L'ETUDE DES VOIES DE SECRETION DES CELLULES AtT20: L'ASSOCIATION AMYLASE D'ORGE ET CALRETICULINE DANS
LE TRAFIC DISTAL DE LA GLYCOPROTEINS
Par
Helena Senta
these presentee au Departement de biologie en vue de l'obtention du grade de docteur es sciences (Ph.D.)
FACULTE DES SCIENCES UNIVERSITE DE SHEBROOKE
1*1
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Canada
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Le 9 mai 2008
lejury a accepte la these de Mme Helena Senta dans sa version finale. Membres dujury
M. Denis LeBel Directeur
Departement de biologie
Mme Nathalie Beaudoin Membre
Departement de biologie
M. GuyBoileau Membre externe
Departement de biochimie - Universite de Montreal
M. Richard Blouin President-rapporteur Departement de biologie
SOMMAIRE
Dans le but d'etudier les voies de la secretion on a exprime l'amylase d'orge dans les cellules neuroendocrines AtT20. Nos recherches demontrent que le site consensus de glycosylation present dans la structure primaire de Pamylase d'orge est fonctionnel et qu'il est facilement reconnu par la machinerie de glycosylation. Ceci est la premiere fois que la glycosylation de l'amylase d'orge est produite. Cette glycosylation est du type riche en mannose et l'enzyme glycosylee maintient son activite catalytique envers son substrat l'amidon. Efficacement exprimee, la glycoprotein est secretee dans le milieu extracellulaire. Cependant, cette secretion ne repond pas a la stimulation par secretagogue ce qui prouve qu'elle est exclue de la voie de secretion regulee (grains de secretion matures). Curieusement, on observe une nette difference dans la proportion de la glycoforme de la proteine secretee et celle retenue dans la cellule. Par des etudes dynamiques (marquage radioactif) on a pu etablir que la proportion de la glycoforme retrouvee dans la secretion ne depasse pas 50 % de la proteine totale tandis qu'on retrouve une moyenne de 70 % de la glycoforme dans la cellule. On a aussi observe ce comportement de l'amylase dans les cellules pancreatiques AR42J et les cellules PC 12 de la glande surrenale.
Par pontage chimique on a confirme l'association d'amylase d'orge avec une autre proteine et identifie cette derniere comme etant la calreticuline. Selon nos resultats, dans les cellules AtT20, la calreticuline normalement residente du reticulum plasmique, se lie specifiquement a l'amylase glycosylee et l'accompagne du reticulum endoplasmique jusqu'a un compartiment acide localise dans une region distale du post toms'-Golgi. De plus, en neutralisant le pH intracellulaire, on a demontre un changement de la distribution et de la proportion d'amylase glycosylee dans la cellule, indiquant que la dissociation du complexe calreticuline-amylase pourrait se faire suite a un changement de pH dans ce compartiment.
Enfin, nos recherches mettent en evidence un changement draconien de la distribution de la calreticuline cellulaire suite a la transfection de l'amylase.
Les resultats apportes demontrent que le trafic de l'amylase d'orge dans les cellules neuroendocrines pourrait se faire via la calreticuline par un mecanisme actif et hautement specifique.
Dans un deuxieme volet, notre etude avait pour but d'etudier le role du domaine C des alpha-amylases. Ce domaine structural present dans toutes les amylases et faiblement associe au baril catalytique n'a pas un role defini. Nous avons construit des mutants du domaine C manquant un ou plusieurs feuillets (3. Transferees dans les cellules, ces proteines mutantes ne sont pas detectees ni dans le milieu de secretion ni dans la cellule. De plus, nous n'etions pas en mesure de detecter leur activite catalytique. Par contre, dans le systeme d'expression in vitro les mutant sont efficacement traduits et transloques dans les microsomes. Malgre ceci, les proteines demeurent catalytiquement inactives comme observe in vivo. Selon nos resultats, le seul mutant detectable dans les cellules conserve trois des quatre feuillets P faisant face au domaine A. Nos resultats demontrent qu'un domaine C entier d'une amylase de source differente pourrait remedier a l'expression de la proteine dans les cellules sans toutefois reconstituer 1'activite enzymatique. Ceci nous indique qu'un domaine C intact est necessaire pour le bon repliement de la proteine et aussi pour une activite enzymatique valide.
REMERCIEMENTS
La realisation de ce travail ne aurait pas ete possible sans la precieuse aide du Dr. Denis LeBel, son esprit critique, ses conseils judicieux et sa direction.
Des remerciements particuliers sont adresses a M. Will Home pour son soutien moral et pour toute la collaboration qu'il m'a offerte durant mon sejour au laboratoire. Ici, je profite de l'occasion pour remercier tous les etudiants et stagiaires pour les discussions utiles, enrichissantes et souvent interminables.
TABLE DE MATIERES
SOMMAIRE i
REMERCIEMENTS iii
TABLE DE MATIERES iv
LISTE DES FIGURES v
INTRODUCTION 1
CHAPITRE 1
Presentation de 1'article 33
Glycosylated barley amylase drags calreticulin into a post-TGN
compartment 36
CHAPITRE 2
Presentation de l'article 60
The a-amylase C domain plays an essential role in both the folding and the enzymatic
activity of the protein 63
CHAPITRE 3
Resultats supplementaires 90
DISCUSSION 97
CONCLUSION 104
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Structure des amylases 4
Figure 2. Comparaison des domaines C des amylases d'orge et
pancreatique 5
Figure 3. Les JV-glycoproteines 10
Figure 4. La calreticuline dans le repliement des glycoproteins 15
Figure 5. Le transport vesiculate entre les differents compartiments
intracellulaires 18
Figure 6. Deux modeles du mouvement dans l'appareil de Golgi 20
Figure 7. Voies de secretion 23
Figure 8. Modele de ciblage a entree 26
Figure 9. Modele de ciblage par retention 27
Figure 10. Chromatographie d'affinite sur Concanavaline A de 1'amylase
d'orge 92
Figure 11. L'expression des mutants non glycosylates dans les cellules
AtT20. Stimulation avec 8 Br-cAMP 94
Figure 12. Essai de solubilisation 95
Figure 13. Comparaison de solubilisation de mutants et d'amylase d'orge
INTRODUCTION
La controverse entourant les mecanismes de la secretion cellulaire etant toujours vive et passionnante fait que les etudes menees ne peuvent guere generaliser ni uniformiser ce sujet dont rimportance est indeniable. Le texte qui suit n'est done qu'une modeste contribution, qui vise a aj outer de nouvelles etincelles sur le feu de ce debat.
AMYLASE
L'alpha-amylase (1,4-a-glucanohydrolase E.C. 3.2.1.1.) catalyse Phydrolyse des liaisons osidiques a-1,4 des polysaccharides comme Pamidon et le glycogene. En comparant des sequences des glucoside hydrolases, il est possible de classer ces enzymes en trois families selon leur structure plutot que leur specificite catalytique (Henrissat et Bairoch, 1993). D'apres cette classification, ces families regroupent en effet des enzymes apparentees catalysant l'hydrolyse ou la transglucosylation des polysaccharides. La plupart de ces enzymes agissent sur l'amidon. L'enzyme la plus importante et la plus etudiee est l'alpha-amylase (Henrissat et Bairoch, 1993; MacGregor et al., 2001). Une caracteristique pour toutes les enzymes appartenant a la famille de glucanohydrolases est le fait qu'elles emploient un mecanisme variable de retention du substrat. Toutes ces enzymes sont des proteines a plusieurs domaines et se caracterisent par leur domaine catalytique en forme de baril (P/a)s. Cette structure, revelee par cristallographie a rayons X chez plusieurs alpha-amylases est un baril forme de huit brins p entoures de huit helices a. Cet arrangement forme le domaine A qui est le domaine le plus conserve. Dans la plupart des amylases, ce domaine est localise en N-terminal de la proteine (Janecek et al., 1997). Les boucles liant les brins P aux helices avoisinantes portent les acides amines du site actif et sont assez longues pour etre considerees comme un domaine en soi. La large boucle entre le troisieme brin p et
1997; Ramasbubbu et al., 1996; Brayer et al, 1995; Kadziola et al., 1994; Quian et al., 1993). Le site actif de 1'enzyme dans le domaine A est forme par plusieurs sous-sites, chacun competitionnant pour la liaison avec le glucide tandis que le domaine B a pour role de Her le Ca2+. En plus de ces deux domaines, plusieurs autres domaines peuvent s'inserer
dans le baril catalytique ou le succeder comme les domaines C, D, E et I (van der Maarel et al., 2002). Dans le cas des deux enzymes utilisees dans notre etude qui sont l'amylase pancreatique de rat et l'amylase d'orge c'est le domaine C qui succede aux domaines A et B. Ce domaine C se situe en C terminal de la proteine (Figure 1) et il consiste structuralement en des brins P replies independamment des domaines A et B. Cependant, la fonction exacte du domaine C n'est pas connue. Plusieurs rapports indiquent qu'il est necessaire pour stabiliser le domaine catalytique en protegeant les residus hydrophobes du domaine A (Robert et al., 2003; MacGregor et al., 2001). D'autres rapports suggerent que le domaine C peut assister dans la liaison avec le substrat (Dauter et al., 1999). Les mutation dans le domaine C d'amylase de Bacillus stearothermophilus indiquent que ce domaine est implique dans Pactivite catalytique (Holm et al., 1990). Cette etude qui cible trois residus conserves du domaine C (His 238, Asp 311 et Arg 232) indique que le domaine C est essentiel pour Pactivite enzymatique car ces mutations diminuent Pactivite specifique, la thermostabilite ou encore, abolissent carrement Pactivite catalytique. Dans le cas d'amylase pancreatique, Petude de Doyon et al. (2002) demontre que les mutations ponctuelles des sites de glycosylation contenus dans le domaine C n'affectent pas Pactivite specifique de cette enzyme.
En raison de son activite catalytique et la facilite d'expression dans les differents systemes, P alpha amylase est une proteine de choix dans les etudes du transport vesiculate et de la secretion cellulaire. Tel que documente dans les travaux de Daull et al (2003), Colomer et al (1994) et Hoops et al (1993), c'est l'amylase pancreatique de mammiferes qui est souvent utilisee comme modele de proteine de secretion. Pour ce projet, nous avons choisi l'amylase d'orge, une enzyme vegetale, dont la structure est similaire a celle de l'amylase pancreatique (Figure 1) excepte pour le domaine C qui est moins volumineux avec seulement cinq
feuillets p antiparalleles (Kadziola et al., 1994) comparativement aux dix feuillets dans l'amylase pancreatique (Qian et al., 1993) (Figure 2).
Comme toutes les amylases, l'amylase d'orge a un domaine A et B en forme de baril (P/a)s qui contient le site actif, son domaine B etant stabilise par trois ions Ca2+ (Kadziola et al.,
1994). Ce dernier est essentiel pour la stabilite et l'activite de Penzyme (Kadziola et al., 1998). Le domaine C (Figure 1) est aussi present mais son role fonctionnel n'est pas connu (Nielsen et al., 2004 ; MacGregor et al, 2001 ; Kadziola et al, 1998). En depit des similitudes de structure, il est important de noter que la sequence des residus en acides amines de l'amylase d'orge n'est pas tres etroitement apparentee aux amylases de sources differentes (amylases animales ou de microorganismes) (Rogers, 1985a). D'apres les travaux de MacGregor (2001), l'amylase d'orge presente seulement neuf residus identiques avec l'amylase pancreatique (MacGregor et al., 2001). Cependant ceci n'affecte pas l'activite catalytique qui demeure tres semblable. L'amylase d'orge a par contre dix sous-sites de reconnaissance avec le substrat comparativement a l'amylase humaine et porcine qui en ont cinq (Oudjeriouat et al., 2003). Les mutations de sous-sites affectent la specificite de liaison avec le substrat (Gibson et Svensson, 1998 ; Oudjeriouat et al., 2003). Le domaine C de l'amylase d'orge ne possede que cinq feuillets (3 et son role n'est pas determine. Cependant il existe des indications que son role pourrait etre d'assurer le soutien du substrat lors de la catalyse par le site catalytique comme cela est documente dans les travaux de Geiger et al. (2003), Robert et al. (2003) et , plus recemment de Bozonnet et al. (2007). Lors de la germination dans les grains d'orge, l'amylase a pour role la degradation de l'amidon qui constitue environ 70 % de la masse seche du grain (Im et Henson, 1995). Cet amidon constitue la source primaire d'energie et de carbone jusqu'a ce que la plantule devienne autotrophe (Im et Henson, 1995). Le grain d'orge produit deux isoenzymes d'amylase AMY1 et AMY2 provenant de genes differents (Jones et Jacobsen, 1991; Rogers, 1985a). Ces deux isoenzymes ont 80 % d'identite de sequences (Rogers, 1985b). Malgre des caracteristiques biochimiques differentes, AMY1 a un pi plus bas (pl=4,9) tandis que AMY2 est la forme ayant le pi le plus eleve (pl=5,9) (Jacobsen et Higgins, 1982).
Figure 1 : Structure des amylases.
Les structures 3D de 1'amylase pancreatique (A) et de l'orge (B) obtenues par cristallographie a rayons X. Les domaines A (en rouge) de 1'enzyme ont la structure du baril (p7ot)8, tandis que le domaine C (en jaune) est forme de cinq feuillets P antiparalleles
(Kadziola et al., 1994; Qian et al., 1993). Le domaine B (en vert) est une boucle protuberante du baril A.
AMY2 est l'isoenzyme majeure constituant 80-98 % de l'amylase totale du grain d'orge (Jones et Jacobsen, 1991). AMY1 a plus d'affmite pour le Ca2+ (Berthoft et al., 1984) et est
plus stable a pH acide et a temperature elevee (Berthoft et al., 1984). Aussi, AMY1 a plus d'affmite et plus d'activite pour l'amidon granulaire (Sogard et Svensson, 1990). Par contre, seul AMY2 est inhibe par le BASI (angl, barley a-amylase/subtilisin inhibitor) (Nielsen et al., 2003, Rodenburg et al., 2000).
Figure 2 : Comparaison des domaines C des amylases d'orge et pancreatique.
Le domaine C de l'amylase d'orge est compose de cinq feuillets |3 antiparalleles (Kadziola et al., 1994) comparativement a 10 feuillets chez l'amylase pancreatique (Qian et al., 1993).
Puisque l'amylase d'orge est une proteine avec une structure quelque peu differente de celle des autres amylases, surtout au niveau de son domaine C, notre etude visait a determiner si cette caracteristique pouvait changer le comportement de cette proteine in vivo. Nous avons done utilise l'amylase d'orge AMY2 dans le cadre de ce projet. L'isoforme AMY2 a ete
choisi pour sa participation majeure dans le grain d'orge et sa grande affinite pour Pamidon. De plus, ceci nous a permis de la detecter facilement grace a son activite enzymatique exprimee dans les cellules de mammiferes.
Dans la vision traditionnelle d'une cellule specialised pour la secretion qui est notre sujet principal, le mouvement du materiel synthetise (i.e. amylase) est dirige dans les deux voies majeures : la voie de secretion regulee et la voie constitutive. Plusieurs organites : le reticulum endoplasmique, le compartiment intermediate ERGIC (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment), Pappareil de Golgi, pour en nommer quelques-uns, participent a ce transport. Nous allons aborder plus en details leurs roles et leurs interactions dans le trafic de ce materiel. Nous allons aussi porter une attention particuliere au phenomene de la glycosylation, puisque notre proteine modele, l'amylase d'orge, est glycosylee. Enfin, nous allons continuer cette introduction en abordant les processus de ciblage et du tri dans les differentes voies de secretion.
TRANSPORT INTRACELLULAIRE
Les cellules eucaryotes sont constitutes d'organites hautement specialises dont la fonction concertee est essentielle a l'homeostasie et a la survie cellulaire. Pour ce faire, chaque organite est dote d'une membrane dont la composition est unique, ce qui permet un transport specifique d'un organite a l'autre. Les proteines portent l'information de leur ciblage vers la destination correcte. Presentement, on connait plusieurs de ces signaux dont certains seront abordes plus tard dans la section modeles, mecanismes et signaux de ciblage. Les organites des voies de secretion trient, ciblent et dirigent les proteines pour l'exocytose, pour la livraison a la membrane cellulaire ou pour les lysosomes. Sinon, les proteines sont retenues dans les organites ou elles sont residentes. Ce transport comprend plusieurs etapes comme la formation des vesicules de transport entre les compartiments, la fusion specifique de ces vesicules avec la membrane cible et implique des interactions complexes entre les proteines et les lipides. Enfin, dans le contexte humain et animal, plusieurs pathologies sont le resultat d'un transport cellulaire deficient ou errone. Ces maladies sont souvent reliees a
des defauts de la machinerie de transport ou a la retention et la degradation du materiel dans un compartiment de la voie de secretion. L'emphyseme hereditaire, dysplasie spondilo-epihyseale, I cell disease, maladie de Cushing, pour en nommer quelques unes, sont des exemples de ces pathologies (Aridor et Hannan, 2000 ; Olkkonen et Ikonen, 2000).
RETICULUM ENDOPLASMIQUE
La traduction des proteines de secretion et membranaires debute sur les ribosomes libres dans le cytosol. Les chaines polypeptidiques ainsi formees sont ciblees vers le reticulum endoplasmique grace a une sequence signal en N-terminal du polypeptide (Walter et Johnson, 1994). La chaine polypeptidique s'allonge a partir du ribosome et se lie a la particule de reconnaissance de la sequence signal, appele SRP (signal recognition particle) qui va diriger le ribosome avec le polypeptide naissant a la face cytosolique du reticulum endoplasmique. Ensuite, cet ensemble s'attache a la membrane par interaction avec le complexe Sec61p et le recepteur de SRP (Matlack et al., 1998). Simultanement a la traduction, la chaine polypeptidique entre dans la lumiere du reticulum endoplasmique par le pore que constitue le Sec61p aussi appele translocon. La sequence signal sur le N-terminal du polypeptide est alors clivee par une signal peptidase (Martoglio et Dobberstein, 1998). Dans la lumiere du reticulum endoplasmique, les proteines chaperons comme la BiP, la calnexine, la calreticuline et la proteine disulfide isomerase assistent au repliement de la chaine polypeptidique (Freedman, 1994 ; Hammond et al., 1994 ; Molinari et al., 2004). Cette assistance se manifeste par la prevention de l'agregation, le ralentissement du repliement et la formation des liens disulfures. Les chaperons assurent aussi un controle de qualite en dirigeant les proteines mal repliees vers le proteasome pour une degradation cytoplasmique (Cabral et al., 2001, Molinari et al., 2004).
Le reticulum endoplasmique est aussi le site initial de la glycosylation des proteines. Etant donne la grande importance de ce phenomene dans ce travail, la glycosylation et les
principes de la glycobiologie sont traites ci-dessous. Le trafic intracellulaire sera de nouveau aborde lors de la presentation du transport vesiculate.
GLYCOBIOLOGIE
BIOSYNTHESE DES GLYCOPROTEINS
Environ 1 % du genome humain est dedie a la production, l'entretien et la degradation des glycoproteins dans la cellule (Varki et Marth, 1995; Winchester, 2005). Apres la formation du lien glucosidique, les chaines d'oligosaccharides peuvent etre construites en ajoutant un par un, les monosaccharides a partir des donneurs actives a 1'exception des oligosaccharides lies a l'asparagine dont 1'amorce est transferee en bloc sur le polypeptide.
Les oligosaccharides peuvent etre lies sur la chaine polypeptidique par deux types de liaisons:
• Liaison asparagine-JV-acetyl-D-glucosamine par le processus de JV-glycosylation
• Liaison serine (threonine)-A^-acetyl-D-galactosamine par le processus d'Oglycosylation.
iV-glycosylation
La biosynthese des iV-glycoproteines debute dans le reticulum endoplasmique rugueux avec un transfert co-traductionnel de 1'oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2) sur le dolichol pyrophosphate sur le residu Asn du polypeptide. L'asparagine doit etre dans une sequence Asn-Xaa-Thr/Ser appelee sequon ou Xaa peut etre tout acide amine" sauf la proline. Ceci est suivi par Penlevement de trois residus glucose dans la lumiere du reticulum endoplasmique et dans l'appareil de Golgi du a Taction des enzymes specifiques
oc-glucosidases et a-mannosidases. Le produit de cette activite enzymatique donne la structure suivante :
[Manal-6(Manal-3)Manal-6](Manal-3)Mapl-4GlcNAcpl-4GlcNAcP-Asn qui est le
point de depart de la synthese de tous les N-glycoproteines du type complexe ou hybride (Kornfeld et Kornfeld, 1985; Winchester, 2005). L'enzyme clef pour la conversion des glycoproteines riches en mannose en glycoproteines complexes ou hybrides est la GlcNAc-transferase qui ajoute les residus GlcNAc au tronc commun. De plus, la voie de biosynthese des glycoproteines est caracterisee par plusieurs points ou les differentes enzymes entreront en competition pour le meme substrat. Le sens de la glycosylation qui est ensuite pris est du aux activites relatives des differentes transferases. Par exemple, certains residus glucidiques servent de signal d'arret dans la voie de synthese. Par exemple, l'insertion d'un residu GlcNAc dans un branchement arrete Taction de l'a3/6-mannosidase II (Schachter, 1986) bloquant ainsi la formation de tout autre branchement d'oligosaccharide.
0-glycosylation
La biosynthese des O-glycoproteines ressemble a celle decrite ci-dessus. Les groupements osidiques sont lies aux chaines polypeptidiques par les hydroxyles des residus serine, threonine ou hydroxylysine. Les details de cette glycosylation ne seront pas decrits parce qu'ils ne font pas l'objet de ce travail.
Les etudes des aspects fonctionnels devoilent deux roles principaux des glucides mentionnes plus haut:
1. conferer aux glycoproteines les proprietes physico-chimiques particulieres 2. agir comme signaux a la surface cellulaire.
CH
2OH
0
H
NHCOCH3
(NAG)
NH
°
xNH—C CH
2CH
C=0
X
Ser or Thr
Asn
Mana(l—*-6) Mana (1 3)Man 0(1 —>- 4)NAGP(1 4) NAG
# = NAG, • = Mannose, A = Galactose, '.. =iV-Acetylneuraminicacid, • = Fucose
Figure 3 : Les ./V-glycoproteines.
En haut, tous les liens entre Pentite glucidique et la proteine se font entre le
P-iV-acetylglucosamine et Fasparagine de la sequence consensus. En bas, la structure du tronc trimannosyl commun a toutes les ./V-glycoproteines (Tire de Voet & Voet, 3e edition,
Structure des N-glycoproteines
Tous les oligosaccharides lies a l'asparagine contiennent a leur base un pentasaccharide :
Man<xl-6(manal-3)Manal-4GlcNAc pi-4GlcNAc. Cette structure est commune a toutes
les 7V-glycoproteines. On la decrit sous le nom de tronc trimannosyl (Figure 3).
Base sur la structure et la localisation des glycans ajoutes a ce tronc, les ./V-glycoproteines se classent en trois groupes :
1. Les ./V-glycoproteines complexes qui ne contiennent que trois residus mannose du tronc commun. Parmi les iV-glycoproteines, c'est le groupe le plus diversifie au niveau structural. Ceci est du a l'attachement de branches (antennes) sur le tronc trimannosyl. L'attachement est initie par action de quatre GlcNAc transferases (I, II, III et IV). L'oligosaccharide peut etre allonge davantage en ajoutant des residus D-galactose, N-acetyl-galactosamine, L-fucose, acide sialique et sulfate. Chez les mammiferes, le nombre d'antennes peut etre compris entre deux (bi antennaire) et quatre (tetra antennaire).
2. Les JV-glycoproteines riches en mannose sont celles qui contiennent exclusivement les deux residus mannose du tronc trimannosyl commun.
3. Les iV-glycoproteines du type hybride possedent les residus mannose du tronc commun et peuvent etre mono- ou bi antennaires (Kornfeld et Kornfeld, 1985).
Structure des O-glycoproteines
Comparees aux iV-glycoproteines, les O-glycoproteines ont moins de contraintes structurales. Elles ne partagent pas une structure commune mais peuvent avoir plusieurs troncs communs.
CONTROLE DE QUALITE DES GLYCOPROTEINS
Dans les cellules eucaryotes, le reticulum endoplasmique joue un role primordial dans la biosynthese et le controle de qualite des proteines incluant les glycoproteines membranaires
Durant les dernieres decennies, la recherche a permis de mieux comprendre le role des glycans dans la maturation des proteines et le controle de qualite effectue sur les proteines dans le reticulum endoplasmique. La composition en oligosaccharides sert de signal dans le recrutement des proteines chaperons et des recepteurs de triage essentiels aux processus de repliement, de controle de qualite et de degradation. La necessite et le role de chaque glycan est tres variable; lorsque certains sont indispensables pour une maturation complete, les autres ne sont pas requis.
Une fois la glycosylation completee, les glycoproteines sont empaquetees dans des vesicules de transport en route vers l'appareil de Golgi. Ceci est la voie principale d'exportation de toutes les proteines synthetisees dans le reticulum endoplasmique. Ce transport sera traite plus loin dans le texte dans la section transport vesiculate. Cependant, les glycoproteines mal repliees ne suivent pas cette voie mais sont transportees de la lumiere du reticulum endoplasmique vers le cytoplasme pour une degradation par le proteasome. Bien que le processus de controle de qualite ERAD (endoplasmic reticulum associated degradation) s'applique a toutes les proteines « defectueuses », nous allons nous concentrer sur les glycoproteines seulement.
La maturation des glycoproteines de leur synthese a l'atteinte de leur conformation finale est requise non seulement pour leur transport au-dela du reticulum endoplasmique mais aussi pour leur stabilite structurale (Cabral et al., 2001; Cacan et Verbert, 2000). Les glycoproteines non conformes deviennent alors substrat pour la destruction par ERAD. En termes generaux, ce processus multi etapes inclut une translocation retrograde via le pore constitue par le Sec61 vers le cytoplasme et l'ubiquitination signalant la degradation par le proteasome (Denic et al., 2006; Cabral et al., 2001).
DEGRADATION DANS LE LYSOSOME
La degradation lysosomale des glycoproteines est le processus d'entretien des constituants cellulaires et de maintien de Phomeostasie de la glycosylation. Dans certains cas, il faut considerer les lysosomes comme une destination finale pour les proteines de la
voie de secretion (Le Borgne et Hoflack, 1998). La localisation et la fonction de la glycoproteine determinent son taux de recyclage et la route de livraison vers le lysosome. Ceci peut etre effectue par le processus d'endocytose (heterophagie) ou par le processus non-selectif d'autophagie (Cuervo, 2004). Les fragments des glycans derives de la degradation des glycoproteines dans le RE et dans le cytosol y sont livres par un mecanisme impliquant un recepteur specifique (Saint-Pol et al., 1999). Cette voie est acceleree si la cellule secrete activement les glycoproteines matures ou si elle produit les glycoproteines anormales en grande quantite. Dans les lysosomes, les glycoproteines sont degradees par Pactivite enzymatique des proteases et des glycosidases (hydrolases lysosomales) au pH acide caracteristique pour cet organite. L'implication des lysosomes dans la regulation de la biosynthese et la distribution des N-glycoproteines est sans doute essentielle (Schekman, 2004 ; Moore, 1999; Saint-Pol et al., 1999 ; Pisoni et Thoene, 1991).
TRANSPORT INTRACELLULAIRE DES GLYCOPROTEINES
Dans l'optique de la nature particuliere des glycoproteines, il faut se poser la question suivante: comment les glycoproteines peuvent-elles etre ciblees chacune vers une destination appropriee ?
A la fin des annees 1980, il a ete accepte que le flux spontane des proteines vers la surface cellulaire se faisait par defaut, ceci entrainant des modifications glucidiques consecutives lors du passage dans chacun des compartiments (Wieland et al., 1987). II est maintenant evident que la cellule dispose de moyens specifiques pour diriger le mouvement des glycoproteines entre certains compartiments des voies de secretion. Ceci est principalement du a la presence de lectines (proteines liant specifiquement les glucides) entre certains sites cellulaires (Schrag et al.,2003). Certaines evidences existent demontrent la capacite de la cellule a gerer le transport des glycoproteines via ces lectines (Braakman, 2001). Par exemple, les deux lectines calnexine et calreticuline, sont localisees dans le reticulum
famille des recepteurs du mannose (East et Isacke, 2002) dont le membre le plus connu est le recepteur de mannose-6-phosphate est localise dans le reseau trcms-golgien (voir section sur le ciblage des proteines). II est done possible que d'autres lectines existent ailleurs dans la voie de secretion. Elles restent cependant a etre mises en evidence.
CALNEXINE ET CALRETICULINE
La calnexine et la calreticuline sont les deux lectines les plus importantes. Elles sont localisees dans le reticulum endoplasmique et agissent comme des proteines chaperons durant le repliement de la chaine polypeptidique. La calnexine est une proteine membranaire dont la masse moleculaire est de 90 kDa (Wada et al., 1991). Par contre, la calreticuline est une proteine soluble de la lumiere du reticulum endoplasmique dont la masse moleculaire est de 60 kDa (Fliegel et al, 1989; Williams., 2006).
Les deux proteines reconnaissent specifiquement leurs substrats qui sont les
JV-glycoproteines dont les 2 residus de glucose ont ete enleves par Taction des glucosidases I et II (Figure 4) dans le reticulum endoplasmique (Hammond C. et al., 1994; Hebert et al., 1995). On peut alors les definir comme des lectines specifiques pour un intermediate transitoire des JV-glycoproteines ayant un seul residu glucose: GlciManpClcNaci (Spiro et al., 1996; Ware et al., 1995). Parmi toutes les glycoproteines monoglucosylees, certaines vont s'associer avec une proteine chaperon seulement tandis que d'autres s'associent aux deux simultanement ou sequentiellement (Van Leeuven et Kearse, 1996 ; Helenius et al., 1997). La liaison entre la glycoproteine et la lectine est initiee durant la translocation (Chen et al., 1995) et elle est maintenue lors des etapes suivantes du repliement de la glycoproteine. La dissociation entre la lectine et son substrat se fait au moment de Pexportation de la proteine du reticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi. Etant donne que le glucide reconnu par ces lectines est forme par Taction concertee des glucosidases I et II, Tutilisation d'un inhibiteur de ces dernieres, la castanospermine, a permis la caracterisation des etapes fonctionnelles de Tinteraction. Les etudes utilisant cette approche indiquent que la plupart
des glycoproteines vont s'associer a la calnexine ou a la calreticuline dans le reticulum endoplasmique (Danilszyk et Williams, 2001 ; Parodi, 2000).
GI/QII UGGT A ^ \ xtomf rf.2M
1
EXIT GIUCDBKJaSB I GlucosMase El «1,2-iiianiiosldaao-Asn-Xaa-Ser/Thr-Figure 4 : La calreticuline dans le repliement des glycoproteines.
La calreticuline (CRT) lie les carbohydrates monoglucosylees. Le substrat de la calreticuline et de la calnexine est devoile grace a l'activite des glucosidases I et II. La glucosidase II agit aussi sur l'UDP glucose glycoproteine-glucosyltransferase (UGGT). L'UGGT est responsable du triage entre des glycoproteines repliees et celles qui ne le sont pas.
En utilisant les cellules de souris knock-out Cnx" (calnexine), Crt"(calreticuline) (Williams, 2006), il a ete prouve que le repliement des glycoproteines exige une association specifique avec la calnexine, ou avec la calreticuline. Le point determinant de cette selection semble etre le nombre de sites de glycosylation (Harris et al., 1998; Hebert et al., 1997) ainsi que la differente topologie des deux lectines, car la mutation de la calnexine en proteine soluble ou la mutation de la calreticuline en proteine membranaire change aussi la specificite pour leur substrat de maniere que la calnexine mutee lie les glycoproteines comme la calreticuline et la calreticuline mutee en proteine membranaire agit comme la calnexine (Williams, 2006).
La calreticuline est d'autant plus interessante car, malgre la presence du signal de la retention dans le reticulum endoplasmique (KDEL), elle a ete identified a la surface de plusieurs types cellulaires dont les cellules endotheliales (Goicochea et al., 2000) et les cellules neuronales (Xiao et al., 1999a; Xiao et al., 1999b). Par contre, la calnexine qui ne possede pas le meme determinant de la retention n'est pas detectee a la surface cellulaire. Aujourd'hui, il est accepte que la calreticuline est une proteine a multiples fonctions presente dans plusieurs sites cellulaires tout en demeurant la plus abondante dans le reticulum endoplasmique. Cependant, il faut mentionner que la calreticuline presente a la surface cellulaire joue un role dans plusieurs processus comme dans 1'adhesion cellulaire (Goicochea et al., 2000; Xiao et al., 1999a; White et al., 1995) et dans la suppression de la proliferation des cellules endotheliales (Pike et al., 1999). Cette proteine a suscite un interet particulier pour traiter le cancer (Johnson et al., 2001).
ERGIC-53 et VIP36
La proteine ERGIC-53 (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment) d'une masse moleculaire de 53 kDa est residente de l'ERGIC et sert ainsi de marqueur pour ce dernier (Schrag et al., 2003 ; Appenzeller-Herzog et al., 1999 ; Arrar et al., 1995). Cette lectine est specifique pour les glycoproteines riches en mannose et son fonctionnement est
9-1-dependant du Ca (Arrar et al., 1995). Plusieurs proteines ont ete identifiees comme des cibles de PERGIC-53 notamment les facteurs de coagulation V et VIII (Nyfeler et al., 2006 ; Nichols et al., 1998 ; Moussali et al., 1999 ) ainsi que la cathepsine Z et la cathepsine C (Appenzeller-Herzog et al., 2005; Appenzeller-Herzog et al., 1999). Recemment, Appenzeller-Herzog et al. (2005) ont montre que l'ERGIC-53 peut selectionner son substrat via une boucle en epingle a cheveux pour se Her sur l'oligosaccharide riche en mannose expose sur la molecule de la glycoproteine. Selon cette etude, lorsque ce motif n'est plus accessible, la cathepsine Z ne s'associe plus a l'ERGIC 53. En plus du motif en epingle a cheveux et le Ca2+, le pH influence la capacite de liaison de l'ERGIC-53. Cette liaison se
Pacidification maintient done la liaison du complexe ERGIC53-substrat (Appenzeller-Herzog et al., 2004). Ce mode d'action est semblable a celui du recepteur de mannose 6-phosphate qui se dissocie de son substrat dans le lysosome qui presente un pH acide (Ghosh et al, 2003; Olson et al., 2002).
En comparant les sequences primaires, il a ete demontre que la VIP36 (Vesicular Integral Protein) est un homologue de l'ERGIC-53 (Fiedler et Simons K., 1994). Tout comme cette derniere, e'est une lectine specifique pour les glycans riches en mannose (Hara-Kuge et al., 1999) et son association avec le substrat in vitro est dependante du pH. Pour la VIP36, le pH optimal de la liaison est de 6,5 (Kamya et al., 2005). La VIP36 est localisee dans les citernes du cw-Golgi (Dahm. et al., 2001 ; Fullekrug et al., 1999). Malgre les rapports precedents indiquant que sa localisation post-golgienne est un artefact de surexpression (Fiedler et al., 1994), la presence de VIP36 est maintenant observee dans le reseau trans-Golgi des cellules epitheliales renales MDCK (Shimada et al., 2003 ; Hara-Kuge et al., 2002) ainsi que dans les grains de secretion immatures et matures des cellules acineuses de la parotide (Shimada et al., 2003) ou elle est associee a la secretion de Pamylase salivaire (Hara-Kuge et al., 2004). Ces etudes semblent indiquer un role de la VIP36 dans le ciblage et le transport distal des proteines de secretion. Ces deux derniers sujets seront traites dans la section modeles, mecanismes et signaux de ciblage.
TRANSPORT VESICULAIRE
Les proteines, qu'elles soient glycosylees ou non, sont exportees du reticulum endoplasmique a partir des sites specialises nommes les elements de transition (Palade, 1975). Ces derniers font partie du reticulum endoplasmique lisse et sont situes a proximite de la region cis de l'appareil de Golgi (Klumperman, 2000). C'est a partir de ces structures que le bourgeonnement des vesicules de transport prend place. Les vesicules migrent pour fusionner afm de former le compartiment intermediate : ERGIC (angl., endoplasmic
1996). Cette region est un site majeur de ciblage pour les proteines recyclees dans les vesicules de transport retrograde vers le reticulum endoplasmique ou pour leur transport anterograde vers le cis Golgi (Warren et Mellman, 1999).
REetERGiC
Golgi
exocyftose
Figure 5 : Le transport vesiculaire entre les differents compartiments intracellulaires.
Les vesicules tapissees COP I et COP II dirigent le transport des proteines entre les compartiments proximaux de la voie de secretion incluant 1'appareil de Golgi. Le transport vesiculaire dans les compartiments distaux est assure par les vesicules tapissees de clathrine et les vesicules d'exocytose (vesicules de la voie constitutive, grains de secretion immatures et matures). Pour alleger la representation graphique, l'ERGIC est illustre avec le reticulum endoplasmique (RE).
Le materiel destine au transport anterograde est pris en charge par les vesicules tapissees avec la COP II (angl. coat protein II) (Barlowe, 1998) (Figure 5). En meme temps, une autre population de vesicules tapissees de COP I (Figure 5) bourgeonne de l'ERGIC et sert a recycler les proteines residentes du reticulum endoplasmique (Aridor et al., 1995). Aussi,
ces vesicules jouent un role dans la concentration des proteines solubles par 1'enlevement des proteines residentes du Golgi (Martinez-Menarguez et al., 1999) facilitant ainsi le ciblage de ces proteines dans la voie de secretion distale. La selectivite de ce transport suscite la controverse, car on ne peut pas dire avec certitude si c'est un processus selectif ou s'il s'agit d'un mouvement de masse (angl., bulk-flow). Warren et Mellman (1999) suggerent qu'il est possible que ces deux phenomenes puissent exister en raeme temps dans la cellule : les proteines abondantes sont transportees par le transport en masse tandis que les proteines moins representees sont transportees par les vesicules COP II d'une maniere selective (Kuehn et Schekman., 1997).
Les structures dynamiques du compartiment intermediaire se deplacent discretement suivant les microtubules pour atteindre la region cis de l'appareil de Golgi ou elles vont fusionner avec ce dernier (Lippincott-Schwartz et al., 2000). L'appareil de Golgi sera done le prochain point aborde dans cette introduction.
L'APPAREIL DE GOLGI ET LES VOIES DE SECRETION L'APPAREIL DE GOLGI
En resumant le transport cellulaire comme vu precedemment, les proteines de secretion nouvellement synthetisees sont transportees dans 1'appareil de Golgi qui est un complexe membranaire de citernes et de saccules via le compartiment intermediaire (Hauri et Schweizer, 1992 ; Schweizer et al., 1990). L'appareil de Golgi est compose de trois compartiments distincts le cis, le medial et le trans base sur la localisation des enzymes residentes qui les distinguent (Farquhar, 1985). Ces dernieres sont des glucosidases et des glycosyltransferases modifiant les oligosaccharides lies aux glycoproteines.
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transport par T , . . . . in . - J- i I fusion homotypiquc l'intarm*d»ire I „ „ , ™ , / de micortubulcs I dc I'ERGIC
Figure 6 : Deux modeles du mouvement dans l'appareil de Golgi.
A. L'appareil de Golgi dont la structure est considered stable dans le temps. Selon ce
modele, le transport vesiculate est responsable du trafic des proteines (Lowe et Kreis, 1998) d'un compartiment a 1'autre.
B . Selon le modele de maturation des citernes, le materiel sortant du RE converge vers l'appareil de Golgi et forme une citerne du cis Golgi. La maturation progressive de ce compartiment lui permet d'acquerir les proprietes d'une citerne mediane sans que les proteines aient a quitter la lumiere des saccules et ainsi de suite jusqu'a la face trans et le TGN (Mironov et al., 1997). Le processus s'effectue par le transport retrograde des proteines residantes du compartiment anterieur.
L'appareil de Golgi est aussi un acteur important dans la synthese des lipides i.e. du cholesterol et des sphingolipides (van Vliet et al., 2003). Selon le modele conventionnel, l'appareil de Golgi est une structure statique. Le mouvement du materiel a travers l'appareil de Golgi implique done des vesicules pour assurer le transport entre les citernes.
Bourgeonnant sur la membrane d'une citerne et fusionnant avec la membrane de la citerne suivante, (Figure 6A) les vesicules tapissees de COP I assurent le transport du materiel entre les feuillets. Impliquees dans le transport anterograde (COP I-a, Figure 6A) (Orci et al., 1989; Rothman et Wieland, 1996) et retrograde (COP I-r, Figure 6A) (Martinez-Menarguez et al., 2001; Mironov et al., 2001; Martinez-Menarguez et al., 1999; Letourneur et al., 1994), les vesicules tapissees de COP I migrent entre les saccules enveloppant les proteines de secretion en excluant les proteines residentes (Cosson et al., 2002; Orci et al., 2000). Longuement accepte, ce modele n'offre pas une explication sur le processus de la selection du materiel dans des vesicules identiques destinees autant pour le transport anterograde que pour celui de sens oppose.
Les resultats des travaux de Mironov (2001) et de Bonfanti (1998) offrent une nouvelle explication pour le transport intra golgien en adoptant une vision dynamique de cet organite. Supporte par les observations in vivo dans les levures (Matsuura-Tokita et al., 2006 ; Losev et al., 2006), ce modele propose que le mouvement des proteines est obtenu par la maturation des citernes individuelles dont le contenu est uniquement equilibre par le transport retrograde des enzymes residantes dans les vesicules COP I. Ainsi, le mouvement anterograde est assure de la face cis a la face trans de l'appareil de Golgi sans que les proteines ne quittent la lumiere de la citerne (Pelham, 2006; Pelham et Rothman, 2000) (Figure 6B).
Peu importe le modele adopte pour expliquer le mouvement des proteines, le fait meme qu'il y ait une secretion cellulaire prouve que le transport dans le Golgi est efficace et que les proteines de secretion s'y deplacent pour finalement atteindre un compartiment distinct distal de l'appareil de Golgi: le reseau trans-Golgi (TGN).
La difference morphologique et fonctionnelle du TGN repose sur le fait que plusieurs processus comme la sialisation et le clivage proteolytique y sont confines (Chege et Pfeffer, 1990). C'est dans le TGN que le processus de triage s' amorce pour diriger les proteines soit vers les lysosomes, soit vers la surface cellulaire (Figure 7). Le mecanisme de triage vers le
Golgi sur un residu mannose expose avec un recepteur de ce mannose-6-phosphate localise dans le TGN (Gu et al., 2001 ; Hille-Rehfeld, 1995 ; Kornfeld , 1992). Apres cette interaction, les proteines lysosomales sont transporters dans les lysosomes par les vesicules tapissees de clathrine (Ni et al., 2006) (Traub, 2005). La clathrine tapisse les regions specifiques de la membrane du TGN et son recrutement dans la membrane vesiculate depend de la presence d'une proteine adaptatrice (AP-1) ainsi que de l'interaction avec les queues cytosoliques du recepteur du mannose-6-phosphate (Knuehl et al., 2006). Les complexes proteine-recepteur sont alors transporter vers le compartiment endosomal ou les proteines lysosomales se dissocient du recepteur en raison de l'environnement acide du compartiment. Ensuite, elles sont livrees aux lysosomes tandis que les recepteurs sont recycles au TGN (Rohn et al., 2000 ; Traub et Kornfeld, 1997). II faut noter que le recepteur du mannose-6-phosphate n'est pas la seule molecule a etre recyclee entre le reseau trans-Golgi et le systeme endosome/lysosome. Les autres proteines transmembranaires telles la furine et la TGN38 sont aussi recyclees de la meme maniere (Rohn et al., 2000). Done, en absence du signal de mannose-6-phosphate, soit en abolissant la glycosylation, les enzymes lysosomales sont exocytees (Nishimura et al., 1988; Nishimura et Kato, 1988). Cependant, la presence d'un signal et de son recepteur si bien identified ne peut pas expliquer le ciblage de toutes les autres proteines de secretion.
LES VOIES DE SECRETION
C'est done au niveau du reseau TGN que s'effectue le tri des proteines destinees a une secretion immediate (secretion constitutive) ou a une secretion sous stimulus physiologique (secretion regulee) (Burgess et Kelly, 1987).
Dans la suite de cette introduction et en tenant compte de l'existence des deux voies
differentes de secretion, nous clarifierons comment la cellule trie et cible les proteines dans chaque voie de secretion.
Figure 7 : Voies de secretion.
A partir du reseau trcms-Golgi, la cellule trie et cible les proteines vers trois principales destinations : le lysosome, la voie constitutive et la voie regulee.
La voie constitutive est caracterisee par une fusion continue des vesicules de transport avec
la membrane cellulaire. Cette exocytose se deroule rapidement apres la synthese des proteines et sans entreposage. Le taux de cette secretion est directement fonction de la biosynthese de la proteine, cette secretion ne peut pas etre stimulee. Cette voie se retrouve dans toutes les cellules et est utilisee pour la secretion des proteines dont la presence dans le milieu extracellulaire est requise a un niveau constant (Burgess et Kelly, 1987) (Figure 7).
La voie regulee existe dans les cellules specialisees comme les cellules neuroendocrines et
dans les cellules pendant plusieurs heures ou plusieurs jours jusqu'au moment ou la fusion avec la membrane cellulaire est sollicitee par un stimulus physiologique. Suite a la stimulation, une cascade de messagers secondaires comme le Ca2+ et l'AMPc transmettent le
signal aux grains de secretion conduisant a leur fusion. De cette maniere, la voie regulee peut liberer de grandes quantites de materiel a un moment bien precis (Burgess et Kelly,
1987) (Figure 7).
Une autre voie differente par ses proprietes de stimulation et de mecanisme de secretion a ete mise en evidence. II s'agit de la voie « constitutive-like » ou voie maturative (Arvan et Castle, 1992). Elle repose sur l'evidence qu'une partie des proteines regulees est secretee en absence de stimulation (Moore et al., 2002; van Vliet et al., 2003; Kuliawat et Arvan, 1994). Aussi, cette voie peut etre considered comme une voie accessoire a la voie regulee. Les resultats soumis par plusieurs equipes indiquent que ce sont les vesicules tapissees de clathrine qui facilitent ce processus et amenent les proteines dans l'endosome precoce et a la membrane cellulaire (Feng et Arvan, 2003;Hinners et Tooze, 2003; Turner et Arvan, 2000; Arvan et Castle, 1998).
Tel qu'observe dans les cellules pancreatiques (Molinete et al., 2000; Kuliawat et Arvan, 1994), la voie constitutive-like est constitute de vesicules qui bourgeonnent a partir des grains de secretion immatures durant le processus de maturation servant ainsi a raffiner le contenu du grain. L'autre fonction possible est d'eliminer les proteines constitutives des grains de secretion mature.
Alors, comment la cellule trie les proteines pour les cibler dans la bonne voie de secretion ? Du a la cinetique tres rapide de la sortie des vesicules de la voie constitutive et leur petite taille, les etudes de triage et de ciblage portent surtout sur la voie regulee. Comme explique par Belasquez et Sherman (2000) et confirme par Feliciangeli et Kitabgi (2002) (Belasquez et Sherman, 2000; Feliciangeli et Kitabgi, 2002), les etudes sur des proteines chimeres demontrent qu'il est possible de rediriger une proteine constitutive vers la voie regulee. Serait-il possible alors que ce soient les proteines regulees qui portent un signal dominant ?
Ce signal serait suffisant pour les separer des proteines constitutives ou il est determinant pour leur sequestration dans les grains de secretion.
MODELES, MECANISMES ET SIGNAUX DE CIBLAGE
Comme mentionne au cours de cette introduction, plusieurs sites, surtout a la sortie d'un compartiment, sont selectifs. Autrement dit, ils sont capables d'exercer un tri des proteines. Ceci debute tres tot, dans le reticulum endoplasmique rugueux, continue dans l'ERGIC, dans les saccules de l'appareil de Golgi et a la sortie du TGN. Aussi plus distalement dans la cellule, le tri des proteines continue dans les grains de secretion immatures et dans le compartiment endosomal. En raison de sa localisation intracellulaire, il est generalement accepte que le TGN soit le site clef de triage. A partir de la, plusieurs destinations sont envisageables : le lysosome, ou encore la surface cellulaire soit via la voie constitutive, soit via la voie constitutive-like ou encore soit via la voie regulee.
Comment se fait ce ciblage ?
Pour mieux visualiser ce phenomene, deux modeles sont proposes
1. Ciblage a l'entree : Ce modele propose que les proteines regulees soient activement
separees des autres proteines (constitutives et lysosomales) pour l'entree dans la voie regulee. Ce triage se ferait par l'entremise d'un recepteur. Si on accepte que le grain de secretion immature soit le premier site de la voie regulee, alors la segregation des proteines dans leurs voies respectives devrait s'effectuer dans le TGN (Gu et al., 2001; Tooze, 1998; Arvan et Castle, 1998). Ainsi, l'agregation des proteines doit debuter dans le TGN afin de faciliter la selection des agregats dans la voie regulee (Figure 8).
Ciblaqe par entree
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Figure 8 : Modele de ciblage a 1'entree.
Selon ce modele, le materiel est trie dans le TGN par un mecanisme actif et specifique avant la formation des grains de secretion. (Tooze, 1998).
2. Ciblage par retention : Selon ce modele, Fensemble des proteines entrerait dans le grain
de secretion immature sans qu'il y ait un processus de tri specifique. Ceci est du aux conditions physico-chimiques particulieres du grain de secretion immature comme le pH acide et la forte concentration en Ca , qui favorisent Pagregation des proteines (Tooze 1998). Ces conditions sont a la base de la formation des agregats des chromogranines et de l'insuline (Huang et Arvan, 1994, Leblond et al., 1993; Gerdes et al., 1989). Durant la maturation du grain de secretion, les proteines sont eliminees par les interactions specifiques comme par exemple, la formation d'agregats ou Passociation avec la membrane. Ce triage
doit compter sur la voie constitutive-like (maturative) afin d'eliminer les proteines non triees dans le TGN qui se retrouvent solubles dans le grain en voie de maturation (Hinners et Tooze, 2003; Tooze, 1998; Arvan et Castle, 1998) (Figure 9).
Figure 9 : Modele de ciblage par retention.
Selon ce modele, Pensemble du materiel pour la secretion est inclus dans le grain de secretion immature qui est le site de tri final. La voie constitutive-like ou maturative participe a la maturation du grain en eliminant les proteines non agregees par bourgeonnement des vesicules (Tooze, 1998).
MECANISMES DE TRIAGE
En raison de leur differente localisation dans la cellule, les proteines membranaires et les proteines solubles, devraient etre triees de manieres differentes. En effet, pour les proteines membranaires, le ciblage est souvent facilite par 1'association de la proteine a la membrane soit par l'interaction avec une autre proteine comme avec la proteine des vesicules tapissees COP 1 (Lanoix et al., 2001) ou par les petites proteines Rab (Smythe, 2002; van Ijzendoorn et al., 2002), soit par la presence des regions distinctes riches en lipides (rafts) de la membrane (Chatterjee et Mayor, 2001). Comme notre travail porte sur le trafic des proteines solubles, nous nous concentrerons sur les mecanismes de triage de celles-ci.
RECEPTEURS
L'une des hypotheses postulees est que le triage des proteines solubles est assure par l'entremise d'un recepteur. Pour que la proteine soluble soit sequestree dans un vehicule de transport afin d'etre acheminee a sa destination, il faut qu'il y ait une reconnaissance specifique avec un recepteur qui lui est propre (Glombik et Gerdes, 2000). Ceci implique par consequent qu'un signal soit present sur la proteine cible. Comme mentionne plus tot dans ce texte, une telle interaction est possible pour la cathepsine Z dans l'ERGIC (Appenzeller-Herzog et al., 1999). Dans le TGN, les proteines lysosomales portant le groupement mannose-6-phosphate sont dirigees vers le lysosome (Hille-Rehfeld, 1995). Aussi, le triage d'autres proteines dans le TGN et dans les grains de secretion immatures se fait grace a la reconnaissance d'un signal par les pro-proteines convertase. II y a presentement des evidences qui demontrent que ceci pourrait etre le cas des prohormones comme la prosomatostatine et la proinsuline (Brakch et al., 1994; Kuliawat et al., 2000) ainsi que de la carboxypeptidase E et la POMC. Le modele de ciblage a l'entree, illustre a la figure 8, stipule que le ciblage vers les voies de secretion est un processus actif et que les recepteurs specifiques sont presents dans la membrane du TGN.
AGREGATION
Considerons maintenant l'agregation des proteines comme un autre mecanisme de ciblage a la voie regulee. Vraisemblablement, ce processus represente la difference majeure entre les voies constitutive et regulee. II s'amorcerait dans le reseau trans-Go\gi et continuerait dans les grains de secretion immature (Arvan et al., 2002a ; Tooze, 1998) en presence de Ca2+ et
d'un pH acide. Ceci a ete documente pour plusieurs proteines : les chromogranines A et B (Chanat et Huttner, 1991), la secretogranine II (Chanat et Huttner, 1991) et les hormones de l'hypophyse (Moore et al., 2002; Colomer et al., 1996). La neutralisation du pH intravacuolaire par la chloroquine ou le chlorure d'ammonium inhibe la formation des agregats et provoque les arrets de la secretion regulee (Zhu et al., 2004; Gerdes et al., 1989; Moore et al., 1983). Les agregats peuvent etre composes de plusieurs proteines (Colomer et al., 1996; Leblond et al., 1993; Palmer et Christie, 1992). On peut aussi considerer l'agregation comme un facteur favorisant 1'association avec la membrane du TGN et du grain de secretion (Laine et LeBel, 1999, Kang et Yoo, 1997). Ce fait est utilise dans le modele de ciblage par retention ou il est propose que la grande taille des agregats empeche leur incorporation dans les vesicules de transport. Ces dernieres qui sont petites (60 a 70 nm) bourgeonnent sur les grains de secretion immatures et constituent la voie maturative (figure 9) qui elimine les proteines solubles non-agregees. Ainsi, seules les proteines destinees a la voie regulee sont retenues dans les grains matures.
SIGNAUXDE CIBLAGE
Pour certaines proteines de la voie regulee, des similitudes de sequence et de structure ont ete avancees (Gorr et Darling, 1995 ; Kizer et Tropsha, 1991). L'analyse du N-terminal des proteines regulees a demontre la presence d'un domaine hydrophobe avec des acides amines specifiques et une helice alpha amphipathique (Gorr et Darling, 1995). Dans certaines proteines, cette structure inclut aussi un pont disulfure agissant comme stabilisateur de la boucle hydrophobe (Cool et al., 1995).
Pour mieux illustrer la complexity des etudes de signaux et des mecanismes de ciblage, les chromogranines constituent un bon exemple sur lesquelles de nombreux travaux ont ete effectues.
La chromogranine A (CgA), la chromogranine B (CgB) ainsi que la pro-opiomelanocortine (POMC) sont des proteines dont la structure en N-terminal a ete etudiee (Gorr et al., 2001). Un signal specifique de quatre acides amines a ete identifie comme site d'interaction avec les residus Arg255-Lys26o de la carboxypeptidase E (Loh et al., 2004). Ceci est le cas pour la
POMC mais pas pour la CgA et la CgB. Par contre, la CgA et la CgB peuvent se lier sur le recepteur IP3 par leur pont disulfure (Yoo et al., 2000). Ceci porte a croire qu'un signal en soi ne determine pas le ciblage mais sa presence facilite le tri par les mecanismes discutes precedemment. Les resultats de Gerdes et Glombik (1999) et ceux par Cowley et al. (Cowley et al., 2000) suggerent que c'est certainement le cas pour la CgA, et que Phomodimerisation de cette proteine est essentielle pour son ciblage vers la voie regulee (Thiele et Huttner, 1998). II s'avere done que plusieurs signaux de ciblage peuvent exister et fonctionner avec les differents mecanismes de ciblage en meme temps. Ceci est le cas pour les cellules AtT20 et PC 12 (Martin et Grishanin, 2003; Moore et al., 2002). Ces cellules reconnaissent le signal sur le N-terminal de la POMC (Loh et al., 2004), le signal dibasique de la renine (Brechler et al., 1996), le signal consistant en deux acides amines acides du facteur natriuretique pro-atrial (Canaff et al., 1996) et peuvent, en meme temps, cibler leurs proteines par agregation et par la liaison avec la carboxypeptidase E (Loh et al., 2002; Martin et Grishanin, 2003; Moore et al., 2002).
OBJECTIFS DU TRAVAIL ET PRESENTATION DES ARTICLES
L'existence de plusieurs mecanismes de ciblage et/ou de differents signaux supporte Phypothese que le ciblage n'est pas un evenement passif mais plutot un mecanisme cellulaire controle. Ce controle peut s'effectuer par Pagregation et le ciblage (positivement
ou negativement) ou il peut etre exerce par la proteolyse des precurseurs (Garcia et al., 2005). Ces controles peuvent prendre place tot dans le reticulum endoplasmique (Lara-Lemus et al., 2006) ou tard, dans les voies de secretion (Gorr et al., 2001; Seidah et Prat, 2002). Les essais d'identification des signaux de ciblage au sein d'un vaste eventail de proteines regulees ont demontre qu'il n'existe pas un seul signal de ciblage conserve dans toutes ces proteines qui pourrait se comparer a celui de proteines solubles residentes du reticulum endoplasmique (KDEL) ou celui du mannose-6-phosphate pour les proteines lysosomales (Pelham, 1990 ; Hille-Rehfeld., 1995).
Dans le cas de cette etude nous nous sommes penches sur l'hypothese des signaux de ciblage qui pourront etre presents sur la molecule d'alpha amylase. Chez les mammiferes, cette enzyme est secretee par les cellules du pancreas exocrine. Cependant, lorsque l'amylase pancreatique ou salivaire est exprimee dans les cellules neuroendocrines elle n'est pas sequestree dans les grains de secretion stimulables (Colomer et al., 1994; Castle et al., 1997). Ce ciblage est peut etre du a un auxiliaire de ciblage present uniquement dans les cellules exocrines (Colomer et al., 1994) ou il s'agit d'un signal moleculaire qui ne peut pas etre reconnu par les cellules neuroendocrines. Malgre l'hypothese tres convoitee d'un recepteur universel present dans les grains de secretion permettant le ciblage des proteines dans la voie regulee (Cool et Loh, 1998), il est de plus en plus evident que chaque proteine regulee est un cas specifique. Alors serait-il possible qu'une autre amylase, en l'occurrence l'amylase d'orge, pourrait etre ciblee vers la voie regulee des cellules neuroendocrines si amylase pancreatique ne le reussi pas ? Une difference structurale au niveau de son domaine C et la difference significative de la sequence primaire (Macgregor et al., 2001), seront-elles suffisantes pour diriger cette proteine dans les grains de secretion matures ?
Ce travail a pour objet 1'etude des voies de secretion. En utilisant surtout les cellules AtT20 possedant une voie constitutive et une voie regulee, nous avons d'abord etudie le trafic intracellulaire et le ciblage de l'amylase d'orge. Dans un deuxieme volet, notre objectif etait d'exploiter la difference structurale de l'amylase d'orge, en l'occurrence son domaine C,
dans les cellules AtT20 afin de determiner 1'importance de ce domaine dans le repliement de la proteine ainsi que dans l'activite enzymatique.
Dans P article presente dans le chapitre 1, nous sommes la premiere equipe a avoir documente la TV-glycosylation de l'amylase d'orge dans les cellules eucaryotes. Selon nos resultats, cette modification n'affecte pas l'activite enzymatique. Nos resultats demontrent que le trafic de l'amylase d'orge glycosylee dans les cellules AtT20 est associe a son interaction avec la calreticuline.
Dans l'article presente dans le chapitre 2, nous avons demontre que le domaine C en entier est essentiel pour le bon repliement de la proteine ainsi que pour l'activite de 1'enzyme. Selon nos resultats, les mutations minimes de cette region affectent grandement l'expression de la proteine dormant au domaine C un interet fonctionnel particulier.
Dans une derniere partie, nous presentons les resultats supplementaires qui se rajoutent a l'etude du ciblage de l'amylase d'orge dans les voies de secretion. Ces resultats semblent indiquer qu'une mutation particuliere du site consensus de glycosylation ou la serine 350 est substitute par l'alanine suffit pour diriger la proteine dans la voie regulee.
CHAPITRE1
L'article qui suit est le resultat des travaux effectues uniquement par l'auteure de cette these dans le cadre de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor sous la direction du Dr Denis LeBel. L'auteure a conduit tous ces travaux. Elle a contribue de facon majeure aux choix des orientations prises durant la poursuite de ces recherches.
La redaction de la premiere version de ce travail a ete effectuee par l'auteure tandis que les travaux de correction et la version finale de l'article ont ete realises en collaboration avec le Dr LeBel.
Cet article a ete soumis pour publication a Biochemical Journal le 21 fevrier 2008.
PRESENTATION DE L'ARTICLE
Dans le but d'etudier le ciblage des proteines dans les cellules possedant une voie de secretion regulee nous avons exprime Pamylase d'orge dans les cellules neuroendocrines AtT20. Suite a cette transfection, Pamylase d'orge est JV-glycosylee. Cette observation correspond a la presence d'un site consensus de la glycosylation sur N348. Cette glycosylation est du type riche en mannose. La forme glycosylee represente 50 % de Pamylase d'orge secretee par les cellules AtT20. Dans l'extrait cellulaire, 70 % de la proteine detectee est glycosylee. L'amylase d'orge dans synthetisee par autres types cellulaires comme AR42J et PC 12 a le meme comportement que celui observe dans les cellules AtT20. Par contre, lorsqu'elle est exprimee par les cellules epitheliales du rein MDCK transferees, Pamylase d'orge n'adhere plus a ces observations. Les etudes dynamiques par marquage radioactif demontrent un retard de la secretion de la glycoforme. Ce dernier n'est pas du a P accumulation de la proteine dans les grains de secretion car la
proteine ne repond pas a la stimulation avec le secretagogue 8Br-cAMP. En utilisant les
gradients de densite, nous avons demontre que la fraction la plus legere contient moins de la glycoforme. Ceci indique que les conditions presentes dans les regions distales de la voie de secretion pourront etre un facteur important dans ce changement de proportion de la
glycoforme. Pour le verifier, nous avons neutralise le pH intracellulaire ce qui a diminue la participation de la glycoforme. Pour evaluer la possibilite qu'un recepteur du type lectine puisse interagir avec la glycoforme, nous avons performe le pontage chimique avec le reactif homobifonctionnel thiol-clivable. Les resultats obtenus mettent en evidence une proteine dont le poids moleculaire est estime a 55kDa. Cette proteine interagit specifiquement avec la glycoforme. Nos observations indiquent qu'une proteine residente du reticulum endoplasmique avec une activite du type lectine, la calreticuline, pourrait etre impliquee dans le trafic d'amylase d'orge dans les cellules AtT20. De plus, nous avons obtenus des resultats demontrant un changement drastique de distribution de la calreticuline dans les cellules transferees qui contraste la localisation restreinte dans le reticulum endoplasmique de la calreticuline dans les cellules AtT20 non transferees.
Glycosylated Barley Amylase Drags Calreticulin in a Post-TGN Compartment in Cells with a Regulated Secretory Pathway
Helena Senta, Will Home and Denis LeBel
Department of Biology, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke, J1K 2R1 Quebec, Canada
Corresponding author: Dr. Denis LeBel, Department of Biology, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, CANADA, J1K2R1 Telephone: 819-821-8000, ext. 62007 Fax: 819-821-7060 Email: Denis.LeBel@USherbrooke.ca
