HAL Id: tel-01980920
https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01980920
Submitted on 14 Jan 2019HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
cardiaques humaines dans un but thérapeutique
Oualid Ayad
To cite this version:
Oualid Ayad. Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique. Biologie moléculaire. Université de Poitiers, 2017. Français. �NNT : 2017POIT2303�. �tel-01980920�
THESE
Pour l’obtention du Grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016) Ecole Doctorale : Biologie-santé
Secteur de Recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie Présentée par :
Oualid AYAD
************************
Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique
************************
Directeurs de Thèse : Pr. Patrick Bois & Dr. Aurélien Chatelier ************************
Soutenue le 12 décembre 2017 Devant la Commission d’Examen
************************
JURY
C. VANDIER Professeur, Université de Tours Rapporteur
E. DEVAL CR CNRS, IPMC, Nice Rapporteur
A. ARIES Chercheur, IRHT, Mulhouse Examinateur
V. CORONAS Professeur, Université de Poitiers Examinateur
A. CHATELIER MCU, Université de Poitiers Examinateur
P. BOIS Professeur, Université de Poitiers Examinateur
Sommaire
1
SOMMAIRE
TABLE DES ILLUSTRATIONS ... 8
ABREVIATIONS ... 12
INTRODUCTION ... 16
Chapitre I : Cellules souches et régénération tissulaire ... 16
1 Historique ... 16
2 Propriétés des cellules souches ... 17
2.1 L’auto-renouvellement ... 17
2.2 Pouvoir de différenciation en plusieurs lignages cellulaires ... 18
3 Types et potentiels de différenciation des cellules souches humaines : ... 19
3.1 Les cellules souches embryonnaires (CSEs) : ... 20
3.1.1 Les cellules souches totipotentes : ... 20
3.1.2 Les cellules souches pluripotentes : ... 21
3.2 Les cellules souches adultes: ... 21
3.2.1 Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) ... 22
3.2.2 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) ... 24
3.2.3 Les cellules souches du tissu adipeux ... 27
3.2.4 Les cellules progénitrices endothéliales ... 27
3.2.5 Les cellules souches de l’épithélium intestinal : ... 29
3.2.6 Les cellules souches de l’épiderme ... 31
3.2.7 Les cellules souches de l’épithélium pulmonaire ... 32
3.2.8 Les cellules souches de la cornée et de la rétine ... 33
3.2.9 Les cellules souches/progénitrices hépatiques ... 35
3.2.10 Les cellules souches neurales (CSNs) du système nerveux central ... 36
3.2.11 Les cellules souches musculaires squelettiques ... 39
3.2.12 Les cellules souches cardiaques ... 41
Chapitre II : Cellules souches et progéniteurs cardiaques ... 43
1 Nature des cellules souches cardiaques ... 43
2 Types des cellules souches cardiaques... 45
2.1 Les CSCs c-kit positives (CSC c-kit+) ... 45
2.2 Les CSCs Sca1 positives (CSC Sca1+) ... 48
2.3 Les CSCs Isl-1 positives (CSCs Isl-1+)... 50
2
2.5 Les cellules dérivées des cardiosphères (CDCs) ... 53
2.6 Les CSCs W8B2 positives (CSC W8B2+) ... 54
3 Modulateurs de la différenciation in vitro des CSCs adultes en cardiomyocytes ... 56
3.1 La 5-azacytidine ... 57 3.2 Le TGF-b: ... 58 3.3 L’acide ascorbique : ... 59 3.4 L’acide rétinoïque : ... 60 3.5 La dexaméthasone :... 61 3.6 L’ocytocine: ... 61
Chapitre III : Physiologie des cellules souches /progéniteurs cardiaques ... 62
1 Le calcium : ... 62
1.1 Le calcium dans les cellules souches: ... 62
1.1.1 L’activité calcique spontanée dans les cellules souches: ... 63
1.1.2 Canaux VGCC et signalisation calciques ... 64
1.1.3 Les stocks calciques intracellulaires dans les cellules souches: ... 67
1.2 Le calcium dans les cellules souches/progéniteurs cardiaques: ... 67
2 Les canaux ioniques : ... 70
2.1 Les canaux ioniques dans les CSEs: ... 70
2.2 Les canaux ioniques dans les CSMs: ... 71
2.3 Les canaux ioniques dans les cellules souches/progéniteurs neurales: ... 72
2.4 Les canaux ioniques dans les CSCs: ... 73
3 Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation des cellules souches: ... 73
3.1 Prolifération ... 73
3.2 Différenciation : ... 75
POSITION DU PROBLEME ... 76
MATERIELS ET METHODES ... 78
I- Isolement et purification des CSCs W8B2+ à partir d’échantillons humains d’oreillettes droites 78 1 Isolement des CSCs W8B2+ avec la méthode des explants ... 78
2 Purification des CSCs W8B2+ ... 79
2.1 Enrichissement en CSCs W8B2+ par le système du tri cellulaire magnétique positif: ... 79
2.1.1 Principe : ... 79
2.1.2 Protocole expérimental : ... 81
2.2 Purification des CSCs W8B2+ par le système de tri cellulaire par cytométrie en flux: ... 82
2.2.1 Principe: ... 82
Sommaire
3
II- Immunophénotypage des CSCs W8B2+ ... 87
III- Conditions de culture et entretien des CSCs W8B2+ ... 88
IV- Congélation/décongélation des CSCs W8B2+ ... 89
V- Test de formation de colonies (CFU-Fs). ... 89
1 Principe : ... 89
2 Protocole expérimental: ... 89
VI- Test de prolifération par comptage cellulaire ... 90
1 Principe : ... 90
2 Protocole expérimental: ... 90
VII- Test de blessure (wound healing assay) ... 90
1 Principe : ... 90
2 Protocole expérimental : ... 91
VIII- Test de viabilité cellulaire ... 91
1 Principe : ... 91
2 Protocole expérimental: ... 92
IX- Analyse du cycle cellulaire avec l’iodure de propidium ... 92
1 Principe : ... 92
2 Protocole expérimental : ... 92
X- Immunocytochimie indirecte ... 93
1 Principe : ... 93
2 Protocole expérimental : ... 93
XI- Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+... 94
1 Principe : ... 94
2 Protocole expérimental : ... 94
XII- Imagerie calcique ... 95
1 Principe : ... 95
2 Protocol expérimental : ... 96
XIII- RT-PCR « Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction » ... 98
1 Principe : ... 98
2 Protocole expérimental : ... 98
2.1 Extraction des ARNs totaux ... 99
2.1.1 Extraction des ARNs totaux à partir des CSCs W8B2+ adhérentes en culture : ... 99
2.1.2 Extraction des ARNs totaux à partir des EODHs : ... 99
2.2 Rétro-transcription ou RT (Reverse Transcription): ... 100
2.3 Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 100 XIV- RT-qPCR « Reverse Transcription- quantitative Polymerase Chain Reaction » en SybrGreen 101
4
1 Principe : ... 101
2 Protocole expérimental : ... 101
2.1 qPCR avec la technologie SybrGreen ... 102
2.2 RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (TaqMan Low Density Custom Array) ... 102
2.2.1 Principe: ... 102
2.2.2 Extraction des ARNs totaux ... 102
2.2.3 Transcription inverse ou RT (Reverse Transcription): ... 103
2.2.4 qPCR avec la technologie TaqMan ... 103
XV- Western blot ... 106
1 Principe: ... 106
2 Protocole expérimental: ... 107
XVI- Patch clamp ... 108
1 Principe : ... 108
2 Protocole expérimental : ... 108
XVII- Tests statistiques ... 109
RESULTATS ... 110
Chapitre I : Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ ... 110
I- Isolement et caractérisation phénotypique des CSCs W8B2+ ... 111
1 Isolement des CSCs W8B2+ ... 111
2 Capacités d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+ ... 111
3 Immunophénotype des CSCs W8B2+ ... 114
II-Caractérisation génique des CSCs W8B2+ ... 115
1 Profil d’expression des marqueurs cardiaques ... 115
1.1 Profil d’expression génique des facteurs de transcription cardiaques ... 115
1.2 Profil d’expression génique des structures contractiles cardiaques ... 117
1.3 Profil d’expression génique des connexines cardiaques. ... 118
1.4 Profil d’expression génique des peptides natriurétiques... 119
2 Profil d’expression génique des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+ ... 119
2.1 Profil d’expression génique des canaux sodiques dans les CSCs W8B2+ ... 120
2.2 Profil d’expression génique des canaux potassiques dans les CSCs W8B2+ ... 121
2.3 Profil d’expression génique des canaux HCN dans les CSCs W8B2+ ... 127
2.4 Profil d’expression génique des canaux calciques dans les CSCs W8B2+ ... 128
2.5 Profil d’expression génique des transporteurs ioniques dans les CSCs W8B2+ ... 129
3 Profil d’expression génique des acteurs de l’homéostasie calcique dans les CSCs W8B2+ ... 130
III-Caractérisation fonctionnelle des CSCs W8B2+ ... 131
Sommaire
5 1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des marqueurs cardiaques ... 132
1.1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des facteurs de transcription cardiaques ... 132 1.1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des structures contractiles cardiaques ... 134 1.1.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des connexines cardiaques ... 136 1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux ioniques ... 137
1.2.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux sodiques ... 137 1.2.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux potassiques ... 138 1.2.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux HCN ... 142 1.2.4 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux calciques ... 143 1.2.5 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des transporteurs ioniques et/ou des acteurs de l’homéostasie calcique ... 145 2 Etude de l’activité calcique au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ . 151
2.1 Signature de l’activité spontanée calcique au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 151 2.2 Evolution des paramètres calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 153
2.2.1 Evolution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 153 2.2.2 Evolution de l’amplitude des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 155 2.2.3 Evolution de la durée des oscillations calciques au cours de la différenciation
cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 155 2.2.4 Evolution de l’aire des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 155 2.2.5 Evolution du TTP (time to peak) des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 157 2.2.6 Evolution du TTR (time to recovery) des oscillations calciques au cours de la
différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 157 2.2.7 Evolution des pentes 1 et 2 des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 158 2.2.8 Evolution du pourcentage du temps d’activité calcique au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 160
6 2.3 Identification des acteurs impliqués dans la génération des oscillations calciques dans les
CSCs W8B2+ différenciées ... 161
2.3.1 Effet de l’inhibition de l’échangeur NCX sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours... 161
2.3.2 Effet de l’inhibition de la SERCA sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours ... 162
2.3.3 Effet de l’inhibition des canaux CaV de type L sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours... 163
2.3.4 Effet de l’inhibition des récepteurs à l’IP3 sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours... 164
2.3.5 Effet de l’inhibition des récepteurs à la ryanodine sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours ... 170
Chapitre II : Rôle du canal BKCa dans la régulation de la prolifération et de l’auto-renouvellement des CSCs W8B2+ ... 172
1 Cadre de l’étude ... 172
2 Résumé des résultats ... 173
3 Article scientifique: « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS EXPRESSING W8B2». ... 174
4 BKCa et oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées ... 192
Chapitre III : Effets de la sphingosine 1-phosphate sur les propriétés des CSCs W8B2+ ... 196
1 Contexte bibliographique ... 196 1.1 S1P et signalisation ... 196 1.2 S1P et tissu cardiaque ... 197 1.3 S1P et cellules souches ... 198 2 Contexte de l’étude ... 198 3 Résultats ... 199
3.1 Profil d’expression des cinq récepteurs à la S1P dans les CSCs W8B2+ ... 199
3.2 Effet de la S1P sur les capacités prolifératives des CSCs W8B2+ ... 201
3.3 Implication des S1PR dans l’effet antiprolifératif de la S1P observé dans les CSCs W8B2+ 204 3.4 Effet de la S1P sur les propriétés d’auto-renouvellement des CSCs W8B2+ ... 205
3.5 Effet de la S1P sur les capacités migratoires des CSCs W8B2+ ... 206
DISCUSSION ... 207
I-Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ ... 207
II-Profil d’expression génique des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+ ... 208
III-Rôle des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+ ... 209
IV-Profil d’expression génique des acteurs calciques dans les CSCs W8B2+ ... 211
V-Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 213
Sommaire
7
2 Profil des transcrits codant pour les canaux ioniques ... 215
3 Oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 219
4 La sphingosine 1-phosphate (S1P) joue un rôle important dans les CSCs W8B2+ ... 223
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... 227
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 230
RESUME ... 266
8
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Liste des figures
Figure H-1 : Hiérarchie de la différenciation des cellules souches. ... 19
Figure H-2 : La hiérarchie des cellules souches. ... 20
Figure H-3 : Les cellules souches hématopoïétiques ... 23
Figure H-4 : Les cellules souches mésenchymateuses ... 25
Figure H-5 : Les cellules progénitrices endothéliales ... 28
Figure H-6 : Les cellules souches intestinales ... 30
Figure H-7 : Les cellules souches de l'épiderme interfolliculaire ... 32
Figure H-8 : Les cellules souches de l’épithélium pulmonaire ... 33
Figure H-9 : Les cellules souches du limbe scléro-cornéen ... 34
Figure H-10 : Les cellules progénitrices hépatiques ... 36
Figure H-11 : Les cellules souches neuronales ... 38
Figure H-12 : Les cellules satellites du muscle strié squelettique ... 40
Figure H-13 : Concept des cellules souches cardiaques ... 42
Figure H-14 : Hiérarchie de la croissance et de la différenciation des cellules souches cardiaques... 44
Figure H-15 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant c-kit et de leur pouvoir de différenciation ... 46
Figure H-16 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant Sca-1 et de leur pouvoir de différenciation ... 50
Figure H-17 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant BCRP et de leur pouvoir de différenciation ... 53
Figure H-18 : Illustration schématique de l’expression fonctionnelle des canaux et récepteurs calciques au cours de la différenciation des CSEs et des CSMs (du tissu adipeux et de la moelle osseuse) ... 66
Figure H-19 : Voies de signalisations majeures impliquées dans le maintien de la pluripotence ou de la favorisation de la différenciation des cellules souches cardiaques ... 69
Figure H-20 : Structure chimique de la sphingosine 1-phosphate ……….196
Figure MM-1 : Schéma du protocole d’isolement et de purification des CSCs W8B2+ à partir des échantillons auriculaires humains ... 78
Figure MM-2 : Schéma du principe de la technique du tri cellulaire magnétique positif ... 80
Figure MM-3 : Schéma simplifié du principe de la technique du tri cellulaire par FACS ... 83
Figure MM-4 : Schéma simplifié du principe du fonctionnement d’un cytomètre de flux ... 84
Figure MM-5 : Schéma simplifié des paramètres clés mesurés par le cytomètre de flux ... 85
Figure MM-6 : Schéma simplifié du protocole de différenciation cardiaque in vitro utilisé pour différencier les CSCs W8B2+ ... 95
Figure MM-7 : Schéma du Mécanisme d’action de la GCaMP ... 95
Figure MM-8 : Exemple d’image de fluorescence obtenue lors des oscillations calciques après traitement avec le logiciel Image J... 97
Figure MM-9 : Tracé d’une oscillation calcique obtenue au 28ème jour de différenciation montrant les différents paramètres calculés avec le logiciel IDL ... 98
Figure R-1 : Proportions des CSCs W8B2+ durant les différentes étapes de purification ... 112
Figure R-2 : Morphologie des CSCs W8B2+ isolées et des colonies formées ... 113
Table des illustrations
9 Figure R-4 : Pourcentage des CSCs W8B2+ positives pour les marqueurs de surface indiqués
déterminé par cytométrie en flux... 114 Figure R-5 : Profil d’expression des facteurs de transcription cardiaques dans les CSCs W8B2+ ... 116 Figure R-6 : Profil d’expression génique des structures contractiles cardiaques dans les CSCs W8B2+
... 117 Figure R-7 : Profil d’expression génique des connexines cardiaques dans les CSCs W8B2+ ... 118 Figure R-8 : Profil d’expression génique des peptides natriurétiques de type A et de type B dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 119 Figure R-9 : Profil d’expression génique des canaux sodiques voltage-dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 120 Figure R-10 : Profil d’expression génique des sous-unités alpha des canaux potassiques voltage-dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 122 Figure R-11 : Caractérisation de l’expression des ARNm codant pour KV4.2 et KV4.3 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ... 122 Figure R-12 : Profil d’expression génique des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage-dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 123 Figure R-13 : Caractérisation de l’expression des ARNm codant pour KCa1.1, KCa3.1 et KCa2.1 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ... 124 Figure R-14 : Profil d’expression génique des canaux potassiques TWIK et TASK dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 125 Figure R-15 : Profil d’expression génique des canaux potassiques rectifiants entrants (avec leurs sous-unités régulatrices) et le courant sensible au baryum enregistré dans les CSCs W8B2+ ... 126 Figure R-16 : Profil d’expression génique des canaux HCN dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 127 Figure R-17 : Profil d’expression génique des canaux calciques dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 129 Figure R-18 : Profil d’expression génique des échangeurs Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 130 Figure R-19 : Profil d’expression génique des acteurs impliqués dans l’homéostasie calcique dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 131 Figure R-20 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des facteurs de transcription cardiaques ... 133 Figure R-21 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des structures contractiles cardiaques ... 135 Figure R-22 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des peptides natriurétiques de type A et de type B déterminé par RT-qPCR ... 136 Figure R-23 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des connexines déterminé par RT-qPCR ... 137 Figure R-24 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux sodiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ... 138 Figure R-25 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ... 139 Figure R-26 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ... 140 Figure R-27 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux potassiques TWIK et TASK déterminé par RT-qPCR ... 141 Figure R-28 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des sous-unités régulatrices et des canaux potassiques rectifiants entrants déterminé par RT-qPCR ... 142
10 Figure R-29 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux HCN déterminé par RT-qPCR ... 143 Figure R-30 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des canaux calciques déterminé par RT-qPCR ... 144 Figure R-31 : Courant dynamique enregistré sur les CSCs W8B2+ différenciées en configuration cellule-entière ... 145 Figure R-32 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des échangeurs Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 déterminé par RT-qPCR ... 146 Figure R-33 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ sur l’expression génique des acteurs impliqués dans l’homéostasie calcique déterminé par RT-qPCR ... 147 Figure R-34 : Regroupement hiérarchique des gènes dans les CSCs W8B2+, les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque (Diff) et les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation optogénétique du CHR2 ... 150 Figure R-35 : Types d’activités calciques spontanées enregistrées au 2ème jour et au 28ème jour de différenciation des CSCs W8B2+ ... 152 Figure R-36 : Evolution de la fréquence et de l’amplitude de l’activité calcique spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ... 154 Figure R-37 : Evolution de la durée et de l’aire de l’activité calcique spontanée au cours des 4
semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ... 156 Figure R-38 : Evolution de TTP et de TTR de l’activité calcique spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+... 158 Figure R-39 : Evolution de la pente 1 et de la pente 2 de l’activité calcique spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ... 159 Figure R-40 : Evolution du temps d’activité exprimé en pourcentage de l’activité calcique spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ... 160 Figure R-41 : Effet de SEA-0400 sur l’activité calcique spontanée enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 162 Figure R-42 : Effet de la thapsigargine sur l’activité calcique spontanée enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 163 Figure R-43 : Effet de la nifédipine sur l’activité calcique spontanée enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 164 Figure R-44 : Effet de la xéstospongine C sur les l’amplitude, la fréquence, l’aire et la durée des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation
... 165 Figure R-45 : Effet de la xéstospongine C sur le TTP , le TTR , la pente1 , la pente 2 et le pourcentage du temps d’activité des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 166 Figure R-46 : Effet du 2-APB sur l’amplitude, la fréquence, l’aire et la durée des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 168 Figure R-47 : Effet du 2-APB sur le TTP , le TTR , la pente1 , la pente 2 et le pourcentage du temps d’activité des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 169 Figure R-48 : Effet de la ryanodine sur l’amplitude, la fréquence, l’aire et la durée des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 170 Figure R-49 : Effet de la ryanodine sur le TTP , le TTR , la pente 1 , la pente 2 et le pourcentage du temps d’activité des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 171
Table des illustrations
11 Figure R-50 : Effet de la paxilline sur l’activité calcique spontanée enregistrée sur les CSCs W8B2+
après 28 jours de différenciation ... 192
Figure R-51 : Effet de la paxilline sur l’amplitude, la fréquence, l’aire et la durée des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 194
Figure R-52 : Effet de la paxilline sur le TTP , le TTR , la pente 1 , la pente 2 et le pourcentage du temps d’activité des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ... 195
Figure R-53 : Caractérisation de l’expression des ARNm codant pour les récepteurs à la sphingosine 1 phosphate de type 1 (S1PR1) et de type 2 (S1PR2) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ... 199
Figure R-54 : Caractérisation de l’expression des ARNm codant pour les récepteurs à la sphingosine 1 phosphate de type S1PR3, de type S1PR4 et de type S1PR5 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ... 200
Figure R-55 : Profil d’expression génique des cinq récepteurs à la S1P (S1PR1, S1PR2, S1PR3 S1PR4 et S1PR5) dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ... 201
Figure R-56 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence de la S1P ou en situation contrôle ... 202
Figure R-57 : Test de viabilité cellulaire des CSCs W8B2+ par cytométrie en flux en présence de S1P ou en situation contrôle ... 202
Figure R-58 : Analyse du cycle cellulaire par cytométrie de flux en présence de la S1P ou en situation contrôle ... 203
Figure R-59 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ en présence de la S1P, S1P + JTE013 , S1P + W146, S1P + BML241 ou en situation contrôle ... 204
Figure R-60 : Test de formation de colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la S1P , S1P+JTE013, S1P+W146 ou en situation contrôle ... 205
Figure R-61 : Test de migration cellulaire après 7 heures en présence de la S1P, S1P+JTE013, S1P+W146 ou en situation contrôle ... 206
Figure D-1 : Modèle hypothétique d’un potentiel d’action généré par une cellule W8B2+différenciée ... 218
Figure C-1 : Shéma récapitulatif des principaux gènes dont l’expression varie après différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ... 229
Liste des tableaux Tableau H-1 : Principaux marqueurs des cellules souches cardiaques (CSCs) ... 45
Tableau H-2 : Protocoles de différenciation cardiaques utilisés pour différents types de CSCs ... 57
Tableau MM-1 : Liste des anticorps utilisés pour l’immunophénotypage par cytométrie en flux ... 88
Tableau MM-2 : Liste des anticorps utilisés pour l’immunocytochimie indirecte ... 94
Tableau MM-3 : Liste des amorces sens et anti-sens utilisées pour la PCR ... 101
Tableau MM-4 : Liste des sondes et des 96 gènes analysés par TLDA ... 104
Tableau MM-5 : Liste des anticorps utilisés pour le Western Blot ... 107
Tableau R-1 : Etat d’expression des principaux gènes dont l’expression varie avant et après différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ... 148
12
ABREVIATIONS
A
AA : acide ascorbique
ADN:acide désoxyribonucléique
ADNc: acide désoxyribonucléique complémentaire ADSCs: adipose-derived stem cells
ALP: alkaline phosphatase ANG:Angiopoietin ANKB:ankyrine B
ANP:atrial natriuretic factor ARN:acide ribonucléique ATP:adénosine triphosphate
ATF2: activating transcription factor 2 AT2: alveolar type 2
B
BCRP: breast cancer resistance protein
BKCa : Large conductance calcium-activated potassium channel BMSCs: bone marrow stromal cells
BNP: brain natriuretic peptide BrdUrd: bromodésoxyuridine
C
Ca2+: calcium ion CaM: calmoduline
CaMK-II: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II CD: Cluster of differentiation
CDCs : cellules dérivées des cardiosphères CFU-Fs: colony-forming unit-fibroblasts ChR2: channelrhodopsins 2
Cl- : chloride ion
CLASP2: cytoplasmic Linker Associated Protein 2 CPEs: cellules progénitrices endothéliales CPHs: cellules progénitrices hépatiques CPS : prosurfactant protein C
CREB: C-AMP response element-binding protein CSBAs : cellules souches broncho-alvéolaires CSCs: cellules souches cardiaques
CSECs: cellules souches de l’épithélium cornéen CSEs: Cellules souches embryonnaires
CSHs: cellules souches hématopoïétiques CSIs: cellules souches intestinales CSKs: cellules souches des kératinocytes CSMs: cellules souches mésenchymateuses CSNs: cellules souches neurales
CSEps: cellules souches de l’épiderme CSRs: cellules souches rétiniennes CT: cycle threshold
CX: connexine
[Ca2+]i: concentration de calcium intracellulaire
D
DG: dental gyrus
Abréviations
13 DNMT: DNA Methyltransferases
dNTP: deoxynucleotide
E
eCSCNs : cellules souches épidermiques issues de la crête neurale EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid
EGF: epidermal growth factor
EGFP: enhanced green fluorescent protein EGF-R: epidermal growth factor receptor EGM-2: Endothelial Cell Growth Medium 2 EODHs: échantillons humains d’oreillettes droites ER : endoplasmic reticulum
F
FACS: fluorescence activated cell sorting FGF: Fibroblast growth factors
FSC: forward scatter channel
G
GFP: green fluorescent protein
G-CSF: granulocyte colony-stimulating factor GPCs: glial progenitor cells
GPI: glycerophosphatidylinositol
H
hEag1 human Ether à Go-Go 1
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HCN Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated HLA: human leukocyte antigen
HGF : Hepatocyte growth factor
I
IA : A-type potassium current ICa.L : L-type calcium current ICa.T : T-type calcium current ICl : chloride current
ICl.vol : Volume-sensitive chloride channels IDL: interactive data language
IGF : insulin-like growth factor
Ih : hyperpolarization-activated cation current IKir : cardiac inward rectifier potassium current
IKCa : intermediate-conductance Ca2+-dependent potassium channels IKDR : delayed rectifier potassium current
IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium INa : sodium current
InsP3 : inositol trisphosphate IP: iodure de propidium
iPSCs : induced pluripotent stem cells IP3 : inositol trisphosphate
IP3R: inositol trisphosphate receptor ISL1: ISL LIM Homeobox 1
Ito : cardiac transient outward potassium current
J
14
K
K+: potassium ion
KCa: calcium-activated potassium channels Kv: voltage-gated potassium channels K2P: two-pore domain potassium channels
L
LIN- : lignage négatif
L-VOCC: L type Voltage-operated calcium channels
M
MACS: magnetic-activated cell sorting MAPK: mitogen-activated protein kinases MEF2C: myocyte enhancer factor 2C M-MLV: moloney murine leukemia virus MPC: myocyte progenitor cells
MSCA-1: mesenchymal stem cell antigen 1 MYH: myosin heavy chain
MYL: myosin light chain M199: medium 199
N
Na+: sodium ion
Nav: voltage-gated sodium channels NCX: sodium-calcium exchanger
Na+/K+ ATPase: sodium-potassium pump NFAT: nuclear factor of activated T-cells NF-KB: nuclear factor-kappa B
NPCs: neural progenitor cells
N-VOCC: N type Voltage-operated calcium channels
O
OB: olfactory bulb OV-6: ovalbumine-6
P
PBS: phosphate-buffered saline PGF: placental growth factor PKC: protein kinase C
PMCA : plasma membrane Ca2+ ATPase PMT : photomultiplicateur
P/Q-VOCC : P/Q type Voltage-operated calcium channels pRb : retinoblastoma protein
P2X P2Y: purinergic receptors
Q
QSP : quantité suffisante pour
R
RA: retinoic acid
RAR: retinoic acid receptor RMS: rostro-migratory stream RPL13A: Ribosomal Protein L13a
RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction RYR: ryanodine receptor
R-VOCC : R type Voltage-operated calcium channels
S
SCA-1: stem cell antigen 1 SCF: stem cell factor
Abréviations
15 SCs: satellite cells
SDF-1: stromal cell-derived factor-1
SERCA: sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SHH: Sonic hedgehog
siRNA: Small interfering RNA
SK: small conductance calcium-activated potassium channels SOC: store-operated channel
SP: side population SSC: side scatter channel SUR : sous-unité régulatrice SVF: sérum de veau fœtal SVZ : subventricular zone S1P: sphingosine 1-phosphate
S1PR: sphingosine 1-phosphate receptor
T
TA: transit amplifying TAK: tat-associated kinase THY-1: thymus cell antigen 1 TTP: time to peak
TTR: time to recovery
TRP: transient receptor potential TTX: tetrodotoxin
TRPC1: transient receptor potential cation channel subfamily C member 1 TLDA: taqMan low density arrays
TNNI: troponin I TNNT: troponin T
TNAP: tissue nonspecific alkaline phosphatase TGFβ: transforming growth factor beta
T-VOCC: T type Voltage-operated calcium channels
U
UA: unité arbitraire
V
VEGF: Vascular endothelial growth facto VPC: vascular progenitor cells
VGCC HVA: voltage-dependent calcium channels high-voltage-activated VGCC LVA: voltage-dependent calcium channels low-voltage-activated 2-APB: 2-aminoethoxydiphenyl borate
W
16
INTRODUCTION
Chapitre I : Cellules souches et régénération tissulaire
1 Historique
La biologie des cellules souches a vu sa renaissance à la fin du siècle passé grâce à John Gurdon (prix Nobel en 2012 avec Shinya Yamanaka), qui est parvenu (dans les années 1960) à remplacer avec succès le noyau d’une cellule immature d’un ovocyte de grenouille avec le noyau d'une cellule mature d’origine intestinale. Cet ovocyte s’est ensuite développé normalement.
En 1997, Wilmut et son groupe ont appliqué le résultat de John Gurdon pour démontrer que le noyau des cellules somatiques avait un potentiel génétique complet en donnant naissance à la brebis Dolly. Un an après, Thomson et al. (1998) ont développé une méthode d’isolement et de culture pour maintenir les cellules souches embryonnaires (CSEs) humaines in vitro. Ces travaux ont ouvert les portes pour de nouvelles perspectives de recherche sur les CSEs (Thomson et al., 1998).
Pour ce qui est des cellules souches adultes, l’histoire commence avec Ernest McCulloch et James Till (dans les années 1960) qui s’intéressaient aux effets des radiations (d'une explosion atomique) sur la capacité de la moelle osseuse à produire des cellules sanguines. McCulloch a observé des grumeaux sur la rate d’une souris ayant reçu des injections de moelle. Ces deux chercheurs ont pensé que ces nodules étranges provenaient d'une seule cellule, probablement de la moelle osseuse.
En 1966, Friedenstein et ses collègues ont caractérisé les propriétés d’une petite population mixte de cellules de la moelle osseuse capable d’adhérer au plastique in vitro. Cette population mixte était constituée de cellules souches hématopoïétiques et d’une autre population cellulaire, inconnue à l’époque, capable de donner naissance à des cellules « réticulaires » et à des ostéoblastes. Cette population inconnue correspond à ce que l’on appelle maintenant les cellules souches mésenchymateuses (CSMs). Cette équipe a également montré l’importance de l’interaction des CSMs avec le microenvironnement de la moelle osseuse (ou niche hématopoïétique) mais aussi leur capacité à se différencier en tissu
Introduction
17
d’origine mésodermique. Dans certaines conditions, les CSMs étaient capables de se différencier en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes (Caplan, 1986; Piersma et al., 1985). Dans les années 1990-2000, le pouvoir de différenciation myogénique des CSMs a été démontré (Wakitani et al., 1995), notamment leur différenciation en cardiomyocytes in vivo (Toma et al., 2002; Vacanti et al., 2005). Durant la même période une autre étude a pu mettre en évidence un pouvoir immuno-modulateur des CSMs par surpression de la prolifération des lymphocytes T (Di Nicola et al., 2002). Cette étude a attiré particulièrement l’attention du milieu scientifique sur l’application thérapeutique des CSMs lors de transplantations allogéniques.
Ces études ont révélé la plasticité et le pouvoir multipotent des cellules souches adultes et ont ouvert les possibilités de thérapies cellulaires.
Avant de faire une description plus exhaustive des différents types de cellules souches, il est important de rappeler les propriétés intrinsèques qui les définissent.
2 Propriétés des cellules souches 2.1 L’auto-renouvellement
Les cellules souches sont définies comme étant des cellules indifférenciées dotées de capacité d’auto-renouvellement et de différenciation en d’autres types cellulaires. L’auto-renouvellement est un processus par lequel une cellule souche se divise asymétriquement ou symétriquement pour générer respectivement une ou deux cellules filles qui présentent un potentiel de développement similaire à celui de la cellule mère. Les divisions symétriques supposent que les cellules filles conservent les caractéristiques propres d’une cellule souche (Ulloa-Montoya et al., 2005). La capacité d’auto-renouvellement est essentielle pour les cellules souches pour accroitre leur nombre durant le développement, être maintenues au sein des tissus adultes et rétablir le stock des cellules souches après blessure. L’auto-renouvellement se différencie de la prolifération même si les deux processus sont liés à la division cellulaire. La prolifération est un terme plus générique qui regroupe tous les types de divisions des cellules souches et progénitrices. L’auto-renouvellement implique qu’au moins une des cellules filles possède le même potentiel de développement que la cellule mère.
Pour la plupart des cellules souches de mammifères, telles que les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) et les cellules souches neurales (CSNs), l'auto-renouvellement est
18
une division avec maintien de la multipotence. Pour les cellules souches qui forment un seul type de cellule fille, par exemple les cellules souches spermatogoniales, l'auto-renouvellement est la division avec la maintenance de l'état indifférencié. La plupart des mécanismes impliqués dans l'auto-renouvellement des cellules souches régulent ceux impliqués dans la prolifération de nombreux types cellulaires (Molofsky et al., 2003; Nishino et al., 2008).
Les cellules souches conservent pendant de très longues périodes leur capacité d’auto-renouvellement. Il est bien établi qu’à chaque duplication du génome, des erreurs de lecture ou des dommages de l’ADN peuvent survenir. Les cellules souches possèdent des mécanismes de surveillance qui détectent les erreurs de réplication et éliminent les cellules dans lesquelles apparaissent ces erreurs. Il y aurait intervention de la protéine p53 bien connue pour son rôle de facteur anti-tumoral et pro-apoptotique, et de la protéine du rétinoblastome (pRb), elle aussi facteur anti-tumoral. Ce mécanisme préviendrait ainsi la formation de tumeur par mutation d’une cellule souche et prolifération de cette cellule mutée (MORRISON et SPRADLING, 2008).
2.2 Pouvoir de différenciation en plusieurs lignages cellulaires
La différenciation est définie comme un changement dans le phénotype cellulaire en raison de l’expression de gènes spécifiques de la fonction cellulaire suivant le lignage auquel elle appartient (Gargett, C.E. 2007). Comme nous l’avons déjà mentionné, les cellules souches entrent dans la voie de différenciation par des divisions dites asymétriques impliquant qu’une seule des deux cellules filles conserve les caractéristiques propres des cellules souches, alors que l’autre cellule fille continue dans la voie de la différenciation (Ulloa-Montoya et al., 2005).
Il semblerait que l’asymétrie soit liée à une asymétrie moléculaire au sein de la cellule souche en division. Il y aurait une ségrégation asymétrique des protéines, des ARNs, des organelles et de l’ADN. Il semblerait également que le fuseau nécessaire à la division cellulaire soit lui aussi asymétrique (Morrison and Spradling, 2008). Enfin l’environnement interviendrait aussi dans l’asymétrie des divisions. La cellule fille obtenue entrant dans la voie de différenciation est appelée cellule d’amplification transitoire (transit amplifying progenitor ou cellule TA) (Gargett, 2007). Ces cellules TA, aussi appelées, suivant leur stade, cellules progénitrices puis cellules précurseurs, possèdent des propriétés intermédiaires entre les cellules souches adultes et les cellules différenciées : elles ont un potentiel de division limité,
Introduction
19
une absence de capacité à l’auto-renouvellement et donnent naissance progressivement aux cellules différenciées (Figure H-1).
La division asymétrique jouerait aussi un rôle dans la capacité qu’ont les cellules souches à se maintenir longtemps : les mutations de l’ADN seraient spécifiquement envoyées dans la cellule fille poursuivant la différenciation alors que l’ADN original, intact, serait conservé dans la cellule souche fille responsable de l’auto-renouvellement. Ce phénomène n’a cependant pas été décrit dans tous les systèmes (Morrison and Spradling, 2008).
3 Types et potentiels de différenciation des cellules souches humaines :
Le pouvoir de différenciation des cellules souches est différent selon le type de cellules souches qui peuvent être totipotentes, pluripotentes ou multipotentes (Laurie, 2004; Takahashi et al., 2007; Thomson et al., 1998) (Figure H-2).
Figure H-1 : Hiérarchie de la différenciation des cellules souches. Les cellules souches subissent des divisions cellulaires asymétriques, ce qui leur permet de s’auto-renouveler ou de se différencier pour donner naissance à des progéniteurs engagés. Ces derniers prolifèrent et donnent lieu à des « cellules amplificatrices de transit » ou (transit amplifying (TA) cells) plus différenciées, qui prolifèrent rapidement et se différencient finalement pour produire de nombreuses cellules fonctionnelles différenciées sans capacité de prolifération. D’après Gargett, C.E et al., 2007.
20 3.1 Les cellules souches embryonnaires (CSEs) :
3.1.1 Les cellules souches totipotentes :
Les cellules souches ont la capacité de se différencier en tous types cellulaires spécialisés. Le nombre de type de cellules spécialisées différents que peut engendrer une cellule souche définit sa potentialité.
Figure H-2 : La hiérarchie des cellules souches. Le zygote totipotent formé par la fusion de l’ovule et le spermatozoïde se divise pour former la masse cellulaire interne (ICM ou inner cell mass) et le tissu extra-embryonnaire (EE ou extra-embryonic) du blastocyste. Lorsqu'elles sont isolées du blastocyste, les cellules de l'ICM peuvent être maintenues in vitro en culture sous la forme de lignées de cellules souches embryonnaires (CSEs) pluripotentes. Au cours du développement de l'embryon, les cellules souches pluripotentes de l'ICM sont de plus en plus restreintes dans leur potentiel de lignage et génèrent des cellules souches multipotentes tissu-spécifiques. Celles-ci incluent des cellules souches épidermiques (cellules souches du follicule pileux) qui forment la peau et les cheveux, des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse qui donnent naissance à toutes les cellules hématopoïétiques, des cellules souches neurales dans la zone subventriculaire du cerveau, des cellules souches gastro-intestinales situées dans la crypte de l'intestin grêle, des cellules ovales qui donnent naissance au foie (non montrées) et des cellules souches mésenchymateuses qui résident dans la moelle osseuse et peuvent former des cellules osseuses, stromales et des adipocytes (non représentées). D’après Eckfeldt, C.E et al.2005.
Introduction
21
Les cellules souches totipotentes ont la capacité de donner naissance à n’importe quel type cellulaire constituant l’organisme humain y compris les tissus extra-embryonnaires comme le placenta (Thomson et al., 1998). L’existence de ces cellules souches totipotentes est courte, et dure entre la fertilisation et la formation du blastocyste, lorsque le zygote ou œuf fécondé commence à se diviser jusqu’à avoir huit cellules identiques (Figure H-2).
3.1.2 Les cellules souches pluripotentes :
Au quatrième jour du développement embryonnaire, l’amas cellulaire forme le “blastocyste”. Le blastocyste est constitué de deux couches ; une couche externe qui se transforme en tissus extra-embryonnaires et la couche interne qui est un ensemble de 30 cellules environ qui formeront par la suite l’organisme (Eckfeldt et al., 2005) (Figure H-2).
Ces cellules sont pluripotentes et ont le potentiel de se différencier en 200 types cellulaires à l’essence du corps humain (Laurie, 2004). Ainsi, les cellules souches pluripotentes de la couche interne du blastocyste représente une source pour créer des lignées de CSEs humaines (Laurie, 2004; Thomson et al., 1998). A la différence des cellules souches totipotentes, les cellules souches pluripotentes ne peuvent pas être à l’origine d’un être humain puisqu’elles sont incapables de constituer les tissus extra-embryonnaires essentiels au développement embryonnaire. Les cellules souches pluripotentes peuvent donc former les trois feuillets germinaux (endoderme, mésoderme et ectoderme) et se spécialiser ensuite en d’autres types de cellules souches que sont les cellules souches multipotentes (Enmon et al., 2002).
3.2 Les cellules souches adultes:
On retrouve les cellules souches adultes multipotentes dans plusieurs tissus et organes comme la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang périphérique, le muscle squelettique, l’épiderme, le cœur, le foie et le cerveau. Ces cellules sont « organes-spécifiques », se forment pendant le développement fœtal et perdurent dans l’organisme adulte (figure H-2).
Elles sont indifférenciées avec une capacité d’auto-renouvellement et une forte prolifération et se différencient en cellules spécialisées avec des fonctions spécifiques (Pittenger et al., 1999). Les cellules souches multipotentes comme par exemple les cellules souches hématopoïétiques, mésenchymateuses et épidermiques, peuvent êtres différenciées in vitro et utilisées en médecine régénérative (Ma, 2010; Macrin et al., 2017). Malgré leur
22
pouvoir limité de différenciation, les cellules souches adultes multipotentes peuvent être orientées vers plusieurs types cellulaires et facilement manipulées in vitro contrairement aux CSEs dont l’utilisation est souvent très limitée pour des questions éthiques. Les cellules souches multipotentes adultes se présentent donc comme de bons candidats pour le traitement de multiples pathologies dans le domaine de la médecine régénérative et de la thérapie cellulaire. Cependant, il est nécessaire et indispensable de bien caractériser et comprendre in vitro leurs mécanismes d’auto-renouvellement, de prolifération et de différenciation.
Avant de développer plus spécifiquement les cellules progénitrices cardiaques il est important de faire une description plus généraliste (synthétique) des différents types de cellules souches adultes
3.2.1 Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs)
Elles font partie des cellules souches adultes de la moelle osseuse les plus connues et les plus étudiées. Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules multipotentes et donnent naissance aux deux lignées myéloïde et lymphoïde des cellules sanguines. Ces cellules ont été utilisées avec succès dans la thérapie cellulaire (Kuznetsov et al., 2001) et peuvent être aussi trouvées dans le sang périphérique ou dans le sang du cordon ombilical des nouveaux-nés. Les CSHs ont été à l’origine du début des recherches modernes sur les cellules souches adultes grâce aux découvertes faites sur leur très forte capacité d’auto-renouvellement et de différenciation en tous les types cellulaires du lignage hématopoïétique (figure H-3).
Introduction
23
Les CSHs peuvent être isolées par prélèvement direct de la moelle osseuse hématopoïétique mais aussi prélevées dans le sang périphérique après stimulation par des cytokines (Sackstein, 2004). Les CSHs de la moelle osseuse expriment à leur surface des marqueurs qui permettent de les identifier comme le CD34, KDR, CD45, AC133. Elles expriment peu les marqueurs THY-1, KIT et SCA-1. Les CSHs ont la capacité de se différencier en toutes les lignées cellulaires qui composent le sang. Leur pouvoir de différenciation in vivo en cardiomyocytes a été analysé mais les résultats obtenus in vitro sont controversés ; des études ont montré que les CSHs isolées de la moelle osseuse pouvaient exprimer plusieurs facteurs de transcription cardiaques intégrant les protéines sarcomériques (Eisenberg et al., 2003).
Plusieurs études ont suggéré que des cellules isolées de moelle osseuse et donc enrichies en CSHs pouvaient régénérer le myocarde dans des modèles animaux d’infarctus (Agbulut et al., 2003; Jackson et al., 2001; Kajstura et al., 2005; Orlic et al., 2001a). Cependant,
Figure H-3 : Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs). Les CSHs sont dotées d'une capacité d'auto-renouvellement (flèche incurvée) qui maintient leur stock et de potentiel de différenciation multipotent qui permet de produire toutes les cellules du système hématopoïétique mature. À mesure que les CSHs se différencient, elles perdent leur capacité d’auto-renouvellement et leur pouvoir multiple de différenciation devient de plus en plus restreint. Les CSHs donnent naissance à des progéniteurs (CLP, CMP, MEP et GMP) qui s’engagent dans un processus de différenciation pour donner à la fin des cellules spécialisées (lymphocyte B, lymphpcyte T, cellules NK etc ... CLP (common lymphoid progenitor); CMP (common myeloid progenitor); GMP, (granulocyte monocyte progenitor); MEP (megakaryocyte erythrocyte progenitor); NK (natural killer). D’après Eckfeldt, C.E et al.2005.
24
des publications ont montré que la même population de cellules adoptait uniquement un phénotype hématopoïétique après transplantation (Balsam et al., 2004; Murry et al., 2004).
D’autres stratégies comme la mobilisation de cellules précurseurs hématopoïétiques par du Stem Cell Factor et du Granulocyte-Colony Stimulating Factor ou G-CSF pendant le déroulement d’un infarctus ont également donné des résultats contradictoires (Deten et al., 2005; Orlic et al., 2001b).
3.2.2 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs)
Les cellules souches mésenchymateuses appelées également cellules souches stromales ont été également retrouvées dans la moelle osseuse. Comme nous l’avons déjà mentionné les CSMs de la moelle osseuse ont été décrites pour la première fois par Ernest McCulloch et James Till dans les années 1960. D’autres chercheurs durant les années 70-80 (Friedenstein (1970), Owen (1988), Tavassoli et Crosby (1970), qualifiaient ces cellules de « mechanocytes dérivées de la moelle osseuse » ou encore « des fibroblastes stromaux ». Ce n’est qu’à partir de 1991 que Caplan nomma ces cellules ; «cellules souches mésenchymateuses ». Les CSMs sont fusiformes et ont la propriété d’adhérer au plastique in vitro. A l’inverse, la plupart des autres types de cellules souches de la moelle osseuse comme les CSHs n’ont pas cette propriété d’adhérence au plastique (Friedenstein, 1995). Les CSMs peuvent s’auto-renouveler et se différencier en lignage mésodermique (adipocyte, chondrocytes, ostéoblastes et cellules stromales) (figure H-4).
Des études ont montré la capacité des CSMs à se transdifférencier in vitro en d’autres lignages (ectoderme et endoderme) mais cette transdifférenciation est controversée in vivo (figure H-4). Elles interviennent in vivo lors des processus de réparations des tissus endommagés comme l’os, le cartilage, le muscle, le ligament, le tendon et le stroma (Pittenger et al., 1999; Psaltis et al., 2008). Les CSMs ont pu être isolées à partir de plusieurs tissus comme le sang périphérique (Kuznetsov et al., 1997), le sang du cordon ombilical (Lee et al., 2004), le sang foetal (Noort et al., 2002), la pulpe dentaire (Gronthos et al., 2000), le liquide amniotique (In ’t Anker et al., 2003), le poumon (Fan et al., 2005), le foie (Campagnoli et al., 2001), le tissu adipeux (Zuk et al., 2002), l’intestin (Bjerknes and Cheng, 2002) et le follicule pileux (Amoh et al., 2005).
Introduction
25
Un des problèmes d’identification des CSMs est l’absence de marqueurs immunophénotypiques universels qui leur sont spécifiques (Rastegar et al., 2010; Williams and Hare, 2011). Cependant, le comité de la société internationale pour la thérapie cellulaire s’intéressant aux cellules souches mésenchymateuses (the International Society for Cellular Therapy), a bien défini certains critères pour décrire une CSM, qui se résume en leur adhésion au plastique en conditions de culture. De plus une CSM doit exprimer le CD105, CD73 et CD90 et doit être négative pour le CD45, CD34, CD14, CD79, CD19 et HLA-DR et doit se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes in vitro (Dominici et al., 2006). En général, elle
Figure H-4 : Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Les MSCs de la moelle osseuse ont la capacité de s’auto-renouveler (flèche incurvée) et à se différencier vers la lignée mésodermique en donnant naissance aux cellules stromales, chondrocytes, adipocytes et ostéoblastes, (flèches continues). D’autres capacités de différenciation in vitro vers les lignages ectodermique et endodermique, ont été documentées dans la littérature (flèches pointillées). D’après Uccelli, A et al.2008.
26
n’exprime pas le CD11b, le CD31, le CD34 et le CD45 (Majumdar et al., 2003). D’autre part, les CSMs sont connues pour être positives pour les peptides de surface SH2, SH3, SH4, le CD35 (trans-membrane protein), le CD73, le CD90 (Thy1), le CD123, le CD117, CD271 et le Stro-3-positive mesenchymal precursor cell (Kuçi et al., 2010). Ces cellules souches doivent d’autre part exprimer des marqueurs embryonnaires comme l’Oct4, le Nanog et le SSEA-4 (Gang et al., 2007).
Néanmoins, d’autres types cellulaires, comme les CSHs, expriment également certains des marqueurs déjà cités rendant la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses plus complexe (Kim and Ahn, 2012). Il en résulte que pour bien distinguer les CSMs des CSHs, une sélection basée sur l'absence des marqueurs hématopoïétiques CD34, CD45 et CD14 serait suffisante (Majumdar et al., 2003).
Les CSM peuvent se différencier en plusieurs types cellulaires. La première différenciation a été réalisée par Friedenstein et ses collaborateurs (1970) qui ont pu isoler et différencier les CSMs en tissus osseux in vitro. Différents groupes ont montré par la suite que les CSMs peuvent se différencier en cellules pancréatiques (Lee et al., 2004) , neuronales (Woodbury et al., 2000), en os (Haynesworth et al., 1992), en cartilage (Yoo et al., 1998), en muscle (Wakitani et al., 1995), stroma de la moelle (Majumdar et al., 1998), tendon et ligament (Young et al., 1998), tissu adipeux (Dennis et al., 1999) et en différents tissus connectifs (Studeny et al., 2004). Les CSMs de la moelle osseuse sont également capables de freiner et « réparer » les altérations pulmonaires (Curley et al., 2012), le diabète (Si et al., 2012), les désordres neurologiques (Edalatmanesh et al., 2011), les maladies rénales (Alfarano et al., 2012) et les blessures hépatiques (Zhao et al., 2012). En plus de leur pouvoir de différenciation en différents lignages mésenchymateux, les CSMs peuvent aussi donner naissance (sous certaines conditions de culture) à d’autres cellules spécialisées comme les cardiomyocytes.
Ces travaux ont permis de mettre en évidence des changements d’expression de certains gènes cardiaques comme la chaîne lourde de myosine, la troponine T cardiaque, des facteurs de transcription précoces cardiaques comme NKx2.5 et GATA4 (Reik, 2007). GATA4 est un régulateur majeur de l’expression des gènes cardiaques durant la différenciation (Heineke et al., 2007). Présent dans le cœur adulte il joue un rôle de régulateur transcriptionnel de nombreux gènes cardiaques comme le facteur natriuretic atrial, le peptide
Introduction
27
natriuretic de type B, la chaîne lourde de myosine et la troponine T cardiaque qui sont deux protéines contractiles cruciales dans la fonction musculaire squelettique et cardiaque.
3.2.3 Les cellules souches du tissu adipeux
Des études ont montré que le tissu adipeux contient des cellules souches nommées cellules mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSCs ou Adipose tissue-derived stem cells) (Nakagami et al., 2005). Ce tissu est abondant, facile d’accès et représente une potentielle source de cellules pour des transplantations autologues. Les ADSCs sont multipotentes et sont localisées au niveau du stroma vasculaire du tissu adipeux sous cutané. Ces cellules ont beaucoup de similitude avec les CSMs de la moelle osseuse. Elles seraient positives pour les marqueurs SCA-1 et CD44 et négatives pour les marqueurs KIT, CD11b, CD31, CD34 ou CD45 (Nakagami et al., 2005). Elles présentent un phénotype proche de celui des fibroblastes et peuvent se différencier in vitro en adipocytes, ostéoblastes et chondroblastes. Les ADSCs secrètent de nombreuses cytokines (HGF, VEGF, PGF, TGFβ, FGF, ANG-1 et ANG) mais aussi des facteurs angiogéniques comme le VEGF et le HGF. Les ADSC partagent beaucoup de gènes avec les CSMs de la moelle osseuse et expriment des marqueurs hématopoéitiques (CD34, CD133 et ABCG2) (Planat-Benard et al., 2004) suggérant une double population d’ADSCs : celles de type hématopoïétique et celles de type mésenchymateux.
3.2.4 Les cellules progénitrices endothéliales
Les cellules progénitrices endothéliales (CPEs) sont des cellules circulantes de la moelle osseuse qui résident au sein de l’endothélium et contribuent à la vasculogenèse et l’homéostasie vasculaire (Khakoo and Finkel, 2005) (figure H-5). Elles ont été identifiées pour la première fois en 1997 (Asahara et al., 1997) et ont été isolées à partir du sang périphérique comme étant des cellules exprimant le marqueur CD34. Ces cellules seraient natives de la moelle osseuse.
28
Les hémangioblastes (présents pendant l’embryogenèse) seraient à l’origine des cellules précurseurs des endothéliums (Kubo and Alitalo, 2003; Risau and Flamme, 1995) mais pourraient également provenir directement des CSHs (Kubo and Alitalo, 2003). En effet, les CPEs partagent des marqueurs communs avec les CSHs comme le CD133 et CD34 mais elles expriment en plus le marqueur endothélial FLK-1 (Liao et al., 2007). Les CPEs se présenteraient comme une sous population de CSHs ayant la capacité d’acquérir un phénotype endothélial (Liao et al., 2007). Les CPEs sont très peu nombreuses dans le sang périphérique et dans la moelle, limitant leur utilisation (Nakagami et al., 2005). Ces cellules ont été utilisées en thérapie cellulaire pour différentes pathologies comme certaines maladies cardiovasculaires (Kawamoto and Losordo, 2008) et le diabète (Fadini et al., 2010).
Figure H-5 : Les cellules progénitrices endothéliales (CPEs). Les CPEs peuvent dériver de cellules embryonnaires (hémangioblastes) et de plusieurs tissus adultes (cellules CD14+/ CD34+/CD133+ du sang périphérique, moelle osseuse, paroi vasculaire et myocarde). Les CPEs sont impliquées essentiellement dans la reendothelisation des vaisseaux lésés et dans l’angiogenèse dans des zones ischémiques.D’après Leri, A., and Kajstura, J. (2005).
Introduction
29 3.2.5 Les cellules souches de l’épithélium intestinal :
Les cellules souches de l’épithélium intestinal font partie des cellules souches épithéliales des tissus à renouvellement rapide et exposés au milieu extérieur. L’intestin a un rôle protecteur majeur par la formation d'une barrière avec le milieu extérieur d’où la nécessité de se renouveler en permanence. Ce renouvellement (tous les deux à sept jours) est assuré par la présence de cellules souches qui en se différenciant, donnent différents types cellulaires avec différentes fonctions. Les cellules souches intestinales (CSIs) résident dans les cryptes et expriment à leur surface les marqueurs (MSI-1), CD-24 et KIT (Reya and Clevers, 2005). Elles sont multipotentes et se différencient en quatre types cellulaires : les entérocytes (rôle d’absorption des aliments), les cellules mucipares caliciformes (protection de la surface de l'épithélium par la sécrétion du mucus), les cellules entéroendocrines (sécrétion des hormones peptidiques) et les cellules de Paneth (sécrétion de lysozymes et rôle immunitaire) (Goodell et al., 2015) (figure H-6).
Les entérocytes, les cellules mucipares caliciformes et les cellules entéroendocrines se différencient en migrant vers l’extrémité des cryptes et en haut des villosités, ces cellules subissent l’apoptose et desquament dans la lumière intestinale. Les cellules de Paneth se différencient en migrant vers la base de la crypte. Ces cellules ont une durée de vie plus longue que les autres types cellulaires avant d’être phagocytées par les cellules environnantes.
30
Figure H-6 : Les cellules souches intestinales (CSIs). Les CSIs sont localisées au niveau de la base des cryptes de Lieberkühn et sont de deux types : les cellules souches CBC (Crypt base columnar) et les cellules souches intestinales quiescentes (qISC). Les cellules souches CBC prolifèrent quotidiennement et assurent la production des différents types cellulaires de l’épithélium intestinal. Les cellules souches CBC se divisent et produisent des cellules filles progénitrices de deux types ; les cellules TA (transient amplifying) et les cellules progénitrices sécrétrices. Ces cellules progénitrices se différencient par la suite et donnent naissance aux divers types cellulaires de l’épithélium intestinal (entérocytes, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines, cellules de Paneth). Les qISC se divisent rarement sous conditions homéostatiques mais peuvent être induites à produire de nouvelles cellules souches CBC en réponse à des lésions ou à d'autres stimuli. D’après Goodell, M.A et al (2015).
Introduction
31 3.2.6 Les cellules souches de l’épiderme
L’épiderme est un tissu qui se renouvelle constamment par le phénomène de desquamation. Cette dernière correspond à l’élimination des cellules de la couche cornée qui sont replacées rapidement par les kératinocytes. Il existe ainsi une population de cellules souches multipotentes capables d’auto renouvellement et qui expriment des marqueurs spécifiques comme la K15, des molécules d’adhésion comme des β1-intégrines, des E-cadhérines et des β-caténines. Ces cellules souches portent le nom de cellules souches des kératinocytes (CSKs) (Watt, 2002). Ces CSKs donnent rapidement des cellules intermédiaires qui se détachent de la membrane basale et se différencient (Solanas and Benitah, 2013) (figure H-7). On a ainsi des CSKs au niveau de la couche basale associée à des cellules intermédiaires, des cellules intermédiaires dans la couche épineuse, des cellules différenciées dans la couche granuleuse et des cellules mortes dans la couche cornée.
Les CSKs sont issues d’autres cellules souches multipotentes appelées cellules souches de l’épiderme (CSEps). Les CSEps expriment les marqueurs CD34, le K5 et la α6-intégrine (Mimeault and Batra, 2006). Les CSEps sont à l’origine des cellules progénitrices de la matrice du follicule pileux, des cellules progénitrices des glandes sébacées et des cellules de la papille dermique. A la différence des CSKs qui ne donnent naissance qu’aux cellules épidermiques, les CSEps se différencient à la fois en cellules de l’épiderme et en cellules progénitrices de la matrice du follicule pileux. En plus des CSKs et des CSEps, la peau contient également des cellules souches pluripotentes épidermiques issues de la crête neurale (eCSCNs). Les eCSCNs ont été découvertes par LI et al. en 2003 chez la souris comme des cellules exprimant la nestine (marqueur des cellules de la crête neurale) et retrouvées en partie au niveau du bulbe du follicule pileux. Les eCSCNs expriment aussi le CD34 et THY-1 et peuvent se différencier en plusieurs lignages cellulaires incluant des neurones, des mélanocytes, des cellules de Schwann et des cellules de Merkel (Mimeault and Batra, 2006) et (Sakaue and Sieber-Blum, 2015). Les eNCSCs semblent être localisées au niveau du bulbe du follicule pileux mais leur localisation change suivant le cycle folliculaire (Li et al., 2003).
