Pépite | Nouvelles approches de modulation des points de contrôle de l’immunité par les petites molécules en onco-immunologie

Texte intégral

(1)Université de Lille Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Année Universitaire 2018- 2019. THESE D’EXERCICE pour obtenir le grade de DOCTEUR EN PHARMACIE. Soutenue publiquement le 22 Octobre 2019 Par Alexis Pruvost. NOUVELLES APPROCHES DE MODULATION DES POINTS DE CONTROLE DE L’IMMUNITE PAR LES PETITES MOLECULES EN ONCO-IMMUNOLOGIE Membres du jury : Président : Pr. Rébecca Deprez-Poulain Assesseur : Dr. Christophe Carnoy Membre extérieur : Dr. Sophie Duquesnoy.

(2) Faculté de Pharmacie de Lille 3, rue du Professeur Laguesse - B.P. 83 - 59006 LILLE CEDEX  03.20.96.40.40 -  : 03.20.96.43.64 http://pharmacie.univ-lille2.fr. Université de Lille Président :. Jean-Christophe CAMART. Premier Vice-président :. Damien CUNY. Vice-présidente Formation :. Lynne FRANJIÉ. Vice-président Recherche :. Lionel MONTAGNE. Vice-président Relations Internationales :. François-Olivier SEYS. Directeur Général des Services :. Pierre-Marie ROBERT. Directrice Générale des Services Adjointe :. Marie-Dominique SAVINA. Faculté de Pharmacie Doyen :. Bertrand DÉCAUDIN. Vice-Doyen et Assesseur à la Recherche :. Patricia MELNYK. Assesseur aux Relations Internationales : :. Philippe CHAVATTE. Assesseur à la Vie de la Faculté et aux Relations avec le Monde Professionnel :. Thomas MORGENROTH. Assesseur à la Pédagogie :. Benjamin BERTIN. Assesseur à la Scolarité :. Christophe BOCHU. Responsable des Services :. Cyrille PORTA. 2.

(3) Liste des Professeurs des Universités - Praticiens Hospitaliers Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. Mme. ALLORGE. Delphine. Toxicologie. M.. BROUSSEAU. Thierry. Biochimie. M.. DÉCAUDIN. Bertrand. Pharmacie Galénique. M.. DEPREUX. Patrick. ICPAL. M.. DINE. Thierry. Pharmacie clinique. Mme. DUPONT-PRADO. Annabelle. Hématologie. M.. GRESSIER. Bernard. Pharmacologie. M.. LUYCKX. Michel. Pharmacie clinique. M.. ODOU. Pascal. Pharmacie Galénique. M.. STAELS. Bart. Biologie Cellulaire. Liste des Professeurs des Universités Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. M.. ALIOUAT. El Moukhtar. Parasitologie. Mme. AZAROUAL. Nathalie. Physique. M.. BERTHELOT. Pascal. Onco et Neurochimie. M.. CAZIN. Jean-Louis. Pharmacologie – Pharmacie clinique. M.. CHAVATTE. Philippe. ICPAL. M.. COURTECUISSE. Régis. Sciences végétales et fongiques. M.. CUNY. Damien. Sciences végétales et fongiques. Mme. DELBAERE. Stéphanie. Physique. M.. DEPREZ. Benoît. Lab. de Médicaments et Molécules. Mme. DEPREZ. Rebecca. Lab. de Médicaments et Molécules. M.. DUPONT. Frédéric. Sciences végétales et fongiques. M.. DURIEZ. Patrick. Physiologie. M.. FOLIGNE. Benoît. Bactériologie. M.. GARÇON. Guillaume. Toxicologie. 3.

(4) Mme. GAYOT. Anne. Pharmacotechnie Industrielle. M.. GOOSSENS. Jean François. Chimie Analytique. M.. HENNEBELLE. Thierry. Pharmacognosie. M.. LEMDANI. Mohamed. Biomathématiques. Mme. LESTAVEL. Sophie. Biologie Cellulaire. M.. LUC. Gerald. Physiologie. Mme. MELNYK. Patricia. Onco et Neurochimie. M.. MILLET. Régis. ICPAL. Mme. MUHR – TAILLEUX. Anne. Biochimie. Mme. PAUMELLE-LESTRELIN. Réjane. Biologie Cellulaire. Mme. PERROY. Anne Catherine. Législation. Mme. ROMOND. Marie Bénédicte. Bactériologie. Mme. SAHPAZ. Sevser. Pharmacognosie. M.. SERGHERAERT. Eric. Législation. Mme. SIEPMANN. Florence. Pharmacotechnie Industrielle. M.. SIEPMANN. Juergen. Pharmacotechnie Industrielle. M.. WILLAND. Nicolas. Lab. de Médicaments et Molécules. Liste des Maîtres de Conférences - Praticiens Hospitaliers Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. Mme. BALDUYCK. Malika. Biochimie. Mme. GARAT. Anne. Toxicologie. Mme. GOFFARD. Anne. Bactériologie. M.. LANNOY. Damien. Pharmacie Galénique. Mme. ODOU. Marie Françoise. Bactériologie. M.. SIMON. Nicolas. Pharmacie Galénique. 4.

(5) Liste des Maîtres de Conférences Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. Mme. ALIOUAT. Cécile Marie. Parasitologie. M.. ANTHERIEU. Sébastien. Toxicologie. Mme. AUMERCIER. Pierrette. Biochimie. Mme. BANTUBUNGI. Kadiombo. Biologie cellulaire. Mme. BARTHELEMY. Christine. Pharmacie Galénique. Mme. BEHRA. Josette. Bactériologie. M. BELARBI. Karim. Pharmacologie. M.. BERTHET. Jérôme. Physique. M.. BERTIN. Benjamin. Immunologie. M.. BLANCHEMAIN. Nicolas. Pharmacotechnie industrielle. M.. BOCHU. Christophe. Physique. M.. BORDAGE. Simon. Pharmacognosie. M.. BOSC. Damien. Lab. de Médicaments et Molécules. M.. BRIAND. Olivier. Biochimie. M.. CARNOY. Christophe. Immunologie. Mme. CARON. Sandrine. Biologie cellulaire. Mme. CHABÉ. Magali. Parasitologie. Mme. CHARTON. Julie. Lab. de Médicaments et Molécules. M. CHEVALIER. Dany. Toxicologie. M.. COCHELARD. Dominique. Biomathématiques. Mme. DANEL. Cécile. Chimie Analytique. Mme. DEMANCHE. Christine. Parasitologie. Mme. DEMARQUILLY. Catherine. Biomathématiques. M.. DHIFLI. Wajdi. Biomathématiques. Mme. DUMONT. Julie. Biologie cellulaire. Mme. DUTOUT-AGOURIDAS. Laurence. Onco et Neurochimie. M.. EL BAKALI. Jamal. Onco et Neurochimie. 5.

(6) M.. FARCE. Amaury. ICPAL. Mme. FLIPO. Marion. Lab. de Médicaments et Molécules. Mme. FOULON. Catherine. Chimie Analytique. M.. FURMAN. Christophe. ICPAL. Mme. GENAY. Stéphanie. Pharmacie Galénique. M.. GERVOIS. Philippe. Biochimie. Mme. GOOSSENS. Laurence. ICPAL. Mme. GRAVE. Béatrice. Toxicologie. Mme. GROSS. Barbara. Biochimie. M.. HAMONIER. Julien. Biomathématiques. Mme. HAMOUDI. Chérifa Mounira. Pharmacotechnie industrielle. Mme. HANNOTHIAUX. Marie-Hélène. Toxicologie. Mme. HELLEBOID. Audrey. Physiologie. M.. HERMANN. Emmanuel. Immunologie. M.. KAMBIA. Kpakpaga Nicolas. Pharmacologie. M.. KARROUT. Youness. Pharmacotechnie Industrielle. Mme. LALLOYER. Fanny. Biochimie. M.. LEBEGUE. Nicolas. Onco et Neurochimie. Mme. LECOEUR. Marie. Chimie Analytique. Mme. LEHMANN. Hélène. Législation. Mme. LELEU-CHAVAIN. Natascha. ICPAL. Mme. LIPKA. Emmanuelle. Chimie Analytique. Mme. MARTIN. Françoise. Physiologie. M.. MOREAU. Pierre Arthur. Sciences végétales et fongiques. M.. MORGENROTH. Thomas. Législation. Mme. MUSCHERT. Susanne. Pharmacotechnie industrielle. Mme. NIKASINOVIC. Lydia. Toxicologie. Mme. PINÇON. Claire. Biomathématiques. M.. PIVA. Frank. Biochimie. Mme. PLATEL. Anne. Toxicologie. M.. POURCET. Benoît. Biochimie. 6.

(7) M.. RAVAUX. Pierre. Biomathématiques. Mme. RAVEZ. Séverine. Onco et Neurochimie. Mme. RIVIERE. Céline. Pharmacognosie. Mme. ROGER. Nadine. Immunologie. M.. ROUMY. Vincent. Pharmacognosie. Mme. SEBTI. Yasmine. Biochimie. Mme. SINGER. Elisabeth. Bactériologie. Mme. STANDAERT. Annie. Parasitologie. M.. TAGZIRT. Madjid. Hématologie. M.. VILLEMAGNE. Baptiste. Lab. de Médicaments et Molécules. M.. WELTI. Stéphane. Sciences végétales et fongiques. M.. YOUS. Saïd. Onco et Neurochimie. M.. ZITOUNI. Djamel. Biomathématiques. Professeurs Certifiés Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. M.. HUGES. Dominique. Anglais. Mlle. FAUQUANT. Soline. Anglais. M.. OSTYN. Gaël. Anglais. Professeur Associé - mi-temps Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. M.. DAO PHAN. Hai Pascal. Lab. Médicaments et Molécules. M.. DHANANI. Alban. Droit et Economie Pharmaceutique. 7.

(8) Maîtres de Conférences ASSOCIES - mi-temps Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. M.. BRICOTEAU. Didier. Biomathématiques. Mme. CUCCHI. Malgorzata. Biomathématiques. M.. FRIMAT. Bruno. Pharmacie Clinique. M.. GILLOT. François. Droit et Economie pharmaceutique. M.. MASCAUT. Daniel. Pharmacie Clinique. M.. ZANETTI. Sébastien. Biomathématiques. M.. BRICOTEAU. Didier. Biomathématiques. AHU Civ.. NOM. Prénom. Laboratoire. Mme. DEMARET. Julie. Immunologie. Mme. HENRY. Héloïse. Biopharmacie. Mme. MASSE. Morgane. Biopharmacie. 8.

(9) . )DFXOWpGH3KDUPDFLHGH/LOOH 3, rue du Professeur Laguesse – B.P. 83 LILLE CEDEX Tél : 03.21.96.40.40 – Télécopie : 03.20.96.43.64 http://pharmacie.univ-lille.fr. /¶8QLYHUVLWpQ¶HQWHQGGRQQHUDXFXQHDSSUREDWLRQDX[RSLQLRQV pPLVHVGDQVOHVWKqVHVFHOOHVFLVRQWSURSUHVjOHXUVDXWHXUV . . 9.

(10) Remerciements Je tiens à remercier en premier lieu l’ensemble des enseignants, présents ou non ce jour, qui ont éclairé mon parcours et contribué à l’aboutissement de mon projet professionnel, de cette passion pour la pharmacie. J’ai également une pensée particulière pour le professeur Rébecca Deprez-Poulain qui a su éveillé en moi l’esprit scientifique, l’amour pour le médicament et l’envie de comprendre jusqu’au moindre détail l’interaction étroite entre chimie et biologie. Pour ce suivi assidu et pour l’estime que vous m’avez porté durant trois ans, un grand merci ! Je remercie par ailleurs, les autres membres de mon jury, merci Dr. Christophe Carnoy et Dr. Sophie Duquesnoy d’avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse. Merci également au professeur Benoit Deprez qui m’accueilli de nombreuses fois au sein du laboratoire U1177 que ce soit pour les stages ou encore pour de simples discussions. Merci à toute l’équipe de ce même laboratoire, qui m’a connu trois années consécutives et m’a toujours accueilli comme un membre à part entière. Je garderai à jamais le souvenir de chacun d’entre-vous. Des remerciements tout à fait particuliers pour Lucile Brier, une très grande amie désormais. Nous nous sommes rencontrés par hasard il y a trois ans et depuis une grande complicité scolaire mais aussi amicale est née ! Merci d’avoir été là pour les travaux de groupe, les quatre mois en Suède et tout ce que nous avons partagé ensemble au labo et en amphi. Pour toute la fierté que vous avez montré au fil de l’avancement de mes études merci à mes grand-parents, mes grands-mères présents ce 10.

(11) jour mais également mes grands pères et arrières grands mères qui n’ont pas eu l’opportunité d’assister à cette soutenance de thèse d’exercice de Pharmacie. Votre soutien des ma première année à été la base de tout le travail accompli, sans vous rien n’aurait été possible. Je tiens à remercier celui qui, toujours a été présent, et avec qui j’ai partagé beaucoup de choses qui ont confirmé mon envie de donner le meilleur. Merci Théo, mon meilleur ami, notre histoire commune a constitué une source inépuisable de motivation. Depuis trois ans, tu as partagé et as épaulé toutes mes périodes de révisons, l’absence de vacances et la faible disponibilité imputée à mes études. Je te remercie romain, mon copain que j’aime ! Pour toute l’attention que vous m’avez porté durant ces six années, mais également depuis vingt quatre ans aujourd’hui, je tiens à remercier mes parents. Personnes sans qui, je n’aurais jamais pu accomplir la moitié de ce que j’ai fait aujourd’hui. Vous avez supporté mes études d’un point de vue moral, financière et avez entretenu ma motivation. Maman, tu m’as appris une rigueur de travail, une organisation sans faille afin de toujours fournir le meilleur sans jamais être débordé. Je te remercie de tout mon cœur, tu as contribué à faire de moi l’homme que je suis et le professionnel que je serai ! Ton professionnalisme me fait remarquer chaque jour que se contenter du minimum n’est absolument pas suffisant et qu’il faut s’améliorer en continue. Papa, depuis mon plus jeune âge, tu m’as fait sans le vouloir le plus beau des cadeaux. Tu m’as transmis ta passion pour l’aide envers l’autre, pour la santé, pour la pharmacie. Je sais que je n’ai pas toujours été clément envers toi et que je t’ai violemment répondu un jour que « je ne vendrai jamais des boîtes comme toi ! ». Mais cet abus d’orgueil n’était qu’une manière de ne pas te montrer que tu reste aujourd’hui mon modèle. 11.

(12) Abréviations. OMS : Organisation Mondiale de la Santé PD-1 : Programmed cell death protein 1 PD-L1/2 : Programmed cell death protein ligand 1/2 ADN : Acide Désoxyribonucléique UV : Ultra-violet V600E : Mutation du triplet de nucléotide codant pour la valine 600 par un triplet codant pour un acide glutamique. GnRh : Gonadotropin Releasing Hormone SMKI : Small molecule kinase inhibitors, petites molecules inhibitrices de kinases ARN : Acide Ribonucléique +. +. +. +. LT CD8 /CD4 : Lymphocyte T CD8 /CD4 NKT : Natural killer T lymphocyte. CMH I : Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I CMH II : Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe II CPA : Cellule Présentatrice d’Antigènes TCR : T-cell receptor ou Récepteur des lymphocytes T Ig X : Immunoglobuline d’isotype X CDCC : Complement-dependent cellular cytotoxicity l’ADCC : Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity CDC : Complement-dependent cytotoxicity CTAL-4 : cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4 CD80-86 : cluster de differenciation 80-86 ITIM : immunoreceptor tyrosine‐based inhibitory motif SHP-1/2 : Scr homology region 2 domain‐containing phosphatase-1/2 ITSM : Immunoreceptor tyrosine‐based switch motif INF I et II: Interférons de type I et II TNF-α : tumor necrosis factor α VEGF : Vascular growth factor IL-4 : Interleukine 4 Val : Valine Ile : Isoleucine Leu : Leucine. 12.

(13) Ala : Alanine Tyr : Tyrosine Met : Méthionine Gln : Glutamine Asp : Acide aspartique Arg : Arginine PPIIs : protein-protein interaction inhibitors ou inhibiteurs d’interaction protéine-protéine t. N : Extréminté N terminale d’un peptide ou d’une protéine IrAEs : Immun related adverse effects. 13.

(14) Plan de thèse I]. Introduction : le cancer, une préoccupation toujours actuelle..................................................... 18 A]. Processus d’oncogenèse : d’une cellule mère à l’apparition d’une tumeur ............................. 18. B]. Aperçu de la thérapeutique actuelle concernant les petites molécules ................................... 20. 1]. Les agents cytotoxiques ............................................................................................................ 21. 2]. L’hormonothérapie : un pas vers une thérapeutique ciblée du cancer .................................... 22. 3]. L’étude du phénotype de la tumeur : les thérapies ciblées ...................................................... 23. II]. Interaction immunité versus cancer : les points de contrôle de l’immunité ................................ 24 A]. Réponse antitumorale physiologique ....................................................................................... 25. B]. Tolérance et échappement tumorale5,7,8,21 ............................................................................... 28. C]. Découverte des points de contrôle de l’immunité.................................................................... 29. III]. PD-1/PD-L1-2: cibles thérapeutiques prometteuses................................................................. 32. A]. Rôle physiologique du complexe PD-1/PD-L1.2 ........................................................................ 32. B]. Preuve de concept : vers une réactivation du système immunitaire........................................ 34. C]. Structures protéiques et interactions au sein du complexe PD-1/PD-L1.2............................... 35. 1]. Structure de la protéine PD-1.................................................................................................... 35. 2]. Structure des ligands de PD-1 : PD-L1 et 2 ................................................................................ 37. 3]. Interaction au sein du complexe PD-1/PD-L1 ........................................................................... 38. IV]. V]. Des Anticorps monoclonaux aux petites molécules organiques de synthèse .......................... 41. A]. Les anticorps monoclonaux anti-PD-1/PD-L1 : mode d’action, avantages et limites ............... 41. 1]. Bases structurales d’interaction des anticorps monoclonaux avec PD-1 et PD-L1 ................... 41. a]. Mode de liaison des anti-PD-1 .................................................................................................. 42. a.1]. Liaison du pembrolizumab avec PD-1 ................................................................................... 42. a.2]. Liaison du nivolumab avec PD-1 ............................................................................................ 44. b]. Mode de liaison des anti-PD-L1 ................................................................................................. 45. 2]. Utilisation en clinique des anticorps monoclonaux : avantages et limites ............................... 46. B]. Recherche d’inhibiteurs peptidiques et pseudo-peptidiques ................................................... 48. C]. Vers un contrôle plus fin de la pharmacocinétique : les petites molécules organiques ........... 48. 1]. Avantages des petites molécules de synthèse organique......................................................... 48. 2]. Premier inhibiteurs du complexe PD-1/PD-L1 décrit dans la littérature .................................. 49 Conclusion et perspectives de recherche...................................................................................... 53. Bibliographie ......................................................................................................................................... 55. 14.

(15) Table des figures 3. Figure 1. Hypothèse admise quant au processus d'oncogénèse . ....................................................... 19 Figure 2. Historique de découverte et de mise sur le marché des inhibiteurs de kinases spécifiques comme thérapies ciblés du cancer. (a) Nombre d'approbation d'inhibiteurs de kinases deopuis 1950. (b) Inhibiteurs de kinases classés par date de mise sur le marché et par type de kinase inhibée. (c) Proportion des inhibiteurs de kinases découvert en fonction des laboratoires pharmaceutiques. SMKI = small molecule kinase inhibitors ou petites molécules inhibitrices de kinases. ................................. 23 Figure 3. Etablissement, propagation et expansion de la réponse immunitaire antitumorale. (1) Les antigènes les plus immunogènes de la tumeur sont captés et présentés sur le CMH des cellules présentatrices d’antigènes CPA. (2) Après migration dans les organes lymphoïdes (ganglions lymphatiques, thymus, rate…), (3) les CPAs vont être responsables de l’activation du clone de Lymphocyte T (LT) spécifique de la tumeur. (4-5) Après migration vers le foyer tumorale les LT, + notamment CD8 , (6) vont activer leurs capacités cytotoxiques (interaction FAS/ FAS-Lg, GranzymePerforine) et détruire les cellules tumorales après reconnaissance de leur antigène spécifique, présenté sur le CMH de classe II. Certains Lymphocytes B (LB) seront à l’origine de la sécrétion d’anticorps tumeur-spécifique (après différenciation en plasmocyte). Ceux-ci permettront l’activation du complément afin d’accroitre le phénomène de lyse tumorale. Les antigènes issus de la lyse de ces 6 cellules vont permettre l’amplification de ce cycle . .............................................................................. 25 Figure 4. A] Structure d'un anticorps (immunoglobuline d'isotype G (IgG)). Les IgG sont constituées de deux chaines protéiques présentant en C terminal une partie constante, conservé entre tous les anticorps et un partie variable responsable de la spécificité de reconnaissance de l’antigène en N terminale. B] Cytotoxicité cellulaire médiée par les anticorps (ADCC). Et cytotoxicité cellulaire médiée 19,20 par l’activation du complément grâce aux anticorps (CDC) . ........................................................... 26 19. Figure 5. Différentes isoformes d'immunoglobulines ainsi que leur structure quaternaire . ................ 27 Figure 6. Activation d’un lymphocyte T CD8+ par une cellule présentatrice d’antigène (à gauche). L’antigène présenté par la cellule dendritique (en vert) sur son complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH II) est reconnu par le TCR (T cell receptor) du lymphocyte T CD8+. Cette reconnaissance constitue le premier signal d’activation de la synapse immunologique. Le second signal activateur de la réponse immunologique repose sur l’interaction entre les protéines de costimulation (CD20/CD80-86 par exemple). Après migration vers le site tumorale (à droite), le microenvironnement inflammatoire de la tumeur va promouvoir le recrutement des ligands de la protéine « programmed cell death 1) 1 et 2 (PDL1/2). Cette reconnaissance provoque ainsi une 22 inhibition de la réponse immunitaire conduisant à l’échappement tumoral. ...................................... 29 Figure 7. Historique de découverte des premiers anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôle 5 de l'immunité jusqu'en 2012 . ................................................................................................................ 30 +. Figure 8. Induction de l’anergie des lymphocytes T CD8 via l'interaction PD-1/PD-L1 et ciblage par des anticorps monoclonaux. IgC, constant immunoglobulin domain; IgV, variable immunoglobulin domain; ITIM, immunoreceptor tyrosine‐based inhibitory motif; ITSM, immunoreceptor tyrosine‐based switch motif; MHC, major histocompatibility complex; PD‐1, programmed cell death‐1; PD‐L, programmed cell death ligand; SHP, Scr homology region 2 domain‐containing phosphatase; TCR, T 5 cell receptor; Treg, regulatory T lymphocytes . ..................................................................................... 33 Figure 9. Imagerie IRM de la regression d'une tumeur rénale chez le patient 4033 dans l’essai de phase 1 du nivolumab. Une réponse partielle est visible au 22 avril 2008. Au 22 juillet 2008 la taille de 37 la tumeur a été divisée par deux . ........................................................................................................ 35. 15.

(16) Figure 10. Interaction PD-1/PD-L1 inhibant la cascade de kinases des voies PI3K-Akt-mTOR et RasMEK-ERK. L'expression de PD-L1, induit par différentes mutation au sein de la cellule cancéreuse, conduit à une tolérance immunologique vis-à-vis du cancer (à gauche). Séquence d’acides aminés de 40 la protéine PD-1 accompagné de la structure annoté par domaine . .................................................. 36 42. Figure 11. A] Structure de la partie extracellulaire de la protéine PD-L1 humaine . B] Profil de 40 reconnaissance de PD-L1 et PD-L2 . .................................................................................................. 38 Figure 12. Structure annotée par feuillets de la protéine PD-1 interagissant avec son ligand PD-L1. L’organisation en sandwich des feuillets des deux protéines est indiquée par des pointillés (en A). Les chaines latérales des acides aminés clés de l'interaction sont présentées (en B). .............................. 39 39,43,44. Figure 13. interface d’interaction entre la protéine PD-1 et PD-L1. . ............................................. 40. Figure 14. Exemple d'interactions hotspots entre PD-1 et PD-L1. Deux liaisons hydrogènes sont visibles entre les résidus D122 (Asp122), Y123 (Tyr123) de PD-L1 et Y68 (Tyr68) et E136 (Glu 136) de PD-1.Une interaction de type pi-pi est également visible entre les tyrosines 123 et 68 des deux protéines. Images obtenues avec le logiciel Pymol® (code PDB : 3RRQ). .......................................... 40 Figure 15. Illustrations des différentes spécialités sur le marché en 2019 ciblant le complexe PD-1/PDL1. Image obtenues sur les différents sites web des laboratoires pharmaceutiques exploitants : BMS, MSD, Genentech (Roche), Pfizer et AstraZeneca. ............................................................................... 41 Figure 16. a] Superposition de PD-1 (représenté en surface grise) avec le nivolumab (en vert) et le pembrolizumab (en magenta). b]Surface de liaison de PD-1 avec le nivolumab (en vert) et le 27 pembrolizumab (en magenta) . c] Superposition du fragment Fab du pembrolizumab avec le PD-L1, 44 liant la protéine PD-1 humaine . .......................................................................................................... 42 Figure 17. Vue des deux sous surface d'intéraction entre PD-1 et la partie variable du Fab du Pembrolizumab. PD-1 est représenté en bleu, les domaines L1 et L3 des chaines lègères du pembrolizumab sont représentés en orange clair et le domaine H3 de la chaine lourde du 44 pembrolizumab est représenté en vert clair ........................................................................................ 43 Figure 18. Vue de l'interaction entre les boucles N-terminale et BC de PD-1 avec les domaines variables du nivolumab (à gauche). Vue de l'intéraction entre la boucle FG de PD-1 et les domaines variables 27 du pembrolizumab (à droite) . CDR =Complementary determinig regions ou région hypervariable responsable de l’affinité entre paratope et épitope. ............................................................................................................ 44 Figure 19. Structure co-cristallisé montrant l'interaction entre l'atezolizumab (anticorps monoclonal humanisé ciblant la protéine PD-L1) et PD-L1. Les résidus de l’atezolimumab sont représentés en couleurs (violet, jaune, orange) et les résidus de PD-L1 sont représentés en gris. Les acides aminés 46 clés de l’interaction entre PD-1 et PD-L1 sont entourés par des cercles pointillés rouges . ............... 46 Figure 20. Structures accompagnées des activités (IC 50) des composés du laboratoire BMS possédant une activité inhibitrice sur PD-L1. La famille du (2-Méthyl-3-biphenylyl)méthanol est encadrée en rouge et représenté par le composé BMS-202. La famille du [3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2méthylphényl]méthanol est encadrée en bleu et représentée par les composés BMS-200, 1001 et 1166. Les IC50 ont été obtenues à l’aide d’un test d’affinité mesuré par fluorescence avec la technique 39 d’ HTRF (homogenous time-resolved fluorescence).Image adaptée de Yang et Hu , et obtenue à l’aide du logiciel Biovia draw®. .............................................................................................................. 50 Figure 21. A] Interaction des composés BMS-200 et BMS-202 au sein du dimer PD-L1A/PD-L1B formé. B] Modification de conformation de la tyrosine 56 (encadré en rouge) de PD-L1A induite par le composé BMS-200. C] Liaison du composé BMS-202 au sien du dimer de PD-L1. D] Liaison du 55 composé BMS-200 au sein du dimer de PD-L1. Image adapté de Guzik et al. . ................................ 51. 16.

(17) Figure 22. Sites d'interactions disponibles pour l'accueil de petites molécules inhibitrices de la 39 reconnaissance PD-1/PD-L1 . ............................................................................................................. 52. 17.

(18) I] Introduction : le cancer, une préoccupation toujours actuelle « Malgré les avancées de la recherche, la France (…) comptent toujours, chaque année, de nouveaux cas de cancer. La mobilisation reste plus que jamais d’actualité. » D’après un article de la ligue contre le cancer (2019). D’après les chiffres de l’organisation mondiale de la santé (OMS), le cancer est responsable de 8,8 millions de décès en 2015. Près d’un décès sur six est dû directement ou indirectement au cancer1. Le cancer se manifeste la plus part du temps au niveau du poumon, du foie, du colon/rectum, de l’estomac ou encore du sein. Bien qu’ayant fait de nombreuses découvertes depuis la compréhension plus fine des mécanismes physiopathologiques du cancer, cette pathologie liée au vieillissement, au mode de vie et à l’exposition au monde extérieure reste préoccupante. Dans cette thèse, l’objectif sera de décrire brièvement le processus par lequel l’organisme autorise la prolifération du cancer. Les avancées effectuées en recherche ont permis de démontrer une interaction forte entre cancer et immunité. Plus récemment, la mise au point et l’utilisation des anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôle de l’immunité, notamment PD-1 et ses ligands (PD-L1 et PD-L2), en clinique ont constitué une révolution dans le traitement du cancer. Ces traitements montrent aujourd’hui quelques limites. Celles-ci peuvent être résolues par le retour aux petites molécules de synthèse organique. Les premiers inhibiteurs puissants du système PD-1/PD-L1 ont été reportés dans la littérature et découvert grâce aux données structurales obtenues via l’utilisation des anticorps monoclonaux.. A] Processus d’oncogenèse : d’une cellule mère à l’apparition d’une tumeur Le cancer se définit par une prolifération incontrôlée des cellules de l’organisme impliquant une sortie du cycle cellulaire2,3. L’apparition de l’état cancer d’une cellule est issu d’une suite de mutation de proto-oncogènes en oncogènes ou de la désactivation de gènes suppresseurs de tumeurs. Les proto-oncogènes sont des gènes naturellement présents dans le noyau des cellules. Ils codent pour la synthèse de protéines impliquées dans le cycle cellulaire (pour la réplication de l’ADN, la division cellulaire…). Des mutations peuvent apparaitre de manière aléatoire formant ainsi des oncogènes. Ces mutations peuvent être d’origine chimique (molécules 18.

(19) toxiques comme le benzène par exemple), d’origine physique (comme les radiations ionisantes, les UVs…), ou épigénétique/environnementale (c'est-à-dire la manière dont l’organisme active ou non certains gènes par rapport aux autres). Les protéines mutées issues de l’expression de ces gènes ont alors une fonction perturbée. Il est possible de prendre la kinase Raf, mutée dans le mélanome pour exemple. Cette kinase est responsable de la phosphorylation d’une autre kinase MEK, toutes deux impliquées dans l’entrée en réplication des cellules humaines. Dans le cadre du mélanome, un cancer de la peau, une mutation se produit chez certains patients en position 600 de la protéine. Une valine est alors remplacée par un acide glutamique (V600E)4. Ce remplacement d’acides aminés dans la séquence de la protéine provoque un changement de conformation qui prend la protéine constitutivement active et engendre une prolifération incontrôlée des mélanocytes au niveau de l’épiderme4,5.. From normal cells to cancer: Oncogenic process. 3. Figure 1. Hypothèse admise quant au processus d'oncogénèse .. Plusieurs décennies de recherche sur le processus d’oncogénèse ont conduit à valider le caractère multi-étape de celui-ci. Le processus d’apparition du cancer repose sur quatre/cinq étapes définies1–3,6.. 19.

(20) . (1) Des altérations d’ordre épigénétique, environnementale, des altérations de chromosomes, ou encore l’apparition de mutations (activation d’oncogènes ou inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs) constituent la première étape de transformation des cellules saines en progéniteurs tumoraux [Figure 1a-b].. . (2) Les progéniteurs tumoraux vont ensuite se multiplier et accumuler d’autres mutations dans divers endroit du génome pour conduire à l’apparition de cellules transformées [Figure 1b-c].. . (3) La production de cytokines va entrainer une modification d’expression des profils de gènes, au sein des cellules transformées. Certaines d’entre-elles vont alors passer à un état de transition en cellules mésenchymateuses. Les cellules mésenchymateuses sont des cellules ayant récupérées des capacités de prolifération proche de celles des cellules souches multipotentes [Figure 1c-d].. . (4) Ces cellules vont ensuite proliférer dans le microenvironnement tumoral. Certaines vont perdre leurs adhérences et quitter le site de la tumeur. On parle de métastases [Figure 1d-e].. . (5) Après migration de ces cellules cancéreuses, via le système sanguin ou lymphatique, les métastases peuvent coloniser d’autres organes et induire des modifications dans le comportement normal des cellules colonisées. Le cancer va alors s’étendre jusqu’à épuiser l’organisme [Figure 1e-f]. Le processus d’oncogénèse est un processus complexe constitué de plusieurs. étapes successives. Ce processus aboutit à des altérations à différents niveaux au sein des cellules transformées : génétique, épigénétique, transcriptomique, protéomique, métabolique et enfin phénotypique2,3,5–8. La compréhension des mécanismes mis en jeu dans l’apparition du cancer à permis le développement de nombreuses classes de médicaments à visée anticancéreuse.. B] Aperçu de la thérapeutique actuelle concernant les petites molécules Le traitement du cancer a connu plusieurs révolutions au cours du temps et de l’avancée des connaissances relatives à la physiopathologie du cancer. Dans le cas de tumeurs solides ou localisées les premiers traitements consistaient en l’exérèse de la tumeur par chirurgie9. Plutôt invasive, cette technique reste maintenant utilisée en dernier recours pour des tumeurs résistantes aux traitements médicamenteux. 20.

(21) Elle reste néanmoins la technique ayant le plus grand taux de réussite depuis ses débuts dans les années 20. En effet, dans le cas de tumeurs localisées, la résection permet d’éradiquer 100% des cellules tumorales après drainage lymphatique afin d’éviter les rechutes. Vers le début des années 40, la radiothérapie est venue en complément ou en substitution à la chirurgie. Non sans effets indésirables, elle n’est adaptée que pour les cancers localisés et non métastatiques comme la chirurgie9. L’arrivée des premières chimiothérapies, a permis, en complément des deux techniques précédentes, de diminuer le nombre de rechute et d’atteindre les cellules ayant quittées l’environnement proche de la tumeur. Différentes classes de molécules ont été développées à partir des années 40. Parmi elles, on trouve tout d’abord les agents cytotoxiques capables de détruire les cellules à haut niveau de réplication. Peu sélectives ces molécules ont laissé place à des thérapies plus spécifiques de la tumeur concernée. De l’hormonothérapie aux anticorps monoclonaux, en passant par la découverte des traitements ciblés (inhibiteurs de kinases mutées) et la mise en évidence du rôle clé de l’immunité, le paysage de la thérapie anticancéreuse a beaucoup évolué. La classification Vidal offre un panorama des différentes classes disponibles actuellement ou dans le passé10,11.. 1] Les agents cytotoxiques Les agents alkylants de l’ADN (acide désoxyribonucléique) et apparentés ont pour fonction d’alkyler les base de l’ADN afin de déstructurer le repliement de la double hélice au sein du noyau. On trouve comme principaux représentants : le cisplatine (dérivé du platine), le cyclophosphamide (Endoxan®), le melphalan (Alkeran®) (moutardes à l’azote) ou encore la carmustine (Bicnu®) (nitroso-urée). Les poisons du fuseau mitotique permettent d’empêcher la division cellulaire au sein de cellules en anaphase. Les médicaments de cette famille sont pour la plus part de molécules issues des plantes. On trouve la vincristine, la vinblastine et dérivés d’hémisynthèses découverts dans la petite pervenche de Madagascar. D’autres molécules comme les taxanes (docetaxel (Taxotere®), paclitaxel (Abraxane®) et dérivés d’hémisynthèses) ont été découverts dans l’écorce d’ifs du pacifique. Ces derniers stabilisent les fuseaux de microtubules afin d’empêcher la cellule de ramener les chromosomes aux pôles de la cellule en division.. 21.

(22) La réplication de l’ADN est nécessaire à la division cellulaire et donc à la prolifération du cancer. Les antimétabolites viennent perturber le métabolisme de réplication de l’ADN afin de bloquer le cycle des cellules en division. Cette famille d’agents anticancéreux est composée des anti-foliques (methotrexate (Novatrex®), pémétrexed (Alimta®)) qui bloque principalement la réduction de l’acide folique, nécessaire à la formation des bases de l’ADN. La seconde sous-classe renferme les antipuriques comme la mercaptopurine, et les antipyrimidiques comme l’azathioprine (Imurel®) responsable principalement de l’insertion de thionucléotides au sein de l’ADN et de l’ARN (acide ribonucléique). Enfin la troisième sous-classe comporte les inhibiteurs du protéazome comme le bortezomib (Velcade®) ou encore la carfilzomib (Kyprolis®). Ces molécules sont des inhibiteurs covalents du protéasome qui empêche la cellule cancéreuse de dégrader les protéines mal conformées ou oxydées. L’accumulation d’agrégats de protéines conduira à la mort de la cellule. Des coupures de l’ADN peuvent apparaitre plus fréquemment dans les cellules cancéreuses suite à des divisions répétées et trop rapides9. En conditions physiologiques les topoisomérases sont des enzymes capables de cliver les brins d’ADN afin de permettre une réparation et une diminution des contraintes de torsion de la double hélice d’ADN. Des inhibiteurs de topo-isomérase ont donc été développés comme agents anticancéreux. Les dérivés de la camptotécine (irinotecan (Campto®) ou topotécan (Hycamtin®)) inhibent la topo-isomérase de type I alors que les anthracyclines (daunorubucine (Cerubudine®), doxorubicines (Adriblastine®)…), ou les dérivés de la podophyllotoxine (étoposide) inhibent préférentiellement la topo-isomérase de type II.. 2] L’hormonothérapie : un pas vers une thérapeutique ciblée du cancer Par la suite, la découverte du caractère hormonodépendant de certains cancers a permis de développer des molécules antagonistes de la prolifération des cellules cancéreuses9. Ces traitements ont été bénéfiques notamment dans le traitement du cancer du sein, de la prostate ou encore de pathologies frontière comme le fibrome utérin12. Les antagonistes de la GnRh (Gonadotropin Releasing Hormone) comme le dégarelix (Firmagon®) ont pour rôle de bloquer le signal hormonal, au niveau hypophysaire, responsable de la multiplication incontrôlée des cellules cancéreuses. Au niveau local les anti-androgènes comme l’abirantérone (Zitiga®) permettent également de contenir la population de cellules cancéreuses. De manière similaire des 22.

(23) anti-oestrogènes ont été développés comme le tamoxifène (Nolvadex®) ou le fulvestrant (Faslodex®) par exemple, pour avoir la même action mais en bloquant les récepteurs aux œstrogènes. D’autres molécules ont pour rôle de neutraliser la production d’hormones comme le létrozole (Femara®) (inhibiteur d’aromatase bloquant la formation des œstrogènes).. 3] L’étude du phénotype de la tumeur : les thérapies ciblées Vers la fin des années 90 et début des années 2000, les nouvelles connaissances sur différents types de cancers ont montré une variabilité importante quant aux protéines impliquées dans la prolifération du cancer9,13,14. L’analyse des voies métaboliques et des cascades de kinases a permis l’arrivée sur le marché en 2001 de l’imatinib (Glivec®) comme inhibiteur spécifique de la kinase Bcr-Abl dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique à chromosome Philadelphie13,15 [Figure 2]. D’autres thérapies ciblées vers la protéine BRaf V600E ont vu le jour comme discuté précédemment, avec la mise sur le marché du vémurafénib (Zelboraf ®)4,5.. Figure 2. Historique de découverte et de mise sur le marché des inhibiteurs de kinases spécifiques comme thérapies ciblés du cancer. (a) Nombre d'approbation d'inhibiteurs de kinases depuis 1950. (b) Inhibiteurs de kinases classés par date de mise sur le marché et par type de kinase inhibée. (c) Proportion des inhibiteurs de kinases découvert en fonction des laboratoires pharmaceutiques. SMKI = small molecule kinase inhibitors ou 13 petites molécules inhibitrices de kinases .. De la même manière les études effectuées sur l’interaction entre cancer et immunité ont permis de mettre en lumière un rôle majeur du système immunitaire 6. 23.

(24) En effet, celui-ci est en charge de maintenir l’homéostasie immunitaire vis-à-vis de menaces extérieures ou intérieures. Ainsi l’utilisation d’anticorps monoclonaux comme le rituximab (Rituxan®) ciblant spécifiquement les cellules au niveau de la protéine CD20 s’est inscrit dans les thérapeutiques comme nouvelle arme contre le cancer et à ouvert la porte au développement d’autres biothérapies. L’influence et le rôle du système immunitaire dans le cycle du cancer a bénéficié de nouvelles avancées et nous permet aujourd’hui d’envisager de nouveaux modes d’actions pour les médicaments de demain. Les anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôle de l’immunité ont constitué une révolution dans le traitement des cancers surexprimant ces types de protéines. Les points de contrôle de l’immunité sont un pilier de l’interaction immunité-cancer.. II] Interaction immunité versus cancer : les points de contrôle de l’immunité Du fait de leur cohabitation dans l’environnement, les êtres vivants sont exposés en permanence à des agents du soi (ensemble des cellules et antigènes de notre corps) ainsi qu’à des agents du non-soi (l’ensemble des antigènes issus de bactéries, virus, parasites ou encore de cellules transformées) capables de les infecter et de compromettre leur survie16. Les mammifères ont donc dû développer, au fil de l’évolution, un système de surveillance ingénieux capable de garantir l’homéostasie immunologique du corps : le Système Immunitaire. Cet équilibre immunologique est permis grâce à la coopération étroite des cellules de l’immunité innée (Monocytes, Macrophages, polynucléaires…) et celle de l’immunité adaptatives (Lymphocytes B, T et NKT)17. Dans des conditions physiologiques, le système immunitaire est alors en mesure de détecter et d’éliminer les cellules transformées ainsi que les agresseurs microbiologiques potentiels tout en épargnant les cellules saines de notre corps. La présentation ou reconnaissance antigénique est un principe fondamental de l’immunité. Au sein du corps humain, un grand nombre de cellules sont capables de capter des peptides antigéniques et de les associer à des protéines de présentation, au niveau de la surface cellulaire8,18. Le Complexe Majeur d’Histocompatibilité ou CMH rempli cette fonction par l’intermédiaire de deux sous types : le CMH de classe I (CMH I) et de classe II (CMH II). 24.

(25) A] Réponse anti-tumorale physiologique L’ensemble des mutations acquises lors du processus d’oncogenèse, au sein de la cellule tumorale est responsable d’une modification de son métabolisme et donc de modifications dans le peptidome de surface. Ces modifications rendent les cellules cancéreuses plus immunogènes et donc plus visibles par le système immunitaire. Les cellules immunitaires de l’hôte sont capables de capter et d’internaliser des antigènes tumoraux et de les présenter associées aux molécules du CMH II. Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPA (Cellules dendritiques, Macrophages, Lymphocyte B périphériques activés…) naïves vont alors migrer dans les ganglions lymphatiques et autres organes lymphoïdes (thymus, rate) afin d’initier un processus de coopération cellulaire5,6. Durant cette migration les protéines du CMH ainsi que les protéines de co-stimulation (CD80 par exemple) vont être surexprimées. A ce niveau, les CPAs vont faire interagir leur complexe CMH-antigène avec le TCR (T-cell receptor) des Lymphocytes T16. La sélection du clone de LT spécifique de l’antigène présenté, conduira à l’activation de celui-ci. Une fois activés, les LT spécifiques de la tumeur vont rejoindre le foyer tumoral afin de détruire les cellules les plus immunogènes par le biais de leurs capacités cytotoxiques (interaction FAS/FAS-Ligand, Granzyme-Perforine…)19. La destruction des premières cellules de la tumeur va conduire à la libération de nouveaux antigènes tumoraux. Captés par les CPAs, ceux-ci vont permettre d’alimenter et d’entretenir l’activation et l’expansion de la réponse immunitaire adaptative et spécifique de la tumeur [Figure 3]5,6.. Figure 3. Etablissement, propagation et expansion de la réponse immunitaire anti tumorale. (1) Les antigènes les plus immunogènes de la tumeur sont captés et présentés sur le CMH des cellules présentatrices d’antigènes. 25.

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(43) l’assemblage de deux chaines protéiques : une chaine légère et une chaine lourde reliées par quatre ponts disulfures [Figure 4]. De l’extrémité C terminale (CT) vers le N terminale (NT) on trouve les domaines CH3-CH2-CH1-VH (pour la chaine lourde « heavy chain») et CL-VL (pour la chaine légère « light chain »). Les régions constantes (CH et CL) sont conservées entre toutes les IgG, alors que la région variable (VH et VL) donne la spécificité de reconnaissance épitope-paratope. L’interaction anticorps-antigène est l’une des interactions possédant naturellement le plus d’affinité.. 19. Figure 5. Différentes isoformes d'immunoglobulines ainsi que leur structure quaternaire .. En parallèle de l’action de neutralisation, les anticorps participent à l’élimination des cibles reconnues. Ils assistent les phénomènes de cytotoxicités médiés par les lymphocytes T, cellules NK ou les autres phagocytes. Le fragment Fc en partie CT peut être reconnu par les récepteurs FcγR à la surface des cellules immunitaires. Après reconnaissance à la fois de l’antigène spécifique et du FcγR, la proximité entre cellule immunitaire et cellule tumorale va aboutir à la destruction de la cible par le mécanisme de l’ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) [Figure 4]. Les anticorps jouent enfin un dernier rôle dans la clairance des cellules tumorales. De manière indépendante des cellules immunitaires, deux IgG adjacentes fixés sur leurs antigènes tumoraux vont pouvoir activer la voie du complément ou CDC (Complement-dependent cytotoxicity). Le complément est une série de protéases solubles dont le rôle est de créer des pores dans la membrane des cellules à détruire. Durant l’activation du complément la C3 convertase (complexe du C2a et C4b) libère la protéine C3b. Celle-ci va pouvoir s’insérer dans la membrane de la cellule tumorale et être reconnu par le récepteur C3bR à la surface des macrophages. A l’issu de cette. 27.

(44) reconnaissance les macrophages pourront également participer à la réponse antitumorale par CDCC (Complement-dependent cellular cytotoxicity)20. Les cellules cancéreuses sont des cellules à haut niveau métabolique présentant un taux de mutation élevé. Ainsi de multiples antigènes vont être créés et libérés perpétuant la réponse anti-tumorale jusqu’à sélection des cellules les moins immunogènes5.. B] Tolérance et échappement tumorale5,7,8,21 En oncologie, la reconnaissance de peptides antigéniques spécifiques de la cellule cancéreuse est à l’origine de la destruction du foyer tumoral au sein d’un organisme non malade8. En cas de modification de l’immunopeptidome de surface, ou de surexpression de protéines inhibitrices de la réponse immunitaire, une nonreconnaissance de cellules transformées, infectées ou cancéreuses peut perturber l’homéostasie vis-à-vis du cancer. Le cycle immunitaire du cancer est constitué de trois étapes majeures : . L’élimination des cellules tumorales par le système immunitaire grâce à la clairance des cellules tumorales après reconnaissance des peptides présentés sur le CMH I (pCMH I) par le TCR (T-cell receptor) des LT.. . Une phase d’équilibre où cohabitent des cellules cancéreuses non détruites mais dont la prolifération est contrôlée par l’immunité. Ainsi lors des phases d'élimination et d'équilibre, les cellules immunitaires parviennent à détruire et contrôler la progression de la tumeur. Cependant, certaines cellules ont acquis des mutations leur conférant une immunogénicité amoindrie. Il se produit alors un phénomène de sélection des cellules les moins immunogènes.. . Et enfin l’étape d’échappement ou tolérance immunologique. Suite à la sélection immunitaire, certaines cellules tumorales ont développé des mécanismes permettant d’inhiber la réponse immunitaire. Certaines d’entre-elles sont par exemple capables, de reproduire le phénomène d'anergie ou d'induire l'apoptose des cellules immunitaires. Ce processus est souvent dû à l'expression en surface des cellules cancéreuses, de signaux inhibiteurs de l'immunité (PD1-PD1L et CTLA4CD80/86). Ainsi, la balance entre signaux inhibiteurs et activateurs de la réponse immunitaire penche fortement en faveur de l'inhibition des cellules immunitaires et 28.

(45) donc de la prolifération des cellules tumorales. D’autres cellules quant à elles, exposent un immunopeptidome modifié ne présentant pas de peptides caractéristiques de cellules transformées. Elles ne peuvent donc pas être reconnues par les LT et échappent au contrôle immunitaire.. Figure 6. Activation d’un lymphocyte T CD8+ par une cellule présentatrice d’antigène (à gauche). L’antigène présenté par la cellule dendritique (en vert) sur son complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH II) est reconnu par le TCR (T cell receptor) du lymphocyte T CD8+. Cette reconnaissance constitue le premier signal d’activation de la synapse immunologique. Le second signal activateur de la réponse immunologique repose sur l’interaction entre les protéines de co-stimulation (CD20/CD80-86 par exemple). Après migration vers le site tumorale (à droite), le microenvironnement inflammatoire de la tumeur va promouvoir le recrutement des ligands de la protéine « programmed cell death 1) 1 et 2 (PDL1/2). Cette reconnaissance provoque ainsi une inhibition de 22 la réponse immunitaire conduisant à l’échappement tumoral .. La tolérance immunitaire naturelle ou induite en reconnaissance des antigènes du soi ou du non-soi est essentielle au maintien d'une réponse immunitaire physiologique. Cela permet de répondre efficacement aux antigènes non-soi tout en évitant les phénomènes d'auto-immunité. L'apprentissage de cette tolérance immunitaire intervient au stade primaire de développement des lymphocytes dans le thymus (pour les lymphocytes T) est dans la moelle osseuse (pour les lymphocytes B) c'est ce que l'on appelle la tolérance centrale22–24. L'ensemble des lymphocytes de la moelle osseuse ou du thymus sont mis en contact avec des antigènes du soi. Ceux présentant une trop grande affinité (auto-réactivité) seront alors éliminés. De cette manière, l'organisme est en mesure de ne libérer dans la circulation que les lymphocytes qui ne seront pas auto-réactifs. Ce système n'étant pas parfait, il arrive que certaines cellules auto-réactives sortent de la moelle osseuse ou du thymus, et se voient impliquées dans des phénomènes auto-inflammatoires. Pour pallier à cela, le système immunitaire est doté de lymphocytes T régulateur, capables d'induire des phénomènes d'apoptose ou d'anergie.. C] Découverte des points de contrôle de l’immunité. 29.

(46) C’est au 19ème siècle que William Coley testa l’hypothèse d’une interaction entre cancer et immunité. Coley montra que l’utilisation d’une toxine bactérienne connue sous le nom de toxine de Coley à l’époque pouvait induire une rémission spontanée et de longue durée, chez des patients atteints de sarcomes inopérables 5. Suite à ces expériences, le rôle de la réponse immunitaire fut mis en lumière dans la destruction des cellules tumorales. Le mécanisme inflammatoire induit par l’injection de cette toxine, inconnu à l’époque, a conduit pendant les années suivantes à la mise à l’écart de cette approche innovante utilisant le système immunitaire pour éradiquer les tumeurs. Ainsi d’autres traitements de chimiothérapies conventionnels ont vu le jour (Alkylants de l’ADN, poison du fuseau, intercalant de l’ADN, inhibiteur du protéasome…) accompagnés par la suite de la radiothérapie et de la chirurgie 11. Après plusieurs décennies de recherche, l’accumulation de nouvelles connaissances sur la physiopathologie du cancer et sur le fonctionnement du système immunitaire ont remis au goût du jour les travaux de Coley [Figure 7].. Figure 7. Historique de découverte des premiers anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôle de 5 l'immunité jusqu'en 2012 .. Avant l'arrivée des premières thérapies, ciblant les points de contrôle de l'immunité, cœur de cette thèse, le traitement du fond du cancer consistait en l’injection 30.

(47) d'interleukin-2 ou d'agents cytotoxiques non spécifiques utilisés dans les chimiothérapies5. Le profil de toxicité de ces molécules, accompagné d'une faible amélioration de la survie chez les patients ont poussé la recherche à développer de nouvelles thérapies ciblées (notamment les premiers inhibiteurs des kinases BRAF et MEK : le vémurafénib et le tramétinib (Mekinist®) dans le traitement du mélanome). Dans l'essai clinique brim 3 par exemple, plus de la moitié des patients ont montré une réponse au vémurafénib, deux d'entre eux ont montré une réponse complète et 104 une réponse partielle. A l’inverse, dans le groupe traité par chimiothérapie conventionnelle à base de dacarbazine et de paclitaxel seulement 5% de réponse au traitement a été constaté25. Malheureusement le ciblage direct des protéines mutées au sein des tumeurs montre de plus en plus, un épuisement de la réponse thérapeutique après 6 à 7 mois de traitement. C'est finalement dans les débuts du 21ème siècle que la découverte des points de régulation de l'immunité a permis le développement de nouveaux régulateurs de ces protéines. C'est en 2011, que le premier anticorps monoclonal ciblant un des points de contrôle de l'immunité a été approuvé pour les patients atteints de mélanome. L'ipilimumab, premier anticorps monoclonal ciblant la protéine CTLA-4. Très rapidement, la mise sur le marché du nivolumab et du pembrolizumab (en 2014), tous deux ciblant la protéine PD-1, est venue compléter l’arsenal thérapeutique dans le traitement du mélanome [Figure 7]. En comparaison aux chimiothérapies conventionnelles, les inhibiteurs des points de contrôle de l'immunité ne montrent pas seulement une augmentation de la survie sans progression mais également une réponse durable avec un effet de plateau au cours du temps. L'intérêt pour les inhibiteurs des points contrôle de l'immunité est alors désormais grandissant. Ainsi en 2013, le journal scientifique Science a dénommé l'immunothérapie du cancer comme la révolution de l'année26. Par la suite en 2015, de nombreux anticorps monoclonaux ont obtenu des extensions d'indication pour le traitement de cancers hématologiques. Plus récemment sont également été mis sur le marché en 2016 l'atezolimumab et en 2017 l'avelumab et le darvalumab ciblant l’interaction PD-1/PD-L1. Au regard de ces avancées ciblant les points de contrôle de l'immunité dans le traitement du cancer, peu de conception rationnelle de petites molécules inhibitrices, de ces mêmes protéines, ont été effectué durant les 10 à 20 dernières années. L'im31.

(48) portance biologique des points de régulation de l'immunité n'est plus à démontrer à l'heure actuelle. Les limitations observées lors de traitement par les anticorps monoclonaux ciblant ces protéines nous conduisent à penser que le développement de petites molécules organiques ciblant ces protéines pourrait venir compléter l'arsenal thérapeutique déjà disponible en oncologie. Par ailleurs, les avancées dans l'étude fonctionnelle et structurale de ces protéines de contrôle de l'immunité permettent actuellement de déterminer des hotspots d'interaction pouvant être ciblés par de petites molécules organiques5.. III]PD-1/PD-L1-2: cibles thérapeutiques prometteuses Le développement de petites molécules inhibitrices, par conception rationnelle, requière une compréhension fine de la structure des protéines ciblées ainsi que du mode d’interaction mise en jeu. Les études effectuées sur les protéines PD1/PD-L1.2 (programmed cell death protein 1/ programmed cell death protein ligand 1.2) et CTAL-4/CD80-86 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4/ cluster de differenciation 80-86) ont permis d´élucider les acides aminés essentiels responsables de l’interaction inhibitrice du système immunitaire27.. A] Rôle physiologique du complexe PD-1/PD-L1.2 Depuis la fin des années 90 [Figure 7], le complexe PD-1/PD-L1 a été identifié comme une voie majeure entrainant l’anergie et l’apoptose des cellules immunitaires. A l’inverse du complexe CTLA-4/B7, affectant les lymphocytes T à leur stade primaire de développement, l’expression de PD-1 intervient en périphérie au niveau du microenvironnement tumorale. Il se produit alors une diminution de l’activation des lymphocytes T CD8+ au sein de la tumeur qui est responsable de l’inhibition de la réponse immunitaire à médiation cellulaire par les LT CD8+ pré-activés28.. 32.

(49) +. Figure 8. Induction de l’anergie des lymphocytes T CD8 via l'interaction PD-1/PD-L1 et ciblage par des anticorps monoclonaux. IgC, constant immunoglobulin domain; IgV, variable immunoglobulin domain; ITIM, immunoreceptor tyrosine‐based inhibitory motif; ITSM, immunoreceptor tyrosine‐based switch motif; MHC, major histocompatibility complex; PD‐1, programmed cell death‐1; PD‐L, programmed cell death ligand; SHP, Scr 5 homology region 2 domain‐containing phosphatase; TCR, T cell receptor; Treg, regulatory T lymphocytes .. En conditions physiologiques, l'interaction entre le pCMH I, d'une cellule cancéreuse, et le TCR d'un LT aboutie à l’activation d’une cascade de kinase intracellulaire. Une vive réponse cytotoxique avec destruction de la cellule tumorale permet ensuite d’éliminer les cellules malades. En parallèle, l’activation des cellules immunitaires permet aussi d’accroitre la prolifération, la survie, la production de cytokine et diminue l’orientation en profil T régulateur des lymphocytes T CD4+. L’interaction PD1-PD-L1 est également responsable de l’induction de la tolérance immunologique du soi. En effet, l’activation de ce point de contrôle de l’immunité permet de diminuer l’occurrence et l’intensité des réactions inflammatoires indésirables, comme celles responsables des poussées inflammatoires en cas de maladies auto-immunes. Ainsi, des déficits de signalisation PD-1/PD-L1 ont été mis en évidence comme responsable de l’apparition de différentes maladies dysimmunitaires : glomérulonéphrite de type lupique29, arthrite29, cardiomyopathie auto-immune30, diabète31, colite inflammatoire32 ou encore sclérose en plaque33 dans divers modèle animaux. L’exposition en surface, par les cellules cancéreuses, des ligands de la protéine PD-1 (PD-L1 ou 2) sera responsable de l’activation de phosphatases SHP-1/2 (Scr homology region 2 domain‐containing phosphatase 1/2), au niveau de domaine ITIM (immunoreceptor tyrosine‐based inhibitory motif) [Figure 8]5. Ces phosphatases pourront venir inhiber le signal activateur de la réponse immunitaire afin de provoquer l’anergie ou l’apoptose du lymphocyte T. Le développement de molécules anti PD-1 ou anti PD-L1/2 est alors un moyen efficace pour briser la tolérance immu-. 33.

(50) nologique induite par certaines tumeurs et ainsi retrouver l’homéostasie vis-à-vis du cancer [Figure 8]5,26,28. Le complexe PD-1/PD-L1 joue également un rôle très important dans la réponse immunitaire à divers pathogènes. Par exemple, chez les patients atteint d’une tuberculose active, l’expression de PD-1 est augmentée. Cela conduit à une augmentation du pool de lymphocyte T anergique d’activité amoindrie. Par ailleurs, des essais de neutralisation utilisant des antagonistes de PD-1 ou de ces ligands ont permis de mettre en évidence un éveil du système immunitaire accompagné de la prolifération des lymphocytes T spécifique du pathogène et d’un contrôle de la maladie34.. B] Preuve de concept : vers une réactivation du système immunitaire Exprimé plus tardivement à la membrane des lymphocytes T activés, la protéine PD-1 est induite de manière forte dans le microenvironnement tumoral 5. Ainsi la proportion de lymphocytes surexprimant PD-1 est plus forte dans le cas de tumeurs solides. A l’inverse, les ligands de PD-1, PD-L1 et PD-L2 sont exprimés dans diverses cancers qu’ils soient solides ou non. L’expression de PD-L2 en grande quantité est également corrélée à de meilleurs pronostics que celle de PD-L135. En effet, l’expression du ligand PD-L1 reste très faible voire absente dans les tissus sains. Elle n’augmente qu’en conditions inflammatoires, sous l’effet des interférons, afin d’éviter la destruction d’un trop grand nombre de cellules normales5,34,35. Cependant, comme décrit précédemment, l’expression de cette protéine par des cellules cancéreuses (colonniques, ovariennes, pulmonaires ou encore dans le mélanome) peut conduire à une tolérance vis à vis du cancer par les cellules immunitaires36. Des tests effectués chez des souris immunodéficientes afin de prouver que le blocage du système PD-1/PD-L1 pouvait permettre de réactiver le système immunitaire et de rétablir une réponse anticancéreuse physiologique. Des souris de type RAG-1-/-, immunodéficientes, ont été inoculées en intra péritonéale, par des cellules de mastocytome P815 présentant (B7-H1/P815) ou non (P815) une surexpression de PD-L1 (B7-H1). L’injection de lymphocytes T CD8+ activés pour le groupe de souris P815 (cellules tumorales de mastocytome ne surexprimant pas le ligand de PD-1) a conduit à une diminution du nombre de cellules tumorales. A l’inverse, cette même injection dans le groupe de souris B7-H1/P815 (cellules tumorales de mastocytome 34.