3 Méthodologie
3.1 Cinétique enzymatique
La caractérisation de la cinétique enzymatique permet de nous renseigner sur plusieurs aspects de la réaction enzymatique que l’on traduit en constante cinétique. Pour effectuer des cinétiques enzymatiques, on incube l’enzyme avec une dizaine de concentration de substrat souvent déterminé à l’aide de la littérature ou par essai et erreur. Avec les valeurs de vitesse obtenues, il est possible de tracer un graphique de Michaelis-Menten (Figure 16) qui servira au calcul des constantes cinétiques.
Figure 16 : Représentation graphique de la courbe de Michaelis-Menten
La première constante est la vitesse maximale de la réaction notée Vmax. La Vmax correspond à la vitesse
maximale de transformation du substrat en produit par l’enzyme lorsque les sites actifs de celle-ci sont complètement saturés de substrat. Lors d’une représentation graphique d’une courbe cinétique, l’atteinte du plateau de la vitesse correspond à la Vmax. 82
La seconde constante cinétique est l’affinité de l’enzyme pour le substrat connue sous le nom de la constante de Michaelis-Menten noté Km. Graphiquement, il est possible de visualiser la km comme étant
la moitié de la Vmax lorsqu’il s’agit du modèle de Michaelis-Menten, mais il est plus juste de dire qu’il s’agit
de la concentration à laquelle il y a la moitié des sites actifs de l’enzyme qui est occupé par le substrat. La mesure de la Km est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme pour son substrat, par
exemple, une km de deux démontre une meilleure affinité qu’une Km de cinq, ainsi il est possible de
comparer l’affinité de deux enzymes pour le même substrat. Certains aspects peuvent faire en sorte que la Km diffère pour la même enzyme et le même substrat puisque la Km est sensible au changement de
Vmax
Vite
ss
e (µ
M
/s
)
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pH et de température de la réaction enzymatique. C’est pour cette raison que la comparaison des données entre deux laboratoires pour la même enzyme et le même substrat peut différer en plus de la façon dont l’enzyme a été extraite.82
La troisième constante est la clairance intrinsèque(CLint), quant à elle, nous renseigne sur l’efficacité de
l’enzyme pour métaboliser le substrat et correspond au rapport de la Vmax sur la Km (𝑉𝑚𝑎𝑥𝐾
𝑚 ). Cette
constante est très utile si l’on veut comparer différent substrat pour une enzyme ou comparer différente enzyme pour le même substrat. 82
Il existe d’autres constantes cinétiques spécifiques à des modèles cinétiques particuliers et seront détaillées dans leur section respective. 82
3.1.1 Calcul des constantes
Afin de calculer les constantes citées ci-haut, il faut transformer les valeurs en une régression linéaire soit d’Eadie-Hostee ou de lineweaver-Burk. Selon la régression choisit, il est possible de tirer différentes informations à partir du graphique. Sur le graphique d’Eadie-Hofstee (Figure 17), l’intercepte de l’axe des y est la Vmax, celle de l’axe des X est la clairance (𝑉𝐾𝑚𝑎𝑥
𝑚 ) et la pente est la Km en négatif. Pour celui de
Lineweaver-Burk (Figure18), la pente est le rapport de la 𝑘𝑚
𝑉𝑚𝑎𝑥, l’intercepte de l’ordonnée 1
𝑉𝑚𝑎𝑥 et si on
prolonge la droite l’intercepte de l’abscisse est 1
𝑘𝑚. S’il s’agit d’une inhibition par le substrat ou du modèle
de coopérativité de Hill, il faut un logiciel pour calculer ces constantes car il ne s’agit plus d’une droite, mais d’une courbe.
Dans la littérature on retrouve généralement la courbe d’Eadie-Hofstee et c’est pourquoi l’analyse des résultats ont été fait avec celle-ci.
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Figure 17: Régression linéaire d’Eadie-Hofstee pour les mêmes données que la figure précédente.82
Figure 18 : Régression linéaire de Linewaever-Burk pour une gamme de concentration [S] = 0.25-5.0 Km.82
3.1.2 Modèle cinétique attendu
Plusieurs modèles cinétiques ont été répertoriés dans la littérature pour l’ensemble des enzymes UGT. On retrouve le modèle de Michaelis-Menten qui est celui le plus souvent rencontré, mais également celui de l’inhibition par le substrat et celui de la coopérativité nommé Hill.
Michaelis-Menten
Le modèle de Michaelis-Menten (MM) est le modèle classique, mais également le modèle le plus fréquemment observé lors de la caractérisation d’une cinétique enzymatique. La courbe reflète la formation de produit ou la disparition du substrat qui fut transformé (Figure 19).
31 Figure 19 : Graphique de Michaelis-Menten. 82
Inhibition par le substrat
L’inhibition par le substrat (IS) se caractérise par une baisse de la vitesse de formation de produit à haute concentration de substrat. Il est possible d’identifier visuellement une réaction qui suit le modèle en observant à haute concentration de substrat que la vitesse de la réaction chute de façon plus ou moins abrupte (Figure 20). Afin de déterminer la constante d’inhibition (Ki), on effectue un graphique d’Eadie-
hofstee. Également, dans ce type de réaction lorsque la km est plus petite que la Ki cela signifie que le substrat se lie de façon préférentielle au site du produit.83
Quelques exemples ont été démontrés dans la littérature pour la progestérone et la testostérone avec la CYP3A4 ainsi que pour les enzymes UGT. 84,85
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Hill (coopérativité)
Le paramètre n (constante de Hill) dans les réactions de coopérativité est un autre constante à vérifier. La coopérativité s’observe lorsque la courbe de la régréssion d’Eadie-Hofstee ne suit pas la droite attendue, mais plutôt dévit de celle-ci en courbe (Figure 21). Afin de déterminer le paramètre n qui renseigne sur le type de coopérativité soit positive ou négative, il faut utiliser une graphique de Hill (Figure 22) et calculer la pente. Entre autre, il a été démontré pour la CYP3A4 d’effectuer la testostérone 6β- hydroxylation par autoactivation.87 Également, certains ont été démontré à effectuer de l’autoactivation
notamment en formant estradiol 3-glucuronide. 88
Figure 21 : Représentation graphique d’une coopérativité et de la régression linéaire avec différente valeur de n. 86
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Expérimentalement, le calcul des constantes se fait généralement à l’aide de graphique et de logiciel spécialisé. Lors du projet, on a réalisé les calculs avec le logiciel Sigma Plot 11.2 assisté du module Enzyme kinetics 1.3. On a ensuite vérifié les graphiques obtenus afin de bien identifier le modèle pour chaque couple d’enzyme et de substrat.