Eur J Med Chem ( 199 1) 26,723-727 0 Elsevier, Paris
723
Communication courte
Synthbse, activitk antiparasitaire et antifongique de thiourkines B motif aminoacide
R Caujollel, M Payardl, PR Loiseau 1, H Amarouchz, MD Linas3, JP StZgut5la3, C Bories4, PM Loiseau4, P Gayral4
IDepartement de chimie, fact& de pharmacie, 31, allees Jules-Guesde, 31000 Toulouse, France;
2Departement de biologie, faculte’ des sciences, I, route d’E1 Jadida, Casablanca, Maroc;
3Laboratoire de parasitologie et mycologic, CHU Rangueil, 31054 Toulouse;
4Faculte’ de pharmacie, 3, rue JB-Clement, 92290 Chatenay-Malabry, France (Re9u le 19 juillet 1990; accept6 le 5 mars 1991)
R&urn6 - Seize composes de type aryl ou aralkylthioureines possedant un motif @&nine ou y-aminobutyrique ont Ctk synthetises et Cvalues vis-a-vis de trois genres de nematodes ainsi que de huit souches de champignons filarnenteux opportunistes et de 34 souches de levures isolees de prelevements pathologiques. Si l’activite anthelminthique de tous ces composes est faible ou nulle, en revanche, sept d’entre eux presentent des CM1 moyennes inferieures a 50 pg/ml vis-a-vis des levures et/au des champignons opportunistes.
Summary - Synthesis, antiparasitic and antzfungic activity of thioureines with aminoacid chain. Sixteen compounds, close to aryl or aralkylthioureines, with a palanine or yLaminobutyric acid chain, were synthesized for in vitro screening towards 3 types of nematodes, 8 classes of opportunist germs and 34 classes of yeasts. Their anthelminthic activity was very weak, but on the other hand, 7 compounds were effective against yeasts andlor opportunist germs, with an MIC < 50 pglml.
thioureine / aminoacid I GABA i nematodicid / antifongic
Introduction
La recherche de substances antiparasitaires analogues ouverts du t&amisole (1) nous a precedemment conduits [l] a la synthese d’aminothiazolines (n = 1) et d’aminodihydrothiazines (n = 2) (2) substituees en position 2.
(n=1,2) (n=2,3)
1 2 3
Les composes 2 peuvent Ctre consider-es comme des isothiourees cyclisees et ont rev616 des actions nema- todicides interessantes; une approche de leur meca- nisme d’action biochimique a 6% realide en Cvaluant leur pouvoir inhibiteur vis-a-vis de la fumarate-reduc-
tase, enzyme intervenant dans le bilan dnergetique des nematodes.
Par ailleurs, Brewer et al [2] ont montre que des isothiourees derivant du tetramisole lui-mCme par substitution en 3 sur le groupement phenyle, posd- dent une activite nematodicide mais Cgalement cesto- dicide et tenicide, ce qui confirme ainsi le tropisme antiparasitaire du motif thiouree deja reconnu vis-a- vis des helminthes et principalement des nematodes [31.
Nous avons voulu prolonger ce travail en Ctudiant l’activite antiparasitaire des thioureines ouvertes du type 3 dans lesquelles on reconnait le motif p-alanine (n = 2) ou y-aminobutyrique (n = 3).
Ce demier aminoacide est un mediateur inhibiteur du systeme neuromusculaire des nematodes et nous avons pens6 que des molecules englobant ce groupe- ment pourraient se comporter comme des effecteurs du systbme gabaergique.
Cette propriete a CtC vCrifiCe pour l’acide 2-amino- thiazoline-4-acetique [4] et des composes non cycli- ques a motif thiouree [5].
Par analogie avec quelques composes a motif thia- zolique ou thiouree ayant des activites antifongiques
[6], nous avons complete notre etude par la mesure de l’effet inhibiteur des composes 3 vis-a-vis des levures (34 souches) et des champignons filamenteux oppor- tunistes (8 souches).
R&hats et discussion Chimie
Les derives 3 ont Cte obtenus selon le schema 1;
lorsque l’isothiocyanate n’est pas commercial, il est prepare a partir de l’amine correspondante 4 et reagit
&suite avec l’aminoacide.
R-NH2 + CS2 + (CpH5)3N -.->
4
R-NH-CS-S ,( CpH5)3NH+ + CICOOC$l5 ---a
R-NH-CS-S-CO-OC2H5 + ( %!-kkiN >
R-N&4 + NHp-( CH&-COOH --.->
Schema 1.
R-NH-E-S‘ .( C2H5)3NH+
5 R-NH-CS-S-CO-OC2H5
6 R-N&&
L
R-NH-CS-NH-( CH2)n-COOH 3 (n=2) ou (n=3)
L’obtention des composes intermediaires a Cte realisee selon Hodgkins et al [7]; pour la derniere
&ape, nous avons additionne lentement 51. la tempera- ture ambiante une solution aqueuse de l’amino- acide en presence d’une quantite stoechiometrique de soude a une solution acetonique de l’isothiocyanate, en adaptant le protocole utilise par Garmaise et al pour preparer la l-(2-carboxyCthyl)-3-phenylthio- urke [8].
Les caract&istiques des produits synthetises sont resumees dans le tableau I.
Activite’ vis-h-vis des levures
Sept composes sur 16 presentent une CM1 inferieure a 50 p-g/ml; l’activite parait davantage like a la nature du substituant aromatique qu’a la longueur de la chaine hydrocarbonee (n = 2 ou 3): ainsi les derives:
phenyl, phenethyl et 1-naphthyl ont des activites notables et cornparables (CM1 moyenne comprise entre 19 et 41 y&ml), qu’ils presentent un motif p- alanine ou y-aminobutyrique.
La nature du milieu de culture utilise semble sans influence sur l’activite des molecules vis-a-vis de toutes les souches qui se rev&lent sensibles.
11 n’appara?t aucune specificite pour une souche particulibre.
Tableau I. Carackistiques des produits synthetises.
R-NH-CS-NH-(CH,),-COOH 3 (n = 2 ou 3)
Compo- R n Rdt
(C, Formule
ses @)
3a CsHS 2 97 118-1191 C10H12N202S
3b GWHz 2 60 126-128 C,,H,z,N202S 3c C,HSCH2CH, 2 35 130-131 C,2H,&202S
3d P-CH~W~& 2 71 161 GfL,W3S
3e p-ClC6H4 2 70 158 C,oW,CWM
3f P-NW&H, 2 98 106-109 C,,H,,N304S 3g 1 -naphthyl 2 82 154 W&&W 3h 2-naphthyl 2 80 111-113 C,4H,,N,0,S
3i GK 3 98 133 W%&~W
3 W-W-b 3 71 139 CIZH,&@ZS
3k C6HSCH,CH, 3 27 135-137 C,3H,8NZ02S
31 p-CH30C6H., 3 65 134 G&WV
3m JFClC6H4 3 66 146 GJWNW
3n P-N&C&, 3 97 154-156 CllH,3N304S 30 1 -naphthyl 3 47 178-179 C,5H,6N202S
3P 2-naphthyl 3 42 166-168 C,SH16N202s
tLitt: 117.5-l 18.5 [8].
Activite’ vis-h-vis des champignonsfilamenteux opportunistes
Les composes 3c, 3g et 31 se distinguent par leur acti- vite; il est a noter que les CM1 relatives a 3c sont voisines de 10 pg/ml.
Pour ces trois produits, l’activite parait indepen- dante du milieu de culture et non specifique d’une souche donnee.
Activite’ anthelminthique
L’activite nematodicide de ces composes est faible ou nulle vis-a-vis des trois tests pratiques.
La presence d’un motif rappelant le GABA ne semble pas favorable a cette activite.
La diminution de lipophilie due au groupe carboxy- lique est un facteur defavorable a la penetration de la molecule en direction du systeme nerveux du parasite, les nematodes offrant w-tout une absorption transcuti- culaire [9]; le GABA ne se revble en effet actif pour les mCmes tests qu’a de t&s fortes concentrations
(loo0 I-W [lo].
Une relation structure-activite de mCme nature a CtC observee avec d’autres classes d’antiparasitaires comme les spiroarsoranes, bien que le site d’action soit different [ 111.
Conclusion
725 IR: 3325 NH; 1708 C=O; 754 C=S.
L’ensemble de ces resultats confirme le tropisme anti- parasitaire au sens large du motif thiouree: sur diverses souches de levures ou de contaminants opportunistes, les activites sont notables et indepen- dames du milieu de culture; le spectre est Ctendu vis- a-vis de toutes les souches tesdes qui sont sensibles d’une man&e equivalente; cependant, l’activite n’a pas CtC CvaluCe sur les dermatophytes.
L’activite nematodicide est tres faible, voire nulle, l’introduction d’un motif GABA n’apportant pas l’effet escompte, probablement en raison de la perte de lipophilie introduite par la presence du groupement carboxylique.
Protocoles expbrimentaux Chimie
L’obtention des isothiocyanates 7 a Cte prectdemment d&rite dans la reference [ 11.
Pour la preparation des derives 3, nous avons utilise le protocole suivant: 10 mmol de p-alanine ou d’acide y-amino- butyrique sont dissous dans 10 ml d’une solution normale de soude aqueuse; cette solution est ajoutee lentement a la tempe- rature du laboratoire a 10 mmol de l’isothiocyanate prealable- ment dissous dans 20 ml d’acetone en maintenant une agitation pendant 4 h. Le milieu reactiomrel est ensuite acidifie jusqu’a pH 4 par de l’HC1 dild et l’adtone Cvaporee sous vide; le produit brut qui precipite est ensuite recristallise dans l’alcool dilue au demi.
Les caracteristiques physicochimiques ainsi que les rende- ments figurent dans le tableau I.
Les donnees spectrometriques infrarouge (en pastilles dans KBr) et de RMN (en solution dans CD,OD a 60 MHz) sont repartees ci-apres.
1-(2-Carboxyethyl) 3-phe’nylthioure’e 3a
RMN 1H: 7.37 (m. 5H. aromatiaues): 5.30 (s. 3H Bchan- geables); 3,86 (t, 2H; CHiNH); 2,67’(t, %I, &,dd).
IR: 3402 NH; 1695 C=O; 738 C=S.
I -(2-Carboxykthyl) 3-benzylthiouree 3b
RMN tH: 7,33 (m, 5H, aromatiques); 4,90 (s, 3H Cchan- geables); 4,70 (s, 2H, C6H5CH2); 3,78 (s, 2H, NHCH,); 2,63 (t, 2H, C&CO).
IR: 3370 NH; 1705 C=O; 728 C=S.
I -(2-Carboqe’thyl) 3-phene’thylthiourte 3c
RMN tH: 7,33 (m, 5H, aromatiques); 4,90 (s, 3H tchan- geables); 3,77 (t, 2H, C6H.&!H2CH,NH); 3,65 (t, 2H, NHCH,- CH,CO; 3,5 1 (t, 2H, C,H,CH,CH,); 2,3 1 (t, 2H, CH,CO).
IR: 3420 NH; 1698 C=O; 725 C=S.
1-(2-Carboayethyl) 3-p-anisylthiouree 3d
RMN tH: 6,97 et 7,27 (d, 4H, aromatiques); 4,83 (s, 3H Cchan- geables); 3,86 (s, 3H, CH,O); 3,83 (t, 2H, NHCH,); 2,63 (t, 2H, Cl&CO).
I -(2-Carboxye’thyl) 3-p-chlorophe’nylthiouree 3e
RMN tH: 7.42 (m. 4H. aromatiaues): 4.93 (s. 3H Cchan- geables); 3,87 (t, 2H; CHiNH); 2,67’(t, %I, CH,dd).
IR: 3390 NH; 1700 C=O; 765 C=S.
I -(2-Carboxytthyl) 3-p-nitrophe’nylthiouree 3f
RMN tH: 8,20 et 7,78 (d, 4H, aromatiques); 4,88 (s, 3H Cchan- geables); 3,90 (t, 2H, CH,NH); 2,72 (t. 2H, COCH,).
IR: 3415 NH; 1736 C=O; 780 C=S.
I -(2-Carboxytthyl) 3-(1 -naphtyl)thiouree 3g
RMN 1H: 7.45 ?I 8.17 (m. 7H. aromatiaues): 4.90 (s. 3H Bchan- geables); 3,82 (t, 2H, CHiNH); 2,60 (t,iH,‘Ck,CG).
IR: 3388 NH; 1702 C=O; 780 C=S.
1-(2-Carboxyethyl) 3-(2.naphtyl)thiouree 3h
RMN tH: 7,40 a 8,13 (m, 7H, aromatiques); 4,88 (s, 3H Cchan- geables); 3,93 (t, 2H, CH,NH); 2,72 (t, 2H, UT&O).
IR: 3340 NH; 1708 C=O; 742 C=S.
I -(3-Carboxypropyl) 3-phenylthioure’e 3i
RMN 1H: 7,38 (m. 5H, aromatiques); 5,OO (s, 3H Cchan- geables); 3,60 (t, 2H, CH,NH); 2,33 (t. 2H, CH,CO); 1,90 (m, 2H, CH,CH,CH).
IR: 3335 NH; 1698 C=O; 738 C=S.
I-(3-Carboxypropyl) 3-benzylthioure’e 3j
RMN 1H: 7,40 (m, 5H, aromatiques); 4,92 (s, 3H Cchan- geables); 4,77 (s, 2H, C,HQf,); 3,55 (t, 2H, CH,NH); 2,37 (t.
2H, CH,CO); 1,87 (m, 2H, CH,CH,CH,).
IR: 3375 NH; 1704 C=O; 742 C=S.
I-(3-Carboxypropyl) 3-(2-phe’nyle’thyl)thiouree 3k
RMN 1H: 7.27 (m. 5H. aromatiaues): 4.96 (s. 3H echaneea- bles); 3,65 (t, 2H, C,H,CH,CH,NH); 3,57 (t, %I, NHCH,CH,- CHJ; 3,43 (t, 2H, NHCH#ZH& 2,33 (t. 2H, CH,CO); 1,85 (m.
2H, CH2CH2CH2).
1-(3Carboxypropyl) 3-p-anisylthioure’e 31
RMN 1H: 7,27 et 6,92 (2d, 4H, aromatiques); 4,85 (s, 3H Bchangeables); 3,80 (s, 3H, CH,O); 3,57 (t, 2H, CH,NH); 2,33 (t, 2H, CH,CO); 1,88 (m, 2H, CH&H&HJ.
IR: 3360 NH; 1685 C=O; 734 C=S.
I-(3-Carboxypropyl) 3-p-chlorophknylthiouree 3m
RMN 1H: 7,39 (m, 4H, aromatiques); 4,97 (s, 3H Cchangea- bles); 3,63 (t, 2H, CH,NH); 2,40 (t, 2H, CH,CO); 1,93 (m, 2H, CH2CH,CH2).
IR: 3375 NH; 1710 C=O; 735 C=S.
1-(3-Carboxypropyl) 3-p-nitrophe’nylthiouree 3n
RMN tH: 8,22 et 7,80 (2d, 4H, aromatiques); 4,88 (s, 3H Cchangeables); 3,68 (t, 2H, CH,NH); 2,43 (t, 2H, CH,CO);
1,97 (m. 2H, CH,CH,CH,). - IR: 3395 NH; 1698 C=O; 725 C=S.
I -(3-Carboxypropyl) 3-(1 -naphtyl)thiouree 30
RMN *H: 7,40 a 8,18 (m, 7H, aromatiques); 4,77 (s, 3H echan- geables); 3,63 (t. 2H, CH,NH); 2,33 (t, 2H, (X&O); 1,90 (m, 2H, CH,CH,CH,).
IR: 3390 NH; 1700 C=O; 776 C=S.
I -(3-Carboxypropyl) 3-(2-naphtyl)thiouree 3p
RMN 1H: 7,33 a 8,07 (m, 7H, aromatiques); 4,85 (s, 3H Cchan- geables); 3,67 (t, 2H, CH,NH); 2,40 (t. 2H, CH,CO); 2,00 (m, 2H, CH,CH,CH,).
IR: 3416 NH; 1720 C=O; 762 C=S.
No Milieu de C albicans
culture CMI MOY
C krusei C glabrata C tropicalis C parapsil
CMI MOY CMI MOY CMI MOY CMI MOY
3a YNBG 324 33 32-64 41 324 40 32-64 44 32-64 41
CAS 324 41 32-64 41 324 39 32-64 49 324 39
3c YNBG 32-64 39 32-64 49 324 53 32-64 52 32-64 39
CAS 324 53 32-64 49 32-64 53 64-128 93 32-64 41
3g YNBG 16-32 19 16-32 22 1632 27 16-32 19 16-32 21
CAS 16-32 22 16-32 22 16-32 29 1632 29 16-32 21
3i YNBG 32-64 39 32-64 43 32-64 49 32-64 49 324 35
CAS 64-128 78 64-128 79 64128 76 32-64 49 324 38
3k YNBG 32-64 40 32-64 39 32-64 38 32-64 53 32-64 34
CAS 3264 39 64-128 69 324 38 64-128 72 3264 34
31 YNBG 16-32 19 1632 22 16-32 20 32-64 35 1632 19
CAS 1632 19 16-32 29 1632 30 32-64 42 1632 22
30 YNBG 324 35 32-64 41 32-64 44 324 49 16-32 27
CAS 324 39 32-64 41 324 59 324 49 32-64 38
Econazole 8-16 11 8-16 16 8-16 13 324 28 16-32 20
Activite’ antifongique
Les spectres d’activite antifongique ont BtC realises par la mesure des concentrations minimales inhibitrices (CMI).
Nous avons utilise la m&ode de dilution en gelose sur deux milieux de culture differents: milieu Yeast Nitrogen Base Glucose a 2% (YNBG) et milieu casitone (CAS); les proto- coles utilises ont Cte anterieurement d&its [ 12, 131 et sont resumes ci-apres.
Me’thode de de’termination de la concentration minimale inhi- bitrice (CMI)
Les composes sont dissous dam le dimethylsulfoxyde (DMSO) a 10% dans l’eau, puis des dilutions au demi sont alors reali- sees a partir des solutions meres avec le meme solvant.
1 ml de chaque dilution de produit a tester est melange a 19 ml du milieu gelose; les concentrations finales sont 128, 64, 32, 16, 8,4, 2 et 1 pg/ml.
Pour chaque s&e d’essai, nous realisons deux temoins: un temoin de croissance des souches utilisees est r&lid avec 20 ml du milieu gClosC qui servira comme reference pour la lecture des resultats; un temoin solvant est prepare en m&n- geant 19 ml de milieu gClosC liquefie a 1 ml de DMSO a 10%;
il permet de mettre en evidence une Cventuelle action du solvant sur la croissance des champignons.
Levures
Candida albicans 25 souches + Candida AFWOR (ATCC 2094) Candida parapsilopsis 4 souches
Candida tropicalis 4 souches
Candida krusei 1 souche
Candida glabrata 1 souche
Champignons opportunistes Aspergillus fumigatus 2 souches
Aspergillus niger 2 souches
Aspergillus flaws 2 souches
Scopulariopsis 2 souches
brevicaulis
Tableau III. CM1 vis-a-vis des champignons filamenteux opportunistes (en p&ml). Ne figurent dam ce tableau que les resul- tats relatifs aux composts pour lesquels les CM1 sont inferieures a 128 l&ml, les autres &ant consider& comme inactifs.
No Milieu de culture
A fumigatus
CMI MOY
A flavus A niger SC brevicaulis
CMI MOY CMZ MOY CMI MOY
3c YNBG CAS 8-16 8-16 ; 1632 8-16 10 17 8-16 8-16 ; 8-16 8-16 ;
% YNBG CAS 32-64 3264 2: 32-64 32-64 z; 32-64 324 39 32-64
z
32-64 i’:
31 YNBG 32-64 34 32-64 35 324 32-64 33
CAS 32-64 34 32-64 44 324 35 32-64
Econazole 2-4 4 2-4 4 l-2 2 32-64 ii
727 Tableau IV. Activites anthelmintbiques CEsO (en l&ml). Les composes pour lesquels la CE,, est superieure a 200 pg/ml sont consider& comme inactifs (I).
No L3 de M dessetae Larves et ad&es L3 de N brasiliensis
invitroh7j de R pseudoelongata ci 2 h invitrod4j
3a I I I
3b I 100 I
3c 30 I 100
3d I I I
3e 100 100 I
3f I I I
33 100 I I
3h 50 50 120
3i I 60 I
4 I 50 I
3k 10 75 I
31 I I I
3m I 60 I
3n 175 I 300
30 40 I I
3P 100 I I
Tetramisole 3 074 02
Tomes les souches Btudiees ont Bte isolees au Centre Hos- pitalier Universitaire de Toulouse-Rangueil, et proviennent de divers prelkements pathologiques.
Preparation de I’ inoculum
Levures. L’inoculum est prepare a partir des colonies de levures qui sont a leur phase de croissance exponentielle; a partir d’tme culture de 24 h a 37°C sur gelose de Sabouraud glucosee, on Bmulsionne une partie aliquote de la souche testee dans 10 ml d’eau distillee sterile.
La densite cellulaire de cette suspension est Cvaluee par comptage a l’aide d’une cellule hematimetre de Thoma; elle est ajustee par dilution adequate dans l’eau distill&e sterile a la valeur de 107 blastopores par ml.
La mesure de la densite optique de cette suspension nous a servi pour la determination et I’ajustage des blastopores des autres suspensions.
Champignons opportunistes. Nous avons utilise des cultures de 5 a 8 jours permettant de travailler avec des spores; les spores sont recup&ees et mises en suspension dans l’eau distil- lee sterile et la densite cellulaire est ajustee par dilution adequate dam de l’eau distillee sterile a la valeur de 107 spores par ml.
Lecture des resultats
Les lectures sont faites apres 48 h d’incubation a 36°C par rapport aux boites temoins.
Les resultats, report& dans les tableaux II et III, indiquent les limites inferieures et superieures des CM1 observees ainsi que leur moyenne (3 essais r&h&s pour chaque produit et chaque milieu).
Activite nematodicide
L’activite nematodicide a Cte Cvalute sur trois modtles in vitro selon des protocoles anterieurement d&its [l]: un nematode libre, Rhabditis pseudoelongata; des larves infectantes d’un nematode parasite de l’intestin du rat, Nippostrongylus brasi-
liensis; des larves infectantes dune filaire parasite des ron- geurs, Molinema dessetae.
Les resultats rep6rtes dans le tableau IV sont exprimes en concentration efficace 50 (CE,, en pg/ml).
Remerciements
Les essais sur nematodes ont Cte realises avec l’aide de l’universite Paris-Sud (contrat AT no 21).
RCf&ences 1
5 6 7 8 9 10 11 12 13
Caujolle R, Amarouch H, Payard M, Loiseau PR, Bories C, Loiseau PM, Gayral P (1989) Eur J Med Chem 24,287-292
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