl(IsK)
La protéine IsK (voir IK(IsK) ci-dessus) injectée à une concentration de 1 µg/µl, induit dans l'ovocyte de Xénope un courant chlore, ICl(IsK), d'une amplitude de 500 nA à -130 mV et qui ressemble à ICl(h)
(Figure 7). IsK injectée à une concentration plus faible induit un courant potassique (voir IK(IsK) ci- dessus) (Attali et al., 1993).
Une autre équipe a suggéré que ce courant puisse être induit non spécifiquement par la forte concentration en ARN utilisée. Ils ont observé le même courant après avoir exprimé dans l'ovocyte des protéines aussi différentes qu'un canal K+ à rectification sortante muté pour le rendre non fonctionnel (shW434F), un canal K+ à rectification entrante non fonctionnel seul (BIR9), un transporteur d'acide aminé (EAAT2), le récepteur D2 dopaminergique et la β galactosidase, tous injectés à 1 µg/µl. Les courants induit sont observés 4 à 8 jours après l'injection d'ARN ce qui est 2 à 4 fois plus long qu'avec IsK. Le retrait de tout le calcium externe du milieu des ovocytes révèle un
courant cationique, après expression d'IsK. Les auteurs concluent que l'injection de fortes concentrations en ARN induit deux courants, ICl(IsK) et Icationique (Tzounopoulos et al., 1995).
Le groupe de Bernard Attali a montré qu'un fragment peptidique de 34 acides aminés de la portion N-terminale de la protéine IsK (N34) est suffisant pour activer le courant chlore et qu'un fragment C- terminale de 27 acides aminés (C27) est suffisant pour activer le courant potassique (Benefraim et al., 1996).
II-A-6 Récepteur de l'ovocyte
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♦ Muscarinique
L'acetylcholine induit une dépolarisation de la membrane des ovocytes via l'ouverture de canaux chlore (Figure 8 A) (Kusano et al., 1977; Arellano & Miledi, 1993). Ces récepteurs agissent via une mobilisation du calcium interne par l'IP3.
Dés la concentration de 10-9 M l'acetylcholine est capable d'activer son récepteur, son effet est bloqué par un antagoniste muscarinique, l'atropine (10-7 M), mais pas par la tétrodotoxine (10-6 M), ni par un antagoniste nicotinique, l'α-bungarotoxine (1 µg/ml). Aucune réponse n'est obtenu avec les agonistes nicotiniques (nicotine, 1,1-dimethyl-4-phenylpiperazinium). Ces résultats suggèrent que ces récepteurs sont de type muscarinique (Kusano et al., 1982). Le type exact de ces récepteurs qui sont des M1 (minoritaire) et M3 (majoritaire) a été déterminé à l'aide d'antagonistes plus ou moins spécifiques des récepteurs muscariniques (pirenzepine, AFDX-116, himbacine, méthobromure de 5- diphenylacetoxy-N-methyl-piperidine, atropine) et par injection d'oligonucléotides antisens spécifiques des récepteurs M1 et M3 (Davidson et al., 1991; Oron & Dascal, 1992). Par contre, une autre étude montre le clonage de l'ADNc des récepteurs de type M4 et montre par PCR qu'il serait le seul messager présent dans l'ovocyte (Herrera et al., 1994).
II-A-7 Canal potassique des cellules folliculaires
Cette conductance peut être étudier en enregistrant les courants au niveau de l'ovocyte car les cellules folliculaires sont couplées électriquement à l'ovocyte qu'elles entourent via des jonctions gap (Browne et al., 1979).
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♦ IK(ATP)
Les ouvreurs de canaux K+ ATP sensible activent des courant IK(ATP) dans les cellules folliculaires des ovocytes (Figure 8 B). Plusieurs classes d'ouvreurs ont été testés avec dans l'ordre d'efficacité: le P1075 (EC50 = 5 µM), P1060 (EC50 =12 µM), BRL38227 ou lemakalim (EC50 = 77 µM), RP61419 (EC50 = 100 µM), (-) pinacidil (EC50 = 300 µM). Le sulfate de minoxidil, le nicorandil, le RP49856 et le diazoxide sont sans effet. Les effets des ouvreurs sont annulés par le glibenclamide (Honoré &
Lazdunski, 1991b).
Ce canal à une conductance unitaire de 19 pS, il nécessite la présence de 20 µM ATP et de Mg2+
pour pouvoir être activé par les ouvreurs, par contre une concentration de l'ordre du mM en ATP ou en ATP[γS] inhibe le canal. Une augmentation de la concentration en AMPc interne ou bien l'application directe de la sous-unité catalytique de la PKA active le courant IK(ATP) (Honoré &
Lazdunski, 1993).
II-A-8 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant K
+De nombreux récepteurs sont localisés au niveau des cellules folliculaires et peuvent notamment induire une activation de l'adénylate cyclase (voir Miledi & Woodward, 1989a).
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♦ Adénosine
Des récepteurs purinergiques et à l'adénosine induisent une dépolarisation rapide produit par un courant chlore (ID) puis une hyperpolarisation lente impliquant des courants potassiques (IH) dans les ovocytes follicularisés (Figure 8 C). L'effet sur IH passe par une augmentation de l'AMPC, est modulé par la concentration interne en calcium et est antagonisé par une stimulation muscarinique (Stinnakre & Van Renterghem, 1986). Les agonistes ont des effets variables sur IH avec dans l'ordre croissant : AMP et adénosine > ATP et ADP, de plus une forte diminution de la réponse est obtenue avec la théophylline (50 µM), ce qui suggère un récepteur à l'adénosine de type A2 (anciennement purinergique de type P1) (Lotan et al., 1982).
♦♦
♦♦ Adrénergique
Les ovocytes répondent aux agonistes β-adrénergiques (isoprotérénol 10 µM, épinephrine 1 µM) par l'activation d'un courant potassique et la réponse est antagonisée par les bloqueurs β-adrénergique (propranolol et dichloro isoprotérénol 10 µM). Les agonistes α-adrénergiques (phenyléphrine 100 µM) et les bloqueurs α-adrénergiques (phentolamine) sont inactifs. Cette réponse semble être due à des récepteurs présents sur les cellules folliculaires entourant l'ovocyte car elle n'est pas obtenue sur des ovocytes défollicularisés (Kusano et al., 1977; Kusano et al., 1982).
♦♦
♦♦ Angiotensine II
Un récepteur à l'angiotensine II a été décrit sur des ovocytes follicularisés. La réponse, caractérisée par un EC50 de 150 nM, est une dépolarisation d'environ +18 mV pour 1 µM d'angiotensine II. La dépolarisation est absente des ovocytes défollicularisés (Lacy et al., 1989).
♦♦
♦♦ CGRP
Un récepteur au CGRP est présent dans les cellules folliculaires, sa stimulation active le KATP via l'AMPc. C'est un récepteur de type CGRP1 car la réponse est spécifiquement antagonisée par le CGRP(8-37) (Guillemare et al., 1994).
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♦ Dopamine
Une hyperpolarisation induite par la dopamine (1 µM) a été brièvement décrite par Kusano (1977).
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♦ Gonadotrophines
Des préparations de FSH (de porc) ou de hCG (humain) à 10 µg/ml activent des courants potassiques et la même réponse est obtenue avec une injection d'AMPc (Woodward & Miledi, 1987a).
♦♦
♦♦ IGF
Une potentialisation des courants KATP (voir le chapitre II-A-5-d, page 21) a été observé avec l'IGF (0,4 nM) et l'insuline (4 nM) et qui implique un récepteur à l'IGF couplé à une protéine G pertussis toxine sensible (Sakuta, 1994). Une autre équipe a montré que l'IGF-1 est capable de stimuler l'activité phosphodiesterase in-vivo dans l'ovocyte et d'inhiber in-vitro l'adénylate cyclase (Sadler &
Maller, 1987).
Des mesures de liaison donne un KD de 9 nM pour l'IGF-1. Il y aurait également un phénomène d'endocytose de l'IGF avec implication d'une tyrosine kinase, ce mécanisme aurait un rôle dans la maturation de l'ovocyte (Taghon & Sadler, 1994).
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♦
♦
♦ Prostaglandines, ocytocyne, ANF, VIP
Les prostaglandines (PGE1, PGE2, PGA1, PGA2, PGB1, 11-deoxy-PGE1, 11-β-PGE2) à 1 nM ainsi que l'ocytocyne (2 µM) stimule un courant potassique lent en présence des cellules folliculaires. Cet effet est reproduit avec des augmentations d'AMPc (forskoline 5 µM) et amplifié en inhibant les phosphodiesterases (théophylline et IBMX). Par contre les prostaglandines PGF2α, PGI2, PGD2 et 8-
courant cationique, après expression d'IsK. Les auteurs concluent que l'injection de fortes concentrations en ARN induit deux courants, ICl(IsK) et Icationique (Tzounopoulos et al., 1995).
Le groupe de Bernard Attali a montré qu'un fragment peptidique de 34 acides aminés de la portion N-terminale de la protéine IsK (N34) est suffisant pour activer le courant chlore et qu'un fragment C- terminale de 27 acides aminés (C27) est suffisant pour activer le courant potassique (Benefraim et al., 1996).
II-A-6 Récepteur de l'ovocyte
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♦ Muscarinique
L'acetylcholine induit une dépolarisation de la membrane des ovocytes via l'ouverture de canaux chlore (Figure 8 A) (Kusano et al., 1977; Arellano & Miledi, 1993). Ces récepteurs agissent via une mobilisation du calcium interne par l'IP3.
Dés la concentration de 10-9 M l'acetylcholine est capable d'activer son récepteur, son effet est bloqué par un antagoniste muscarinique, l'atropine (10-7 M), mais pas par la tétrodotoxine (10-6 M), ni par un antagoniste nicotinique, l'α-bungarotoxine (1 µg/ml). Aucune réponse n'est obtenu avec les agonistes nicotiniques (nicotine, 1,1-dimethyl-4-phenylpiperazinium). Ces résultats suggèrent que ces récepteurs sont de type muscarinique (Kusano et al., 1982). Le type exact de ces récepteurs qui sont des M1 (minoritaire) et M3 (majoritaire) a été déterminé à l'aide d'antagonistes plus ou moins spécifiques des récepteurs muscariniques (pirenzepine, AFDX-116, himbacine, méthobromure de 5- diphenylacetoxy-N-methyl-piperidine, atropine) et par injection d'oligonucléotides antisens spécifiques des récepteurs M1 et M3 (Davidson et al., 1991; Oron & Dascal, 1992). Par contre, une autre étude montre le clonage de l'ADNc des récepteurs de type M4 et montre par PCR qu'il serait le seul messager présent dans l'ovocyte (Herrera et al., 1994).
II-A-7 Canal potassique des cellules folliculaires
Cette conductance peut être étudier en enregistrant les courants au niveau de l'ovocyte car les cellules folliculaires sont couplées électriquement à l'ovocyte qu'elles entourent via des jonctions gap (Browne et al., 1979).
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♦ IK(ATP)
Les ouvreurs de canaux K+ ATP sensible activent des courant IK(ATP) dans les cellules folliculaires des ovocytes (Figure 8 B). Plusieurs classes d'ouvreurs ont été testés avec dans l'ordre d'efficacité: le P1075 (EC50 = 5 µM), P1060 (EC50 =12 µM), BRL38227 ou lemakalim (EC50 = 77 µM), RP61419 (EC50 = 100 µM), (-) pinacidil (EC50 = 300 µM). Le sulfate de minoxidil, le nicorandil, le RP49856 et le diazoxide sont sans effet. Les effets des ouvreurs sont annulés par le glibenclamide (Honoré &
Lazdunski, 1991b).
Ce canal à une conductance unitaire de 19 pS, il nécessite la présence de 20 µM ATP et de Mg2+
pour pouvoir être activé par les ouvreurs, par contre une concentration de l'ordre du mM en ATP ou en ATP[γS] inhibe le canal. Une augmentation de la concentration en AMPc interne ou bien l'application directe de la sous-unité catalytique de la PKA active le courant IK(ATP) (Honoré &
Lazdunski, 1993).
II-A-8 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant K
+De nombreux récepteurs sont localisés au niveau des cellules folliculaires et peuvent notamment induire une activation de l'adénylate cyclase (voir Miledi & Woodward, 1989a).
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♦ Adénosine
Des récepteurs purinergiques et à l'adénosine induisent une dépolarisation rapide produit par un courant chlore (ID) puis une hyperpolarisation lente impliquant des courants potassiques (IH) dans les ovocytes follicularisés (Figure 8 C). L'effet sur IH passe par une augmentation de l'AMPC, est modulé par la concentration interne en calcium et est antagonisé par une stimulation muscarinique (Stinnakre & Van Renterghem, 1986). Les agonistes ont des effets variables sur IH avec dans l'ordre croissant : AMP et adénosine > ATP et ADP, de plus une forte diminution de la réponse est obtenue avec la théophylline (50 µM), ce qui suggère un récepteur à l'adénosine de type A2 (anciennement purinergique de type P1) (Lotan et al., 1982).
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♦♦ Adrénergique
Les ovocytes répondent aux agonistes β-adrénergiques (isoprotérénol 10 µM, épinephrine 1 µM) par l'activation d'un courant potassique et la réponse est antagonisée par les bloqueurs β-adrénergique (propranolol et dichloro isoprotérénol 10 µM). Les agonistes α-adrénergiques (phenyléphrine 100 µM) et les bloqueurs α-adrénergiques (phentolamine) sont inactifs. Cette réponse semble être due à des récepteurs présents sur les cellules folliculaires entourant l'ovocyte car elle n'est pas obtenue sur des ovocytes défollicularisés (Kusano et al., 1977; Kusano et al., 1982).
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♦♦ Angiotensine II
Un récepteur à l'angiotensine II a été décrit sur des ovocytes follicularisés. La réponse, caractérisée par un EC50 de 150 nM, est une dépolarisation d'environ +18 mV pour 1 µM d'angiotensine II. La dépolarisation est absente des ovocytes défollicularisés (Lacy et al., 1989).
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♦♦ CGRP
Un récepteur au CGRP est présent dans les cellules folliculaires, sa stimulation active le KATP via l'AMPc. C'est un récepteur de type CGRP1 car la réponse est spécifiquement antagonisée par le CGRP(8-37) (Guillemare et al., 1994).
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♦ Dopamine
Une hyperpolarisation induite par la dopamine (1 µM) a été brièvement décrite par Kusano (1977).
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♦ Gonadotrophines
Des préparations de FSH (de porc) ou de hCG (humain) à 10 µg/ml activent des courants potassiques et la même réponse est obtenue avec une injection d'AMPc (Woodward & Miledi, 1987a).
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♦♦ IGF
Une potentialisation des courants KATP (voir le chapitre II-A-5-d, page 21) a été observé avec l'IGF (0,4 nM) et l'insuline (4 nM) et qui implique un récepteur à l'IGF couplé à une protéine G pertussis toxine sensible (Sakuta, 1994). Une autre équipe a montré que l'IGF-1 est capable de stimuler l'activité phosphodiesterase in-vivo dans l'ovocyte et d'inhiber in-vitro l'adénylate cyclase (Sadler &
Maller, 1987).
Des mesures de liaison donne un KD de 9 nM pour l'IGF-1. Il y aurait également un phénomène d'endocytose de l'IGF avec implication d'une tyrosine kinase, ce mécanisme aurait un rôle dans la maturation de l'ovocyte (Taghon & Sadler, 1994).
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♦ Prostaglandines, ocytocyne, ANF, VIP
Les prostaglandines (PGE1, PGE2, PGA1, PGA2, PGB1, 11-deoxy-PGE1, 11-β-PGE2) à 1 nM ainsi que l'ocytocyne (2 µM) stimule un courant potassique lent en présence des cellules folliculaires. Cet effet est reproduit avec des augmentations d'AMPc (forskoline 5 µM) et amplifié en inhibant les phosphodiesterases (théophylline et IBMX). Par contre les prostaglandines PGF2α, PGI2, PGD2 et 8-
iso-PGE1 sont incapable d'induire ce courant. L'ANF (60 nM) en présence d'IBMX (500 µM) induit un courant potassique similaire (Miledi & Woodward, 1989b) ainsi que le VIP (Woodward &
Miledi, 1987b).
II-A-9 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant Cl
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♦ Purinergique
Nous utilisons la dernière nomenclature des récepteurs purinergiques et à l'adénosine (TINS, 1997;
Féolde, 1997).
Les récepteurs purinergiques et à l'adénosine induisent une dépolarisation rapide produite par un courant chlore (ID) puis une hyperpolarisation lente impliquant des courants potassiques (IH) (Figure 8C). La sensibilité aux agonistes est dans l'ordre croissant ATP, ADP > AMP, adénosine pour le courant chlore ID ce qui correspond au profil des récepteurs purinergiques P2y (Lotan et al., 1982;
Miledi & Woodward, 1989a). Des expériences avec des agonistes spécifiques indiquent que dans les cellules folliculaires il n'y aurait effectivement que des récepteurs à l'adénosine et des récepteurs purinergiques de type P2y et P2U (maintenant nommés P2y1 et P2y2) (Pintor et al., 1996). Les récepteurs P2U (ou P2y2) ont pour agonistes l'UTP et l'ATP, ils sont antagonisés par la suramine et active un courant sodique amiloride sensible (IC50=31 µM). Les récepteurs P2Y ont pour agoniste le 2MeSATP, ils sont insensibles à la suramine et active un courant chlore (King et al., 1996).
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♦ FSH
Il a également été montré que le FSH (1 µg/ml) permet l'activation d'un courant chlore, le calcium interne ne semble pas impliqué (chélation avec l'EGTA ou le BAPTA) (Arellano & Miledi, 1993).
II-A-10 Conclusion : l'ovocyte comme modèle d'expression
Les Tableaux 2, 3, 4 et 5 ci-dessous résument les propriétés biophysiques, pharmacologiques et la régulation des courants mesurables dans l'ovocyte. Les pourcentages de variation des courants sont négatifs pour les inhibitions et positifs pour les activations, 0% indiquant aucun effet. Les potentiels, les concentrations utilisées ou les IC50 sont indiqués entre parenthèses. Les produits sont appliqués sur la face externe sauf indication contraire. Pour les produits injectés dans l'ovocyte les concentrations finales sont indiquées (injection d'environ 50 nl pour un volume total de 5 µl, soit une dilution au 1/100).
La Figure 9 résume les voies de transduction et les effets des récepteurs présents sur les membranes des ovocytes (voir page 4 pour les abréviations).
Tableau 2 : Courants Cl- de l'ovocyte de Xénope.
Propriétés :
Abréviations page 4 ICl(h) ICl(Ca) ICl(IsK) ICl(PLM) ICl(swell)
Niveau de courant 1-2µA (-150mV)
50-500nA (+20mV)
500nA
(-130mV) 5µA (-150mV) 3µA (+70mV)
Seuil d'activation -
ττττactivation
13 et 200ms
(-140mV) <1ms
ττττinactivation 484ms (+70mV)
E1/2inactivation -62 mV
ττττréactivation 3 s
Sélectivité
I->NO3-
>Br->Cl-
>propionate
>acétate
SCN->I-≥NO3-
=Br->Cl-
>MS≥HCO3-≥acétate
>gluconate>glutamate
DIDS -60% (1mM) IC50=30µM
SITS -38% (1mM) 0% (1mM) IC50=60µM
9-AC -14% (1mM) 0% (2mM) -50% (200µM
interne)
NPPB 0% (2mM) IC50=10µM
Bumétamide -16% (1mM)
Acide niflumique 0% (50µM)
H+ inhibition
Na+ = 0 0%
Cs+ 0% (10mM)
Ca2+ = 0 0% -100% +60% activation 0%
Ba2+ IC50=180µM IC50=400µM IC50=360µM
Cd2+ -37% (100µM) -100% (50µM) -17% (1mM)
Co2+ -34% (100µM) -100% (50µM)
Ni2+ -7% (100µM) -100% (50µM)
Mn2+ 0% (100µM) -100% (50µM)
Zn2+ -56% (100µM) 0% (100µM)
Sr2+ 0% (100µM)
La3+ IC50=8µM -100% (50µM) IC50=60µM
Gd3+ -3% (100µM) -100% (50µM) IC50=250µM
TEA 0% (10mM)
Clofilium +50%(100µM)
AMPc externe IC50=3,5mM
ATP Inhibition (5mM)
GTP Inhibition (5mM)
Injection EGTA -100% (1 mM) 0% (5mM)
Injection BAPTA 0% (50µM)
Injection Ca2+ +100% (1 µM) 0%
Injection IP3 +100% (1 mM) 0%
PMA +60% (30nM) 0%
Injection GTPγγγγS 0% (100µM)
Leukotriène D4 0% (2µM)
Arachidonate 0% (100µM)
Références :
(Kowdley et al., 1994; Tokimasa
& North, 1996)
(Barish, 1983;
Parker &
Miledi, 1986;
Tokimasa &
North, 1996)
(Attali et al., 1993)
(Moorman et al., 1992)
(Ackerman et al., 1994)
Tableau 3 : Courants K+ des cellules folliculaires et de l'ovocyte de Xénope.
Cellules folliculaires Ovocyte Ovocyte Ovocyte
Propriétés :
Abréviations page 4 IK(ATP) IK(V) IK(Na) IK(IR)
Conductance unitaire 19 pS 140-170pS
Fréquence ou densité 47% patch
Courant global 30-400nA(+30mV) 75-600nA
Seuil d'activation -50mV
ττττactivation <50ms
ττττinactivation 17s (-10mV) 75 et 552ms (-
140mV)
Cs+ -25% (5mM)
Ca2+ 0%
Ba2+ 0% (10mM) -47% (5mM)
TEA -15% (10mM) -50% (50mM)
4-AP -15% (10mM) -10% (10mM)
DTX-I 0% (1µM)
ChTX 0% (1µM) 0% (10nM)
Apamine 0% (1µM) 0% (1µM)
Quinine IC50=35µM -46% (5mM)
Glibenclamide IC50=200µM
Tolbutamide -40% (100µM)
RP61419 EC50=100µM
Lemakalim EC50=77µM
P1060 EC50=12µM
P1075 EC50=5µM
(-) Pinacidil EC50=300µM
Minoxidil 0% (300µM)
Nicorandil 0% (300µM)
[Na+]interne = 0 -100%
AMPc activation (300µM)
s/u catalytique PKA activation (150 UI/ml)
PMA -100% (30nM)
Chloramine T -50% (2mM)
Références :
(Honoré & Lazdunski, 1991b;
Honoré & Lazdunski, 1991a;
Honoré & Lazdunski, 1993)
(Lu et al., 1990)
(Egan et al.,
1992) (Bauer et al., 1996)
Tableau 4 : Courants K+ de l'ovocyte de Xénope.
Propriétés :
Abréviations page 4 IK(Ca) IK(slow) IK(IsK) IK(CHIF)
Conductance unitaire 200 pS Fréquence ou densité 1/3000µm2
Courant global 65nA (+10mV) 1µA (+20mV) 1µA (+30mV)
Sélectivité K+>Rb+>NH4+>Cs+>Na+>Li+
Seuil d'activation -70mV -40mV -50mV
ττττactivation 370ms (-50mV) 3 et 25 s (+15mV) 4 et 26s
(+20mV)
E1/2activation -32mV -11 mV
Cs+ IC50=21mM
Ba2+ -100% (2mM) IC50=2,4mM -80% (5mM)
La3+ -50% (1mM)
TEA IC50=250µM 0% (50mM) IC50=20mM -50% (30mM)
4-AP O% (1mM) 0% (3mM) 0% (4mM)
DTX-I 0% (10nM)
ChTX -90% (50nM) 0% (50nM) 0% (50nM)
Apamine 0% (100nM)
ββββ bungarotoxine 0% (10nM)
MCD peptide 0% (100nM)
Quinine 0% (300µM) 0% (500µM)
Quinidine 0% (300µM)
Amiodarone 0% (300µM) 0% (300µM)
Sotalol 0% (300µM)
Tedisamil 0% (300µM)
Clofilium IC50=100µM -60% (100µM)
Vérapamil IC50=50µM
Halothane -68% (340µM)
[Ca2+]interne Activation
(>1µM)
A23187 +30% (1µM) +300% (1µM)
8-Br AMPc +50% (1mM)
PMA -60% (30nM) -50% (30nM)
OAG -50% (100µM)
PKII + calmoduline +30% (10µg/ml+50µM)
Références : (Krause et al., 1996)
(Tokimasa & North, 1996)
(Folander et al., 1990; Honoré et al., 1991; Attali et al., 1992;
Hausdorff et al., 1991)
(Attali et al., 1995)
Tableau 5 : Courants Na+, Ca2+ et cationiques de l'ovocyte de Xénope.
Noms : Propriétés :
Abréviations page 4
INa(V) INa(t) INa(M2) ICa(V) Istretch IC Ifond
Conductance unitaire 28 pS
Sélectivité
K+>NH4+
>Cs
+>Rb+>Na+>
Li+>Ca2+
Cs+>Na+,K+
Densité 2 canaux/µm2
Niveau de courant 100nA (+50mV)
300nA (+50mV)
80 à 200 nA (-130mV)
33nA (+10mV)
470nA (+50mV)
60nA (-20mV)
Seuil d'activation -25mV -40mV -50mV
τactivation 18s (+55mV)
τinactivation
250ms (+10mV)
1s et 4s (-110mV)
H+ (pH5,8)+830%
Li+ -100%
Ca2+ IC50=340µM IC50=61µM
Mg2+ IC50=201µM
Co2+ -40% (3mM)
Ni2+ 0% (10 µM) -40% (3mM)
Gd3+ -100%
(10µM)
La3+ (100µM)-100% -40% (3mM)
Lu3+ (100µM)-100%
4-AP -40% (3mM)
DTX-I 0% (100nM)
ChTX 0% (100nM)
Apamine 0% (100nM)
β bungarotoxine 0% (100nM)
glibenclamide 0% (10µM)
MCD peptide 0% (100nM)
TTX (1mM)-100%
Vératridine 0%
BRL38226 IC50=150µM
ω conotoxine 0% (1µM)
Nicardipine 0% (10µM)
BayK 8644 0% (1µM)
Amantadine (10µM)-100%
Théophylline 0% (100µM)
AMPc +300%
(50 pmole)
IBMX 0% (100µM) ~ +300%(1 mM)
OAG +220%(2 µM)
Références :
(Baud et al., 1982; Baud
& Kado, 1984)
(Parker &
Miledi, 1987)
(Pinto et al., 1992)
(Dascal et al., 1986;
Bourinet et al., 1992)
(Methfessel et al., 1986;
Yang &
Sachs, 1989;
Yang &
Sachs, 1990)
(Arellano et al., 1995)
(Honoré &
Lazdunski, 1991b)
