Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biotechnologie
Licence L3 Technique biologie moléculaire Génétique Semestre 6
T.P. N°01
Matière: Génie génétique et biologie moléculaire
Intitulé : Extraction ADN Génomique
Protocole :
Principe: Extraction d’ADN génomique. Méthodologie (succincte):
Dans un mortier, broyer des feuilles fraîches dans du sable ou de l’azote liquide pour Obtenir de la poudre fine (lyse mécanique). Transférer la poudre dans un tube de 1,5 ml contenant de tampon de lyse (Extraction). Incuber. Centrifuger. Pipeter le surnageant. Ajouter sous hotte du chloroforme/octanol. Ajouter de l’isopropanol, mélanger délicatement par retournement, pour obtenir une pelote d’ADN. Laisser 15 min à température ambiante. Centrifuger. Eliminer le surnageant. Rincer avec une solution de nettoyage 1 (Lavage). Centrifuger et éliminer le surnageant. Rincer avec une solution de nettoyage 2 (Lavage). Eliminer le surnageant. Reprendre le culot avec 100 µl de TE pH 8. Laisser à température ambiante toute la nuit pour dissoudre l’ADN. Stocker l’ADN à : -20°C pour la visualisation sur gel agarose (TP2).
Produits chimiques Consommable /Verrerie Petits Matériels
CTAB EDTA SDS Tris Borate Isopropanol Chloroforme Ethanol absolue Acétate d’ammonium Acétate de sodium NaCl Béchers 500 ml ; 1000 ml Erlenmeyers 250 ml ; 500ml, 1000 ml Tubes Eppendorf (1.5 ml)
Pointes jaunes et blanches, pointes bleues Gant en nitriles Azote liquide Mortiers en céramique avec pillons Micropipettes volume variable 0-10 ; 10-100 ; 100-200 ; 500-1000 µl
T.P. N°02
Matière: Génie génétique et biologie moléculaire
Intitulé : Analyse qualitative ADN : Sizing sur gel d’agarose
Protocole :
Principe: Une fois l’ADN génomique extrait, la qualité de l’ADN extrait est visualisé après une migration sur un gel d’agarose sous une tension de 100 v.
Méthodologie (succincte):
Préparez pour un volume de 90 ml une solution de TBE à partir d’une solution mère 10X de TBE pour préparer un gel d’agarose à 0.8 %. Préparez 350 ml de TBE 1x à partir de la solution mère 10 X (tampon cuve).
Porter à ébullition la solution jusqu’à est ce que la solution devient claire, puis rajoutez un intercalant (Bromure d’éthidium dans la solution d'agarose). Coulez le gel au niveau de la cuve, précédemment préparez avec un peigne de 12 puits et le tampon cuve TBE 1 x (350 ml). Mélanger 10 μL d’extrait d’ADN avec 2μL de bleu de charge et déposez les 12 μL dans les puits du gel. Lancez la migration sous une tension de et un voltage de 100 V. Visualisez sous UV, après démoulage du gel prendre une photo.
Produits chimiques Consommable /Verrerie Petits Matériels
RNAse Agarose Glycérol Bleu de Bromophénol BET Tris Borate EDTA Béchers 500 ml ; 1000 ml Erlenmeyers 250 ml ; 500ml, 1000 ml Tubes Eppendorf (1.5 ml)
Pointes jaunes et blanches, pointes bleues Gant en nitriles Cuve électrophorèse horizontale. Table UV
T.P. N°03
Matière: Génie génétique et biologie moléculaire
Protocole :
Principe: Amplifier l’ADN extrait à l’aide d’un marqueur de type SSR.
Méthodologie (succincte): Préparer le TP10x. Répartir au niveau des différents échantillons dans un tube PCR 2 µl d’ADN, puis le mixe que vous avez préparé donnez un coup pour bien mélanger le tout bien fermer les tubes (éviter l’évaporation). Puis lancer la PCR.
Produits chimiques Consommable /Verrerie Petits Matériels
Taq polymérase dNTPs Glycérol Amorces spécifiques Tubes PCR Béchers 500 ml ; 1000 ml Erlenmeyer 250 ml ; 500ml, 1000 ml Tubes Eppendorf (1.5 ml)
Pointes jaunes et blanches, pointes bleues Gant en nitriles Agarose Thermocycleur
