Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation des

3.1 Prolifération

Les canaux ioniques jouent un rôle important dans le contrôle de la prolifération cellulaire (MacFarlane and Sontheimer, 2000; Pardo, 2004). Dans les CSMs de la moelle osseuse de rat, il a été montré que durant la transition G1/S du cycle cellulaire, le courant IKDR diminue tandis que le courant IKCa augmente dans les MSC dérivés de la moelle osseuse de rat (Deng et al., 2007).

De plus, l’extinction des canaux IKDR ou les canaux IKCa avec des siRNA ciblant KV1.2 et KV2.1 (pour IKDR) ou KCa3.1 (pour IKCa) inhibe la prolifération cellulaire et provoque l’accumulation des cellules en phase G0 / G1 du cycle, ce qui suggère que ces deux canaux sont nécessaires à la régulation de la prolifération cellulaire de ces cellules (Deng et al., 2007;

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Wang et al., 2008). Le blocage du canal responsable du courant IKDR réduit considérablement la prolifération des cellules CSEs murines et humaines (Wang et al., 2005), et celle des CSMs humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007) mais pas la prolifération des CSC c-kit+ murines (Han et al., 2010). Cependant, l'inhibition de IKDR favorise la prolifération de cellules progénitrices neurales adultes de rat (Liebau et al., 2006; Yasuda and Adams, 2010; Yasuda et al., 2008) et celle des progéniteurs neuronaux humains (Schaarschmidt et al., 2009).

De même, le blocage de IKCa réduit également la prolifération cellulaire dans les CSMs murines de la moelle osseuse avec une accumulation des cellules dans la phase G0 / G1 du cycle (Tao et al., 2008). Cependant, dans les CSMs humaines du tissu adipeux l'inhibition d’IKCa n'a pas d'effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007).

L'effet régulateur de BKCa sur la prolifération a été reporté dans plusieurs types cellulaires. L'inhibition de BKCa réduit la prolifération cellulaire des pré-adipocytes humains (Hu et al., 2009) et celle des cellules ES murins (Wang et al., 2005) mais pas celle des CSMs humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007). Cependant, l'inhibition de BKCa réduit la prolifération cellulaire et provoque l’arrêt du cycle en phase G0/G1 dans les CSMs humaines de la moelle osseuse (Zhang et al., 2014b). De la même manière, l’inhibition de BKCa réduit la prolifération en accumulant les cellules en phase G0/G1 dans les CSCs c-kit+ humaines (Zhang et al., 2015b). Le canal Cl- sensible au volume a été impliqué dans la prolifération cellulaire et l'apoptose de plusieurs types cellulaires (Blackiston et al., 2009; Lang et al., 2006; Liu et al., 2010). L’inhibition de ICl.vol réduit notablement la prolifération cellulaire des CSMs murines (par accumulation des cellules en phase G0/G1) en inhibant la cycline D et la cycline E (Tao et al., 2008). De même, le blocage du canal ICl.vol diminue également la prolifération cellulaire des CSC c-kit+ murines (Han et al., 2010). L’hyperpolarisation de la membrane est impliquée dans l’inhibition de la prolifération cellulaire (Hu et al., 2009; Kuhlmann et al., 2005).

Dans les cellules progénitrices neuronales adultes, la dépolarisation membranaire par l’inhibition de IKir ou par l'augmentation de la concentration de K+ extracellulaire favorise la prolifération cellulaire (Yasuda et al., 2008). Cependant l’inhibition du canal Kir2.1 dans les CSCs c-kit+ humaines n’affecte pas la prolifération cellulaire (Zhang et al., 2015b). Concernant le rôle du courant Ito dans la prolifération, des études ont montré que l'activation du courant IA (KV4.2) est une condition requise pour la prolifération dans les cellules progénitrices neuronales embryonnaires humaines (Schaarschmidt et al., 2009) et que l’inhibition du canal

Introduction

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KV4.2 réduit la prolifération cellulaire dans les préadipocytes humains (Hu et al., 2009). Une étude récente a montré que l’inhibition des canaux TRPV2 et TRPV4 dans les CSCs c-kit+

humaines réduit la prolifération cellulaire par l’accumulation des cellules en phase G0/G1 du cycle cellulaire.

Le rôle précis des canaux Na+ TTX sensibles et les canaux Na+ TTX résistants (NaV1.5), connus pour jouer un rôle fondamental dans la génération du potentiel d'action dans les cellules excitables, n’est pas totalement élucidé dans les cellules non-excitables y compris les cellules souches (Cai et al., 2004; Li et al., 2005). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, le blocage de l'INa n'affecte pas la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007). De même, l’inhibition des canaux Na+ TTX sensibles dans les CSCs c-kit+ n’a pas d’impact sur leur prolifération(Zhang et al., 2015b).

3.2 Différenciation :

Comme évoqué précédemment, l’activité calcique cytosolique est cruciale pour la croissance et la progression dans le cycle cellulaire des cellules souches et des progéniteurs (Ferreira-Martins et al., 2009; Resende et al., 2010).

L’inhibition des canaux Ca2+ de type L réduit la différenciation des cellules progénitrices neurales dérivées du cortex cérébral de souris (D’Ascenzo et al., 2006). De plus, l'entrée Ca2+

médiée par TRPC1 favorise la différenciation des CSEs neurales de rat(Fiorio Pla et al., 2005). L’inhibition de TRPC5 mais pas TRPC6 avec des siRNA diminue la différenciation des cellules progénitrices neurales de rat (Shin et al., 2010). Ces résultats suggèrent que la régulation du Ca2+ cytosolique par les canaux Ca2+ de type L, TRPC1 ou TRPC5 joue un rôle important dans la transition entre la prolifération et la différenciation neuronale. Dans les CSMs humaines de la moelle osseuse l’inhibition des canaux BKCa ou hEag1 réduit la différenciation adipogénique et ostéogénique de ces cellules (Zhang et al., 2014b).

En résumé, sur les cellules souches cardiaques comme sur d’autre type de cellules souches les propriétés du signal calcique (fréquence amplitude, répartition spatio-temporelle, microdomaines) conditionneraient les propriétés cellulaires des cellules souches (différenciation, auto-renouvellement, prolifération migration). Ce signal conditionnerait l’expression de nombreuses protéines en particulier les canaux ioniques.

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POSITION DU PROBLEME

Le cœur humain a été considéré pendant longtemps comme un organe post-mitotique sans aucune régénération et dans lequel les cardiomyocytes présents à la naissance persisteraient tout au long de la vie sans divisions cellulaires. La seule réponse majeure aux dommages cardiaques serait l’hypertrophie des cardiomyocytes encore viables (Chien and Olson, 2002; MacLellan and Schneider, 2000; Soonpaa and Field, 1998). Ce dogme selon lequel le myocarde est vu comme un tissu statique commençait à être contesté avec les découvertes chez l’animal mettant en évidence des divisions mitotiques dans les cardiomyocytes (McDonnell and Oberpriller, 1984; Rumyantsev and Borisov, 1987). D’autres données ont montré l’existence de myocytes ventriculaires en division chez l’Homme dans des conditions normales et pathologiques (Beltrami et al., 2001; Kajstura et al., 1998; Quaini et al., 2002). Cette nouvelle vision du cœur comme étant un organe dynamique impliquerait la présence d’une population de cellules progénitrices ou de cellules souches cardiaques à partir desquelles les nouveaux myocytes peuvent être formés.

En effet, plusieurs équipes ont mis en évidence l’existence de cellules souches cardiaques (CSCs) multipotentes dans le cœur humain sain et pathologique, capables de se différencier en myocytes, cellules musculaires lisses et en cellules endothéliales (Messina et al., 2004; Urbanek et al., 2005). Cette découverte de CSCs a ouvert un nouveau domaine de recherche sur les mécanismes de l’homéostasie et de la régénération cardiaque et a permis d’envisager des thérapies cellulaires à base de CSCs. Depuis, différents types de cellules ayant des propriétés souches ont été isolées à partir des tissus cardiaques humains et proposées comme modèles de CSCs (Barile et al., 2007; Guan and Hasenfuss, 2013). Ces CSCs portent plusieurs nomenclatures, qui correspondent à des marqueurs qu’elles expriment, comme par exemple les CSCs Isl-1+, les CSCs Sca-1+ ou les CSCs c-kit+.

Récemment, une nouvelle population de CSCs d’origine mésenchymateuse a été découverte dans le cœur humain (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a). Ces cellules expriment des facteurs de transcription spécifiques cardiaques et peuvent être différenciées en plusieurs types cellulaires notamment en « cardiomyocytes ». Cependant, cette différenciation est incomplète et aboutit à des cardiomyocytes très immatures.

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Les CSCs W8B2+ possèdent des capacités réparatrices cardiaques importantes lorsqu’elles sont injectées dans des modèles murins d’infarctus du myocarde (Reus et al., 2016; Rossini et al., 2011). Cette capacité réparatrice cardiaque serait liée au large sécrétome que possède ces cellules qui est composé de cytokines et de facteurs de croissance intervenant notamment dans l'angiogenèse, la survie cellulaire, le chimiotactisme, la réponse immunitaire, l’inflammation et le remodelage extracellulaire (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

Néanmoins, aucune caractérisation fonctionnelle à l’échelle cellulaire (électrophysiologie, signalisation calcique au cours la différenciation…) n’a été rapportée. Ainsi, les objectifs de ces travaux consistent à :

 Mettre au point un modèle de CSCs humaines exprimant le marqueur W8B2+ à partir d’échantillons auriculaires humains obtenus en collaboration avec le CHU de Poitiers.  Caractériser la signature électrophysiologique (canaux ioniques et signalisation

calcique) à l’état souche et après différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+.  Améliorer la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ in vitro par optogénétique.  Suivre les changements calciques au cours de cette différenciation via l’utilisation de

la sonde calcique GCaMP.

En parallèle de ces objectifs, nous avons étudié sur ce modèle cellulaire deux types de cibles, un canal calcium dépendant et un médiateur lipidique, soient:

 l’importance des canaux ioniques (plus précisément le canal BKCa) dans la régulation des propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+.  les effets et le mode d’action de la sphingosine 1-phosphate (un important régulateur physiologique et physiopathologique cardiaque) sur les propriétés des CSCs W8B2+

78 MATERIELS ET METHODES

I- Isolement et purification des CSCs W8B2+ à partir d’échantillons humains d’oreillettes