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Méthodes de microscopie optique et électronique (TD1)
Introduction :
L’architecture cellulaire est fortement liée au fonctionnement intracellulaire: une cellule qui produit beaucoup de protéines aura beaucoup de ribosomes. Ces structures sont plus ou moins développées selon la fonction de la cellule observée. Il existe une étroite relation entre la morphologie cellulaire et la fonction de la cellule. En effet l’étude de la cellule nécessite l’utilisation de plusieurs méthodes et d’outils permettant d’explorer sa structure et son fonctionnement (figure1et2).
Figure 1 : Les dimensions des différents organites cellulaires.
Figure 2 : Synopsis général des techniques (différentes étapes d’étude de la cellule: de l'observation des tissus à la purification et l'analyse des macromolécules biologiques).
UAMOB 2020/2021 Page 2 I .Méthodes et techniques d’observation
1. Les microscopes
L’observation des cellules est délicate du fait de leurs très petites tailles. Elle nécessite un certain nombre d’appareillages dont les microscopes.
Définition : Le microscope est un instrument d’optique conçu pour observer des objets de très faible taille. Son invention remonte à 1590. Elle est attribuée, selon les auteurs, à Jansen, Drebbel ou van Leeuwenhoeck.
Les microscopes utilisent la déviation des particules :
non chargées, les photons, dans les microscopes photoniques (aussi appelé microscopes optiques).
chargées, les électrons, dans les microscopes électroniques.
Ces particules traversent un système de lentilles de manière à former une image agrandie d’un objet.
2. Les différents types de microscopes
On distingue deux grands types de microscopes suivant leur résolution : les microscopes optiques et les microscopes électroniques
2.1. Le microscope optique
2.1.1. Description du microscope optique (photonique)
Le microscope photonique ou optique courant à fond clair utilise de la lumière visible (radiations de 400 à 760 nm) et la qualité de l’image dépend du pouvoir séparateur qui donne la résolution du microscope limitée par la longueur d’onde de la radiation lumineuse. On obtient donc un grossissementX1000. Il est utilisé en microbiologie, parasitologie, cytologie et histologie..
Une caractéristique importante du microscope est son pouvoir de résolution. Il s'agit de la plus petite distance entre deux points. Le pouvoir de résolution des meilleurs microscopes avoisine les 0,2 μ.
La partie optique d’un tel microscope est composée de deux systèmes :
-L’objectif : c’est un système optique (de lentilles) : il permet de donner une image réelle agrandie de l’objet observé.
- L’oculaire : Un système de lentilles, qui donne une image virtuelle de cette dernière.
L’image finale se forme au niveau de l’œil ou d’un appareil photographique associé au microscope.
L'oculaire et l'objectif sont placés aux deux extrémités du tube optique: leur distance est constante.
La puissance d’un microscope est définie par le produit du grandissement de l’objectif par la puissance de l’oculaire.
La mise au point consiste à déplacer le bloc [objectif – tube – oculaire] à l'aide des boutons de réglage grossier et de réglage fin.
NB : Les différentes parties du microscope photoniques ainsi que son fonctionnement seront traités en séance de travaux pratiques.
2.1.2. Les différents microscopes optiques
Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications qui portent :
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Sur l’éclairage : Le microscope optique à fond noir : La cellule apparaît comme un objet brillant sur le fond noir.
Sur l’optique : Le microscope à contraste de phase différentielle : Le microscope à contraste de phase possèdent des systèmes optiques conçus pour exploiter les propriétés de diffraction des cellules vivantes.
Sur la source lumineuse: Pour les microscopes optiques à fluorescence la lumière reçue par l’œil ne traverse pas l’objet; ici on utilise des molécules fluorescentes appelées des fluorochromes, qui sont utilisées comme colorant. Les microscopes optiques à fluorescence nécessitent des cellules fixées, des coupes minces.
NB : ils existent des microscopes optiques ne nécessitant pas de coloration de l’échantillon.
2.2. Le microscope électronique
Son principe est comparable à celui du microscope photonique, à la différence près que le faisceau de photons est remplacé par un faisceau d’électrons. Il utilise des électrons et les lentilles sont électromagnétiques. La colonne surmontant l'installation est occupée par une cathode qui enverra les électrons, un système de refroidissement, et un système permettant de faire le vide (car les électrons ne voyagent pas dans l'air). En raison du faible pouvoir pénétrant des électrons, les échantillons doivent être sous forme de coupes ultrafines et donc soumises à des inclusions. Ces microscopes nécessitent la déshydratation de l’échantillon donc la mort des cellules.
2.2.1. Le microscope à transmission (MET)
Seul le microscope électronique à transmission est capable de révéler les détails intracellulaires. Son grandissement est de 20 000 et sa limite de résolution est de 0,1 à 1 nm.
Le MET ne permet pas d'observer les cellules vivantes. Plus la région de l’échantillon est épaisse, plus cette région de l’image est sombre puisque moins d’électrons touchent la région de l’écran fluorescent correspondante. Le vide doit être fait pour que le trajet des électrons soit linéaire.
Les coupes ultrafines de l'échantillon, placées sous vide, doivent être au préalable déshydratées, fixées puis imprégnés avec des métaux lourds (cuivre, nickel ou or) pour permettre le contraste entre les éléments intracellulaires.
2.2.2. Le microscope à balayage (MEB): consiste à balayer une préparation par un faisceau d’électrons permettant la mise en évidence des reliefs de l’échantillon. Les cellules entières seront fixées puis métallisées (afin de maintenir la forme de la cellule).
Le MEB ne permet que de voir des surfaces et non la structure interne des cellules.
Figure3 :Colonie de cocci Staphylococcus aureus observée en microscopie à balayage
(barre = 2 μm).
UAMOB 2020/2021 Page 4 3.Techniques de préparation des échantillons
3.1. Techniques des coupes :
Afin d’étudier des structures cellulaires on utilise un certain nombre de techniques: La préparation des coupes fines se fait en plusieurs étapes (fig.4) :
1. La fixation : la fixation des cellules permet leur immobilisation et leur conservation. Elle se fait par le formaldéhyde et le glutaraldéhyde.
2. La déshydratation permet l’élimination de l’eau de l’échantillon en la remplaçant par des solvants de types xylène et toluène. La déshydratation consiste en une série de bains dans des alcools de plus en plus concentrés. Cette opération doit être progressive pour que la substitution n’entraine pas de déformation des tissus. Un dernier bain est réalisé dans un mélange alcool/solvant organique du milieu d’inclusion, pour arriver enfin à avoir l’échantillon dans ce solvant pur: xylène, toluène.
3. L’inclusion : permet une solidification de l’échantillon, par leur polymérisation. Cette substance, dont les molécules remplacent en fait les molécules d’eau initiales, est souvent la paraffine qui est liquide à 60 °C et dure à la température ambiante. Elle soluble dans les solvants cités précédemment. elle pénètre dans les tissus. Après plusieurs bains à 60 °C et durcissement de la paraffine, on obtient un «bloc» qui pourra être correctement coupé. Ces blocs servent aussi de moyen de stockage des échantillons.
4. La coupe : la formation des coupes ultrafines est réalisée par des microtomes.
5. La colorationdes coupes se fait par différents types de colorants : Hématoxyline : noyau , Eosine : cytoplasme.
6. Le montage se fait entre lame et lamelle et rend la préparation observable.
3.2. Préparation des coupes ultrafines:
1. Fixation
Les fixateurs classiques ne suffisent pas car ils tendent à coaguler les protéines et à détruire les
structures fines. Il faut utiliser des agents chimiques qui ne les dénaturent ; cette fixation « en douceur
» stabilise les structures:
De ce fait, on combine les avantages des différents fixateurs en réalisant une double fixation : un traitement au glutaraldéhyde suivi d’un traitement au tétroxyde d’osmium.
– le tétroxyde d’osmium se comporte comme le précédent, mais il pénètre mal dans les cellules ; – le glutaraldéhyde pénètre bien dans les cellules, fixe efficacement de nombreuses structures, sauf les membranes.
2. Inclusion en résine
Le principe est le même que pour l’histologie classique, à la différence près que la déshydratation préalable doit se terminer dans un solvant de la résine utilisée pour l’inclusion. Les milieux d’inclusion utilisés sont souvent des résines qui polymérisent à chaud en présence d’un catalyseur. On obtient des petits blocs solides et très durs, incluant et imprégnant l’échantillon à analyser ; la dureté de ce matériel permet d’obtenir des coupes extrêmement fines et régulières
3. Coupe : ultramicrotomie
On découpe l'échantillon avec un Ultra-microtome plus sensible (avec un pas de 50nm). Le couteau est fait de diamant et dont le fil fait 3mm. La coupe est maintenant ultra-fine avec une épaisseur de 100nm.
Avant de couper avec l'ultramicrotome, on vérifie que l'échantillon est intéressant en faisant une coupe semi-fine. La coupe semi-fine aura une épaisseur de 0.5 microns, et pourra être colorée et observé au microscope optique.
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Figure 4 : Techniques cytologiques (microscope photonique)
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Séparation des constituants cellulaires (TD2)
Les méthodes d’analyse des constituants cellulaires ont pour objectif de :
1) Localiser des molécules simples ou complexes, au niveau des différentes structures cellulaires ou molécules constituant un échantillon biologique donné.
2) analyser leurs transformations chimiques ou leurs déplacements dans les cellules, (c’est-à-dire aborder le fonctionnement et la dynamique de la matière vivante.
II.1. Les méthodes de fractionnement cellulaire
Les méthodes de fractionnement subcellulaire consistent à séparer les différents composants cellulaires par destruction de la membrane plasmique, puis par désorganisation de la cellule.
a) Homogénéisation
Le but de l’homogénéisation est de rompre la membrane plasmique (ou la paroi pour les cellules végétales et fongique). Pour se faire on utilise un homogénéiseur est un tube de verre dans lequel on place la préparation puis un piston en verre. La cellule sera comprimée et éclatera libérant ainsi son contenu dans le tampon.
On obtient un homogénat avec tous les constituants de la cellule. La plupart des organites restent intactes, mais sans précaution particulière l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique vont être fragmentés sous forme de vésicules appelées microsomes.
b1) Centrifugation différentielle :
Elle permet de séparer les particules (organites, macromolécules, ...) en fonction de leur taille La centrifugation différentielle permet la séparation de l’homogénat en fonction de la taille et de la densité de ses constituants par une succession de centrifugations à des temps et des accélérations croissants. Pour se faire on centrifuge l’homogénat à différentes vitesses (Figure 7A), à chaque vitesse, différents organites se déposent dans le culot, qui sera prélevé :
A 600g, on observe la sédimentation du noyau et du cytosquelette.
A 100 000g (ultracentrifugation), on observe la sédimentation de la membrane plasmique, des microsomes et des grands polysomes.
A 15 000g, on observe la sédimentation des mitochondries, des lysosomes et des peroxysomes.
A 200 000g, on observe la sédimentation des ribosomes et des petits polysomes. Ce qui reste à la fin c’est la fraction hydrosoluble du cytosol.
B2) Centrifugation par gradient préformé
La centrifugation par gradient préformé consiste à déposer une mince couche d’homogénat au-dessus de la solution de saccharose dont la concentration varie de façon régulière et décroissante du bas vers le haut. Les différents constituants de l’homogénat sédimentent tous à des vitesses différentes, on obtient ainsi différentes bandes (la couche la plus dense étant au fond) que l’on séparera.
La vitesse de sédimentation dépend de la taille des molécules, de la forme des particules et de la densité. La vitesse de sédimentation est définie par le coefficient de sédimentation en unité Svedberg (S) (Figure 7B).
UAMOB 2020/2021 Page 7 (A) Centrifugation différentielle : L’homogénat initial obtenu à partir d’un fragment de tissuest fractionné, par 4 centrifugations de plus en plus fortes, en une série de 4 sédiments contenant des organites ou des particules de masse de plus en plus faible, et un surnageant final à partir duquel plus rien ne peut être sédimenté ( Les microsomes sont de petites vésicules provenant de la fragmentation de certains systèmes membranaires de la cellule au cours de l’homogénéisation.
