Étude de la glucuronidation des précurseurs de
l'androgène actif dihydrotestostérone
Mémoire
Anne-Marie Duperré
Maitrise en sciences pharmaceutiques
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
Étude de la glucuronidation des précurseurs de
l'androgène actif dihydrotestostérone
Mémoire
Anne-Marie Duperré
Sous la direction de :
Chantal Guillemette, directrice de recherche
Éric Lévesque, codirecteur de recherche
iii
Résumé
Les hormones stéroïdiennes jouent un rôle important dans le développement sexuel normal de l’homme et de la femme. Le développement et la progression de plusieurs cancers hormonaux-dépendants tels que le cancer du sein, des ovaires et de la prostate sont également influencés par la disponibilité des stéroïdes actifs et de leurs précurseurs gonadiques et surrénaliens. Les enzymes UDP- glucuronosyltransferase (UGT) font partie de la phase II du métabolisme des médicaments également impliqués dans l’inactivation des stéroïdes. Ces enzymes ont le potentiel de jouer un rôle important sur la biodisponibilité des stéroïdes aux niveaux tissulaire et circulant. Mes travaux portaient sur l’étude de la glucuronidation de précurseurs (13) impliqués dans la formation de la dihydrotestostérone (DHT) et de ses métabolites. Nous avons d’abord déterminé la formation de dérivés glucuronides (-G) de ces stéroïdes au foie, rein et intestin, démontrant la formation de stéroïde-G pour pratiquement tous ceux testés. Quinze enzymes UGT humaines ont été investiguées individuellement pour leur participation à la formation de ces stéroïdes-G. En plus de la sous-famille UGT2B déjà reconnue, l’UGT1A4 est parmi celle qui jouerait un rôle prédominant dans la conjugaison de la plupart des précurseurs surrénaliens et de l’androgène actif DHT, alors que l’enzyme UGT1A10 est active pour la formation de DHT-G et d’androstanediol-G. De plus, nos données indiquent que les isoformes variantes des enzymes UGT1A4 et UGT2B7, issues de polymorphismes génétiques fréquents (>5%) aux codons 24 (UGT1A4*2), 48 (UGT1A4*3) et 268 (UGT2B7*2), pourraient entrainer des variations hormonales significatives en affectant l’activité enzymatique de ces enzymes. Enfin, la mesure de certains de ces métabolites chez un groupe d’hommes et de femmes pré- et post–ménopausées, supporte la variabilité interindividuelle dans les niveaux circulants de stéroïdes-G, toutefois, un plus grand nombre de sujets sera nécessaire afin de déterminer si les variations génétiques des enzymes UGT impliquées sont en cause.
iv
Abstract
Steroid hormones play a critical role in the sexual development of both men and women. The development and progression of several hormono-dependent cancers such as breast, ovarian, uterine and prostate cancers are also influenced by the bioavailability of active steroids as well as their gonadal and adrenal precursors. UDP-glucuronosyltransferase enzymes represents phase II drug-metabolizing enzymes involved in the inactivation of steroids in addition to therapeutic drugs. Variability in this pathway has the potential to affect steroids bioavailability in tissues and in blood. My work focused on the study of glucuronidation of steroid precursors (13) of dihydrotestosterone (DHT) synthesis and its metabolites. We first determined whether glucuronide (-G) derivatives of these precursors are formed in the liver, kidney and intestine. Steroid–glucuronides (-G) were demonstrated for almost every steroids tested. Of the 15 human UGT enzymes tested individually, UGT1A4 is one of the most active towards adrenal precursors (dehydroepiandrosterone, androstanediol and progestogens) and the active androgen DHT, whereas UGT1A10 is active for DHT and androstanediol. In addition, our data indicate that the variant isoforms of UGT1A4 and UGT2B7 resulting from the presence of frequent genetic polymorphisms (>5%) at codons 24 (UGT1A4*2), 48 (UGT1A4*3) and 268 (UGT2B7*2), affect enzyme activity for steroid substrates. Finally, quantification of some of these glucuronide metabolites in a small group of men and pre- and post-menopausal women supports their formation and highlight a significant inter-individual variability in their circulating levels. Additional studies are required to determine whether genetic variations in UGT genes might explain a fraction of the observed variability.
v
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... viii
Liste des abréviations et des sigles ... x
Remerciements ... xii
1 Introduction ... 1
1.1 Les hormones stéroïdiennes ... 1
1.1.1 Synthèse hormonale ... 3
1.1.2 Synthèse hormonale et cancer de la prostate ... 6
1.1.3 Niveaux sériques hormonaux ... 11
1.1.4 Biotransformation des hormones ... 11
1.2 Les enzymes UDP-glucuronosyltransférases... 14
1.2.1 Famille des UGT, leur structure protéique et leur localisation cellulaire ... 14
1.2.2 L’activité enzymatique des UGT ... 17
1.2.3 Expression et variabilité des UGT ... 19
2 Hypothèse et objectifs ... 26
Hypothèse de recherche, objectifs, méthodologies ... 26
3 Méthodologie ... 28
3.1 Cinétique enzymatique ... 28
3.1.1 Calcul des constantes ... 29
3.1.2 Modèle cinétique attendu ... 30
3.2 Matériel et méthode ... 33
vi
3.2.2 Essais enzymatiques ... 33
3.2.3 Quantification des glucuronides par MS/MS ... 34
3.2.4 Analyse des hormones libres, sulfates et glucuronides à partir d’échantillons de plasma ... 35
4 Résultats ... 38
4.1 Identification des substrats glucuronides ... 38
4.2 Potentiel de glucuronidation des tissues ... 38
4.3 Cinétiques des UGT en fonction des stéroïdes ... 44
4.3.1 Glucuronidation des progestatifs... 44
4.3.2 Glucuronidation des précurseurs androgéniques ... 47
4.3.3 Glucuronidation de la DHT et ses métabolites ... 49
4.3.4 Régiosélectivité des UGT pour les hormones ... 51
4.3.5 Capacité de conjugaison des diverses UGT envers les substrats stéroïdiens ... 51
4.4 Isoformes de l’enzyme 1A4 ... 53
4.4.1 Impact des variants génétiques du gène A4 ... 53
4.4.2 Impact d’un variant génétique du gène 2B7 ... 55
4.5 Niveaux circulants de DHEA et de 5-DIOL ... 55
5 Discussion... 58
5.1 Rôle des UGT dans la glucuronidation des stéroïdes ... 58
5.2 Variant des UGT1A4 et UGT2B7 ... 60
5.3 Niveaux circulants de DHEA et de 5-DIOL glucuronides ... 61
6 Conclusion ... 62
vii
Liste des tableaux
Tableau 1 : Substrats stéroïdiens connus des enzymes UGT.
Tableau 2 : Concentrations des stéroïdes libres et conjugués en circulation.
Tableau 3 : Les substrats stéroïdiens des UDP-glucuronosyltranferases et des sulfotransférases. Tableau 4 : Regroupement des résultats de différentes études pour l’expression en ARNm des UGT dans le foie. Tableau tiré de Court 2012.
Tableau 5. Origine des substrats utilisés
Tableau 6. Conditions LC-MSMS et detection optimisée Tableau 7. Conditions HPLC-MSMS et détection optimisée Tableau 8 : Criblage des substrats glucuronidés par les UGT. Tableau 9 : Cinétiques enzymatiques des microsomes de foie. Tableau 10 : Cinétiques enzymatiques des microsomes de rein. Tableau 11 : Cinétiques enzymatiques des microsomes de l’intestin.
Tableau 12 : Activité de glucuronidation des progestatifs par les enzymes UGT in vitro.
Tableau 13 : Activité de glucuronidation du 5-diol et de la déhydroépiandrostérone par les enzymes UGT
in vitro.
Tableau 14 : Activité de glucuronidation de la testostérone et ses métabolites par les enzymes UGT in
vitro.
Tableau 15 : Régiosélectivité des UGT (3-OH et 17-OH).
Tableau 16 : Capacité de conjugaison des diverses enzymes UGT envers les substrats stéroïdiens testés.
viii
Liste des figures
Figure 1 : Voies de synthèse des hormones stéroïdiennes. Légende : Figure adaptée de Mohler 2011. Figure 2 : Source d’androgènes pour la prostate humaine. Figure tirée de Labrie 2011.
Figure 3 : Mesure des stéroïdes chez des patients ayant subi une castration chimique. Figure tirée de Labrie
2014.
Figure 4 : Mécanisme de réactivation du récepteur des androgènes chez les patients CRPC. Figure tirée de
Knudsen 2011.
Figure 5 : Illustration du volume de la tumeur et de l’activité métastatique du cancer de la prostate en fonction
du temps. Figure tirée de Grist 2015.
Figure 6 : Spécificité des UGT envers les androgènes. Figure tirée de Nadeau 2011.
Figure 7 : Représentation de la structure protéique des UGT. Figure tirée de Guillemette 2014.
Figure 8 : Représentation de la réaction de glucuronidation situé dans le réticulum endoplasmique. Figure tirée
de Guillemette 2014.
Figure 9 : Réaction de glucuronidation et groupement fonctionnel réagissant avec les UGT. Figure tirée de
Guillemette 2014.
Figure 10 : Voies d’excrétion des composés glucuronides. Figure tirée de Conjugation Reactions In Drug Metabolism: An Integrated Approach, Publié par Gerard J. Mulder.
Figure 11 : Comparaison du niveau d’ARNm de chacune des UGT en fonction des tissus humains. Figure tirée
de Court 2012.
Figure 12 : Niveau d’expression en ARNm des UGT dans le foie adulte humain. Figure tirée de Court 2012.
ix
Figure 14 : Profil d’expression des UGT au foie. Figure tirée de Margaillan 2015a et Margaillan 2015b. Figure 15 : Variabilité de glucuronidation par les UGT dans une banque de microsomes hépatique humains.
Figure tirée de Court 2010.
Figure 16 : Représentation graphique de la courbe de Michaelis-Menten.
Figure 17: Régression linéaire d’Eadie-Hofstee pour les mêmes données que la figure précédente. Figure 18 : Régression linéaire de Linewaever-Burk pour une gamme de concentration [S] = 0.25-5.0 Km.
Figure 19 : Graphique de Michaelis-Menten.
Figure 20 : Représentation graphique de l’inhibition par le substrat et de la régression d’Eadie-Hofstee. Figure 21 : Représentation graphique d’une coopérativité et de la régression linéaire avec différente valeur
de n.
Figure 22 : Représentation de Hill.
Figure 23 : Cinétique d’une réaction enzymatique comportant un seul substrat.
Figure 24 : Voies de synthèse des hormones stéroïdiennes. Légende : Figure adaptée de Mohler 2011. Figure 25 : Dosage des niveaux du DHEA et de ses métabolites dans le plasma.
x
Liste des abréviations et des sigles
17α-OH-allopreg : 17α-OH-allopregnanolone 17α-OH-DHP : 17α-OH-dihydroprogestérone 17α-OH-preg : 17α-OH-pregnénolone 17α-OH-prog : 17α-OH-progestérone 3α, 3β-diol : androstenediol 4-dione : androstènedione 5-diol : androstanediol A-dione : androstanedione ADN : acide desoxyribonucléique ADT : androstérone
Allopreg : allopregnanolone
AR : «androgen receptor» ou récepteur aux androgènes ARN : acide ribonucléique
ARNm : ARN messager CLint : clairance intrinsèque
CV : coefficient de variation DHEA : déhydroépiandrostérone
DHEA-S : déhydroépiandrostérone sulfate DHT : dihydrotestostérone
enzyme» ou enzyme de clivage de la chaine latérale du cholestérol
GnRH : «Gonadotropin-releasing hormone» ou hormone de libération des gonadotrophines hypophysaires
HAP : hydrocarbure aromatique polycyclique
HPLC : chromatographie en phase liquide à haute performance is : Inhibition par le substrat
Isopreg : isopregnanolone Ki : constante d’inhibition
Km app. : Km apparent
Km : constante de Michaelis-Menten
LH : «luteinizing hormone» ou hormone luteinisante MM : Michaelis-Menten
n : constante de Hill ND : non déterminé
PCR : «polymerase chain reaction» ou réaction de polymérisation en chaine Preg : pregnénolone
Prog : progestérone
xi
QPCR : «quantitative real-time pcr» ou pcr quantitatif en temps réel RDH5 : rétinol dehydrogénase 5
RE : réticulum endoplasmique
SNP : «single nucleotide polymorphism» ou polymorphism nucléotidique SRD5A1/2 : Stéroïde 5-alpha-réductase 1 et 2
SULT : sulfotransferase Testo : testostérone UDP : uridine diphospho
UDPGlcA : «uridine diphosphate glucuronic acid» ou acide uridine diphosphate glucuronique UGT : UDP-glucuronosyltransférases
xii
Remerciements
Je tiens à remercier Dre Chantal Guillemette de m’avoir accueillie dans son laboratoire. Elle m’a fourni un projet de maitrise plus que captivant puisqu’il comportait plusieurs volets autant moléculaires que cliniques. J’ai pu avoir accès à des technologies précisent quant au dosage des hormones. Ce projet n’aurait pas pu être d’une aussi grande ampleur dans un autre laboratoire que celui-ci. Elle m’a aussi donné une chance énorme en me confiant le remplacement de congé de maternité d’une collègue. Elle faisait confiance en mon travail et c’est le plus beau remerciement qu’il soit.
Je tiens également à remercier l’aide reçu par les professionnelles de recherche. Premièrement, Véronique Turcotte qui a analysé tous mes essais enzymatiques. Il faut dire que je remplissais vite son congélateur et au total j’ai dû lui amener environ 6000 échantillons dans l’espace de 6 mois. Aussi, elle fut d’une grande aide pour la préparation de mes présentations orales surtout pour expliquer comment fonctionne un spectromètre de masse. Également, je tiens à remercier Lyne Villeneuve pour son accompagnement dans le laboratoire. Combien de fois j’ai dû lui demander où était tel ou tel produit. Lyne a vraiment une patience légendaire et une joie de vivre contagieuse. Finalement, je dois également remercier Patrick Caron pour son aide lors de l’écriture de mon sujet spécial de maitrise. Le développement d’une nouvelle méthode analytique n’est pas une chose simple et grâce à ses conseils et commentaires j’ai pu mieux comprendre cet univers.
Je tiens à remercier tous les étudiants qui sont passés au laboratoire pendant que j’y étais. Yannick Audet-Delage et Anaïs Belledant qui ont été de bons coachs pour l’écriture de divers documents portant sur mon projet. Il faut dire qu’on formait une belle troupe d’étudiants et que je n’oublierai pas les soupers, les 5 à 7, ni les partys d’anniversaires avec les Français. Et je n’oublierai pas non plus la diversité d’accents et de nationalité de tous, Lucianna notre Brésilienne, Sylvia de Singapour, Éric notre Acadien (et oui il faut aussi s’habituer à son accent), mais je dois dire que nos midis l’où on débattait des différentes expressions québécoises, françaises, ontariennes et acadiennes étaient vraiment des plus divertissante.
De plus, l’encouragement de ma famille et ami m’ont aidée à passer au travers de ces dernières années. Principalement mon conjoint qui a dû faire avec mon caractère et mes états d’esprit que je sois stressée, fâchée, triste, etc. Il a su, à sa façon, me soutenir. Mes parents et beaux-parents qui étaient présents et qui savaient surtout quoi dire ou ne pas dire en fonction de l’avancement de mon écriture. Il faut dire que ce ne fut pas si facile, mais qu’il ne fallait surtout pas lâcher. J’espère que pour vous, familles et amis, j’ai su rendre un peu plus clair mon projet de maitrise dans ce mémoire.
xiii Merci à tous!
1
1 Introduction
Le système endocrinien joue un rôle très important dans le développement sexuel normal de l’homme et de la femme. Plusieurs maladies sont dues à un dérèglement hormonal dont le syndrome des ovaires polykystique et l’hyperandrogénie (virilisation et hirsutisme). Ces dérèglements peuvent survenir à n’importe quel âge que ce soit lors de la puberté, d’une grossesse ou bien lors du vieillissement naturel dont l’exemple très connu de la ménopause chez la femme. De plus, certains cancers sont modulés par l’exposition aux hormones, dont le cancer de la prostate, du sein et des ovaires. La mesure des stéroïdes est déjà courante en clinique chez les femmes subissant une ovariectomie ou chez les patients atteints du cancer de la prostate.
L’élimination des hormones se fait via le métabolisme de phase II des médicaments. On retrouve les enzymes uridine diphospho (UDP)-glucuronosyltransférases (UGT) qui effectuent la glucuronidation d’une large gamme de substrats dont fait partie les hormones stéroïdiennes. De plus, suite à une ovariectomie chez la femme ou d’une castration chez l’homme la mesure des hormones glucuronides a été proposée pour mieux refléter la synthèse hormonale périphérique.1 Il est connu, jusqu’à présent, que
les UGT2B sont impliquées dans la glucuronidation des hormones stéroïdiennes actives telles que la testostérone (testo) et la dihydrotestostérone (DHT) ainsi que ses métabolites l’androstanediol (3α-, 3β-diol) et l’androstérone (ADT).2,3 Par contre, outre ces hormones, celles de l’ensemble des voies de
synthèse androgénique n’ont pas toutes été étudiées quant à leur inactivation par les enzymes UGT. L’objectif principal de mon projet fut d’identifier les enzymes impliquées dans l’inactivation de la DHT et de ses précurseurs et d’en caractériser les cinétiques enzymatiques. Également, des dosages sériques ont été effectués pour certains précurseurs surrénaliens et leurs métabolites conjugués afin d’évaluer leur abondance en circulation chez l’homme et la femme.
1.1 Les hormones stéroïdiennes
Le profil hormonal est très varié dans le corps humain. Ce profil hormonal suit le principe de l’intracrinologie puisque les hormones actives sont synthétisées localement, exercent leur action au site de leur synthèse et sont ensuite métabolisées en composées moins androgéniques ou inactivées avant d’être relâchées en circulation. De ce fait, on retrouve une plus forte abondance de précurseurs androgéniques, des métabolites de la DHT et leur forme glucuronides ou sulfates en circulation plutôt que les hormones actives.4-6 Par exemple, la prostate est le tissu dont la concentration de DHT est la
2
abondance de DHEA (déhydroépiandrostérone) et DHEA-S (DHEA-sulfate), des précurseurs androgéniques importants produits par les surrénales (Tableau 1). 7
Tableau 1 : Concentrations des stéroïdes libres et conjugués en circulation.
Stéroïdes Libres Glucuronides
Prégnénolone 513.6 pg/ml8 (0.514 ng/ml) 1.09 pg/µl9 (1.09 ng/ml) Progestérone 9-30 nM10 (2.8-9.4 ng/ml) 0.32 pg/µl9 (0.32 ng/ml) Dihydroprogestérone 0.27 pg/µl9 (0.27 ng/ml) Allopregnanolone 39.0 pg/ml8 (0.039 ng/ml) Isopregnanolone 0.42 pg/µl9(0.42 ng/ml) DHEA 30 nM10 (8.65 ng/ml) 34.4 pg/dL8 (344 pg/ml) 4.03 pg/µl9 (4.03 ng/ml) 242 ng/dL11 (2.42 ng/ml) 1901 ng/dL 11 (19 ng/ml) Androstenedione 92.5 ng/dL8 (0.925 ng/ml) 5-diol 1.4 ug/ml 12 (1400 ng/ml) Testostérone 3675 pg/ml13 (3.675 ng/ml) 12 nM10 (3.46 ng/ml) 8.86 pg/µl9 (8.86ng/ml) 429 ng/dL 11 (4.29 ng/ml) Dihydrotestostérone 315.04 pg/ml13 (0.315 ng/ml) 0.44 pg/µl9 (0.44ng/ml) 29 ng/dL 11 (0.29 ng/ml) 3α-diol 0.05 pg/µl9 (0.05ng/ml) (3G ) 1.62 ng/ml13 (17G) 3.61 ng/ml13 3β-diol 0.17 pg/µl9 (0.17ng/ml) Androstérone 164.49 pg/ml13 (0.164 ng/ml) 184.8 pg/ml8 (0.185 ng/ml) 11 ng/dL 11 (0.11 ng/ml) 30.20 ng/ml13 44.6 nM14 (20.809 ng/ml)
Légende : ( ) Valeurs transformées en ng/ml , Nombre en exposant : références
Le développement et la progression de plusieurs cancers hormonaux-dépendants tels que le cancer du sein, des ovaires, de l’utérus et de la prostate, sont influencés par la disponibilité des hormones actives.15
Le cancer de la prostate est le second cancer le plus mortel chez l’homme en 2016.16 Il s’agit également
3
testo jouent un rôle majeur dans le développement sexuel masculin. Le récepteur aux androgènes (AR) est activé par la liaison de la DHT ou de la testo.17,18 Toutefois, la DHT possède une meilleure liaison au
récepteur, dû à l’hydrophobicité de celui-ci, lui conférant une meilleure stabilisation des interactions moléculaires.19-21 Le récepteur aux androgènes est un facteur de transcription critique dans la régulation
du développement sexuel masculin et il possède un rôle majeur dans le développement du cancer de la prostate.22-24 Ces hormones sont d’ailleurs d’importants substrats endogènes des enzymes UGT dont
les UGT2B25 qui conjuguent la testo et la DHT ainsi que les métabolites de la DHT le 3α-diol et
l’ADT(Tableau 2). Le métabolisme des hormones par les enzymes UGT entraine leur inactivation et leur élimination du corps en augmentant leur solubilité. Les UGT peuvent avoir des impacts majeurs sur l’exposition des cellules cancéreuses aux hormones qui ultimement a un impact sur le développement du cancer.26
Tableau 2 : Substrats stéroïdiens connus des enzymes UGT.
1A4 2B4 2B7 2B15 2B17 Preg 27 DHEA 28 Testo 27 28 28 28-30 DHT 27 28 28,31,32 28-30 3α-3β 33 31,32 29,30 ADT 27 28 28 28-30
Légende : Les nombres correspondent à des références d’articles.
1.1.1 Synthèse hormonale
Les précurseurs hormonaux proviennent de différents tissus, dont les testicules, les ovaires et les glandes surrénales. Chez l’homme, les testicules fournissent environ 60% des hormones et 40% est compensé par les glandes surrénales.34 On retrouve la synthèse des hormones actives dans la peau, le
foie et les tissus adipeux et nombreux autres tissus, toutefois en plus faible proportion4 comparativement
à leurs sites majeurs qui sont les testicules pour la testo et la prostate pour la DHT.1,35 Les glandes
surrénales contribuent à la formation du DHEA et sa forme sulfatée le DHEA-S qui peut être convertie en hormones actives.1
Voies enzymatiques
Plusieurs voies sont possibles pour la synthèse de la DHT (Figure 1). La première voie, soit la classique, est celle la mieux caractérisée où le DHEA est converti en testo dans les testicules. La testo est relâchée dans la circulation pour atteindre la prostate qui la transforme en DHT. La seconde voie, celle du
delta-4
4, passe par l’androstènedione (4-dione). La troisième voie, la voie alternative ou «backdoor», quant à elle, n’a pas besoin de la testo pour former la DHT d’où son nom.
Dans la voie classique, la DHT est synthétisée à partir de la testostérone (Figure 1). Cette voie implique la conversion du cholestérol en prégnénolone (preg) dans la mitochondrie par la CYP11A1.36-38 La preg
est ensuite convertie en 17α-hydroxyprégnénolone (17α-OH-Preg) suivi du DHEA par l’activité de la CYP17A1.36-38 Le DHEA est par la suite métabolisé en testo en passant soit par l’androstènediol (5-diol)
ou par le 4-Dione s’il s’agit de la voie du delta-4 pour la deuxième option. Cette réaction est catalysée par l’enzyme 17β-hydroxystéroïde déhydrogénases (17β-HSD3). La testo est transformée en DHT par les 5α-réductases de type 1 et 2 (SRD5A1/2) dans la prostate et dont la réaction est irréversible.21 Cette
voie est principalement impliquée dans les testicules sous des conditions physiologiques normales.39
Toutefois, la voie classique n’est pas la seule voie métabolique permettant la formation de la DHT. En effet, la voie alternative n’implique pas la testostérone pour la synthèse de la DHT contournant ainsi la voie de synthèse classique. Cette voie implique la conversion de la preg en progestérone (Prog) par une 3β-HSD1/2, puis la prog est convertie en 17α-hydroxyprogestérone (17α-OH-Prog) par l’intermédiaire de la CYP17A1. La 3β-HSD1 est principalement exprimée dans la peau, les glandes mammaires et le placenta alors que la 3β-HSD2 est exprimée dans les glandes surrénales, les ovaires et les testicules. La 3β-HSD1 possède une meilleure affinité pour preg, le DHEA et la DHT toutefois la conversion des différentes hormones par les 3β-HSD1/2 dépend du tissu où les hormones se trouvent.40 La
17α-OH-prog est 5α-réduit en 17-hydroxydihydro17α-OH-progestérone (17α-OH-DHP) par la 5R1 et la 5R3 et, ensuite, convertit en 17α-hydroxyalloprégnanolone (17α-OH-allopreg) par une 3α-HSD. La 17α-OH-allopreg est convertie en ADT par la CYP17A1 et AKR1C3 ainsi qu’en 3α-diol ou 3β-diol.35 Ces métabolites peuvent
5
Légense : En rouge : médicaments qui inhibent les voies de synthèse des hormones, En vert : composés faisant partie de la voie alternative
6
1.1.2 Synthèse hormonale et cancer de la prostate
Le cancer de la prostate est influencé par les hormones stéroïdiennes d’où l’utilisation de traitements hormonaux.4 Les traitements pour le cancer de la prostate localisé dépendent du niveau de risque du
cancer. Lorsque le risque est faible, les lignes de traitements sont soient l’observation vigilante du patient, une prostatectomie avec ou sans lymphadénectomie avec ou sans castration chimique ou de la radiothérapie si la chirurgie est impossible. Lorsque le risque est intermédiaire, les patients ont recours à la prostatectomie avec ou sans lymphadénectomie avec ou sans castration chimique ou à de la radiothérapie combiné avec la castration chimique. Finalement, lorsque le risque est avancé la première ligne de traitement consiste à la castration chimique ou l’orchidectomie bilatéral, et la seconde ligne consiste au traitement à l’abiratérone, l’enzalutamide ou à la chimiothérapie selon les symptômes et l’état du patient. La radiothérapie réduit le risque d’une récurrence biochimique du cancer de la prostate. Cette récurrence est observée par une hausse de l’antigène prostatique spécifique (PSA).42,43 On note suite à
la prostatectomie et la radiothérapie une régression du cancer de la prostate dû à la diminution des hormones actives qui empêche l’activation du AR. La castration chimique consiste à supprimer la synthèse de testo provenant des testicules par l’utilisation d’analogue de la GnRH (hormone de libération des gonadotrophines hypophysaires) (Figure 2). La GnRH induit la sécrétion de LH (hormone lutéinisante) qui stimule les testicules pour la production de testo qui est ensuite relâché en circulation.44
Malgré la suppression de la testo des testicules, il demeure une synthèse de précurseurs androgénique provenant des glandes surrénales. La testo circulante étant réduite de 97% il demeure une production de DHT d’environ 40% dans la prostate ainsi qu’environ 40% des glucuronides dérivés de celle-ci en circulation (Figure 3).34 La prostate est en mesure de synthétiser la DHT puisqu’elle possède les enzymes
7
Figure 2 : Source d’androgènes pour la prostate humaine. Figure tirée de Labrie 2011. 4
Figure 3 : Mesure des stéroïdes chez des patients ayant subi une castration chimique. Figure tirée de Labrie 2014.34
8
La cause de la récidive du cancer de la prostate suite à la castration chimique est expliquée par plusieurs mécanismes.39 Ces mécanismes sont l’amplification du AR46, la modification épigénétique affectant les
corépresseurs et coactivateurs du AR, des mutations du AR quoique rare dans le cancer de la prostate peuvent diminuer la spécificité du AR donc il devient sensible à une plus grande sélection de ligands47-50
et des altérations des enzymes de la stéroïdogenèse.51,52 On retrouve entre autres une augmentation de
l’expression de l’enzyme AKR1C3 dont le rôle est de convertir le DHEA et le 4-dione en testo et DHT. De plus, il a été démontré que le DHT peut être synthétisé en absence de testo par l’intermédiaire des enzymes SRD5A, 17βHSD et la 3βHSD.53 La figure 4 illustre les différents traitements hormonaux du
cancer de la prostate ainsi que les différentes voies de contournements qui peuvent réactiver l’activité du AR.54 Ces différentes adaptations dans le cancer démontrent l’utilité d’identifier les endroits où il se
produit ces divergences plus particulièrement par rapport aux voies de synthèse hormonales et des traitements visant à les bloquer afin d’identifier plus tôt un risque de réactivation des cellules cancéreuses.
9
Figure 4 : Mécanisme de réactivation du récepteur des androgènes chez les patients CRPC. Figure tirée de Knudsen 2011.54
Médicaments
Plusieurs traitements ont été développés pour cibler le cancer de la prostate (Figure 5). Il existe des médicaments qui ciblent les voies de synthèse hormonales afin d’empêcher l’activation du AR. L’abiratérone acétate est un inhibiteur irréversible de la CYP17A1. Cette enzyme est impliquée dans les trois différentes voies de synthèses androgéniques citées ci-haut dont la biotransformation du 17α-OH-preg, du DHEA, 17α-OH-prog, 17α-OH-DHP, 4-dione, 17α-OH-allopreg et de l’ADT.55 Ce traitement
10
Toutefois, on note un niveau plus élevé de DHEA-S en circulation comparativement à celui de la testo résiduelle chez les patients castrés.56 Le DHEA-S peut être converti en DHEA et éventuellement en
androgènes actifs supportant un rôle de réservoir androgénique.39,56 Le finasteride permet l’inhibition de
la SRD5A2 et comparativement le dutasteride inhibe la SRD5A1 et 2. Ces enzymes convertissent la prog en DHP, la 17α-OH-prog en 17α-OH-DHP, le 4-dione en androstanedione (A-dione) et finalement la testo en DHT. Par contre, ces traitements n’empêchent pas la synthèse de testo.57,58 Les antiandrogènes
agissent de deux façons soit par l’inhibition de la liaison du ligand à AR ou par inhibition de l’activation androgéno-indépendante du récepteur. La seconde option réfère à différents mécanismes, dont l’inhibition des coactivateurs nucléaires, activation des corépresseurs et inhibition de la transcription d’une variété de gènes régulés par les androgènes.59 L’enzalutamide est un antagoniste du AR et
diminue l’affinité du AR pour l’ADN.60,61 Le bicalutamide, flutamide et nilutamide sont des inhibiteurs
compétitifs du AR puisqu’ils empêchent la liaison de la DHT et l’activation du récepteur.62 Suite à ces
différents traitements, les chirurgies et les médicaments, une récidive du cancer est observée autour des deux à trois ans chez les patients avec un cancer avancé ou métastatique.54 Différents traitements sont
disponibles à ce stade dont le docetaxel un agent chimiothérapeutique63,64. Le docetaxel et le cabazitaxel
stabilisent le réseau de microtubule des cellules. Ce faisant, ce traitement provoque la mort cellulaire et empêche AR activé d’être transporté au noyau.65,66
Figure 5 : Illustration du volume de la tumeur et de l’activité métastatique du cancer de la prostate en fonction du temps et leurs traitements associés. Figure tirée de Grist 2015.52
11 1.1.3 Niveaux sériques hormonaux
L’un des précurseurs stéroïdiens le plus abondant en circulation est le DHEA et sa forme sulfatée. On la retrouve en forte concentration dans le sang puisqu’il est principalement formé par les glandes surrénales et relâché en circulation pour être transformé en hormones actives dans les tissus notamment en testo et DHT dans les testicules et la prostate.52 Également, nous retrouvons en quantité importante les
glucuronides des métabolites de la DHT. Dans les cellules, la DHT est convertie en métabolites moins androgéniques et dérivés glucuronides afin d’être éliminée du corps. Le DHEA est de loin l’hormone qui est la plus abondante en circulation en incluant sa forme sulfatée qui a également un potentiel de transformation en hormone active (Tableau 2).
1.1.4 Biotransformation des hormones
Le métabolisme de phase II des médicaments comprend la voie de glucuronidation et de sulfatation qui permet d’éliminer les hormones sous diverses formes ou d’en constituer un réservoir. La glucuronidation est effectuée par les enzymes UGT qui ajoute un groupement glucuronide aux molécules alors que la sulfatation, quant à elle, est effectuée par les sulfotransferases (SULT) qui ajoutent un groupement sulfate. Les SULT et les UGT facilitent l’excrétion des composés dans la bile et l’urine en augmentant la polarité des molécules. Le tableau 3 résume les différentes hormones métabolisées par les SULT et les UGT respectivement.
La sulfatation est considérée comme une réaction réversible. La sulfatase est l’enzyme qui permet de retirer le groupement sulfate afin de retrouver l’hormone initiale.67 La sulfatase est présente dans
plusieurs tissus, dont les testicules, les ovaires, les glandes surrénales, la prostate, la peau, le cerveau, l’endomètre, les reins, la thyroïde, le pancréas, le colon, l’aorte, les os et les lymphocytes.68-70 L’enzyme
se situe dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) des cellules.71 Les hormones sulfatées
sont donc considérées comme étant des réservoirs d’hormones puisqu’ils peuvent à nouveau entrer dans la synthèse des hormones en étant déssulfatées. Contrairement à la sulfatation, la glucuronidation est considérée comme une réaction irréversible. L’enzyme effectuant la réaction inverse, la β-glucuronidase, est uniquement présente dans la flore bactérienne intestinale.72 Ce faisant, seulement une faible
12
Tableau 3 : Les substrats stéroïdiens des UDP-glucuronosyltranferases et des sulfotransférases.
Stéroïdes UGT Km Vmax SULT Km Vmax Références
Cholestérol 2B1b 1.2 µm 73
Preg 1A4 72 pmol/min/mg prot 2A1 1.9-4.9 µm 27,74
2B1a 4.4 µm 73
DHEA 1A4 34 pmol/min/mg prot 1E1 0.2 µm 27,75
2B7 2.1 pmol/min/mg prot 2A1 0.8-3.7 µm 28,73,74,76-81
Testo 1A4 4 pmol/min/mg prot 27
2B7 0.4 pmol/min/mg prot 28
2B15 4.4 pmol/min/mg prot 28
2B17 3.4µm 3.0 pmol/h/ug DNA 36.7 pmol/min/mg prot
28,29
DHT 1A4 18 pmol/min/mg prot 27
2B7 1.7 pmol/min/mg prot 28
2B15 2.8µm 37.4 pmol/h/ug DNA 10.4 pmol/min/mg prot 28,31
2B17 0.7 µm 3.1pmol/h/ug DNA 63.1 pmol/min/mg prot
28,29
ADT 1A4 28 pmol/min-mg prot 2A1 2.1 µm 2777
2B4 3.9 pmol/min/mg prot 28,78
2B7 6.75µm 9.7 µm 94.0 pmol/min/mg prot 97.0 pmol/min/mg prot 28,82
2B17 0.4 µm
0.6 µm 1.3 pmol/h/ug DNA 21.7 pmol/min/mg prot
13
E1 1A1 38 µm 3 pmol/min/mg prot 1E1 0.2 µm 0.11
µm
75,83
1A3 77 µm 50 pmol/min/mg prot 83,84
1A8 55 µm 142 pmol/min/mg prot 2A1 11.2 µm 83,84
1A9 54 µm 4 pmol/min/mg prot 83
1A10 90 µm 3 pmol/min/mg prot 1E1 0.11µm 4.13
pmol/min/mg prot
44,83
E2 1A1 (3G) 23 µm 93 pmol/min/mg prot 1E1 4-300 nm 0.029 µm 28,75,80,83-88
1A3 (3G) 47 µm 39 pmol/min/mg prot 1A1 240 nm 31.3 µm 83,84,88,89
1A3 (17G) 35 µm 13 pmol/min/mg prot 1A2 28.6 µm 83,84,88
1A8 (3G) 38 µm 195 pmol/min/mg
prot 2A1 12.4 µm
83,84,88
1A10 (3G) 17 µm 3 pmol/min/mg prot 2B1a 84.3 µm 83,84
2B7 (17G) 10 µm 3.0 pmol/min/mg prot 42 pmol/min/mg prot 2B1b 60.9 µm 83,84 1E1 0.029 µm 6.88 pmolmin/mg prot 44
14
Figure 6 : Spécificité des UGT envers les hormones sexuelles. Figure tirée de Nadeau 2011.13
1.2 Les enzymes UDP-glucuronosyltransférases
Les enzymes UGT font partie des enzymes de la phase II du métabolisme des médicaments présents de la bactérie aux mammifères.90 Ils catalysent la réaction de glucuronidation sur une vaste gamme de
substrats endogènes et exogènes tels que les médicaments, les toxines environnementales, mais également les hormones.91 Les UGT ont un rôle important dans le maintien de l’homéostasie hormonale
en agissant sur la biodisponibilité des hormones en circulation et intratissulaire.92 L’ajout du groupement
glucuronide par les UGT inactivent les hormones et empêchent leur liaison subséquente aux différents récepteurs hormonaux.
1.2.1 Famille des UGT, leur structure protéique et leur localisation cellulaire
Famille des UGT
Afin de permettre la glucuronidation d’une large gamme de substrats, les UGT ont subi une duplication de gènes et de l’épissage alternatif permettant la formation d’un total de 19 enzymes actives illustrées à la figure 7.91 Les UGT se répartissent en plusieurs familles soient les UGT1, 2, 3 et 8. Ces 19 enzymes
sont issues des sous-familles 1A, 2A et 2B principalement. Les UGT1 et UGT2 sont les plus étudiées et reconnues pour leur rôle dans le métabolisme des médicaments et celui des hormones.
La famille de l’UGT1 et l’UGT2 sont très efficaces pour utiliser l’acide glucuronique comme cosubstrat. Par contre, il est également possible pour ces enzymes d’utiliser l’UDP-glucose ou bien l’UDP-xylose.
93-15
103 L’UGT3A1 et 3A2 utilisent un autre cosubstrat lors de la conjugaison dont l’UDP-N-actylglucosamine,
l’UDP-glucose,l’UDP-xylose94-96 et l’UGT8 ne semble pas être impliqué dans le métabolisme des
médicaments,104 mais plutôt dans la conjugaison des céramides et des acides biliaires avec l’UDP-
galactose.105
La sous-famille UGT1A est encodée par le gène 1 s’étendant sur 200 kilobases et se situe sur le chromosome 2.93 Elle contient respectivement 17 exons menant à 13 transcrits protéiques qui forment 9
protéines enzymatiquement actives (1A1, 1A3, 1A4, 1A5, 1A6, 1A7, 1A8, 1A9 et 1A10) et 4 pseudogènes. Chacune des enzymes UGT1A partage quatre exons communs soit l’exon 2 à 5 et possède un exon 1 alternatif qui lui confère sa spécificité de substrat. Un exon 5 supplémentaire dans la région commune, nommé exon 5b, fut identifié et son utilisation mène à la production de 9 protéines plus courtes nommées isoformes 2 ou i2 qui régulent négativement l’activité des enzymes 1A (renommées i1) par des interactions de type protéine-protéine.106-115
La sous-famille 2A comprend l’UGT2A1, 2A2 et 2A3. L’UGT2A1 est connue pour la glucuronidation des composés odorants phénoliques qui suggère l’implication de cette UGT dans l’initiation et la terminaison du signal odorant.116 Plus récemment, des études ont démontré l’expression de cette UGT dans une
variété de tissus dont les poumons, la trachée, les amygdales, le larynx et le colon avec une activité de glucuronidation envers les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) qui suggère un rôle potentiel dans le métabolisme des carcinogènes du tabac.117 L’UGT2A2 est exprimée dans les tissus de la
muqueuse nasale, les seins, la trachée, le larynx et les reins.118,119 L’UGT2A3 quant à elle est exprimée
dans le petit intestin suivi du foie, du colon, du tissu adipeux, le pancréas, les reins, les poumons, les amygdales, la trachée et le larynx avec une activité envers les acides biliaires.119,120 Seuls les UGT2A1
et 2A2 ont toutes deux été démontrées pour avoir une activité de glucuronidation similaire pour l’estradiol, mais faible de l’ordre de 0.7-2.2 pmol/min/mg pour la vitesse de la réaction.118 Toutefois, l’expression de
ces enzymes principalement dans les voies aérodigestives et leurs activités dirigées vers d’autres composés que les hormones ont mené à l’exclusion de ces UGT pour la suite de l’étude.
La sous-famille 2B, quant à elle, est issue de plusieurs gènes 2B sur le chromosome 4. Contrairement aux 1A, la sous-famille 2B est issue de duplication de gènes qui mènent à la formation de 7 protéines enzymatiquement actives (2B4, 2B7, 2B10, 2B11 2B15, 2B17 et 2B28). La famille 2B à la particularité de partager une très grande homologie de séquence entre chacune de ces protéines. Toutefois, malgré leur ressemblance en C-terminal il est possible de différencier les différentes UGT par le premier exon. C’est dans celui-ci que l’on retrouve le domaine de liaison du substrat qui est spécifique en fonction de différentes UGT.121 À titre d’exemple, l’UGT2B15 et l’UGT2B17 possèdent plus de 97% d’homologie de
16
séquence.29 Également, l’UGT2B17 et l’UGT2B28 sont les deux gènes les plus délétés du génome
humain. De plus, ces délétions sont associées à un risque accru de développer le cancer de la prostate ou de développer une récidive.13,122-130
Figure 7 : Représentation de la structure protéique des UGT. Figure tirée de Guillemette 2014.131
Structure protéique et localisation cellulaire
Les UGT sont des enzymes transmembranaires. On les retrouve principalement dans la membrane du RE mais également au niveau de la membrane nucléaire.132 Elles sont attachées à la membrane du RE
par leur domaine transmembranaire en forme d’hélice α située en C-terminale avec 19 à 26 acides aminés qui ressortent du côté cytoplasmique.133 Il s’agit du seul domaine transmembranaire de la
protéine. L’enzyme se retrouve majoritairement du côté de la lumière du RE qui contient le site actif 134
tel qu’illustré à la figure 8.91 L’UGT2B7 fut la seule UGT à être crystalographiée chez les plantes
17
Figure 8 : Représentation de la réaction de glucuronidation situé dans le réticulum endoplasmique. Figure tirée de Guillemette 2014.91
La séquence protéique des UGT, variant entre 50-60 kDa, est divisée en deux parties soit la région variable et la région conservée. La région conservée correspond à la portion C-terminale alors que la région variable correspond à la portion en N-terminale. La région conservée comprend les autres exons qui codent pour le domaine de liaison de la protéine pour le cosubtrat l’acide uridine diphosphate glucuronique (UDPGlcA) utilisé par toutes les UGT1A et 2B ainsi que le domaine transmembranaire.136
La région variable comprend l’exon 1 pour l’UGT1 et l’exon 1 et 2 pour l’UGT2. Cette région code pour le domaine de liaison du substrat des UGT. Cette région est variable puisque chacune des UGT ont des substrats spécifiques. Les différentes séquences protéiques de cette région permettent de reconnaitre une vaste gamme de substrats ce qui explique la diversité des substrats glucuronidés par les UGT.91,93,107,121,136,137
1.2.2 L’activité enzymatique des UGT
La réaction de glucuronidation consiste en l’ajout d’un groupement acide glucuronique provenant de l’UDPGlcA sur une molécule lipophile. Cet ajout augmente la polarité et la solubilité des molécules, en facilite leur excrétion dans la bile ou l’urine et de façon plus importante rend inactif les composés. Toutefois, il existe des exceptions quant à l’inactivation des substrats par l’ajout du sucre dont la morphine qui une fois glucuronidée en morphine-6-glucuronide devient 100 fois plus active. La forme morphine-6G représente 5-10% de la forme comparativement avec celle de la morphine-3G qui compte pour environ 60%.138 En plus d’inactivé les composés, l’ajout du groupement glucuronide modifie la
structure des substrats, par exemple pour les hormones cela rend impossible l’activation de leurs récepteurs hormonaux puisque la molécule ne peut plus entrer dans le site actif.47,91
18
La réaction de glucuronidation a lieu dans la lumière du RE. Le cofacteur, l’UDPGlcA, est amené à l’intérieur de la lumière. Il est le premier à se lier à l’UGT suivi du substrat.134,139 Il s’en suit une attaque
nucléophile de type SN2. Cette réaction peut avoir lieu sur différent groupement nucléophile tel que les groupements énols (-C=O), carboxyles (-COOH), sulfuryles (-SH), hydroxyle (-OH) et amines (-NH2) tels
qu’illustrés à la figure 9.90,107,140-142 La formation du glucuronide est ensuite reconnue par les
transporteurs anioniques des reins qui permettent l’excrétion dans la bile ou l’urine.121,143,144 Cet ajout
permet d’augmenter la polarité des composés et permet ainsi une meilleure excrétion dans la bile et dans l’urine afin d’être éliminé. De plus, l’ajout de ce groupement inactive la plupart du temps le composé en changeant leur structure Par contre, il existe certaine exception comme pour la morphine qui lorsque glucuronidé voit son activité augmentée.145 Les composés à haut poids moléculaire sont principalement
éliminés par la bile alors que les composés à faible poids moléculaire sont éliminés via les urines.146 La
figure 10 illustre les deux voies d’élimination des composés soit la bile ou l’urine. Pour qu’il y ait glucuronidation par les UGT, les substrats doivent posséder un groupement nucléophile présent ou ajouté par l’action des cytochromes.
Figure 9 : Réaction de glucuronidation et groupement fonctionnel réagissant avec les UGT. Figure tirée de Guillemette 2014.91
19
Figure 10 : Voies d’excrétion des composés glucuronides. Figure tirée de Mulder 2003.147
1.2.3 Expression et variabilité des UGT
Expression tissulaire des UGT
Les UGT sont exprimées dans la majorité des tissus humains toutefois certains tissus les expriment plus fortement et sont donc des meilleurs sujets pour les étudier. Le foie est reconnu comme étant l’organe majeur de la glucuronidation puisqu’il possède l’expression en ARN messager (ARNm) la plus forte parmi l’ensemble des tissus humains (Figure 11).148-150 On y retrouve 13 des 19 enzymes UGT exprimées dont
l’UGT2B4 qui prédomine (Figure 12).150 Mis à part le foie, on retrouve les tissus adipeux, les reins, le
petit intestin, la muqueuse nasale, le colon, la trachée et l’estomac qui ont une bonne expression de ces enzymes.150 Les tissus du tractus gastro-intestinal, comprenant l’estomac, le petit intestin et le colon,
ainsi que les reins sont considérés comme les tissus les plus importants du métabolisme extra-hépatique puisqu’ils sont exposés à une large gamme de composés.92 De plus, on retrouve les tissus
hormonaux-dépendantes dont les ovaires, les testicules, les glandes mammaires et la prostate qui contribuent tous à la glucuronidation (Figure 11).119,142,149-151 La figure 13 présente les transcrits des UGT présents en
20
Figure 11 : Comparaison du niveau d’ARNm de l’ensemble des UGT en fonction des tissus humains. Figure tirée de Court 2012.150
21
Figure 12 : Niveau d’expression en ARNm des UGT dans le foie adulte humain. Figure tirée de Court 2012.150
22
Figure 13 : Expression tissulaire des UGT. Figure adaptée de Guillemette 2014.91
Variabilité interindividuelle des UGT
Le potentiel de glucuronidation présente une variabilité interindividuelle significative. Différents facteurs tels que l’âge, le sexe, la nutrition, l’exposition environnementale, l’influence hormonale et certaines conditions pathologiques peuvent expliquer cette variabilité.90,134
Cette variabilité débute par l’expression en ARNm des UGT. Plusieurs études ont été réalisées afin d’identifier le profil d’expression des UGT (Tableau 4).92,152,153 Les valeurs d’expressions entre chacune
des études présentent des différences importantes. Une autre étude s’est penchée sur cette variabilité et a noté une variation interindividuelle allant de 45 à 184 de coefficient de variation (CV) ce qui peut expliquer pourquoi il existe autant de différence entre chacune des études précédentes (Figure 14).152,153
De façon similaire les mêmes variabilités sont observées au rein autant en en ARNm qu’en protéine allant de 72 à 159 de cv (Figure 14).153 On note également une variabilité dans la glucuronidation de
23
Figure 14 : Profil d’expression des UGT au foie. Figure tirée de Margaillan 2015a et Margaillan 2015b.152,153
24
Tableau 4 : Regroupement des résultats de différentes études pour l’expression en ARNm des UGT dans le foie. Tableau tiré de Court 2012.150
Légende : a 156, b 149, c 148 et d150.
Cette variabilité peut être expliquée par les travaux de Tourancheau et coll. en 2016. L’étude du transcriptome des gènes UGT démontra que plusieurs nouveaux isoformes des UGT peuvent potentiellement être traduits en protéine. Ces protéines peuvent comporter une nouvelle séquence protéique par l’ajout d’un nouvel exon, par la délétion d’un ou d’une partie d’exon ainsi que la combinaison des évènements, et ce en 5’, 3’ ou au milieu de la séquence en ARNm.157 Entre autres, il fut déjà
démontré que l’isoforme i2 produite par l’utilisation d’un exon 5b alternatif produit une protéine alternative et que celle-ci régule négativement l’activité des enzymes 1A en plus d’avoir un impact dans le métabolisme énergétique des cellules cancéreuses du colon.106-115,158 De plus, il fut démontré que parmi
l’ensemble des nouveaux transcrits identifié certains d’entre eux sont presque aussi abondants que la protéine canonique dont l’UGT2B7_i8 qui représente près de 75% des transcrits de l’UGT2B7.159 De
plus, ce nouveau transcrit quant à lui n’est pas enzymatiquement actif avec les substrats de l’UGT2B7 canonique ce qui peut également causer de la variabilité entre les individus.159
Plusieurs variations génétiques communes (fréquence plus de 1%) des gènes UGT ont été identifiées jusqu’à présent. Les polymorphismes nucléotidiques de l’ADN «single nucleotide polymorphism» (SNP)
25
sont des modifications ponctuelles d’une base dans la séquence d’ADN qui peuvent entrainer différentes mutations soit des mutations non-synonymes qui se répercutent par un changement d’acide aminé de la séquence protéique, d’une mutation non-sens qui est l’ajout d’un codon «stop» ou d’une mutation synonyme qui ne change pas l’identité de l’acide aminé. Dans le cas de la mutation non-synonyme, l’acide aminé peut avoir un rôle important au niveau du site actif de l’enzyme ou des interactions avec la stabilisation du substrat dans l’enzyme. Cette modification peut entrainer un changement dans les capacités de glucuronidation de l’enzyme. Les deux paramètres impliqués qui modifient la capacité de glucuronidation sont la vitesse de la réaction ou l’affinité de l’enzyme pour le substrat.80,8178 En modifiant
l’un ou l’autre de ces paramètres, il peut y avoir une amélioration ou une diminution de la capacité de l’enzyme à métaboliser la molécule. Toutes ces modifications ont un impact majeur sur la voie de glucuronidation et d’élimination des médicaments en modifiant leur pharmacocinétique tel que démontré avec le tamoxifène et l’UGT1A4.80 Il est important de bien caractériser cette variation pour mieux adapter
les traitements aux patients afin de prendre en compte les effets secondaires et la toxicité reliée aux médicaments.
Figure 15 : Variabilité de glucuronidation par les UGT dans une banque de microsomes hépatique humains. Figure tirée de Court 2010.154
26
2 Hypothèse et objectifs
Hypothèse de recherche, objectifs, méthodologies
Les hormones stéroïdiennes jouent un rôle important dans le bon fonctionnement du corps humain, et ce, tout au long de notre vie. Les enzymes UGT métabolisent et inactivent la plupart d’entre elles afin de faciliter leur élimination dans l’urine. Ces enzymes jouent donc un rôle important en déterminant la biodisponibilité des hormones dans les différents tissus et dans la circulation sanguine. Ces enzymes sont présentes dans une vaste gamme de tissus. Avec l’âge certaines conditions ou maladies étroitement liées aux hormones apparaissent dont les cancers hormonaux-dépendantes. Les précurseurs hormonaux sont libérés dans la circulation sanguine afin d’atteindre leur tissu cible où ils sont transformés en hormones actives telles que la testo et la DHT. Ces hormones sont inactivées localement au site d’action par les UGT. On retrouve ainsi dans la circulation sanguine un fort taux de stéroïdes glucuronides.
Mes travaux portaient sur l’étude de la glucuronidation de plusieurs précurseurs impliqués dans la formation de la DHT. Il a déjà été démontré que la testo, la DHT et leurs métabolites sont glucuronidés et libérés dans la circulation principalement sous forme de glucuronide. Toutefois, peu de données sont disponibles sur l’action des enzymes UGT sur les précurseurs hormonaux. Ces précurseurs possèdent pour la plupart des groupements réactifs pouvant être glucuronidés par les enzymes UGT tout comme la DHT et ses métabolites, le 3a-diol et l’ADT. Ces précurseurs sont accessibles à différents tissus du métabolisme qui expriment fortement les UGT tels que le foie, les reins et les intestins.
Hypothèse : Les UGT pourraient jouer un rôle important dans la détermination de la biodisponibilité de ces précurseurs de la DHT, influençant ainsi la synthèse des hormones actives.
Mon premier objectif était d’évaluer si ces précurseurs sont conjugués à l’acide glucuronique dans les tissus humains exprimant fortement les enzymes UGT (foie, reins, intestins). Pour ce faire, des essais enzymatiques ont été effectués afin de déterminer quels stéroïdes sont glucuronidés par les UGT. Mon deuxième objectif était d’identifier, pour les hormones conjuguées, les enzymes UGT1A et les UGT2B impliquées dans la glucuronidation, et d’en évaluer les paramètres cinétiques (affinité, vitesse de formation, clairance). Pour ce faire j’ai utilisé des microsomes extraits de cellules HEK293 surexprimant chacune des enzymes UGT1A et 2B. Ensuite, j’ai réalisé des essais enzymatiques avec des préparations de microsomes de cellules exprimant des formes variantes d’enzymes UGT (variations présentes chez plus de 5% de la population) afin d’en déterminer l’impact sur l’efficacité de la glucuronidation. Mon troisième objectif était d’évaluer les concentrations de certains de ces métabolites
27
en circulation chez l’homme et la femme en santé par une approche de spectrométrie de masse développée par le personnel du laboratoire.
28
3
Méthodologie
3.1 Cinétique enzymatique
La caractérisation de la cinétique enzymatique permet de nous renseigner sur plusieurs aspects de la réaction enzymatique que l’on traduit en constante cinétique. Pour effectuer des cinétiques enzymatiques, on incube l’enzyme avec une dizaine de concentration de substrat souvent déterminé à l’aide de la littérature ou par essai et erreur. Avec les valeurs de vitesse obtenues, il est possible de tracer un graphique de Michaelis-Menten (Figure 16) qui servira au calcul des constantes cinétiques.
Figure 16 : Représentation graphique de la courbe de Michaelis-Menten
La première constante est la vitesse maximale de la réaction notée Vmax. La Vmax correspond à la vitesse
maximale de transformation du substrat en produit par l’enzyme lorsque les sites actifs de celle-ci sont complètement saturés de substrat. Lors d’une représentation graphique d’une courbe cinétique, l’atteinte du plateau de la vitesse correspond à la Vmax. 82
La seconde constante cinétique est l’affinité de l’enzyme pour le substrat connue sous le nom de la constante de Michaelis-Menten noté Km. Graphiquement, il est possible de visualiser la km comme étant
la moitié de la Vmax lorsqu’il s’agit du modèle de Michaelis-Menten, mais il est plus juste de dire qu’il s’agit
de la concentration à laquelle il y a la moitié des sites actifs de l’enzyme qui est occupé par le substrat. La mesure de la Km est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme pour son substrat, par
exemple, une km de deux démontre une meilleure affinité qu’une Km de cinq, ainsi il est possible de
comparer l’affinité de deux enzymes pour le même substrat. Certains aspects peuvent faire en sorte que la Km diffère pour la même enzyme et le même substrat puisque la Km est sensible au changement de
Vmax
Vite
ss
e (µ
M
/s
)
29
pH et de température de la réaction enzymatique. C’est pour cette raison que la comparaison des données entre deux laboratoires pour la même enzyme et le même substrat peut différer en plus de la façon dont l’enzyme a été extraite.82
La troisième constante est la clairance intrinsèque(CLint), quant à elle, nous renseigne sur l’efficacité de
l’enzyme pour métaboliser le substrat et correspond au rapport de la Vmax sur la Km (𝑉𝑚𝑎𝑥𝐾
𝑚 ). Cette
constante est très utile si l’on veut comparer différent substrat pour une enzyme ou comparer différente enzyme pour le même substrat. 82
Il existe d’autres constantes cinétiques spécifiques à des modèles cinétiques particuliers et seront détaillées dans leur section respective. 82
3.1.1 Calcul des constantes
Afin de calculer les constantes citées ci-haut, il faut transformer les valeurs en une régression linéaire soit d’Eadie-Hostee ou de lineweaver-Burk. Selon la régression choisit, il est possible de tirer différentes informations à partir du graphique. Sur le graphique d’Eadie-Hofstee (Figure 17), l’intercepte de l’axe des y est la Vmax, celle de l’axe des X est la clairance (𝑉𝐾𝑚𝑎𝑥
𝑚 ) et la pente est la Km en négatif. Pour celui de
Lineweaver-Burk (Figure18), la pente est le rapport de la 𝑘𝑚
𝑉𝑚𝑎𝑥, l’intercepte de l’ordonnée 1
𝑉𝑚𝑎𝑥 et si on
prolonge la droite l’intercepte de l’abscisse est 1
𝑘𝑚. S’il s’agit d’une inhibition par le substrat ou du modèle
de coopérativité de Hill, il faut un logiciel pour calculer ces constantes car il ne s’agit plus d’une droite, mais d’une courbe.
Dans la littérature on retrouve généralement la courbe d’Eadie-Hofstee et c’est pourquoi l’analyse des résultats ont été fait avec celle-ci.
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Figure 17: Régression linéaire d’Eadie-Hofstee pour les mêmes données que la figure précédente.82
Figure 18 : Régression linéaire de Linewaever-Burk pour une gamme de concentration [S] = 0.25-5.0 Km.82
3.1.2 Modèle cinétique attendu
Plusieurs modèles cinétiques ont été répertoriés dans la littérature pour l’ensemble des enzymes UGT. On retrouve le modèle de Michaelis-Menten qui est celui le plus souvent rencontré, mais également celui de l’inhibition par le substrat et celui de la coopérativité nommé Hill.
Michaelis-Menten
Le modèle de Michaelis-Menten (MM) est le modèle classique, mais également le modèle le plus fréquemment observé lors de la caractérisation d’une cinétique enzymatique. La courbe reflète la formation de produit ou la disparition du substrat qui fut transformé (Figure 19).
31 Figure 19 : Graphique de Michaelis-Menten. 82
Inhibition par le substrat
L’inhibition par le substrat (IS) se caractérise par une baisse de la vitesse de formation de produit à haute concentration de substrat. Il est possible d’identifier visuellement une réaction qui suit le modèle en observant à haute concentration de substrat que la vitesse de la réaction chute de façon plus ou moins abrupte (Figure 20). Afin de déterminer la constante d’inhibition (Ki), on effectue un graphique
d’Eadie-hofstee. Également, dans ce type de réaction lorsque la km est plus petite que la Ki cela signifie que le substrat se lie de façon préférentielle au site du produit.83
Quelques exemples ont été démontrés dans la littérature pour la progestérone et la testostérone avec la CYP3A4 ainsi que pour les enzymes UGT. 84,85
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Hill (coopérativité)
Le paramètre n (constante de Hill) dans les réactions de coopérativité est un autre constante à vérifier. La coopérativité s’observe lorsque la courbe de la régréssion d’Eadie-Hofstee ne suit pas la droite attendue, mais plutôt dévit de celle-ci en courbe (Figure 21). Afin de déterminer le paramètre n qui renseigne sur le type de coopérativité soit positive ou négative, il faut utiliser une graphique de Hill (Figure 22) et calculer la pente. Entre autre, il a été démontré pour la CYP3A4 d’effectuer la testostérone 6β-hydroxylation par autoactivation.87 Également, certains ont été démontré à effectuer de l’autoactivation
notamment en formant estradiol 3-glucuronide. 88
Figure 21 : Représentation graphique d’une coopérativité et de la régression linéaire avec différente valeur de n. 86
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Expérimentalement, le calcul des constantes se fait généralement à l’aide de graphique et de logiciel spécialisé. Lors du projet, on a réalisé les calculs avec le logiciel Sigma Plot 11.2 assisté du module Enzyme kinetics 1.3. On a ensuite vérifié les graphiques obtenus afin de bien identifier le modèle pour chaque couple d’enzyme et de substrat.
3.2 Matériel et méthode
3.2.1 Préparations protéiquesLes extraits microsomales sont préparés par centrifugation différentiel tel que décrit dans Villeneuve et coll. et Gagné et coll.160,161. Ces extraits microsomales sont ensuite quantifiés par western blot avec
l’anticorps pan-UGT1A (RC-71) et pan-UGT2B (EL-93), et contrôlé pour la quantité de protéine sur gel avec l’expression de la calnexin. Les anticorps anti-UGT sont des anticorps polyclonaux qui ont été produits dans le laboratoire. Les isoformes variantes d’UGT1A4 ont été générées par mutagenèse dirigée et surexprimées dans les cellules eucaryotes HEK293 (UGT-); tel que publié précédemment.110
3.2.2 Essais enzymatiques
La réaction enzymatique a été réalisée à 37°C dans un volume final de 100µl contenant 10 ug de préparation microsomale, 50 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 2 mM d’ UDPGlcA, 0.5 µg/ml de
leupeptine, 5µg/ml de pepstatin et 20 µg/ml d’alamethicine. Chacune des réactions est arrêtée avec 100 µl de MeOH, centrifugée et conservée à -20°C jusqu’à analyse au spectromètre de masse. Pour le criblage des substrats glucuronidés par les enzymes UGT, des essais avec 10µg de microsome de foie furent effectués avec 200 µM d’un substrat pendant 16 heures.
Pour chaque substrat, des incubations de temps variable (30, 60, 120 et 240 minutes) en présence de substrat ont été effectuées afin de déterminer le temps idéal (30 minutes) pour les essais cinétiques et afin de se situer dans la plage linéaire de la réaction (Figure 23). Dans la majeure partie des cas, cette région linéaire correspond au temps requis pour transformer le substrat en produit.82
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Figure 23 : Cinétique d’une réaction enzymatique comportant un seul substrat. 82
Les cinétiques enzymatiques furent effectuées avec des concentrations variables de substrats (0.5, 1, 2, 3.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 25, 50 et 200 µM) en triplicata et répétés une seconde fois de façon indépendante. Le modèle cinétique de l'enzyme a été sélectionné comme décrit précédemment en utilisant Sigma Plot 11.2 assisté par Enzyme kinetics 1.3. 110
3.2.3 Quantification des glucuronides par MS/MS
Les produits glucuronides furent mesurés à l’aide d’une chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) couplée à un spectromètre de masse triple-quadripolaire. Le système HPLC comprenait un UFLC Prominence 20-AD. Le système a été contrôlé via le logiciel Analyste, version 1.6.2. Le spectromètre de masse (6500 Qtrap) a été utilisé en mode «multiple reaction monitoring» (MRM) et équipé d'une source de pulvérisation turbo réglée à 450°C. La résolution utilisée pour Q1 et Q3 était unité/unité et la tension a été maintenue à 4500 V en positif et -4500 en négatif. Dans le tableau 5, les masses de transitions (m/z), le mode d'ionisation, le potentiel de dégradation (DP) et l'énergie de collision (CE) et LLOQ sont répertoriés.
35 Tableau 5. Conditions LC-MSMS et détection optimisée
Analytes MRM transition (m/z) Ionisation DP (V) CE (V) LLOQ (ng/ml)
Preg-G 510.4→ 299.4 [M+NH4]+ Positive 46 19 Aire sous la courbe Preg-G d4 514.4→ 303.4 [M+NH4]+ Positive 46 19 - 17aOHpreg-G 526.7→ 315.2 [M+NH4]+ Positive 50 20 4 DHEA-G 482.3→ 271.3 [M+NH4]+ Positive 56 25 4 5diol-17G/-3G 484.4→ 273.2 [M+NH4]+ Positive 46 19 4 5diol-17G/-3G d3 487.4→ 276.2 [M+NH4]+ Positive 46 19 - Allopreg-G 512.7→ 301.2 [M+NH4]+ Positive 50 20 4 Allopreg-G d4 516.7→ 305.2 [M+NH4]+ Positive 50 20 - Isopreg-G 512.7→ 301.2 [M+NH4]+ Positive 50 20 4 17aOHallopreg-G 528.7→ 317.3 [M+NH4]+ Positive 56 17 4 DHT-G 484.4→ 273.2 [M+NH4]+ Positive 46 19 4 ADT-G 484.4→ 273.2 [M+NH4]+ Positive 46 19 4 3αdiol-17G d3 489.4→ 278.2 [M+NH4]+ Positive 51 21 - Testo-G 463.1→ 75.0 [M-H] Négative -90 -54 4 3αdiol-17G d3 470.2→ 85.0 [M-H] Négative -90 -54 -
3.2.4 Analyse des hormones libres, sulfates et glucuronides à partir d’échantillons de plasma
La détection des hormones a été réalisée par HPLC couplée à un spectromètre de masse triple-quadripolaire (6500 Qtrap). Le système HPLC était constitué d'un UHFLC Nexera. Le système a été contrôlé via le logiciel Analyste, version 1.6.2. Le spectromètre a été utilisé en mode MRM et équipé d'une source de vaporisation turbo réglée à 450°C et d'un dispositif de mobilité ionique (Selexion). La résolution utilisée pour Q1 et Q3 était unité/unité et la tension a été maintenue à -4500 en négatif. Dans le tableau 6, les masses de transitions (m/z), le potentiel de déclassement (DP) et l'énergie de collision (CE) et LLOQ sont répertoriés.
36 Tableau 6 : Conditions HPLC-MSMS et détection optimisée
Analytes MRM transition (m/z) DP (V) CE (V) LLOQ DHEA-G 463.3→ 75.0 [M-H]- -100 -32 50 pg/ml 5diol-17G/-3G 465.2→ 75.0 [M-H]- -155 -72 5 pg/ml 5diol-17G/-3G d3 468.2→ 75.0 [M-H]- -155 -72 - DHEAG d3 466.3→ 75.0 [M-H]- -100 -32 - DHEAS 367.1→ 97.0 [M-H]- -275 -150 250 ng/ml DHEAS d3 370.1→ 97.0 [M-H]- -275 -150 - 5diol-3S 369.1→ 80.0 [M-H]- -35 -126 5 ng/ml
La colonne utilisée pour la séparation chromatographique est une HSS T3 1,8 um, 75 mm x 2,1 mm. Les phases mobiles se composaient d'eau:ACN 85:15 (v/v) avec du formiate d'ammonium 1 mM (solvant A) et de l'eau:ACN 15:85 avec du formiate d'ammonium 1 mM (solvant B). Le débit était de 0,4 mL/min. Les sulfates (DHEA-S et 5-diol-3S) ont été élués en utilisant le programme suivant: 0-5 min, gradient linéaire 10-17,5% B; 5,1 à 8 min, gradient linéaire 17,5-25% B; 8.1 - 9 min, isocratique 100% B; 9,1-15 min, isocratique 10% B.
Les glucuronides (DHEA-G et 5-diol-3G et 17-G) ont été élués en utilisant le programme suivant: 0-5 min, gradient linéaire 0 à 10% B; 5,1 à 8 min, isocratique 10% B; 8,1-10 min, isocratique 100% B; 10,1-15 min, isocratique 0% B.
La liste des substrats, glucuronides et standard utilisés en analyse de spectrométrie de masse sont répertoriés dans le tableau 7.
