r
Etude de l’impact de la congélation sur les propriétés
physico-chimiques des substituts cutanés et
caractérisation d’un nouveau modèle de substituts
cutanés psoriasiques enrichis en cellules
immunitaires produit par génie tissulaire
Mémoire
Sarah Dubois Declercq
Sciences pharmaceutiques
Maître ès sciences (M.sc.)
Québec, Canada
Résumé
Le défi actuel des chercheurs est d’élaborer de nouveaux modèles de substituts cutanés plus perfectionnés et d’optimiser leur méthode de production afin d’améliorer leur reproductibilité. Cette étude a évalué l’impact de la congélation des substituts cutanés à -20°C pendant 2 mois via leurs propriétés physico-chimiques et leur fonctionnalité. Les analyses d’ATR-FTIR montrent que la cryopréservation n’affecte pas l’organisation des lipides de la couche cornée tandis que les analyses d’absorption percutanée montrent que la congélation affecte la perméabilité des substituts cutanés. De plus, le modèle de peau a été optimisé par l’incorporation de lymphocytes T permettant ainsi d’étudier le rôle des lymphocytes sur la différenciation cellulaire des kératinocytes et de mieux comprendre le rôle de la fractalkine dans le développement du psoriasis. Ces résultats nous incitent à penser que la fractalkine se démarque des autres cytokines inflammatoires dans le développement du psoriasis et se doit d’être mieux connue.
Abstract
The current challenge for researchers is to develop new models for more advanced skin substitutes and optimize their production methods to improve reproducibility. This study evaluates the impact of the freezing of skin substitutes at -20°C for 2 months via their physicochemical properties and functionality. The ATR-FTIR analysis show that the cryopreservation did not affect the lipid organization of the stratum corneum while percutaneous absorption analysis show that the freezing of the permeability affects skin substitutes. In addition, the skin model was optimized by incorporating T lymphocytes and to study the role of lymphocytes in cell differentiation of keratinocytes and better understand the role of fractalkine in the development of psoriasis. These results lead us to believe that fractalkine differs from other inflammatory cytokines in the development of psoriasis and should be investigated.
Tables des Matières
R ésum é...iii
A b stract... v
Tables des M atières...vii
Liste des tab leau x ... xi
Liste des figures...xiii
Liste des abréviations...xv
R em erciem ents... xvii
Chapitre 1 : Introduction générale... 1
Concepts théoriques et problématiques de recherche...1
1.1 La peau ... 2
1.1.1 Hypoderme... 2
1.1.2 Derme...2
1.1.3 Épiderme...2
1.1.3.1 Différenciation épiderm ique... 3
1.1.3.2 La couche cornée ou le stratum corneum ...4
1.1.3.3 La perméabilité de la p eau ... 5
1.1.4 Rôle de la peau dans la réponse immunitaire... 7
1.1.5 Le rôle des kératinocytes dans la réponse immunitaire... 8
1.2 Génie tissu la ire...9
1.2.1 Les modèles de substituts cutanés... 10
1.2.2 La conservation des modèles de peaux reconstruits... 13
1.3 Psoriasis... 15
1.3.1 Généralités... 15
1.3.2 Facteurs génétiques et environnementaux... 16
1.3.3 Composante cutanée... 16
1.3.4 Composante immunitaire... 18
1.3.5 Les cytokines et leurs interactions avec les récepteurs en condition pathologique ... 23
1.3.6 La fractalkine, cytokine clé du psoriasis... 25
1.3.7 Traitements...29
1.3.8 Les modèles in vivo du psoriasis...31
1.3.9 Modèle de peau psoriasique reconstruit par génie tissulaire... 32
1.3.9.1 Les modèles psoriasiques en m onocouche...32
1.3.9.2 Les modèles psoriasiques tridim ensionnels...32
1.4 Problém atique...34
1.5 Hypothèses et objectifs... 35
1.5.1 Hypothèses... 35
C hapitre 2 ...37
ATR-FTIR and drug permeation studies o f cryopreserved human tissue-engineered skin substitutes fo r pharmaceutical studies perspective... 37
2.1 Avant-propos... 38
2.2 Résumé...41
2.3 Abstract...42
2.4 Introduction...43
2.5 Material and methods... 46
2.5.1 Patients...46
2.5.2 Cell culture media... 46
2.5.3 Cell culture...46
2.5.4 Production of tissue-engineered substitutes... 47
2.5.5 Freezing of skin substitutes...47
2.5.6 ATR-FTIR experiments... 47
2.5.7 Percutaneous absorption... 48
2.5.8 Statistical analysis... 48
2.6 Results...49
2.6.1 Kinetics of percutaneous absorption for human skin...49
2.6.2 Kinetics of percutaneous absorption for tissue-engineered skin substitutes... 49
2.6.3 Permeability of normal human skin... 49
2.6.4 Permeability of tissue-engineered skin substitutes...50
2.6.5 ATR-FTIR spectroscopy of fresh and frozen normal human skin...50
2.6.6 ATR-FTIR spectroscopy of fresh and frozen skin substitutes... 50
2.7 Discussion...52 2.8 Conclusion ... 55 2.9 Legend to Figures... 56 2.10 Acknowledgements... 59 2.11 Figures... 60 2.12 References...64 C hapitre 3 ...69
Optimisation d ’un modèle de substituts cutanés psoriasiques enrichis en cellules immunitaires...69
3.1 Mise en contexte... 70
3.2 Démarche expérimentale...70
3.2.1 Extraction et culture cellulaire... 70
3.2.1.1 Patients: donneurs de cellules saines et psoriasiques... 70
3.2.1.2 Patients: donneurs de san g ... 71
3.2.1.3 Extraction des kératinocytes et culture cellu laire... 71
3.2.1.4 Extraction des fibroblastes et culture cellulaire...71
3.2.1.5 Extraction des cellules mononuclées périphériques du s a n g ... 72
3.2.2 Réalisation des co-cultures kératinocytes-lymphocytes en monocouche...73
3.2.3 Réalisation des co-cultures kératinocytes-fibroblastes-lymphocytes en monocouche... 74
3.2.5 Analyses histologiques des substituts sains enrichis en cellules immunitaires... 75
3.2.5.1 Coloration hém atoxyline-éosine... 75
3.2.5.2 Im m unofluorescence...76
3.2.6 Immunoadsorption par enzyme liée (ELISA)...76
3.2.7 Digestion des substituts... 76
3.2.8 La cytométrie en flux par fluorescence (FACS)...77
3.2.9 Analyses statistiques...77
3.3 Résultats ... 78
3.3.1 Expression de la fractalkine pour la co-culture kératinocytes et lymphocytes... 78
3.3.2 Expression de fractalkine pour la co-culture des fibroblastes, kératinocytes et lymphocytes... 81
3.3.3 Résultats macroscopiques et microscopiques des substituts cutanés sains enrichis en cellules immunitaires produits par la méthode d’auto-assemblage...83
3.3.4 Résultats de la digestion des substituts cutanés sains enrichis en cellules immunitaires et décompte cellulaire...85
Chapitre 4: Discussion et conclusion générale... 89
4.1 Discussion... 90
4.2 Conclusion... 101
Bibliographie générale... 102
Annexe I ... 109
Promising new treatments fo r psoriasis...109
5.1 Avant propos...110
5.2 Abstract ... 113
5.3 Introduction...114
5.4 A nti-T N F-a treatm ents... 116
5.5 Other anti-cytokines treatm ents... 117
5.6 Anti-T cells treatment ... 119
5.7 Small molecule inhibitors...120
5.7.1 Phosphodiesterase 4 inhibitors... 120
5.7.2 Protein kinase C inhibitors... 121
5.7.3 Mitogen-activated protein kinase inhibitors... 121
5.7.4 Janus kinase inhibitors... 121
5.7.5 Lipids... 122
5.8 Nerve growth factor in h ib ition ...122
5.9 New therapeutic approaches: natural treatm ents...122
5.10 Research perspectives... 123
5.11 Conclusion... 124
5.12 Acknowledgem ents...125
5.13 Table and Figures...126
Liste des tableaux
Tableau 1 : Principaux modèles de peau produits par génie tissulaire... 12
Tableau 2: Principales études de perméabilité réalisées sur la peau co n g elée...14
Tableau 3: Les traitements contre le psoriasis... 31
Tableau 4: Dosage de la fractalkine à partir d'une co-culture de kératinocytes et de lym phocytes... 79
Liste des figures
Figure 1 : Les différentes couches de la peau normale hum aine... 3
Figure 2: La structure de la couche cornée...5
Figure 3: Les différentes voies de pénétration de la p e a u ... 6
Figure 4: Les différents types cellulaires présents dans la peau normale hum aine...7
Figure 5: Le rôle des kératinocytes dans la réponse im m unitaire...9
Figure 6: Les caractéristiques de la peau psoriasique en comparaison à la peau normale hum ain e...18
Figure 7: La formation des lésions psoriasiques... 19
Figure 8: La synapse im m unologique...21
Figure 9: Profils de sécrétion des kératinocytes sains ou psoriasiques en présence ou non de lym phocytes... 24
Figure 10: La structure de la fractalkine...25
Figure 11: La fonction de la forme soluble et membranaire de la fractalk in e... 26
Figure 12: Les voies de signalisation activées par la fractalkine... 27
Figure 13: Le rôle de chimiotactisme de la fractalkine dans les pathologies inflam m atoires... 28
Figure 14: Extraction des kératinocytes et des fibroblastes... 72
Figure 15: Extraction des lymphocytes à partir du sang to ta l... 73
Figure 16: Production des substituts cutanés enrichis en cellules im m unitaires...75
Figure 17: Digestion des substituts cutanés par la lib érase... 77
Figure 18: Dosage de la fractalkine à partir d'une co-culture de fibroblastes, de kératinocytes et de lym phocytes... 81
Figure 19: Apparences macroscopiques des substituts sains enrichis ou non en cellules im m unitaires...83
Figure 20: Coupes histologiques colorées à l'hématoxyline é o sin e ...84
Figure 21: Localisation des lymphocytes dans les peaux reconstruites saines enrichies en cellules immunitaires 85 Figure 22: Décompte cellulaire par cytométrie en flux: mise en évidence des fibroblastes, des kératinocytes et des lym phocytes... 86
Liste des abréviations
Cellules N K Cellules tueuses naturelles Natural killer cells
CMH I Complexe majeur d ’histocompatibilité
M ajor histocompatibility complex
CPA Cellules présentatrices d ’antigènes Antigen-presenting cell
DM EM Dubelcco-vogt m odified eagle’s medium
EGF Facteur de croissance épidermique Epidermal growth factor
ELISA Dosage d ’immunoadsorption par enzyme liée
Enzyme-linked immunosorbent assay
FACS Cytométrie en flux par fluorescence
Fluorescence activated cell sorter
GM-CSF Facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de monocytes
Granulocytes-macrophage colony- stimulating factor
GPCRs Récepteurs couplés aux protéines G
G protein-coupled receptors
HBSS Solution tampon de Hank H ank’s buffered salt solution
ICAM Molécule d ’adhérence intercellulaire
Intercellular adhedsion molecule
IL Interleukine Interleukine
INF Interférons Interferons
JA K Kinases Jenus Jenus Kinase
LFA Antigène associé aux fonctions du lymphocyte
Lymphocyte function-associated antigen
LOEX Laboratoire d ’Organogénèse Expérim entale
LPS Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide
M APK M itogen activated protein kinase
NF-kB Facteur nucléaire kB Nuclear factor kB
PAMPS M otifs moléculaires répétés associés aux pathogènes
Pathogen-associated molecular pattern
Souris SCID Souris souffrant
d ’immunodéficience sévère
Severe combined immunodeficiency
STAT Signal de transduction et Signal transducer and activator of d ’activation de la transcription transcription
TACE Enzyme de conversion du T N F-a Tumor necrosis factor-a converting enzyme
TCR Récepteur des cellules T T cell receptor Th Lymphocytes T auxiliaires T helper
TLR Récepteur de type Toll Toll-like receptors
T N F-a Facteur de nécrose tumorale a Tumor necrosis factor a
VEGF Facteur de croissance de Vascular endothelial growth l ’endothélium vasculaire
Remerciements
«Ce que signifie le mot recherche? Vivre pleinement la question » Edgar Morin (directeur de recherche au CNRS).
La science a toujours pris une place importante dans ma vie. Ma grand-mère a été le fil conducteur de cette passion durant toute mon adolescence en m ’inculquant ce désir de comprendre les choses, de découvrir le fonctionnement de mécanismes basiques de la vie. C’est donc tout naturellement que mon cursus scolaire s’est orienté petit à petit vers une longue route qui me mènera, j ’en suis persuadée, à une vie de chercheur en quête constante de nouvelles découvertes. Je suis fière de ce que j ’ai accompli, mais j ’ai encore soif de nouvelles aventures, de nouveaux projets, de nouvelles rencontres, qui ne feront que renforcer mes connaissances scientifiques et sublimer mes valeurs humaines.
Je tiens tout d’abord à remercier ma directrice de recherche le Dre Roxane Pouliot pour tout ce qu’elle a fait pour moi depuis mon arrivée au Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale. Au-delà de son professionnalisme, ses qualités humaines remarquables m ’ont permis de surmonter les difficultés que peut rencontrer un étudiant en recherche. Ses encouragements m ’ont été d’un grand secours à des moments ou inévitablement le doute s’installe dans la tête d’un étudiant soucieux de mener à bien son projet.
Ensuite, je souhaiterais remercier le Dre Jessica Jean qui m ’a été d’une aide précieuse pour le lancement de mes deux projets de maitrise. Elle les a formidablement supervisés en me donnant des instructions avec simplicité et en faisant preuve d’une grande pédagogie.
Un grand merci à Sebastien Larochelle pour m ’avoir formée en cytrométrie en flux et pour l’attention qu’il a porté à mon projet axé sur l’immunologie du psoriasis.
Je remercie François-Dominique Scott pour son aide pour les statistiques.
Je tiens à adresser un remerciement tout particulier au Fonds d’Enseignement et de Recherche de la Faculté de pharmacie de l’Université Laval pour m ’avoir soutenue en m ’octroyant une
bourse pour mon projet de recherche de maitrise. La recherche, aussi complexe soit elle, exige sans cesse des appuis financiers considérables, indispensables à l’aboutissement des projets de chacun.
Je ne pourrais conclure sans remercier ma famille qui me soutient et m ’encourage à continuer malgré la difficulté.
Chapitre 1 : Introduction générale
1.1 La peau
La peau est un organe pluristratifié et est essentielle à l’être humain. Ce système tégumentaire possède divers rôles physiologiques. « Ses pouvoirs sont immenses: envelopper et protéger, se renouveler et s’adapter, informer et sentir, plaire, réagir ...» [1]. Effectivement, la peau est une barrière physique et protectrice, non spécifique contre les agressions de l’environnement mais également face aux liquides extérieurs grâce à ses propriétés de semi-perméabilité. De plus, la peau permet de maintenir la température corporelle. La peau « s’informe et travaille dans un chassé-croisé de signaux échangé avec les vaisseaux, les glandes, les nerfs ou l’immunité » [1]. De part sa composition riche en terminaisons nerveuses et par la présence de nombreux récepteurs, la peau sert d’organe de perception. En effet, la peau est reliée au système immunitaire via les cellules qu’elle contient. Sa capacité de régénération lui permet d’assurer ses fonctions malgré les agressions perpétuelles venant du monde extérieur. Chez l’adulte, la peau présente une surface d’environ 2 m2 et un poids de 5 kg. La peau est composée de trois couches pluristratifiées : l’épiderme, le derme et l’hypoderme (figure 1) [2].
1.1.1 Hypoderme
L ’hypoderme est la couche la plus interne de la peau. Cette couche est principalement constituée de tissus conjonctifs vascularisés, adipeux. L ’hypoderme est un interface entre le derme, les muscles, les tendons. L ’hypoderme sert de protection thermique et mécanique. 1.1.2 Derme
Le derme, la couche la plus épaisse de la peau, est majoritairement constitué de fibroblastes. Cependant, des lymphocytes B, des vaisseaux sanguins, des macrophages ainsi que des nerfs sont retrouvés de façon habituelle au niveau de cette couche [3].
1.1.3 Épiderme
L ’épiderme est une couche pluristratifiée et kératinisée. Cet épithélium est la couche la plus externe ou superficielle de la peau, et est principalement composée de kératinocytes. Les
différentes couches de l’épiderme sont : stratum basale, stratum spinosum, stratum
granulosum, stratum lucidum et stratum corneum [4].
Keratohyalin granules Stratum co rn e u m Epidermis H y pode r mi s Adipose < O tissue
Figure 1: Les différentes couches de la peau normale humaine
Tirée de Lacouture ME. Mechanisms of cutaneous toxicities to EGFR inhibitors. Nature reviews Cancer. 2006 0ct;6(10):803-12. PubM ed PMID: 16990857
1.1.3.1 Différenciation épidermique
La couche basale de l’épiderme est responsable du nouvellement cellulaire constant et est constituée d’une seule rangée de kératinocytes non-différenciés qui se divisent fréquemment. Les kératinocytes présents au niveau de l’assise basale vont se différencier
progressivement pour commencer leur processus de maturation et ainsi former chacune des couches de l’épiderme. Les kératinocytes vont ensuite adopter une forme polygonale et vont commencer à synthétiser des kératines. Les kératinocytes de la couche granuleuse sont caractérisés par leurs secrétions importantes de kératines et de lipides. Les kératinocytes deviennent alors matures, vont perdre leur noyau pour ensuite former la couche cornée. Finalement, les kératinocytes seront éliminés sous forme de squames. Les cellules de la couche cornée, les cornéocytes, sont des cellules mortes dépourvues d’organelles [5].
Ce processus est appelé le renouvellement épidermique et est organisé par l’expression de marqueurs de différenciation et de prolifération. Chez un individu sain, le processus de renouvellement cellulaire dure entre 28 et 50 jours.
1.1.3.2 La couche cornée ou le stratum corneum
La principale fonction de la couche cornée est de former une barrière de protection contre les agents toxiques et prévient la déshydratation [6]. Il est possible de retrouver de façon courante dans la littérature la schématisation de la couche cornée selon l’image des briques, (représentées par les cornéocytes) dans le mortier (représenté par les lipides occupant les espaces intercellulaires) [7].
Le stratum corneum est composé de divers lipides. Il est possible de retrouver dans la couche cornée des céramides, du cholestérol, et des acides gras libres en plus des sphingolipides qui s’organisent en bicouche lipidique [8].
Les lipides de la couche cornée sont assemblés afin de former une couche imperméable ce qui confère la fonction barrière du stratum corneum. La formation des lipides intercellulaires est effectuée dans l’appareil de golgi des kératinocytes. La synthèse des lipides débute dans les couches épineuse et granuleuse [9]. Les lipides sont emmagasinés dans des vacuoles, les corps lamellaires présentant une double couche lipidique [10]. Lorsque les corps lamellaires rejoignent la couche cornée, ils libèrent leur contenu par exocytose dans l’espace extracellulaire et forment un feuillet en bicouches lipidiques permettant de conférer la stabilité de la couche cornée (figure 2).
« L ’absorption percutanée ou transfert d’une substance à travers la peau depuis le milieu extérieur jusqu’au sang, peut être définie comme étant la somme de deux phénomènes : une pénétration des molécules du milieu extérieur au sein de la peau entière, suivie d’une résorption depuis le derme par la circulation sanguine ou lymphatique » [11], Il existe deux différentes voies pour la pénétration d’une molécule thérapeutique au travers de la peau.
1.1.3.3 L a p erm éab ilité de la peau
Mosaïque fluide Espace inter-cellulaire
Figure 2: La structure de la couche cornée
M odifiée de ©M arielle Robert
La voie transdermique favorise le passage des molécules au travers la couche cornée. Cette voie comprend deux autres voies : la voie intercellulaire (entre les cellules) et la voie transcellulaire (au travers des cellules). Les autres voies permettant le passage de molécules à travers la peau empruntent la voie des annexes cutanées: les follicules pileux et les glandes sudoripares [7] (figure 3).
C’est grâce à la composition et à l’organisation de la couche cornée qu’on lui attribue le rôle de barrière. Cependant, toutes les structures de la peau participent grandement au processus de perméabilité. En conséquence, tout endommagement structural entraine une modification de la fonction barrière de la couche cornée [7].
Penetration pathways
intracellular intercellular follicular
Close-up of penetration pathways through SC Formulation ~ 4000 nm v Fibroblast \ Langerhans cell
T j Dermic dendritic cell
• M elanocyte i l Desmosome - Tight junction -* Keratinosome <«fc Odland body
Figure 3: Les différentes voies de pénétration de la peau
Tirée de Bolzinger M-A. Penetration of drugs through skin, a complex rate-controlling membrane. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2012;17(3):156-65
Il a été montré que la fonction de perméabilité de la couche cornée pouvait fluctuer en fonction de différents facteurs [7]. En premier lieu, la perméabilité de la peau peut varier en fonction de la zone anatomique du corps, pour une même molécule testée. En effet, selon les différentes régions du corps, l’épaisseur de la couche cornée est différente. Ensuite, la quantité de follicules pileux et de glandes sudoripares peut également faire fluctuer la perméabilité de la peau. Auparavant, la voie empruntant les annexes cutanées était considérée comme secondaire, cependant, des études récentes ont rapporté que cette voie de pénétration semblait intéressante pour les nouvelles techniques de vectorisation des molécules dans des particules [8]. De plus, le contenu ainsi que l’organisation des lipides
sont des paramètres déterminants dans les variations de perméabilité. Finalement, la qualité de l’hydratation cutanée est un paramètre primordial dans l’absorption percutanée. Une hausse de la concentration en eau de la couche cornée provoque d’importantes modifications physico-chimiques et déclenche ainsi des changements de perméabilité [7].
1.1.4 Rôle de la peau dans la réponse immunitaire
Il a été montré que la majorité des pathogènes était détruite au contact de la peau par la sécrétion de lysozymes et d’acides gras. De plus, la peau est en lien avec la réponse immunitaire via les cellules qu’elle contient.
Terminally differentiating Stratum corneum Stratum granulosum , Epidermis Stratum spinosum Stratum basale Dermis Macrophage
Figure 4: Les différents types cellulaires présents dans la peau normale humaine
Tirée de Nestle FO, Di M eglio P, Qin JZ, N ickoloff BJ. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews Immunology. 2009 0ct;9(10):679-91. PubM ed PMID: 19763149. Pubmed Central PMCID: 2947825
La structure de la peau reflète la complexité de ses fonctions en tant que barrière protectrice. L ’épiderme contient des mélanocytes qui produisent les pigments et des cellules de Langerhans. De plus, il est possible de trouver au niveau de la couche basale et de la couche spineuse, des lymphocytes T cytotoxiques CD8+. Le derme contient également des cellules dendritiques, des lymphocytes T auxiliaires CD4 + (TH1), TH2, TH17 [5] (figure 4). Une étude a rapporté que le nombre de lymphocytes T présents au niveau de la peau normale humaine était de 1 million /cm 2 [12].
1.1.5 Le rôle des kératinocytes dans la réponse immunitaire
Les kératinocytes ont le pouvoir de distinguer les organismes commensaux inoffensifs des pathogènes. Ce processus est possible grâce à différents récepteurs comme les motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) incluant les lipopolysaccharides (LPS), le peptigoglycane ou la flagelline [13].
Les récepteurs de type Toll (TLR) constituent une famille de récepteurs qui est exprimée à la surface de divers types cellulaires, mais plus particulièrement sur les cellules qui opèrent dans l’immunité innée [14]. Actuellement, une dizaine de récepteurs TLR ont été caractérisés chez l’espèce humaine. Ces récepteurs ont le pouvoir de reconnaitre les PAMPSs, comme par exemple le LPS ou l’ADN viral ou bactérien. Les récepteurs TLR sont retrouvés à la surface des kératinocytes. Cette caractéristique permet d’attribuer aux kératinocytes un rôle très important dans le processus de réponse immunitaire. La fixation d’un agoniste au niveau du récepteur TLR va entrainer l’activation de différentes voies de signalisation. Par la suite cette activation va provoquer la production de cytokines inflammatoires diverses et variées (figure 5). Les récepteurs TLR ainsi que les voies de signalisation qu’ils activent sont impliquées dans le développement de plusieurs maladies comme les pathologies immunes et les cancers ; la production de médiateurs de l’inflammation comme par exemple le facteur de nécrose tumoral a (TNF-a), et d’interleukine 6 (IL-6) est la conséquence de l’activation des récepteurs TLR.
Il a été montré que l’activation de ces récepteurs conduisait à la production d’interféron de type 1 [15]. En conséquence, les récepteurs TLR sont des cibles très judicieuses pour de
nombreuses pathologies. En effet, il a déjà été rapporté que lorsque les récepteurs TLR 7 et TLR 9 étaient mal régulés, cela entrainait une mauvaise régulation de la réponse immunitaire et finalement ceci pouvait aboutir au développement de pathologies telles que le psoriasis [16] .
Figure 5: Le rôle des kératinocytes dans la réponse immunitaire
Tirée de Nestle FO, Di M eglio P, Qin JZ, Nickoloff BJ. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews Immunology. 2009 0ct;9(10):679-91. PubM ed PMID: 19763149. Pubmed Central PMCID: 2947825
1.2 Génie tissulaire
Depuis les 20 dernières années, le génie tissulaire a beaucoup progressé et fait partie intégrante du secteur pharmaceutique et cosmétique. Effectivement, les règles associées à l’expérimentation sont devenues de plus en plus restrictives alors la recherche a dû développer et mettre au point des moyens de substitution : les substituts cutanés. Ces
moyens de substitution sont constamment en cours de développement, d’une part pour le traitement des grands brulés et des plaies chroniques et d’autre part, pour la recherche fondamentale dans le secteur du médicament et des cosmétiques [17].
1.2.1 Les modèles de substituts cutanés
Pendant longtemps, le secteur pharmaceutique et cosmétique a utilisé des cultures de lignées cellulaires en monocouche pour effectuer les nombreuses études cliniques comme par exemple les tests d’efficacité ou de toxicité. En effet, l’utilisation des modèles en monocouche a permis l’amélioration des connaissances ainsi que la réalisation de nombreux progrès au niveau de l’ingénierie tissulaire. À cet effet, les cultures en monocouche de kératinocytes sont toujours très utilisées pour le traitement des grands brûlés [17]. Cependant, l’utilisation des modèles en monocouche en recherche fondamentale est limitée et non envisageable pour des études d’interactions cellulaires. En quête de disposer de modèles mimant au mieux les conditions in vivo de la peau
normale humaine, l’ingénierie tissulaire a développé de nombreux modèles
tridimensionnels beaucoup plus représentatifs de la complexité de la peau et pus prédictifs, et informatifs que les modèles en monocouche. Il existe actuellement plusieurs types de modèles tridimensionnels. Effectivement la recherche dispose tout d’abord de modèles de culture tridimensionnels unicellulaires représentant soit un derme soit un épiderme. De plus, il existe également des modèles pluricellulaires capables de représenter simultanément en 3D un derme et un épiderme (peaux reconstruites) [18]. La principale différence entre les modèles actuellement disponibles est la composition du derme. Effectivement, certains contiennent une membrane artificielle, un gel de collagène [19], une éponge biodégradable [20] ou un filet de nylon [21].
D ’après une revue de la littérature effectuée par François A. Auger, trois approches sont envisageables pour la production de peaux reconstruites [22]:
• L ’approche utilisant le gel de collagène consiste en l’ensemencement de fibroblastes dermiques allogéniques au sein d’une solution de collagène bovin de type I [23]. Par la suite, les kératinocytes sont ensemencés sur le derme. Ce modèle de peau reconstruite est disponible sur le marché sous le nom commercial d’Apligraf TM.
• L ’approche utilisant un échafaudage naturel ou produit à partir de biomatériaux est la méthode la plus utilisée pour la production de peaux reconstruites par génie tissulaire [22]. Alloderm est une matrice de collagène acellulaire de provenance humaine. En effet, elle est obtenue à partir de la peau de cadavre fraiche qui est par la suite séparée de la couche épidermique. Par un procédé de lyophilisation, la matrice est rendue immunologiquement inerte, cependant la membrane basale est conservée. Le modèle Integra est produit grâce à une composante dermique : du collagène et des glycosaminoglycans associés à une composante épidermique : un feuillet de silicone.
• La dernière approche est la méthode d ’auto-assemblage. Cette méthode a été développée par le laboratoire d’Organogénèse Expérimentale et permet de produire un substitut cutané autologue sans aucun apport exogène. La méthode d’auto-assemblage permet la production d’un modèle de substituts cutanés présentant un derme et un épiderme reconstruits à partir des cellules d’un même patient. Plus précisément, cette méthode est basée sur la capacité des fibroblastes à produire leur propre matrice extracellulaire grâce à l’acide ascorbique incorporé dans le milieu de culture. Cette méthode de production est l’approche utilisée pour la réalisation de mon projet de recherche de maitrise et est décrite en détail dans la partie démarche expérimentale du chapitre 2 et 3.
Les explications ci-dessous ne constituent pas une liste complète et exhaustive de tous les modèles de peaux reconstruits pas génie tissulaire mais seulement les plus utilisés en clinique (tableau 1).
T ableau 1: P rin cip au x m o d èles de p eau p ro d u its p a r g énie tissu laire
Nom du substitut Compagnie Matériau utilisé pour l’épiderme
Matériau utilisé pour le derme Epicel Genzyme tissue repair Kératinocytes
autologues
Absence de derme
Alloderm Life cell Absence
d’épiderme
Matrice de collagène humaine
acellulaire Integra Integra life sciences Silicone Collagène bovin et
glycosaminoglycans Fibroblastes Dermagraft Advanced tissue
science Absence d’épiderme dermiques, matrice extracellulaire et polyglactine
Apligraf Organogenesis Kératinocytes
néonataux
Fibroblastes dermiques et collagène bovin de
type I
M odifié de Ahlstrom LA, Cross SE, M ills PC. The effects of freezing skin on transdermal drug penetration kinetics. Journal o f veterinary pharmacology and therapeutics. 2007 Oct;30(5):456-63. PubM ed PMID:
17803739
C’est en partie grâce à ces nombreuses avancées que l’industrie peut aujourd’hui développer des nouvelles molécules thérapeutiques et principes actifs cosmétiques de plus en plus efficaces, spécifiques et moins nocifs pour l’organisme tout en étant une alternative aux animaux. C’est ainsi que ces modèles deviennent de plus en plus indispensables et par conséquent, leur utilisation représente des enjeux économiques importants [17].
Dans cette optique, Coletica a mis au point en collaboration avec le laboratoire des substituts cutanés de l’hôpital Édouard Herriot, en France, différents modèles de peaux reconstruites. Entre autres, ils ont développé un modèle de substituts cutanés présentant un
équivalent dermique constitué d’une matrice à base de collagène (Duplidisc®) ou de collagène - glycosaminoglycanes-chistosane (Mimedisc®) sur laquelle des fibroblastes humains sains ont été ensemencés (Mimederm®). Ensuite, afin d’obtenir un épiderme pluristratifié, des kératinocytes humains sains sont ensemencés sur l’équivalent dermique et ce modèle est commercialisé sous le nom de Mimeskin® [18]. Même si les modèles de substituts cutanés actuels affichent un fort potentiel pour l’évolution de la thérapeutique, de nombreux perfectionnements sont encore à apporter.
En effet, selon l’approche utilisée la production des substituts cutanés en laboratoire peut prendre une certaine période de temps non négligeable. Il est ainsi très utile de pouvoir disposer en tout temps de substituts cutanés sans aucun délai de production. À cet effet la création d’une banque de substituts congelés est très utile que ce soit pour des applications cliniques ou pour des études pharmacologiques ou cosmétiques. Ainsi, les substituts peuvent être transportés à l’état congelé pour ensuite être immédiatement utilisés ou conservés jusqu’à leur utilisation clinique de façon semblable au système de banque de peau de cadavre [24].
1.2.2 La conservation des modèles de peaux reconstruits
Il est possible de retrouver dans la littérature des études impliquant la conservation de plusieurs types de tissus par le froid. D ’ailleurs, déjà en 1975 l’impact de la cryopréservation sur la peau normale humaine était étudié. En effet, il a été rapporté que la congélation pendant trois mois n’a pas affecté la perméabilité des échantillons de peau normale humaine congelée comparativement à la peau normale humaine non congelée [25]. De plus, d’autres études plus récentes ont montré que la congélation à - 20C° n’entrainait pas de différences histologiques entre la peau de chien fraiche et congelée [26]. Différentes études cliniques à visée thérapeutique impliquant des substituts de peau ont montré des résultats positifs [27]. En effet, les épidermes reconstruits congelés étaient aussi efficaces que les épidermes frais pour la réparation de plaies dues à des ulcères chroniques [28]. Afin de prendre connaissance des principales études se rapportant à la congélation de la peau humaine, il est possible de se référer au tableau 2 qui rapporte les principales études de perméabilité effectuées sur la peau normale humaine fraiche et congelée.
T ableau 2: P rin c ip a le s études de p erm éab ilité réalisées sur la p eau congelée
Experimental variables
A uthors Species Pen etran t tested Freezer tem perature (°C) D uration of freezing Effect of freezing
Burch a n d W insor (1 9 44 ) H um an Astley a n d Levine (1976) Sw arbrick et al. (19 8 2 ) H arrison et al. (1984) H um an H um an
Hawkins and Reifenrath (1984) Pig
W ater
MW: 18 log P: - 1 .3 8
W ater
Chrom one acid (FPL 5 7 7 8 7 )
MW: 302 log P: 4 .4 0
W ater
N .S-diethyl-m -toluam ide
MW: 191 log P: 1.96 Not reported. -20 - 1 7 B ronaugh et al. (1986) Kemppainen et al. (1986) Hadzija et al. (1992) Yazdanian (1994) Hum an W ater
Hum an and m onkey T-2 toxin
MW: 467 log P: 2.25 Rat Salicylic acid
MW: 138 log P: 2.06 Cattle H ydrocortisone MW: 362.5 log P: 1.43 Water MW: 18 log P: -1.38 W ester et al. (1998) Babu et al. (2003) Hum an Rat NA Melatonin MW: 232 log P: 0 .96 Nimesulide MW: 308 log P: 3.79 -20 - 6 0 - 2 0 and - 7 0 -22 -22
Y'arying time points < 2 7 days.
0. 1, 3 a n d 6 m onths. None.
Not reported (one tim e point only). 2- to 3-fold T in penetration (in 2 of 3 skin donors)
Varying tim e points betw een 50 an d 4 6 6 days
0. 1, 2, 4 and 6 weeks
2, 5 and 12 m onths < 1 0 days (one time point only)
0, 3, 6 and 9 weeks
0, 2 weeks. 6 weeks and 6 m onths
>24 h (one time point only) Varying time points between
14 and 180 days.
None.
1 week: no significant t in penetration. 2 weeks: 2 -fold t in penetration. 4 weeks: 2 -fold t in penetration. 6 weeks: 2.86-fold t in penetration None
Hum an: 2.4-fold T in flux. Monkey: 2.7-fold T in flux
3 weeks: 2 -fold t in flux 6 weeks: 2.5-fold T in flux 9 weeks: 3-fold t in flux.
Hydrocortisone 2 weeks: 2.4-fold T in Jkp. 6 weeks: 4.4-fold T in kv. 6 m onths: 7.9-fold T in kp. W ater 2 weeks: 1.7-fold T in kp. 4 weeks: 1.6-fold T in kp. 2 m onths: 1.5-fold T in kp. 6 m onths: 2.0-fold T in kp.
Reduced skin viability Melatonin
14 an d 30 days: no significant t in flux.
6 0 days: 1.5-fold t in flux. 1 2 0 days: 2 .3 -fold t in flux. 1 8 0 days: 5.0-fold t in flux.
Nimesulide
2 & 4 days: no significant t in flux. 7 days: 1.5-fold T in flux.
14 days: 1.5-fold t in flux. 3 0 days: 1.4-fold t in flux. 6 0 days: 1.8-fold t in flux. 1 8 0 days: 2 .5 -fold t in flux.
Tiré de Ahlstrom LA, Cross SE, M ills PC. The effects o f freezing skin on transdermal drug penetration kinetics. Journal o f veterinary pharmacology and therapeutics. 2007 Oct;30(5):456-63. PubM ed PMID:
17803739
De plus, la littérature rapporte de nombreuses études permettant d’évaluer l’impact de la congélation sur les modèles de substituts cutanés. En effet, certains groupes utilisent des tests de viabilité ou de secrétions cellulaires [24]. D ’autres utilisent des techniques plus développées et plus perfectionnées permettant de mesurer la taille des cristaux de glace formés à l’intérieur des cellules [29]. Cependant, à notre connaissance, la littérature ne rapporte pas d’étude évaluant l’impact de la conservation par le froid sur les propriétés physico-chimiques des substituts. Plus précisément, la littérature ne mentionne pas d’études
de perméabilité ou de résultats d’études concernant l’évaluation de l’organisation des lipides de la couche cornée des substituts congelés.
1.3 Psoriasis
1.3.1 Généralités
Le psoriasis est une dermatose non contagieuse qui touche environ 2 à 5% de la population mondiale [30]. Les atteintes macroscopiques du psoriasis se présentent sous forme de plaques rouges arrondies érythémato-squameuses, bien délimitées, souvent symétriques. Bien que le psoriasis soit considéré comme une maladie de la peau, son impact sur les personnes atteintes est très important. Effectivement le psoriasis est perçu comme une maladie de peau problématique dans la vie quotidienne des patients [31]. Il s'agit d'une maladie pouvant être douloureuse et pouvant avoir de nombreuses répercussions sur la vie professionnelle et sociale des patients. La littérature met en évidence que les retombées du psoriasis sur les fonctions physiques et psychologiques des patients sont comparables à celles du cancer, des maladies cardiaques, du diabète ou de la dépression [32].
Actuellement, aucun traitement antipsoriasique n’est capable de traiter de façon définitive la pathologie, mais seulement d’en soulager les symptômes. Par conséquent, il est donc très important que la recherche continue d’innover et de mettre au point d’autres traitements pour contrer cette pathologie.
Suivant l’aspect des plaques psoriasiques, la pathologie peut être classée en différentes catégories : on retrouve le psoriasis en plaques, en gouttes, pustuleux, érythrodermique et inversé [33]. Le pourcentage du corps touché par les plaques psoriasiques permet de distinguer différents degrés de sévérité de la maladie. Effectivement, on peut observer le psoriasis bénin (< 2%), le psoriasis modéré (2 à 10 %) et sévère (> 10%) [34]. Le traitement antipsoriasique est choisi en fonction du type de psoriasis ainsi que du degré de sévérité de la pathologie.
L ’origine exacte de la maladie reste encore inconnue, cependant les différentes recherches permettent de présenter cette maladie comme une pathologie à composante auto-immune
résultant d’interactions entre la peau, le système immunitaire, les prédispositions génétiques ainsi que les facteurs environnementaux.
1.3.2 Facteurs génétiques et environnementaux
Le psoriasis est une pathologie multifactorielle. En effet, cette maladie est liée d’une part à une prédisposition génétique et d’autre part à des facteurs environnementaux. Des études ont montré que le locus PSORS1 était un déterminant majeur dans le développement du psoriasis. Ce locus est situé sur le chromosome 6p et est associé au complexe majeur d’histocompatibilité de classe 1 (CMH 1) et à l’allèle HLA-Cw6 [35]. De plus, il est intéressant de noter que PSORS1 est localisé à coté du gène de la cornéodesmosyne, une protéine importante pour la desquamation, tout comme PSORS4, lié à des gènes intervenant dans la différenciation des kératinocytes [36]. Cependant les facteurs génétiques ne sont pas suffisants à eux seuls pour expliquer l’apparition du psoriasis, mais peuvent néanmoins favoriser son apparition [37].
Diverses conditions environnementales sont connues pour contribuer au développement du psoriasis. Effectivement, la littérature rapporte que la protéine M du Streptococcus pyogenes pourrait jouer le rôle de peptide antigénique provoquant l’activation des lymphocytes T chez les individus ayant des prédispositions génétiques, par exemple : être porteur de l’allèle HLA-CW0602 [38]. Les lymphocytes T seraient alors activés au niveau des amygdales et iraient s’infiltrer dans la peau. Les interactions exactes entre les différents types cellulaires ne sont pas encore connues, cependant ces avancées permettent de nombreuses perspectives pour cibler la pathologie de façon précoce.
1.3.3 Composante cutanée
Le psoriasis est caractérisé par l’apparition de grosses plaques rouges recouvertes de squames épaisses [39]. Chez un individu atteint de psoriasis, le renouvellement épidermique va s’effectuer en 7 à 10 jours, de façon accélérée comparativement au renouvellement épidermique chez un individu sain.
Une lésion psoriasique est caractérisée par une hyperprolifération et une différenciation incomplète des kératinocytes qui aboutit à un épaississement de l’épiderme. De façon
cohérente, dans le psoriasis il est alors possible d’observer au niveau de la couche cornée, normalement formée de kératinocytes morts, des cellules possédant encore leur noyau. Il est également connu que la fonction barrière de la couche cornée est altérée dans le psoriasis comparativement à une peau saine. Plus précisément, une peau psoriasique est plus perméable qu’une peau saine. Cette altération est causée par la mauvaise différenciation des kératinocytes, qui normalement se transforment en cornéocytes en perdant leur noyau, adhèrent entre eux, formant ainsi une barrière imperméable [37]. De plus, il y a une perte d’adhérence entre les kératinocytes ce qui provoque une altération de la membrane basilaire dans les peaux psoriasiques. La diminution de la fonction barrière de la couche cornée d’une peau psoriasique est également due à une altération de la composition des céramides. Cette caractéristique provoque une évaporation d’eau plus importante [40].
Une peau psoriasique présente une expression discontinue de la laminine [41]. Une peau psoriasique est caractérisée par d’importants changements au niveau de nombreux marqueurs de différenciation et de prolifération kératinocytaires. Effectivement, dans le psoriasis, les kératines 5 et 14 se retrouvent exprimées au niveau de toutes les couches de l’épiderme tandis qu’elle sont normalement exprimées uniquement au niveau de la membrane basale dans une peau saine [42]. De plus, des kératines associées à l’hyperprolifération , telles que les kératines 6, 16, et 17 habituellement absentes dans les peaux normales, sont retrouvées dans la peau psoriasique [43]. La littérature rapporte que l’involucrine est exprimée de façon précoce et que la filaggrine est sous-exprimée dans les peaux psoriasiques comparativement aux peaux saines [44]. Effectivement, la couche granuleuse est souvent absente dans le psoriasis ce qui explique la sous expression de la filaggrine [37]. Les peaux psoriasiques expriment une quantité importante d’elafin, normalement absente dans une peau saine. Une lésion psoriasique est également caractérisée par une dilation importante des vaisseaux due à la présence accrue des facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Une peau psoriasique présente une infiltration de polymorphonucléaires neutrophiles au niveau de la couche cornée, et une quantité élevée de lymphocytes T, de cellules dendritiques au niveau du derme (figure 6).
Figure 6: Les caractéristiques de la peau psoriasique en comparaison à la peau normale humaine
Tirée de Lowes MA, Bowcock AM, K rueger JG. Pathogenesis and therapy o f psoriasis. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):866-73. PubM ed PMID: 17314973
1.3.4 Composante immunitaire
Auparavant, le psoriasis était uniquement considéré comme une pathologie causée par une mauvaise fonction des kératinocytes. Cependant, lorsque des traitements à visée immunosuppressive se sont montrés efficaces, c’est ainsi que le système immunitaire a été défini comme étant l’acteur principal pour de développement de la pathologie. Effectivement, Wone-Smith et al. ont montré le rôle des cellules de l’immunité dans le
développement des lésions psoriasiques en utilisant une souris souffrant
d’immunodéficience sévère combinée (SCID) [45]. En effet, après avoir greffé chez la souris un morceau de peau non lésionnelle, cette équipe a pu montrer la conversion de la plaque non lésionnelle en plaque lésionnelle après avoir injecté dans le derme de la souris
des lymphocytes du même patient. Ces études ne peuvent cependant pas évincer complètement le rôle pathologique des kératinocytes dans le développement du psoriasis. À cet effet, le psoriasis peut alors être considéré comme une pathologie à composante auto immune dans laquelle les immunocytes et les kératinocytes, soit par leur activation, soit par leurs interactions, permettent le développement et le maintien des plaques psoriasiques.
Initiation phase Plaque progression Neutrophil
Figure 7: La formation des lésions psoriasiques
Tirée de Nestle FO, Di M eglio P, Qin JZ, N ickoloff BJ. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews Immunology. 2009 0ct;9(10):679-91. PubM ed PMID: 19763149. Pubmed Central PMCID: 2947825.
Plus précisément, le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique dans laquelle les cellules dendritiques, les lymphocytes T, les macrophages, les polymorphonucléaires neutrophiles ainsi que les kératinocytes sont responsables de l’initiation des lésions cutanées [46] (figure 7).
L ’immunité acquise est capable de détruire de façon sélective, les antigènes étrangers en reconnaissant le soi du non-soi. Le lymphocyte T doit être capable d’interagir avec les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) du soi sans être auto-réactif permettant ainsi à l’organisme de lutter contre les maladies auto-immunes.
Afin de produire l’expansion clonale des lymphocytes T CD4+ et CD8+, il est indispensable que ces derniers forment la synapse immunologique avec les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) (figure 8). Ceci conduit à la formation de différents signaux d’activation et à la production de molécules membranaires permettant l’activation des lymphocytes T naïfs en sous populations effectrices.
L ’antigène associé aux fonctions du lymphocyte 3 (LFA-3) est exprimé sur les cellules présentatrices d’antigènes, et, lors de la formation de la synapse immunologique, va se lier à une molécule de CD2, exprimée sur les lymphocytes T matures et sur les cellules tueuses (NK). La liaison de la molécule LFA-3 avec la molécule de CD2 va engendrer des signaux de co-stimulation importants dans le processus d’activation du lymphocyte T naïf en cellules effectrices [47].
L ’antigène associé aux fonctions du lymphocyte 1 (LFA-1) est exprimé sur les lymphocytes T et fait partie de la famille des intégrines P2 ayant des fonctions dans l’adhésion des molécules. La molécule LFA-1 est un hétérodimère composé de deux sous unités CD18 qui est la chaine P commune à toutes les intégrines P2, et le CD11a. Les ligands de la molécule LFA-1 sont les molécules d’adhérence intercellulaire 1 (ICAM-1), 2 (ICAM-2), 3 (ICAM-3) ; les molécules ICAMs sont exprimées sur les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules endothéliales, les kératinocytes et les fibroblastes. La liaison entre la molécule LFA-1 et ICAM est importante pour l’activation des cellules T ainsi que pour l’adhésion des cellules T avec les kératinocytes et les cellules endothéliales. Des études in vitro ont permis de montrer qu’un blocage de la liaison LFA-1 et ICAM par un anticorps monoclonal directement dirigé contre la molécule LFA-1 prévenait les cascades de transduction de signal et ainsi provoquait la perte de fonction des leucocytes [48, 49].
Figure 8: La synapse immunologique
Tirée de Vicente-Manzanares M, Sanchez-Madrid F. Role o f the cytoskeleton during leukocyte responses. Nature reviews Immunology. 2004 Feb;4(2): 110-22. PubM ed PMID: 15040584
Dans des conditions psoriasiques, sous l’influence de conditions environnementales variées, les kératinocytes vont se retrouver en condition de stress et vont alors secréter des molécules qui vont forcer les cellules dendritiques à s’activer. Ce phénomène engendre alors une augmentation excessive de l’activation de lymphocytes T naïfs en sous population de lymphocytes T actifs; la présentation de l’antigène et la formation de la synapse immunologique excessive vont engendrer la sécrétion de différentes cytokines / chimiokines et permettre ainsi la différenciation des lymphocytes T en cellules effectrices soit les TH1, TH2, TH17 [50]. Par la suite chaque cellule effectrice va secréter des cytokines particulières. Les TH1 et les TH17 sont attirés à partir du sang par certaines chimiokines produites par les kératinocytes (CCL20, CXCL19 CXCL10 et CXCL11). Ce processus va ensuite conduire à la formation des plaques psoriasiques [5] (figure 7).
De plus, comme le montre le schéma, la population de TH17 va secréter l’ IL-17 A, l’IL-17 F et de l’IL-22. Cette sécrétion va stimuler l’hyperprolifération des kératinocytes. En réponse à cette stimulation, les kératinocytes vont secréter des molécules inflammatoires comme CXCL1, CXCL3, CXCL5 et CXCL8 permettant le recrutement des
polymorphonucléaires neutrophiles. De plus, au niveau de la jonction dermo-épidermique, les lymphocytes CD8+ exprimant la molécule « very late activation » (VLA1), lient le collagène IV permettant ainsi leur pénétration à l’intérieur du derme [5].
D ’une façon générale, le psoriasis résulte d’un cercle vicieux composé d’interactions constantes entre les cellules de l’immunité et les kératinocytes médié par un ensemble de molécules inflammatoires.
Il a été montré d’une part que l’interféron-a (INF-a), le TNF-a, ainsi que l’IL-2 augmentaient la prolifération des kératinocytes [51] et d’autre part que l’INF-a augmentait la production d’une protéine inhibitrice de l’apoptose des kératinocytes [52]. Le TNF-a active le développement des lésions grâce à son pouvoir régulateur sur des molécules intervenant dans la réponse inflammatoire ou sur des molécules d’adhérence. De plus, il semble que l’IL-2 soit un important stimulateur des lymphocytes T sans toutefois avoir la capacité d’altérer la production de cytokines ou chimiokines des kératinocytes sains ou psoriasiques [53]. Les kératinocytes activés produiraient ensuite des cytokines et des chimiokines qui favoriseraient le recrutement des lymphocytes au site d’inflammation ainsi qu’une dérégulation de leur propre prolifération. En effet, les sous populations TH1 et TH17 ont été retrouvées au niveau des peaux psoriasiques lésionnelles [54]. L ’importante production de facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) par les kératinocytes psoriasiques (en comparaison à une population saine) favorise l’angiogenèse entrainant une vascularisation et une inflammation accrues. Les polynucléaires neutrophiles sont également retrouvés en grande quantité dans les lésions psoriasiques.
Par ailleurs, il est important de noter que le nombre de molécules d’adhésion ICAM est élevé chez les cellules présentes au niveau des peaux psoriasiques. Les molécules d’adhésion interviennent dans le recrutement et dans l’activation des lymphocytes T. Les lésions psoriasiques expriment en majorité des lymphocytes T mémoires (CD45RO+) [55]. De plus, il a été montré que le sérum de patients atteints de psoriasis contenait un niveau élevé de TNF-a. La fixation du TNF-a au niveau des récepteurs engendre une cascade de transduction du signal. Ce processus va ensuite permettre d’activer le facteur nucléaire kB
(NF-kB). Le facteur NF-kB1 est connu pour son rôle dans l’initiation de l’inflammation.
En effet, NF-kB1 est un facteur de transcription qui induit la prolifération et la survie
cellulaire ainsi que la production de cytokines inflammatoires. L ’activation de ce facteur de transcription permet également d’inhiber l’apoptose. Le TNF-a va stimuler la production de cytokines et de molécules d’adhésion par les kératinocytes qui vont augmenter le recrutement des cellules immunitaires et augmenter le processus inflammatoire au niveau des plaques psoriasiques [56]. En conséquence, le TNF-a est une cytokine centrale dans le développement inflammatoire du psoriasis.
Il est connu dans la littérature que les lymphocytes TH17 sont des cellules importantes dans le développement du psoriasis. De plus, l’IL-23 stimule la survie et la prolifération de ces cellules immunitaires. Chez un individu atteint de psoriasis, la production d’IL-23 est augmentée par les cellules dendritiques et les macrophages.
1.3.5 Les cytokines et leurs interactions avec les récepteurs en condition pathologique Les cytokines appartiennent à la famille des protéines et interviennent de façon générale, dans les processus immunologiques et inflammatoires. Les cytokines sont produites au niveau du site d’inflammation et contrôlent l’activation et le chimiotactisme des monocytes, des lymphocytes, des NK, des polymorphonucléaires basophiles, éosinophiles, et neutrophiles [57]. Comme cela a été décrit précédemment, le réseau de cytokines occupe la place centrale du développement et du maintien du psoriasis.
Récemment, notre équipe a analysé en culture 2-D in vitro les interactions entre des lymphocytes T et des kératinocytes psoriasiques. Cette étude a permis de montrer que les kératinocytes psoriasiques augmentaient la survie des lymphocytes T comparativement aux kératinocytes normaux [58]. Suite à cette étude, notre équipe s’est également penchée sur une analyse fonctionnelle de l’interaction entre les kératinocytes et les lymphocytes T. Cette étude a montré que les profils de sécrétion des cytokines et des chimiokines étaient différents selon la présence de kératinocytes sains ou psoriasiques en association avec les lymphocytes T [53].
En effet, l’association des lymphocytes T et des kératinocytes sains ne montre pas de changement au niveau de la production de cytokines. Cependant, lorsque les kératinocytes
psoriasiques sont en présence de lymphocytes T (en comparaison avec les kératinocytes psoriasiques seuls) les productions de TNF-a, d’IL-6 et de facteurs de stimulation des colonies de granulocytes et de monocytes (GM-CSF) sont augmentées par rapport aux kératinocytes sains en présence de lymphocytes T. Cette étude a également montré l’impact de la présence de l’IL-2 : les kératinocytes psoriasiques cultivés en présence de lymphocytes T, activés par l’IL-2, produisent plus de TNF-a, IL-6 et GM-CSF que lorsque les kératinocytes psoriasiques sont cultivés seuls (figure 9).
b p ■ 0.006 400 300 T 200 r 100 0 — 500 4 0 0 • Ë 3 0 0 ■ O ) p = 0.0453 T 2 0 0 ' B l z i o o • = =
□ 1
" 0 . p < 0.0001 = [ = 3 CD C + T C + T HK PK 2000 1500 1000 500 0 ♦ T HK+IL-2 PK+IL-2 p = 0.0447 p - 0.0167 X e 3500 ^ 3000 o> 2500 •S 2000 c/> 1500^
1000 O 500 0 HK PK HK+IL-2 PK+IL-2 f 3500 p < 0.0001 I o> 3000 2500 -a. 2000-p = 0.0243 CO 1500 • □Q
I
— i i i V 2 O 1000 ■ 500 ■ 0 ■ p < 0.0001 □a
HK PK HK+IL-2 PK+IL-2Figure 9: Profils de sécrétion des kératinocytes sains ou psoriasiques en présence ou non de lymphocytes
Tirée de M artin G, Guérard S, Fortin MM, Rusu D, Soucy J, Poubelle PE, et al. Pathological crosstalk in vitro between T lymphocytes and lesional keratinocytes in psoriasis: necessity o f direct cell-to-cell contact. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2012 Jul;92(7):1058-70. PubMed PMID: 22525430
1.3.6 La fractalkine, cytokine clé du psoriasis
La fractalkine est une cytokine encore peu connue dans les mécanismes pathologiques du psoriasis. La fractalkine existe sous deux formes : membranaire et soluble. La présentation à la surface membranaire de cette cytokine s’effectue par la tige mucine. De plus, la fractalkine présente un site de clivage protéolytique extracellulaire permettant à la cytokine d’être relarguée sous forme soluble [59] (figure 10).
Figure 10: La structure de la fractalkine
Tirée de Jones B. Fractalkine /CX3CL1: A potential new target for inflammatory diseases. (Viewpoint ) Frontlines o f research. 2010:263.
La fractalkine est produite dans divers endroits de l’organisme tels le cœur, les reins, le cerveau ou la peau. Au niveau de la peau cette cytokine est produite par différents types cellulaires tels les cellules endothéliales, les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les kératinocytes [60]. L ’expression de son récepteur spécifique est retrouvée au niveau de plusieurs organes tels le cœur et les poumons, cependant ce dernier est exprimé de manière très élevée au niveau des cellules immunitaires et plus précisément au niveau des polymorphonucléaires neutophiles, des cellules NK, des monocytes et des lymphocytes CD4 + et CD8+ [61]. De plus, le récepteur de la fractalkine est également retrouvé au niveau des cellules épithéliales et endothéliales.
La régulation de la fractalkine peut s’effectuer par le clivage enzymatique de la forme membranaire. Une étude a montré l’intervention de deux enzymes, la Tumor necrosis factor-a converting enzyme (TACE) et la métalloprotéase [62] (figures 10 et 11). La régulation de la synthèse de la fractalkine peut s’effectuer via un environnement impliquant la présence de certaines cytokines. En effet, la littérature rapporte que sa synthèse augmente en présence de TNF-a et d’INF-Y [63].
Metalloproteinase • ^ C X o C L I - Â Extracellular space C X -»C R 1
Gcx
P
y
G u
IW S u r v i v a l A d h e s i o n A n t i - A p o p t o s i s M i g r a t i o nI
Figure 11 : La fonction de la forme soluble et membranaire de la fractalkine
Tirée de White GE, Greaves DR. Fractalkine: one chemokine, many functions. Blood. 2009 Jan 22;113(4):767-8. PubM ed PMID: 19164504.
La fractalkine est également régulée par endocytose. Les protéines suivantes: la clathrine et la dynamine ont été identifiées comme étant responsables de ce processus, empêchant ainsi l’intervention des enzymes nécessaires à son clivage. C’est ainsi que l’équilibre de la forme membranaire et soluble de la fractalkine est maintenu. De plus, cette caractéristique particulière permet à la cellule de pouvoir emmagasiner et libérer une grande quantité de
fractalkine en condition inflammatoire; cette cytokine joue ainsi un rôle très important dans l’adhésion des cellules immunitaires [64].
N a tu re R e vie w s | Im m u n o lo g y
Figure 12: Les voies de signalisation activées par la fractalkine
Tirée de Vicente-Manzanares M, Sanchez-Madrid F. Role o f the cytoskeleton during leukocyte responses. Nature reviews Immunology. 2004 Feb;4(2): 110-22. PubM ed PMID: 15040584
Comme de nombreuses cytokines, la liaison de la fractalkine sur son récepteur entraine l’activation de plusieurs voies de signalisation et engendre alors une multitude de signaux [65]. En effet, la fractalkine soluble est capable d’activer différentes voies de signalisation qui interviennent dans le processus inflammatoire comme par exemple la voie des p38 « Mitogen activated proteins » kinase (MAPK) [66]. La forme soluble de la fractalkine exerce ses effets au travers l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). La forme soluble est également capable d’activer la voie de signalisation des kinase Janus
(JAK) et le signal de transduction et d’activation de la transcription 5 (STAT5), d’augmenter l’expression des molécules ICAM-1 permettant ainsi de favoriser son pouvoir dans l’adhésion des leucocytes [67] (figure 12). La forme membranaire de la fractalkine est responsable de la rétention des monocytes et des lymphocytes T dans les tissus [61]. La forme membranaire agit alors comme une molécule d’adhésion (figure 13). L ’action de la fractalkine et de son récepteur est connue pour être impliquée dans diverses pathologies inflammatoires. En effet, la littérature rapporte diverses études impliquant le rôle de la fractalkine dans le développement du diabète [68], dans certains cancers et dans l’athérosclérose [69]. Cependant, la littérature rapporte peu d’études impliquant la fractalkine dans le développement du psoriasis.
Figure 13: Le rôle de chimiotactisme de la fractalkine dans les pathologies inflammatoires
Tirée de Jones B. Fractalkine /CX3CL1: A potential new target for inflammatory diseases. (Viewpoint ) Frontlines o f research. 2010:263.
Il a été démontré que la fractalkine était retrouvée en grande quantité au niveau des lésions psoriasiques tandis qu’elle se retrouvait en faible quantité au niveau de la peau non lésionnelle de ces mêmes patients. De plus, la fractalkine est retrouvée en quantité
importante dans le sérum des patients atteints de psoriasis [70]. En conséquence, soit à titre de marqueur du psoriasis ou en tant que molécule potentiellement impliquée dans la chimiotaxie des leucocytes, le rôle de la fractalkine dans le psoriasis se doit d’être mieux connu.
1.3.7 Traitements
Actuellement, plusieurs traitements sont disponibles pour aider à contrôler le psoriasis. Cependant les traitements disponibles sont uniquement capables de soulager les symptômes et les conditions de vie des individus atteints de la pathologie [71]. Le choix du traitement est effectué selon l’état de santé général du patient, son âge, ses comorbidités, le type, le degré de sévérité (la taille et l’étendue des plaques) ainsi que selon les parties du corps touchées [71]. Le degré de sévérité est souvent mesuré par « Psoriasis Area and Severity Index » (PASI), un index combinant la sévérité globale du psoriasis et la surface corporelle atteinte.
Les différents traitements disponibles vont cibler les multiples caractéristiques pathologiques du psoriasis et exercer diverses activités thérapeutiques. En effet, certains vont posséder des propriétés anti-inflammatoires et vont réduire l’inflammation au niveau des lésions psoriasiques. D ’autres vont permettre de réduire la réponse immunitaire, augmentée en cas de psoriasis. De plus, certains traitements peuvent avoir un effet vasoconstricteur et vont agir au niveau de la diminution de la taille des vaisseaux et des capillaires. Finalement les traitements peuvent également agir au niveau de la prolifération cellulaire grâce à des propriétés antimitotiques qui vont réduire la prolifération des cellules, qui s’avère augmentée en cas de psoriasis.
Il existe quatre grands types de traitements qui vont agir sur les différents mécanismes pathologiques: tout d’abord, des médicaments topiques qui s'appliquent sur la peau. Ensuite, pour des cas plus sévères, il y a des médicaments qui se prennent par voie orale. Ces derniers vont avoir une action systémique. Il existe aussi des médicaments qui s'injectent dans la circulation sanguine qui vont avoir une action générale. Finalement les dermatologues peuvent proposer la technique de la photothérapie en combinaison avec d’autres traitements antipsoriasiques.
