Apport de la RMN conventionnelle et de la RMN DOSY à l'analyse de spécialités pharmaceutiques, de leurs génériques et de leurs copies (ciprofloxacine, Prozac®, Floxyfral®, Viagra®, Cialis®)

Université Paul Sabatier Année: 2007

THESE

Présentée devant l’Université Paul Sabatier de Toulouse (Sciences) En vue de l’obtention du Doctorat de l’Université Paul Sabatier

Spécialité: Chimie-Biologie-Santé par

Saleh TREFI

Apport de la RMN conventionnelle et de la RMN DOSY à

l’analyse de spécialités pharmaceutiques, de leurs génériques et de

leurs copies (ciprofloxacine, Prozac

®

, Floxyfral

®

, Viagra

®

, Cialis

®

)

Soutenue le 25 Septembre 2007 devant la commission d’examen Composition du jury

Président Pr. PRIGENT Yann Université de Toulouse III

Rapporteurs Pr. AZAROUAL Nathalie Université de Lille II Pr. VITTORI Olivier Université de Lyon I

Examinateurs Pr. CHEHNA Fawaz Université d’Alep

Dr. RIBET Jean-Paul Laboratoires Pierre Fabre, Castres Pr. SAUTEREAU Anne-Marie Université de Toulouse III Dr. GILARD Véronique Université de Toulouse III

Groupe de RMN Biomédicale

Remerciements

Je remercie sincèrement tous les membres du jury qui ont accepté de juger mes travaux. Pour ces quatre années passées au sein du groupe de RMN Biomédicale, je tiens à exprimer ma profonde gratitude aux professeurs Myriam et Robert Martino avant tout autre chose pour leur gentillesse que ce soit durant les bonnes périodes ou celles où tout ne se déroulait pas comme prévu. Par leurs compétences, leur rigueur et leur dynamisme, ils m’ont donné le goût de la recherche et m’ont permis de réaliser ce travail.

Jamais je n’oublierai Véronique Gilard qui m’a fait effectuer mes premiers pas sur un spectro et qui m’a aidé et soutenu durant les trois ans, Jamais je n’oublierai sa gentillesse, disposition et ses conseils.

Je remercie énormément les membres du groupe de RMN Biomédicale (Brigitte, Joëlle, Delphine, Franck, Denis et Stéphane) : leurs sourires et leurs disponibilités ont été une aide précieuse et constante dans l’accomplissement de mes travaux.

Je souhaite remercier chaleureusement ma famille et surtout mes parents Sabah et Tarif pour tout ce qu’ils m’ont donné pour que j’arrive jusque là.

Enfin, je tiens à remercier tous mes amis, en particulier Rachid Rachid, Ahmad Batikh, Hassan Sharabaty, Malik Zidan, Alaa Korj et Féssal Arnouss.

SOMMAIRE

Introduction Générale 1

Chapitre 1 7

Introduction 9

1- Autodiffusion 11

2- Etude de l’autodiffusion par les techniques de RMN 14

3- La séquence d'écho de spin stimulé (STE) 17

4- De la première à la deuxième dimension: expériences RMN DOSY 18

4-1 Réduction des courants de Foucault 19

4-2 Suppression de la convection 21

4-3 Le choix des solvants 22

4-4 La linéarité du gradient 22

4-5 La stabilité de la température 23

4-6 La sensibilité de la méthode de RMN DOSY 23

5- Le traitement du signal (processing) du DOSY 24

6- Le domaine d’application de la RMN DOSY 25

Bibliographie 27

Chapitre 2 31

Introduction 33

I- Analyse de la fluoxétine (Prozac®) et de la fluvoxamine (Floxyfral®) par RMN 19F 36 1- Validation analytique de la RMN 19F pour l’analyse de la fluoxétine et de la

fluvoxamine 36

2- Application aux biofluides humains spikés par FLX et FLV 38 3- Application à la quantification dans les formulations pharmaceutiques 39 3-1 Formulations commerciales de fluoxétine et fluvoxamine analysées 39

3-2 Résultats 41

Discussion 43

II-Analyse de formulations pharmaceutiques de fluoxétine et de fluvoxamine

par RMN DOSY 1H 48

1- Spectres RMN 1H de la FLX et de la FLV 48

2- RMN DOSY 1H des formulations commerciales solides 49 3- RMN DOSY 1H des formulations commerciales liquides 53

Discussion 56

4- RMN DOSY 1H d’un mélange de FLX et de FLV 57

Discussion 61

Conclusion 63

Partie Expérimentale 65

I- PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIELS 67

1-Réactifs et Produits Chimiques 67

2-Matériel 67

II- PREPARATION DES ECHANTILLONS 67

1- Pour l’analyse RMN 19F 67

1-1 Préparation des solutions pour la validation de la méthode analytique 67 1-2 Préparation des solutions de biofluides pour la validation de la méthode analytique 68

III-PARAMETRES DE VALIDATION 70

IV-ANALYSE RMN 70

1-Enregistrement des spectres RMN 19F 70

2-Enregistrement des spectres en RMNDOSY 71

A. RMN 1H (1D) 72 E. RMN 2D (DOSY) 72 Bibliographie 75 Chapitre 3 81 Introduction 83 GENERALITES 84

1- La ciprofloxacine et ses principales impuretés 84

2- Méthodes analytiques utilisées pour quantifier la ciprofloxacine et ses impuretés

associées 87

I- ANALYSE DE COMPRIMES DE CIPROFLOXACINE PAR RMN 19F 89 1- Dosage des comprimés de Ciprofloxacine par RMN 19F 90 A. Choix du solvant pour l’extraction du principe actif 90

B. Choix de la référence 90

C. Le traitement des spectres obtenus 91

D. Formulations 91

E. Résultats 93

F. Discussion 95

G. Conclusion 96

2- Les profils d’impuretés des formulations de ciprofloxacine analysés par RMN 19F 97 3- La quantification des impuretés fluorées par RMN 19F 102

A. Résultats 102

B. Discussion 105

II- ANALYSE DE COMPRIMES DE CIPROFLOXACINE PAR RMN 1H 106

Discussion générale 115

III- ANALYSE DE COMPRIMES DE CIPROFLOXACINE PAR RMN DOSY 1H 117

1- Choix du solvant 117

2- Résultats 117

3- Discussion 121

CONCLUSION 122

Partie Expérimentale 123

I- PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIELS 125

1-Réactifs et produits chimiques 125

2-Matériel 125

II-PREPARATION DES ECHANTILLONS 126

1-Pour l’analyse RMN 19F 126

2- Pour l’analyse RMN 1H 127

3- Pour l’analyse RMN DOSY 127

4- Pour l’analyse HPLC 128

III-ANALYSE RMN 128

1-Enregistrement des spectres RMN 19F 128

2-Enregistrement des spectres RMN 1H 129

A. RMN 1H (1D) 129

D. RMN 2D (HSQC) 130 E. RMN 2D (DOSY) 130 3-Attribution 131 IV-ANALYSE HPLC 132 Bibliographie 133 Chapitre 4 139 Introduction 141

I- ANALYSE DE FORMULATIONS DE CIALIS® PAR RMN DOSY 1H 143

1- Généralités sur le Cialis® 143

2- Dosage du tadalafil dans différents matrices 143

3- Attribution des signaux du tadalafil par RMN 1H et 13C 144 4- Analyse du Cialis® et de ses imitations par RMN DOSY 1H 146

4-1 Formulations étudiées 146

4-2 Choix du solvant 147

4-3 Caractéristiques RMN 1H des excipients 148

4-4 Résultats 149

5- Dosage du Cialis® et de ses copies 162

Discussion 163

II- ANALYSE DE FORMULATIONS DE VIAGRA® PAR RMN DOSY 1H 164

1- Généralités sur le Viagra® 164

2- Dosage du sildénafil dans différentes matrices 164

3- Attribution des signaux du citrate de sildénafil par RMN 1H et 13C 165 4- Analyse du Viagra® et de ses imitations par RMN DOSY 1H 167

4-1 Formulations étudiées 167

4-2 Choix du solvant 169

4-3 Caractéristiques RMN des excipients 169

4-4 Résultats 171

5- Dosage du Viagra® et de ses copies 184

Discussion 186

III- ANALYSE DE PRODUITS "NATURELS" PAR RMN DOSY 1H 188

Partie Expérimentale 199

I- PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIELS 201

II-PREPARATION DES ECHANTILLONS 201

1- Pour l’analyse RMN DOSY 1H 202

1-1 Le Cialis® et ses copies 202

1-2 Le Viagra® et ses copies 202

1-3 Les produits "naturels" 203

2- Pour l’analyse HPLC 203

2-1 Le Cialis®et ses copies 203

2-2 Le Viagra® et ses copies 204

2-3 Les produits "naturels" 205

III-ANALYSE HPLC 205

1- Le Cialis® et ses copies 205

2- Le Viagra® et ses copies 205

3- Analyse par LC-MS 206

Bibliographie 207

ABREVIATIONS

β-CD β-cyclodextrine BPP Impulsion bipolaire CE Electrophorèse capillaire Cr(acac)3 Acétylacétonate de Chrome III

CV Coefficient de Variation CD3CN Acétonitrile deutéré

COSY COrrelation SpectroscopY CDCl3 Chloroforme deutéré

CP-MAS Cross Polarization, Magic Angle Spinning CZE Electrophorèse Capillaire de Zone

C-GC-FID Chromatographie en phase Gazeuse Capillaire avec Détection par Ionisation de Flamme

C-GC-MS-SIM Chromatographie en phase Gazeuse Capillaire - Spectrométrie de Masse – Single ion monitoring

D2O Eau deutérée

DOSY Diffusion Ordered SpectroscopY

ESI-MS Spectrométrie de Masse par Ionisation ElectroSpray

FLX Fluoxétine

FLV Fluvoxamine

F- Ion fluorure

FID Décroissance libre du signal d’induction FT Transformée de Fourier

FTIR Spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier FBEN 4-FluoroBenzoate de sodium

GC-MS Chromatographie en phase Gazeuse Capillaire - Spectrométrie de Masse HPLC Chromatographie Liquide Haute Performance

HMBC Corrélation hétéronucléaire à travers plusieurs liaisons

HPLC-MS SSI Chromatographie Liquide Haute Performance - Spectrométrie de Masse avec Ionization Sonic Spray

HSQC Corrélation hétéro nucléaire avec cohérence à un seul quantum ICH Conférence Internationale sur l'Harmonisation

LC-MS Chromatographie Liquide- Spectrométrie de Masse

LC-MS-MS Chromatographie Liquide- Spectrométrie de Masse en Tandem LED Longitudinal Eddy current Delay

LOD Limite de Détection LOQ Limite de Quantification

MO Orange de méthyle

MM Masse Molaire

MS-MS Spectrométrie de Masse en Tandem MeOD Méthanol deutéré

MaxEnt Reconstruction par entropie maximale nOe Effet Overhauser nucléaire

OMS Organisation Mondiale de la Santé PFGSE Gradient Pulsé avec Echo de Spin Ph. Eur Pharmacopée Européenne

PDE-5 Phosphodiestérase de type-5 PEG Polyéthylène Glycol

RMN Résonance Magnétique Nucléaire

RMN 19F Résonance Magnétique Nucléaire de fluor-19 RMN 1H Résonance Magnétique Nucléaire du proton STE Echo de spin STimulé

SPME MicroExtraction en Phase Solide

SSRIs Inhibiteurs Sélectifs de la Recapture de la Sérotonine TB Bleu de thymol

TMPS Acide triméthylsilylpropane sulfonique

USP Pharmacopée américaine

Introduction Générale

Introduction Générale

Introduction Générale

Introduction Générale

Introduction Générale

Le but des travaux présentés dans ce mémoire est de montrer quel est l'apport des techniques de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) comme méthodes analytiques complémentaires pour l'analyse de médicaments.

Les médicaments doivent être sûrs, efficaces et d’une qualité constante, afin de produire l'effet thérapeutique attendu. Aujourd'hui, la nécessité d'assurer un contrôle qualité des médicaments est accrue par augmentation de la mise sur le marché de médicaments génériques partout dans le monde. De ce fait, de plus en plus de laboratoires pharmaceutiques "génériqueurs" sont amenés à mettre sur le marché des médicaments contenant un même principe actif mais avec des formulations différentes. Dans une formulation générique, les excipients utilisés peuvent être différents mais doivent conduire à une bioéquivalence du médicament par rapport à la formulation originale.

Outre le problème des médicaments génériques, le problème des contrefaçons de médicaments (copies illicites, faux médicaments, malfaçons) est de plus en plus aigü puisque, selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), la contrefaçon de médicaments est répandue dans les pays en voie de développement où près de 25% des médicaments consommés sont soit des faux, soit des produits de qualité inférieure. Mais, ces contrefaçons de médicaments touchent également les pays riches puisque près de 30% des médicaments contrefaits concernent les pays industrialisés.

Les médicaments génériques présentent l'avantage d'être commercialisés à moindre coût ce qui, dans le cas de certaines thérapeutiques, permet l'accès au traitement pour des personnes vivant dans les pays pauvres. En outre, dans certains pays riches, quand les prix des médicaments sont très élevés et les systèmes de prise en charge sociale défaillants ou inexistants, il y a une

incitation pour le consommateur à s'approvisionner en médicaments en dehors des sources officielles. Or, aujourd'hui, de nombreux sites Internet proposent la vente en ligne des médicaments les plus courants sans nécessité de prescription médicale pour le patient. Ces transactions de médicaments via Internet favorisent la vente de copies illicites ou de produits n'ayant pas fait l’objet d’une autorisation légale de mise sur le marché après évaluation des autorités sanitaires.

Le contrôle qualité des médicaments est assuré par les différents laboratoires fabricants, bien décrit dans les pharmacopées (Européenne et US) et supervisé par les autorités sanitaires (AFSSAPS, FDA) conformément aux normes règlementaires. Les méthodes analytiques de référence dans les laboratoires de contrôle de médicaments sont, à l'heure actuelle, essentiellement basées sur des méthodes chromatographiques comme l'HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance) qui est aisément couplée à diverses méthodes de détection (UV, fluorescence ou spectrométrie de masse). La spectroscopie RMN pourrait prendre sa place comme technique analytique complémentaire à ces diverses techniques car elle apporte des informations sur la globalité de l'échantillon, sans se limiter au principe actif.

Dans ce mémoire, différents travaux montrant l'apport de la RMN pour l'analyse de médicaments sont décrits. Dans le premier chapitre, le phénomène de diffusion, les méthodes RMN de mesure de diffusion par l'utilisation de gradients de champs pulsés et la RMN DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY) sont présentés.

Dans le deuxième chapitre, nous avons étudié des formulations commerciales de deux médicaments antidépresseurs fluorés, la fluoxétine et la fluvoxamine par RMN 19F et DOSY 1H.

Introduction Générale

Le troisième chapitre porte sur l'analyse de comprimés de ciprofloxacine, un antibiotique de la famille des fluoroquinolones. Cette étude a consisté à analyser différentes formulations pharmaceutiques génériques de ciprofloxacine en provenance de différents pays et laboratoires par RMN 19F, 1H et DOSY 1H.

Enfin, dans le dernier chapitre, des imitations de tadalafil (Cialis®), de sildénafil (Viagra®) ou encore de médicaments vendus comme produits naturels ("Herbal drugs") pour l'amélioration des fonctions sexuelles, ont été analysés par RMN DOSY.

Chapitre

Chapitre

Chapitre

Chapitre 1

1

1

1

Introduction sur

Introduction sur

Introduction sur

Introduction sur la Résonance

la Résonance

la Résonance Magnétique Nucléaire

la Résonance

Magnétique Nucléaire

Magnétique Nucléaire

Magnétique Nucléaire

(RMN)

(RMN)

(RMN)

Introduction

INTRODUCTION

INTRODUCTION

INTRODUCTION

INTRODUCTION

La dernière décennie a été témoin d’une explosion dans l’utilisation des gradients de champs magnétiques dans tous les domaines de la spectroscopie RMN, particulièrement en RMN de diffusion. Parmi toutes les informations obtenues par spectroscopie RMN de diffusion, la mesure du coefficient de diffusion des espèces en solution qui permet d’analyser des mélanges inconnus, sans séparation physique préalable, gagne en popularité en chimie analytique.

Introduite au début des années 90, la RMN DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY) permet de représenter les résultats des expériences RMN de diffusion sous forme d’un spectre bidimensionnel, comparable à ceux obtenus par les méthodes classiques de RMN multi- dimensionnelle. D’un point de vue analytique, la RMN DOSY est une méthode extrêmement utile puisqu’elle permet de corréler rapidement les résonances associées à un système spécifique. Néanmoins, ce n’est que récemment que les chimistes ont commencé à utiliser la spectroscopie RMN de diffusion pour étudier leurs systèmes. Une raison à ce retard est que les impulsions de gradient nécessaires pour les séquences employées pour mesurer la diffusion par RMN n’étaient pas disponibles en standard sur les spectromètres jusqu’à récemment. Cependant, avec l’amélioration technologique de la génération des gradients, principalement grâce au développement des techniques d’imagerie, le matériel permettant de produire de tels gradients est devenu disponible dans le commerce et les gradients de champ magnétique sont actuellement des accessoires conventionnels de la RMN moderne à haute résolution. De plus, la RMN diffusionnelle ou la RMN DOSY présente des difficultés lors du traitement du signal. Une analyse idéale de l’expérience DOSY devrait donner une extrême précision dans la dimension de la diffusion. Quand il y a un recouvrement des signaux dans la dimension de la fréquence, il est

difficile d’obtenir une valeur exacte pour le coefficient de diffusion. Cette limitation est liée à la transformée inverse de Laplace nécessaire pour extraire les informations du signal RMN qui reste mathématiquement un problème mal posé.

L’objectif de ce chapitre est de présenter les bases théoriques de la RMN de gradients de champ pulsés avec écho de spin (PFGSE) et de présenter le concept de RMN DOSY. Nous parlerons également brièvement de la théorie de la diffusion.

Chapitre 1.

1- Autodiffusion

L’autodiffusion dans l'état liquide est définie comme le mouvement aléatoire de translation des molécules ou des ions qui résulte de l'énergie thermique moléculaire dans des conditions d'équilibre thermodynamique. Elle diffère fondamentalement de la diffusion mutuelle et de la convection qui sont respectivement dues à la concentration et aux gradients thermiques. Le mouvement brownien a peut-être été observé à la fin du XVIIIe siècle par de nombreux naturalistes, mais on attribue à Robert Brown, un botaniste écossais, une étude systématique de son origine en 1827. Alors qu’il s’intéressait aux mécanismes de fécondation des plantes à fleurs, il nota le mouvement erratique de particules situées à l’intérieur de grains de pollen en suspension dans de l’eau. Brown montra que ce mouvement d’agitation de particules, dont la taille doit être suffisamment petite (de l’ordre d’un micron) pour être observé, se produisait aussi bien avec des tissus organiques vivants ou morts qu’avec des particules minérales.

Les premières explications à cette agitation incessante, résultant de collisions des particules en suspension avec les molécules du milieu, furent données indépendamment par A. Einstein (1905) et M.V. Smoluchowski (1906). Une théorie plus complète fut finalisée en 1912 par le physicien français Jean Perrin qui dessina la trajectoire de tels grains en repérant leur position à intervalles de temps réguliers (figure 1-1). Il obtint une ligne brisée, sans direction privilégiée. En fait, même si on augmente la fréquence des mesures, on trouve toujours une trajectoire ayant la même complexité avec de nombreux changements de direction sans régularité ni périodicité : c’est une courbe fractale. Si l’on repère la position d’un corpuscule à partir d’une position d'origine, on observe que la distance parcourue est, en moyenne, proportionnelle à la racine carrée du temps d’observation.

Figure 1-1. Mouvement brownien d’une particule microscopique en suspension dans l’eau (d’après un dessin de Jean Perrin).

La diffusion de translation ne doit pas être confondue avec la diffusion de spin ou la diffusion de rotation ; c’est la forme la plus fondamentale du mouvement. Le mouvement de translation d'une molécule en solution peut être décrit par un mouvement aléatoire tridimensionnel. Pour l'autodiffusion libre dans les trois dimensions d’un milieu isotrope, Einstein a montré que la moyenne du déplacement s d'une molécule qui diffuse avec un temps t est donnée par l’équation suivante :

s

=

6

D

t

(1)

où D est le coefficient d'autodiffusion de la molécule. Le facteur 6 vient des trois degrés de liberté liés à une diffusion tridimensionnelle. Dans le cas d'un déplacement unidimensionnel, l'équation devient :

s

=

2

D

t

(2)

Le coefficient de diffusion de translation pour des particules non chargées, à une dilution infinie, est lié à la viscosité du milieu par l'équation de Stokes-Einstein :

Chapitre 1. t

af

kT

D

πη

6

=

₍₃₎

où k est la constante de Boltzmann, T la température absolue, ft le facteur hydrodynamique

de frottement (pour une sphère se déplaçant suivant un écoulement laminaire, le facteur ft de

frottement est égal à 1), η et

a

sont la viscosité et le rayon hydrodynamique (

a

s'appelle également rayon de Stockes). Le rayon hydrodynamique

a

d'une molécule peut être lié à son volume spécifique partiel

v

et à sa masse moléculaire M à travers :

3

4

3

N

v

M

a

π

=

₍₄₎

où N est le nombre d’Avogadro. Le volume spécifique partiel peut être déterminé expérimentalement. D’après les équations (3) et (4), on peut voir que le rapport du coefficient de diffusion de deux particules sphériques ayant le même volume spécifique partiel

v

et diffusant dans un même milieu dépend du rapport de leurs masses moléculaires selon l’équation :

3 1 2 2 1

M

M

D

D

=

₍₅₎

Il faut noter, cependant, que différentes théories sont nécessaires pour décrire le facteur hydrodynamique de frottement ft. En effet, l'analyse précédente est seulement valide quand nous

considérons une particule sphérique qui diffuse dans une solution diluée. Sinon, l'équation (3) doit être modifiée et le facteur ft de frottement doit être corrigé pour prendre en compte la forme

originale liée à l’équation de Stockes-Einstein est seulement valable quand la taille des molécules de soluté dissous est grande par rapport à la taille des molécules dissolvantes de sorte que le solvant peut être traité comme un continuum hydrodynamique.

2- Etude de l’autodiffusion par les techniques de RMN

Fondamentalement, deux méthodes principales sont utilisables pour déterminer le coefficient d'autodiffusion D par RMN. Tout d’abord, le coefficient d'autodiffusion peut être mesuré à partir de l'analyse des temps de relaxation (méthode indirecte). En second lieu, la technique de gradient pulsé avec écho de spin PFGSE peut être employée pour déterminer le coefficient d'autodiffusion (méthode directe). Ces techniques sont liées aux mouvements moléculaires sur des échelles de temps très différentes; l'analyse des temps de relaxation rend compte du mouvement moléculaire sur une échelle de temps allant de la micro à la nanoseconde tandis que la PFGSE rend compte du mouvement moléculaire sur une échelle de temps allant de la milliseconde à la seconde. Nous décrirons brièvement ci-dessous la détermination du coefficient d'autodiffusion par la PFGSE.

Dès les premières expériences RMN dans le domaine du temps réalisées dans les années 50, Hahn a montré un effet de la diffusion moléculaire sur l’amplitude des signaux en présence de gradients de champ magnétique. En fait, toutes les mesures RMN de diffusion sont basées sur le fait que le coefficient de diffusion peut être calculé à partir de l'atténuation de l'écho si l'amplitude et la durée du gradient de champ magnétique sont connues [2].

Les mesures originales ont été effectuées avec des gradients continus mais les avantages des gradients pulsés ont été démontrés d'une façon convaincante par Stejskal et Tanner [3] qui

Chapitre 1. ont proposé l’expérience avec gradients de champ pulsés et écho de spin qui est l’une des séquences d’impulsion de base utilisées pour déterminer la diffusion par RMN.

Généralement, un gradient de champ pulsé introduit dans une séquence d'impulsions produit un gradient de champ magnétique linéaire à travers l'échantillon. Ceci impose un angle de phase

Φ

à la magnétisation nette des noyaux qui change linéairement avec la position des noyaux dans l'échantillon. Bien que les fréquences de précession

ω

des spins dépendent des champs magnétiques statiques locaux, la position (coordonnées x, y et z déterminées par

Φ

) à partir de laquelle la précession a lieu dépend de la force du gradient de champ magnétique appliqué [4]. La position des noyaux peut donc être détectée avant et après une période de temps de diffusion introduite dans une séquence d'impulsions (figure 1-2).

Figure 1-2. Séquence de base d'une expérience de diffusion (PFGSE).

Après une impulsion d'excitation de 90°, un gradient de champ pulsé de durée δ, appliqué pendant la première période de l'expérience, introduit un déphasage de l'aimantation globale lié à un codage spatial de la phase des spins en fonction de leur position le long de l'axe du gradient de champ pulsé appliqué. L'impulsion 180° de refocalisation au temps τ/2 inverse la précession liée aux décalages des déplacements chimiques. Un second gradient de champ pulsé, identique au premier, inverse le codage spatial des phases avant l'enregistrement de l'écho de spin au temps τ.

∆

90° 180° codage décodage

τ

/2

τ

/2

∆

90° 180° codage décodage

τ

/2

τ

/2

Si les spins sont stationnaires durant la période ∆ qui sépare les deux gradients de champ pulsé, le codage et le décodage spatial des phases se compensent et l'écho de spin est maximum avec une amplitude seulement gouvernée par la relaxation T2. Toutefois, les molécules en

solution subissent des mouvements browniens de diffusion translationnelle (ou autodiffusion) et la position des spins le long de l'axe du gradient change au cours de l'intervalle de temps ∆, entraînant un décalage des phases codées et décodées par les deux gradients de champ pulsés. Ce décalage de phase est détecté et mesuré par l'atténuation de l'intensité de l'écho de spin résultant. Dans le cas d'une diffusion isotrope comme dans les liquides, l'atténuation de l'intensité du signal est une fonction exponentielle du coefficient de diffusion.

Les coefficients de diffusion moléculaire (D en cm2.s-1) peuvent être extraits de l'expérience PFGSE en utilisant l'équation de Stejskal-Tanner :

I = I

0

exp [(γ.g. δ)

2

(∆ - δ/3) D] (6)

où g est la force du gradient (G.cm-1), ∆ le délai de diffusion (s), δ la durée d’application du gradient (s), I l'intensité du signal d'écho de spin, I0 l'intensité du signal de l'expérience analogue

exécutée sans gradient et γ le rapport gyromagnétique (rad.G-1.s-1) des noyaux dont la phase est codée et décodée par les gradients.

En pratique, une série de spectres RMN de diffusion est enregistrée en faisant varier l'amplitude du gradient. L'intensité des signaux recueillis pour chaque espèce moléculaire diffusante de l'échantillon est atténuée selon une décroissance exponentielle en (-q2 ∆ D), où q est directement proportionnel à l'intensité des gradients utilisés (q = γ.g.δ avec γ rapport gyromagnétique, g et δ force et durée des gradients pulsés).

Chapitre 1. La variation de l'intensité des gradients étant la même pour tous les composants de l'échantillon, l'atténuation des signaux ne dépend que du coefficient de diffusion D de chacune des espèces. L'augmentation de l'intensité du gradient de champ magnétique pulsé entraîne la décroissance de l'intensité du signal recueilli dont l'amplitude est proportionnelle à la valeur du coefficient de diffusion de la molécule étudiée. L'analyse de la décroissance exponentielle des signaux en fonction de q2 permet d'estimer le coefficient de diffusion des espèces moléculaires présentes (figure 1-3).

Figure 1-3. Décroissance exponentielle (atténuation) de l’intensité des signaux en fonction de l’intensité du gradient de champ magnétique pulsé.

3- La séquence d'écho de spin stimulé (STE)

En 1970, Tanner a proposé d'utiliser la séquence d’écho de spin stimulé à la place de la simple séquence d’écho de spin [1]. Cette séquence comprend trois impulsions 90° qui conduisent à un écho après la troisième impulsion (figure 1-4).

Diffusion lente

_{Diffusion rapide}

ppm 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Intensité du gradient δ_(ppm)

Diffusion lente

_{Diffusion rapide}

ppm 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Intensité du gradient δ_(ppm) ppm 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Intensité du gradient δ_(ppm)

Figure 1-4. Séquence d'écho de spin stimulé (STE).

Dans cette séquence STE, l’atténuation dépend du temps de relaxation T1 pendant

l'intervalle de temps entre la deuxième et la troisième impulsion 90° alors que, dans une séquence classique d’écho de spin, l’atténuation dépend du T2 car le délai après l'impulsion initiale est plus

grand. L’avantage de l’utilisation de cette séquence pour la mesure du coefficient de diffusion est que le temps d'évolution de la magnétisation transversale peut être limité à la condition que 2

τ

<<

T. Dans ce cas, la relaxation dépendra principalement de la relaxation spin-réseau T1 [5].

Même si les séquences de mesure de diffusion avec écho de spin ou écho de spin stimulé ont été introduites longtemps avant l’arrivée de la spectroscopie RMN 2D, un développement technique important, la RMN DOSY, a été proposé par Morris et Johnson en 1992 [2].

4-De la première à la deuxième dimension: expériences RMN DOSY

Une des améliorations majeures en spectroscopie RMN a été l'introduction d'une deuxième dimension de fréquence, fournissant un spectre bidimensionnel. Le développement logique de la RMN PFGSE était la mise en place d'une expérience RMN de diffusion dans une carte

(δ)

(δ)

(∆) T

G

Z 90° 90° 90°

τ

τ

₁

_H

(δ)

(δ)

(∆) T

G

Z 90° 90° 90°

τ

τ

₁

_H

Chapitre 1. bidimensionnelle ; c’est la RMN DOSY. La méthode DOSY permet de réaliser une séparation virtuelle des composés et l'obtention de spectres à deux dimensions: coefficients de diffusion dans une dimension (séparation) et spectre RMN 1H (déplacements chimiques δ) dans l'autre dimension (figure 1-5).

Figure 1-5. Spectre RMN DOSY1_{H 500 MHZ d’un échantillon standard qui se compose de glucose, ATP et}

SDS à 100 mmol.L-1 _{dans D2O [6].}

Fondamentalement, la RMN DOSY exige une qualité élevée de l’ensemble de l’acquisition des données RMN par l’utilisation des gradients de champ pulsés. Il est donc essentiel de réduire au maximum les déformations spectrales par l'enregistrement approprié de la fréquence et de l’intensité des résonances et par l’élimination complète des artéfacts qui proviennent des courants de Foucault ou de la convection.

4-1Réduction des courants de Foucault

L'utilisation des impulsions de gradient induit des courants parasites (courants de Foucault) autour de la structure métallique de la sonde et de l'aimant. Une méthode pour éviter l’apparition de ces courants est l’utilisation de sondes de mesure "blindées". D'ailleurs, parce que les courants

Déplacement Chimique δ (ppm)

Déplacement Chimique δ (ppm)

Déplacement Chimique δ (ppm)

Déplacement Chimique δ ppm

C

o

ef

fi

ci

en

t

d

e

D

if

fu

si

o

n

(

µ

m

2

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-1

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Déplacement Chimique δ (ppm)

Déplacement Chimique δ (ppm)

Déplacement Chimique δ (ppm)

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µ

m

2

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-1

)

de Foucault sont dus à la commutation rapide de l'impulsion de gradient, la modification de la forme de ces gradients (ex : sinusoïdale) peut être utilisée pour réduire ces courants. Néanmoins, le changement de la forme des gradients diminue également la force de ces derniers.

Gibbs a proposé une modification de la séquence d’écho de spin stimulé en ajoutant un délai après la dernière impulsion de gradient, délai appelé LED (Longitudinal Eddy current Delay) [1]. En fait, ce délai permet d’enregistrer le signal en l’absence complète de courants de Foucault et, par conséquent, les artéfacts sont réduits. De plus, pour diminuer les courants de Foucault, on remplace l'impulsion de gradient par deux impulsions de polarité différente séparées par une impulsion 180°. Cette séquence, est appelée séquence "LED-STE-Bipolaire Gradient Pulses (figure 1-6).

Figure 1-6. Séquence "LED-STE-Bipolaire Gradient Pulses".

∆ δ/2

G

_Z 90° 180° 90° 90° 180° 90° T Te 1

_H

δ/2 ∆ δ/2

G

_Z 90° 180° 90° 90° 180° 90° T Te 1

_H

δ/2

Chapitre 1. Les expériences que nous avons réalisées l’ont été avec une séquence qui ne comporte pas ce délai LED et qui est appelée séquence "STE-Bipolaire Gradient Pulses" (figure 1-7).

Figure 1-7. Séquence "STE-Bipolaire Gradient Pulses".

4-2Suppression de la convection

Pendant les mesures de PFGSE, la qualité des données peut souffrir d'autres perturbations tel que l'effet de convection. La séquence PFGSE est sensible au mouvement de translation moléculaire. Il y a deux types de mouvement de translation moléculaire : l’autodiffusion, dans laquelle les mouvements des molécules voisines sont aléatoires, et la convection dans laquelle le mouvement moléculaire a lieu dans une certaine direction particulière du fait d’un gradient de pression externe (figure 1-8). Les courants de convection sont provoqués par de petits gradients de température dans l’échantillon, qui font que le liquide de la partie inferieure du tube de RMN étant plus chaud que celui de la partie supérieure a tendance à s’élever puis à redescendre lorsqu’il s’est refroidi et ceci en un cycle continu. Il y a donc apparition de courants sous forme de rouleaux qui constituent le phénomène dynamique majoritaire dans le tube, empêchant la

∆

G

_Z 90° 180° 90° 90° 180° T 1

_H

δ_/2 δ_/2 ∆

G

_Z 90° 180° 90° 90° 180° T 1

_H

δ_/2 δ_/2

mesure de la diffusion. Les gradients de température ont plusieurs origines comme l’échauffement dû à la radiofréquence, le réchauffement différentiel de l’extérieur de la sonde par les bobines, la conduction le long du tube. Mais la source principale de la convection est le flux d’air utilisé pour régler la température de l’échantillon. En pratique, les effets de la convection peuvent être compensés par des stratégies différentes comme, par exemple, la diminution du volume de l’échantillon, l’utilisation de tubes shigemi, la rotation de l’échantillon ou une séquence d’impulsions particulière [1].

Figure 1-8. Mouvement moléculaire : autodiffusion et convection.

4-3Le choix des solvants

Pour l'enregistrement de spectres DOSY, il est préférable d'utiliser des solvants relativement visqueux comme D2O ou DMSO. La très faible viscosité d’un solvant (CDCl3 par

exemple)associée au gradient de température dans l'échantillon conduit, comme décrit ci-dessus, à des phénomènes de convection.

4-4La linéarité du gradient

Pour mesurer précisément les coefficients de diffusion, la qualité de la bobine de gradient joue un rôle très important. Les gradients utilisés pour les mesures de diffusion doivent être

Autodiffusion

Autodiffusion

Autodiffusion

Autodiffusion

Convection

Convection

Convection

Convection

Autodiffusion

Autodiffusion

Autodiffusion

Chapitre 1. linéaires à travers le volume de l’échantillon c'est-à-dire que la variation du champ magnétique doit être linéaire, donc le gradient de champ magnétique constant.

4-5 La stabilité de la température

Un paramètre expérimental très important à régler pendant les expériences de RMN DOSY est d’assurer une bonne stabilité de la température. Si la température n’est pas stable au cours de l’expérience DOSY, il se crée un gradient de température dans l’échantillon qui va provoquer la convection.

4-6La sensibilité de la méthode de RMN DOSY

D'après une étude récente [7], les meilleurs résultats pour une analyse qualitative en DOSY sont obtenus avec l’utilisation d’une cryosonde. Les spectres DOSY d'un mélange constitué de taurine (6,5 µg), d'acide hippurique (9,3 µg) et de glutathion (16 µg) dans un mélange de solvants DMSO/D2O (75/25), analysé avec une cryosonde (A), une nanosonde (B) ou une sonde

conventionnelle (C), sont présentés dans la figure 1-9. Ces quantités sont détectées dans des volumes de 180 µL avec les sondes cryo et traditionnelle et de 40 µL avec la nanosonde, ce qui correspond à des concentrations respectives en glutathion de 1,45.10-4 et 6,54.10-4 mol.L-1. Le temps total d'acquisition est de l'ordre de 12 heures. Le spectre le mieux résolu est celui enregistré avec la cryosonde (A).

Figure 1-9. Spectres DOSY d'un mélange de taurine, acide hipurrique et glutathion enregistrés avec une cryosonde (A), une nanosonde (B) et une sonde conventionnelle (d'après la référence [7]).

5- Le traitement du signal (processing) du DOSY

Le traitement des données de l'expérience RMN DOSY est un point délicat qui a retardé le développement de la méthode. L'approche la plus simple consiste à ajuster les paramètres d'une fonction exponentielle en q2 sur les données expérimentales (ajustement aux moindres carrés). Mais, cette technique simple ne peut pas être appliquée dans tous les cas, en particulier quand les signaux de résonance de plusieurs composés ayant des coefficients de diffusion différents se superposent, ce qui est le cas dans les mélanges complexes. L'approche la mieux adaptée met en œuvre un traitement par transformée inverse de Laplace. La transformée de Laplace est très semblable à la transformée de Fourier bien connue des spectroscopistes RMN (figure 1-10).

Chapitre 1. Mais, alors que la transformée de Laplace est facile à calculer, sa transformée inverse est un problème numérique très difficile.

Figure 1-10. Comparaison de la transformée de Fourier (FFT) et de la transformée inverse de Laplace (ILT). En 1998, Delsuc et al [8] ont montré que la méthode numérique d'analyse par Entropie Maximum (MaxEnt) permettait d'exécuter l'analyse de la mesure DOSY par transformée inverse de Laplace. Dans l’approche par entropie maximum, la transformée inverse de Laplace est exécutée par un algorithme itératif initialisé à partir d’une estimation du profil de diffusion (habituellement un spectre plat) et qui converge vers la solution par des modifications successives de l’estimation courante [6]. La méthode semble tout à fait efficace. C'est le traitement numérique que nous utilisons; le traitement des spectres DOSY sera réalisé à l'aide du logiciel Gifa développé par M.A. Delsuc.

6- Le domaine d’application de la RMN DOSY

L’intérêt majeur de la RMN DOSY est son utilisation pour l’analyse de mélanges complexes. Divers mélanges complexes peuvent être analysés par cette méthode, tels que les biofluides, les huiles, les arômes, les produits pétroliers ou les matrices alimentaires [2, 9-13].

Les préparations pharmaceutiques que nous avons choisi d’étudier sont des mélanges complexes car, outre la présence du principe actif, elles renferment divers composés comme les excipients et les adjuvants qui vont de petites molécules à des polymères. Or, il est souvent difficile de caractériser ce type de mélanges avec des méthodes chromatographiques alors que la RMN DOSY permet l’analyse simultanée de tous les constituants d’un tel mélange quels que soitent leurs poids moléculaire.

Bibliographie du Chapitre 1.

Bibliographie

Bibliographie

Bibliographie

Bibliographie

Bibliographie du Chapitre 1.

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2. Johnson CS: Diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy: principles and applications. Progress in Nuclear Resonance Spectroscopy 1999, 34:203-256. 3. Stejskal EO, Tanner JE: Spin diffusion measurements: spin echoes in the presence of a

time-dependent field gradient. The Journal of Chemical Physics 1965, 42:288-298. 4. Cobas JC, Groves P, M.Martin-Pastor, Capua AD: New applications, processing

methods and pulse sequences using diffusion NMR. Current Analytical Chemistry 2005, 1:289-305.

5. Lindon JC, Liu M, Nicholson JK: Diffusion coefficient measurement by high resolution NMR spectroscopy: biochemical and pharmaceutical applications.

Reviews in Analytical Chemistry 1999, 18:23-66.

6. Gostan T, Tramesel D, Brun E, Prigent Y, Delsuc M-A: L'experience Dosy, une puissante méthode RMN pour l'analyse de mélanges complexes et la détection de traces. SPECTRA ANALYSE 2004, 240:26-32.

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13. Gil AM, Duarte I, Cabrita E, Goodfellow BJ, Spraul M, Kerssebaum R: Exploratory applications of diffusion ordered spectroscopy to liquid foods: an aid towards spectral assignment. ANALYTICA CHIMICA ACTA 2004, 506:215-223.

Chapitre

Chapitre

Chapitre

Chapitre 2

2

2

2

Évaluation de la

Évaluation de la

Évaluation de la

Évaluation de la qualité des formulations

qualité des formulations

qualité des formulations

qualité des formulations pharmaceutiques

pharmaceutiques

pharmaceutiques

pharmaceutiques

génériques et achetées sur

génériques et achetées sur

génériques et achetées sur

génériques et achetées sur Internet

Internet

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Internet

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Fluoxé

Fluoxé

Fluoxétine et d

tine et d

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tine et de la

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Fluvoxamine par

Fluvoxamine par

Fluvoxamine par

Introduction

INTRODUCTION

INTRODUCTION

INTRODUCTION

INTRODUCTION

Les médicaments antidépresseurs sont largement prescrits pour le traitement de la dépression et autres désordres psychiatriques. Entre 1960 et 1980, la dépression était traitée par les antidépresseurs tricycliques, les inhibiteurs non sélectifs de la monoamine oxydase et le lithium. Depuis le début des années 90, une nouvelle génération de composés, les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (SSRIs), est disponible avec un profil pharmacologique différent et moins d’effets secondaires. Ils augmentent la neurotransmission sérotoninergique par l'inhibition sélective de la recapture neuronale de la sérotonine. La fluoxétine (FLX) et la fluvoxamine (FLV) (figure 2-1) appartiennent à cette classe de médicaments. La FLX, commercialement connue sous le nom de Prozac®, est un des médicaments les plus utilisés car elle est souvent le médicament du choix dans le traitement de désordre dépressif grave.

Le but de ce travail est de fournir des méthodes RMN simples et sélectives pour déterminer la teneur en FLX et en FLV dans des formulations pharmaceutiques et des biofluides par RMN

19

F. Un procédé de validation a été ainsi réalisé. Par ailleurs, encouragés par les systèmes d'assurance de santé, les médicaments génériques sont de plus en plus substitués à des spécialités plus chères. En outre, l'Internet a révolutionné la manière dont les consommateurs achètent les médicaments puisque ils trouvent les pharmacies en ligne plus pratiques et plus économiques que les pharmacies traditionnelles.

Nous avons donc utilisé (i) la RMN 19F pour comparer les quantités de FLX et de FLV dans les spécialités Prozac® et Floxyfral® à celles mesurées dans plusieurs équivalents génériques achetés dans plusieurs pays ou sur internet et (ii) la RMNDOSY pour obtenir des informations

qualitatives sur les différentes formulations pharmaceutiques, particulièrement sur leur composition en excipients.

Figure 2-1. Structures du chlorhydrate de fluoxétine et du maléate de fluvoxamine.

CF3 O HN CF3 N H3CO NH₃+ O HCl COOH COO

-Fluoxétine hydrochloride Fluvoxamine maleate

(E-isomer) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Chapitre 2.

Plusieurs méthodes analytiques de dosage des SSRIs dans les échantillons pharmaceutiques ou biologiques ont été développées ces dernières années. Elles sont principalement basées sur l’HPLC [1-8]. Pour augmenter la sensibilité et la spécificité, des méthodes de chromatographie en phase gazeuse avec divers types de détection ont été développées. Plus récemment, une méthode utilisant la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a été publiée [9-11]. D'autres méthodes basées sur la chromatographie en phase gazeuse capillaire [12], l'électrophorèse capillaire [13, 14] et les méthodes spectrophotométriques [15] ont été proposées dans la littérature. Étonnamment, même si la FLX et la FLV sont des médicaments fluorés, la RMN 19F n’a jamais été décrite pour analyser ces composés dans les préparations pharmaceutiques ou les biofluides. Pourtant, un certain nombre de résultats récemment publiés indiquent que cette méthode est sélective et puissante pour l'analyse de divers médicaments fluorés [16-18].

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’application de la RMN 19F à l'identification et la quantification de la FLX et de la FLV dans des formulations pharmaceutiques. En outre, la RMN DOSY a été utilisée pour analyser ces mêmes échantillons. Cette méthode permet l’analyse du principe actif et des ingrédients non actifs présents dans une préparation pharmaceutique sur un même échantillon. Enfin, nous présentons dans ce chapitre une étude par RMN DOSY de l’effet de la complexation de la FLX et de la FLV par une β-cyclodextrine permettant de distinguer les deux médicaments dans un mélange.

IIII---- Analyse de

Analyse de la

Analyse de

Analyse de

la

la

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fluox

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tine (Prozac

tine (Prozac

®®®®

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_{la fluvoxamine (Floxyfral}

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par RMN

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19191919

_F

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1- Validation analytique de la RMN 19F pour l’analyse de la fluoxétine et de la fluvoxamine

La figure 2-2 présente un spectre RMN 19F d’un mélange de FLX (0.416 mg.mL-1) et de FLV (0.268 mg.mL-1) dans du méthanol. Nous obtenons deux signaux à 13.34 ppm et 12.20 ppm correspondant respectivement à la FLX et à la FLV. La séparation entre les deux signaux est suffisante pour réaliser leur intégration et obtenir une quantification précise de ces deux médicaments. En effet, la largeur du signal à mi-hauteur (∆ν1/2) de chaque signal dans nos

conditions expérimentales n'excède pas 2.1 Hz tandis que la différence de fréquence (∆ν) entre ces deux signaux est environ 320 Hz. Nous n’avons observé aucun élargissement des signaux dans les spectres RMN 19F des mélanges de formulations pharmaceutiques permettant donc d’obtenir un résultat quantitatif.

La linéarité, l’exactitude, la précision et les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été validées pour l’analyse d’un mélange de FLX et FLV dans du méthanol par RMN

19

F. Les résultats de la validation analytique sont reportés dans le tableau 2-1.

La bonne linéarité obtenue sur la gamme examinée, évaluée à partir de la valeur de la concentration trouvée par rapport à la concentration ajoutée, indique que la méthode RMN 19F est appropriée pour la quantification de la FLX et de la FLV. La méthode des moindres carrés a été utilisée pour établir la droite de régression. Les coefficients de corrélation sont supérieurs à 0.998 dans une gamme de concentration de 0.0017 - 0.6228 mg.mL-1 pour la FLX et de 0.0014 – 0.4235 mg.mL-1 pour la FLV.

Analyse de la fluoxétine et de la fluvoxamine par RMN 19_F

Figure 2-2. Spectre RMN 19_{F (282.4 MHz) d’un mélange de fluoxétine (FLX) (0.416 mg.mL}-1_{) et de}

fluvoxamine (FLV) (0.268 mg.mL-1_{) dans du méthanol.}

L'exactitude de la méthode a été évaluée en mesurant le taux de récupération dans sept échantillons après ajout des deux analytes : 100.1 ± 3.4% ont été obtenus pour la FLX et 98.8 ± 3.3% pour la FLV. La précision de la méthode a été évaluée par les coefficients de variation (CV) de la détermination de la FLX et de la FLV dans sept échantillons. Ils étaient de 1.6% et 1.3%, respectivement. Les limites de détection et de quantification sont de 1.3 10-6 et 4.5 10-6 mol.L-1, respectivement. (ppm) -36 -32 -28 -24 -20 -16 -12 -8 -4 0 4 8 12 FLX FLX FLV FLV Reference Reference Reference Reference ( FBEN) ( FBEN) ( FBEN) ( FBEN) δ_ppm 12.20 13.34 (ppm) -36 -32 -28 -24 -20 -16 -12 -8 -4 0 4 8 12 FLX FLX FLV FLV Reference Reference Reference Reference ( FBEN) ( FBEN) ( FBEN) ( FBEN) δ_ppm 12.20 13.34

Tableau 2-1. Résultats de la validation analytique par RMN 19_{F pour la détermination de la fluoxétine et de la}

fluvoxamine dans le méthanol. CV : coefficient de variation.

2- Application aux biofluides humains spikés par FLX et FLV

Les taux de récupération de la FLX et de la FLV dans les biofluides humains spikés (urine et plasma) sont rapportés dans tableau 2-2. Une bonne récupération est obtenue pour les deux médicaments, même si l'écart-type est augmenté pour les plus faibles concentrations (≈1µg.mL-1).

Médicament Chlorhydrate de

Fluoxétine Maléate de Fluvoxamine

Linéarité Ordonnée à l’origine Pente R2 Gamme 2.5 10-3 ± 2.7 10-4 0.984 ± 0.013 0.9981 ± 0.0011 0.0017- 0.6228 mg.mL-1 4.95 10-6-1.8 10-3 mol.L-1 (n = 9 concentrations) 6.6 10-4 ± 7.1 10-4 0.991 ± 0.027 0.9983 ± 0.0013 0.0014-0.4235 mg.mL-1 3.3 10-6-9.75 10-4 mol.L-1 (n = 8 concentrations) Précision (n=7)

CV 1.6% pour 1.2 10-3 mol.L-1 1.3% pour 6.2 10-4 mol.L-1

Exactitude

Nombre de solutions analysées Gamme de concentrations Récupération Moyenne (%) ± Ecart type 13 5.10-6-2.10-3 mol.L-1 100.1 ± 3.4 11 3.10-6-10-3 mol.L-1 98.8 ± 3.3 LOD LOQ 0.00045 mg.mL-1 1.3 10-6 mol.L-1 0.0016 mg.mL-1 4.6 10-6 mol.L-1 0.00056 mg.mL-1 1.3 10-6 mol.L-1 0.0020 mg.mL-1 4.6 10-6 mol.L-1

Analyse de la fluoxétine et de la fluvoxamine par RMN 19_F

Médicament ajouté Récupération du médicament (%) ± Ecart-type Chlorhydrate de Fluoxétine Maléate de Fluvoxamine Chlorhydrate de Fluoxétine Maléate de Fluvoxamine Urine 0.830 mg.mL-1 (2.4 10-3 mol.L-1) 0.103 mg.mL-1 (3.0 10-4 mol.L-1) 1.028 10-3 mg.mL-1 (3.0 10-6 mol.L-1) 0.868 mg.mL-1 (2.0 10-3 mol.L-1) 0.138 mg.mL-1 (3.2 10-4 mol.L-1) 1.378 10-3 mg.mL-1 (3.2 10-6 mol.L-1) 99.6 ± 2.5 (n = 6) 97.2 ± 2.9 96.6 ± 7.1 99.9 ± 2.6 (n = 6) 98.6 ± 3.5 98.0 ± 7.5 Plasma 0.090 mg.mL-1 (2.6 10-4 mol.L-1) 1.058 10-3 mg.mL-1 (3.1 10-6 mol.L-1) 0.032 mg.mL-1 (7.4 10-5 mol.L-1) 1.333 10-3 mg.mL-1 (3.1 10-6 mol.L-1) 104.2 ± 3.5 96.8 ± 5.7 102.5 ± 2.9 93.3 ± 7.5

Tableau 2-2. Valeurs moyennes ± Écart-type (n = 3 sauf indiqué) des récupérations de fluoxétine et de fluvoxamine dans l'urine et le plasma humains spikés.

3- Application à la quantification dans les formulations pharmaceutiques 3-1 Formulations commerciales de fluoxétine et fluvoxamine analysées

Formulations solides

Dix formulations commerciales de FLX et quatre de FLV ont été analysées, parmi lesquelles deux sont les spécialités de LILLY (Prozac®) ou de SOLVAY Pharma (Floxyfral®). Les autres sont des génériques provenant de divers pays ou achetés sur Internet. La quantité de FLX dans les diverses formulations est de 20 mg (numéros 1-9) ou 40 mg (numéro 10). Les formulations de FLV contiennent 50 mg de principe actif (tableau 2-3).

Formulations liquides

Cinq formulations commerciales liquides de FLX ont été analysées, la spécialité de LILLY (Prozac®) et quatre génériques. Elles contiennent 20 mg de FLX pour 5 mL de solution (tableau 2-3). Formulation Forme pharmaceutique et dose Numéro de lot Date d’expiration Nom du fabricant Pays de fabrication 1 Prozac Gélules

20 mg 5002A 03/2008 Lilly France

2 Fluocim Gélules 20 mg 0506B006 03/2008 Siegfried Suisse 3 Prouziac Gélules 20 mg 019 09/2008 Massoud-Bahri & Co Syrie 4 Fluzac Comprimés

20 mg 38 01/2008 Balsam Pharma Syrie

5 Fluoxin Gélules 20 mg 04002 12/2006 S.C. VIM Spectrum Roumanie 6 pms-Fluoxetine Gélules 20 mg 411657 01/2007 Pharmascience Inc. Canada 7 Fluoxetina Gélules 20 mg X002 08/2008 Belmac Espagne 8 Proxetin Gélules 20 mg 3667 05/2008 Mediphar Laboratories Liban 9 Fludac Gélules 20 mg 5017 03/2008 Cadila Pharmaceuticals Inde 10 Salidep Gélules

40 mg 007 06/2006 Mano Pharma Inde

11 Prozac Solution buvable

20 mg/5 mL 6314B 09/2008 Lilly France 12 Fluoxétine Arrow Solution buvable 20 mg/5 mL 2007 06/2008 Laboratoires Aérocid France

Analyse de la fluoxétine et de la fluvoxamine par RMN 19_F 13 Fluoxétine Biogaran Solution buvable 20 mg/5 mL FB0206 09/2009 Laboratoires Aérocid France 14 Fluoxétine Ratiopharm Solution buvable 20 mg/5 mL G22808 07/2009 Merckle GmbH Allemagne 15 Fluoxétine Teva Solution buvable

20 mg/5 mL 896005 08/2009 TEVA Santé France 16 Floxyfral Comprimés

50 mg 0113 04/2009 Solvay Pharma France

17 Fluvoxamine

Merck

Comprimés

50 mg 1002A 10/2007 Merck Pays Bas

18 Fluvoxamine Teva Comprimés 50 mg C749 03/2008 TEVA France 19 Fluvoxamine EG Comprimés

50 mg 06A02.26 11/2008 Eurogenerics Pays Bas Tableau 2-3. Formulations commerciales de fluoxétine (1-15) et de fluvoxamine (16-19) analysées dans cette étude.

3-2 Résultats

Les résultats de la détermination de la teneur en FLX et FLV dans les formulations pharmaceutiques sont reportés dans le tableau 2-4. Tous les échantillons contiennent la substance active entre 94 et 103% de la concentration indiquée.

Nous avons cherché également la présence d’impuretés fluorées dans cinq formulations, trois de FLX (formulations 1, 3 et 9) et deux de FLV (formulations 16 et 17). Aucune impureté fluorée n’est détectée dans les formulations 1 et 9 tandis que 0.02% d’un composé fluoré inconnu résonnant à 12.2 ppm ont été détectés dans la formulation 3. Un signal à 36.1 ppm a été observé dans les deux formulations de FLV correspondant à un composé fluoré inconnu et comptant pour 0.03% dans la formulation 16 et 0.005% dans la formulation 17. L’ion fluorure n’a pas été détecté dans les formulations de FLX et de FLV.

Formulation Forme pharmaceutique et dose % de la concentration nominale n Ecart-type (%) 1 Prozac Gélules 20 mg 99.3 4 2.6 2 Fluocim Gélules 20 mg 100.3 3 0.3 3 Prouziac Gélules 20 mg 94.2 4 0.7 4 Fluzac Comprimés 20 mg 103.3 4 7.5 5 Fluoxin Gélules 20 mg 99.0 3 1.1 6 pms-Fluoxetine Gélules 20 mg 102.8 3 3.5 7 Fluoxetina Gélules 20 mg 98.9 3 0.7 8 Proxetin Gélules 20 mg 94.6 4 2.8 9 Fludac Gélules 20 mg 99.7 3 4.0 10 Salidep Gélules 40 mg 98.8 3 3.2 11 Prozac Solution buvable 20 mg/5 mL 98.3 4 1.0 12 Fluoxétine Arrow Solution buvable 20 mg/5 mL 99.0 4 0.9 13 Fluoxétine Biogaran Solution buvable 20 mg/5 mL 99.5 4 0.8 14 Fluoxétine Ratiopharm Solution buvable 20 mg/5 mL 98.3 4 1.1

Analyse de la fluoxétine et de la fluvoxamine par RMN 19_F 15 Fluoxétine Teva Solution buvable 20 mg/5 mL 98.5 4 1.2 16 Floxyfral Comprimés 50 mg 97.3 4 0.9 17 Fluvoxamine Merck Comprimés 50 mg 95.1 4 0.6 18 Fluvoxamine Teva Comprimés 50 mg 97.0 4 4.6 19 Fluvoxamine EG Comprimés 50 mg 98.5 3 0.6

Tableau 2-4. Quantités de fluoxétine (formulations 1111----15151515) et de fluvoxamine (161616----1916191919) retrouvées dans des formulations commerciales par RMN 19_F.

Discussion

Une méthode simple, précise et sélective de RMN 19F a été développée pour déterminer les quantités de FLX et de FLV dans les préparations pharmaceutiques et dans le plasma et l'urine humains (tableaux 2-2 et 2-4). Une comparaison entre les méthodes analytiques décrites pour le dosage de la FLX et de la FLV dans les formulations pharmaceutiques ou les biofluides est présentée dans les tableaux 2-5 et 2-6, respectivement. Clairement, les avantages principaux de la RMN 19F sont : (i) sa spécificité car seules les molécules fluorées (à condition qu’elles soient présentes à des concentrations suffisantes) sont détectées ; (ii) le fait qu'elle évite un traitement préalable de l'échantillon. En effet, les méthodes existantes développées pour l'analyse de la FLX et de la FLV exigent habituellement une préconcentration d'échantillon, une dérivation et/ou des étapes d'extraction avant l'analyse. L’inconvénient principal de la RMN 19F est sa faible sensibilité qui n'est pas un obstacle pour la quantification dans les préparations pharmaceutiques mais pour l’analyse dans les biofluides. Les niveaux thérapeutiques de FLX et de FLV dans le plasma sont de 160-500 µg.L-1 et 150-250 µg.L-1, respectivement [19], empêchant l'utilisation de

la RMN 19F pour des analyses courantes. Cependant, la méthode peut être utilisée pour les études toxicologiques car les taux plasmatiques toxiques de FLX et de FLV sont supérieurs à 1000 µg.L

-1 _{et 650 µg.L}-1

, respectivement [19].

Toutes les formulations analysées dans cette étude ont des concentrations de FLX qui respectent les spécifications de la pharmacopée américaine qui recommande que les gélules de FLX contiennent entre 90% et 110% de la quantité annoncée de substance active (tableau 2-4) [20]. Nos données sont en accord avec celles rapportées par plusieurs auteurs qui, pour la validation de diverses techniques analytiques ou pour l'évaluation de la qualité des produits pharmaceutiques, ont analysé la FLX ou la FLV dans des formulations pharmaceutiques (comprimés, gélules, solutions orales) de différents pays (Italie, Espagne, Inde, Pologne, Iran, Slovaquie, Portugal) et ont trouvé un contenu compris entre 95% et 108% ou 96% et 102% de la quantité annoncée de FLX ou de FLV, respectivement (tableau 2-5). La variabilité intra-lot est correcte car elle est < 5% pour 18 des 19 formulations de FLX et de FLV analysées ; elle est même < 2% pour douze formulations pharmaceutiques. Pour la formulation 4, une plus grande variabilité (supérieure à la précision de l'analyse RMN 19F (< 2%, tableau 2-1)) a été observée.