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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul SabatierDiscipline ou spécialité : Physiopathologie
JURY
Dr Mohamed BENAHMED (Rapporteur) Pr Marc COLOMBEL (Rapporteur)
Pr Laurent MOREL (Rapporteur) Pr Thierry LEVADE (Examinateur) Dr Olivier CUVILLIER (Directeur de thèse) Pr Bernard MALAVAUD (Directeur de thèse)
Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologies
Unité de recherche : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - CNRS UMR 5089 Directeur(s) de Thèse : Dr Olivier CUVILLIER et Pr Bernard MALAVAUD
Rapporteurs : (s'ils ne font pas partie des membres du jury)
Présentée et soutenue par Claire MARTIN Le 20 avril 2009
Titre : Rôle de la signalisation Sphingosine kinase-1 / Sphingosine 1-Phosphate
dans les interactions stroma-cellules épithéliales au sein des métastases osseuses du cancer de la prostate
Résumé
Les stades tardifs du cancer de la prostate sont caractérisés par l’apparition de métastases notamment au niveau des os. Ces métastases incurables constituent un problème de santé publique majeur car elles détériorent grandement la qualité de la vie en causant la fragilisation osseuse et l’apparition de très violentes douleurs. Elles présentent la caractéristique d’être ostéocondensantes, conduisant localement à l’apparition de néoformations osseuses et impliquant de ce fait une importante composante ostéoblastique. Les mécanismes impliqués la formation des métastases osseuses restent mal connus.
Les messagers sphingolipidiques participent à la régulation de nombreux processus biologiques. Parmi eux, la sphingosine 1-phosphate (S1P) est impliquée lors des processus de prolifération, de survie, de différenciation, ou bien encore d’angiogenèse. La S1P possède également la caractéristique d’exercer des effets à la fois intracellulaires et extracellulaires en tant que facteur paracrine. La sphingosine kinase 1 (SphK1) est une lipide kinase oncogénique, responsable de la production de S1P à partir de la sphingosine.
Dans ce travail doctoral, nous avons étudié le rôle de la signalisation SphK1/S1P dans les interactions entre cellules ostéoblastiques et cellules tumorales prostatiques. Nous avons orienté cette étude autour de deux axes : l’identification du rôle de la SphK1 dans les effets de la modulation androgénique sur l’ostéoblaste d’une part et l’étude du rôle de la S1P comme facteur paracrine entre l’ostéoblaste et la cellule tumorale prostatique d’autre part.
Les androgènes contribuent à la physiologie osseuse, où ils participent au processus de prolifération et de différenciation des cellules ostéoblastiques. Nous avons montré dans un premier temps que les androgènes sont capables de réguler positivement l’activité SphK1 de l’ostéoblaste, cet effet transitoire est accompagné d’une activation de voie de survie PI3K/AKT, de la voie de prolifération MEK/ERK et d’effets prolifératifs tardifs. Nous montrons que cet effet précoce est non génomique mais dépendant du récepteur des androgènes (RA). Dans cette signalisation, nous mettons en évidence la place de SphK1 en aval de PI3K et en amont de MEK. Pour la première fois, nous montrons le rôle de la SphK1 dans la réponse aux androgènes de cellules non transformées.
Nous avons ensuite recherché un rôle paracrine à la S1P. Nous montrons que les milieux conditionnés ostéoblastiques possèdent des propriétés chimio- et radio-protectrices vis-à-vis des cellules tumorales prostatiques. En utilisant des stratégies de blocage de la S1P (anticorps anti-S1P, inhibition par interférence à l’ARN de la SphK1), nos résultats suggèrent que la signalisation SphK1/S1P ostéoblastique contribue aux effets observés. Les études de ce phénomène réalisées in vivo n’ont cependant pas permis de conclure aujourd’hui quant aux effets de la signalisation sphingolipidique.
Ce travail constitue la première étape de l’étude du rôle de la signalisation sphingolipidique dans la physiopathologie des métastases osseuses et pourrait, à plus long terme, permettre d’envisager de nouvelles stratégies anti-tumorales ciblant le métabolisme sphingolipidique.
Abstract
Human prostate cancer (CaP) has a high predisposition to metastasize to bone, resulting in the formation of metastases that are incurable. CaP metastasis to bone is associated with increased osteoblastic activity. The mechanisms implicated in the formation of these bone metastasis are not completely understood.
Sphingolipids are implicated in the regulation of multiple biological pathways. The sphingolipid metabolite sphingosine 1-phosphate (S1P) -the product of the oncogenic lipid kinase sphingosine kinase-1 (SphK1) - is a lipid mediator playing a major regulatory role in tumor cell growth, survival, invasion, and angiogenesis.
We studied the role of the SphK1/S1P signalisation in the interactions between osteoblasts and prostate cancer cells. We developed two projects : 1- we studied the role of SphK1 in androgen induced osteoblast proliferation and 2- we investigated the potential role of S1P, as a paracrine factor implicated osteoblast-PCa cells cross talk.
We report that the oncogenic lipid kinase sphingosine kinase-1 (SphK1) is instrumental in mediating androgen-induced cell proliferation in osteoblasts. Dihydrotestosterone (DHT) triggered cell growth in steroid-deprived MC3T3 cells, which was associated with a rapid stimulation ofSphK1 and activation of both AKT and ERK signaling pathways. This mechanism relied on functional androgen receptor/PI3K/AKT nongenotropic signaling as pharmacological antagonists could block SphK1 stimulation by DHT and its consequences. Finally, SphK1 inhibition not only abrogated DHT-induced ERK activation but also blocked cell proliferation, while ERK inhibition had no impact suggesting that SphK1 was critical for DHT signaling yet independently of the ERK. PCa cells influence bone homeostasis by secreting paracrine factors that can regulate osteoblast proliferation or differentiation. On the other hand, osteoblasts also produce factors that stimulate proliferation of PCa cells, but these bone-derived factors have not yet been identified. Our goal is to investigate the potential role of S1P, as a putative bone-derived factor that could stimulate growth or survival of CaP cells. We have found that osteoblastic cells exhibit a very high SphK1 actvity, far greater than CaP cells, wich could render osteoblasts extremely resistant to chemotherapeutics such as taxanes. Although conditioned medium from osteoblasts did not enhance cell proliferation of CaP cells, it did protect the CaP cells from the killing effects of taxanes (cell survival and clonogenic assays). The pharmacological or genetic (siRNA strategy) inhibition of SphK1 induced a major loss of osteoblasts viability. More importantly, the cytoprotective effect of osteoblasts-derived conditioned medium on CaP cells was abolished when SphK1 activity was first inhibited in osteoblastic cells. The antibody directed against S1P does not permit to confirm the role of S1P as a secreted paracrine effector. This is the first instance of a protective effect of MC3T3 conditionned medium on prostate cancer cell and of the implication of osteoblast sphingosine kinase in this effect.
Abréviations
Acy-1 Aminocyclase-1
AC Adénylate Cyclase
AMPc Adénosine Monophosphate Cyclique AP-1 Activating Protein-1
ARE Androgen Response Element
ARNm Acide Ribonucléique messager ATP Adénosine Triphosphate Bcl-xl Basal cell lymphoma extra-large
BMP Bone Morphogenic Protein
BSA Bovine Serum Albumin
C/EBP CCAAT/Enhancer Binding Protein
CAM Cell Adhesion Molecule
CaP Cancer de la Prostate CaSR Calcium Sensing Receptor Cbfa1 Core Binding Factor 1 CSF-1 Colony Stimulating Factor-1
DAG Diacyl Glycerol
DHT DihydroTestostérone DMS N,N Dimethyl Sphingosine
EDG Endothelial Differenciation Gene
EGF Epithelial Growth Factor
ER Recepteur des oestrogènes
ERK Extracellular Regulated Kinase
ET-1 Endothéline-1
FGF Fibroblast Growth Factor
HIF-1α Hypoxia Inducible Factor-1 Ig Immunoglobulines IGF-1 Insulin-like Growth Factor 1
IGFBP Insulin-like Growth Factor Binding Protein IL-1 Interleukine 1
IL-6 Interleukine 6 IP3 Inositol 1,4,5-triPhosphate
IRM Imagerie par Résonnance Magnétique
kDa kilo Dalton
KO Knock-Out
LPA Acide Lysophosphatidique
LPS Lipopoly Saccharide
MAPK Mitogen-activated Protein Kinase M-CSF Macrophage-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire
MMP Matrix Metalloproteinase
NES Séquence d'Export Nucléaire
NFATc1 facteur de transcription de la famille des "Nuclear Factor Activated T-cell"
NF-κB Nuclear Factor Kappa B
NGF Nerve Growth Factor
NLS Séquence de localisation nucléaire
NOS Nitric Oxyde Synthase
OB Ostéoblaste OC Ostéoclaste OPG Ostéoprotégérine Palc Phosphatase alcaline PGDG Platelet derived Growth Factor PI3K Phosphatidyl Inositol 3 Kinase PKC Protéine kinase C
Abréviations
PLC Phospho Lipase C PLD Phospho Lipase D
PMA Phorbol Myristate Acetate
PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride PP2A Protein Phosphatase 2A PRL Prolactine
PS Phosphatidylserine
PSA Prostate Specific Antigen
PTH Hormone parathyroïdienne
PTHrP Parathyroid-Hormone-related Peptide ou Protein
PTX Toxine Pertussique
RA Récepteur des androgènes
RANK Receptor Activator of Nuclear factor kappa B RANKL Receptor Activator of Nuclear factor kappa B ligand RCPG Récepteurs couplés aux protéines G
RPMI Roswell Park Memorial Institute S1P Sphingosine 1-phosphate SCID Severe Combined Immunodeficiency
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
siRNA small interfering Ribonucleic acid
SKI Sphingosine kiinase inhibitor
SPC Sphingosylphosphorylcholine SphK Sphingosine kinase
SPP Sphingosine Phosphate Phosphatase TGF-β Transforming Growth Factor-β
TNF-a Tumor Necrosis Factor
TPA 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate
TRAF2 TNF Receptor-Associated Factor-2 TRAP Tartrate Resistant Acid Phosphatase u-PA urokinase-type Plasminogen Activator VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
Sommaire
Introduction ... 1
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate ... 5
ENCADRE 1 : Les sphingolipides... 7
I. La sphingosine kinase : régulateur de la balance sphingosine / S1P ... 8
II. Propriétés biochimiques, structurales et localisation... 10
II.I Structure... 10
II.II Propriétés biochimiques et spécificités de substrats... 13
II.III Localisation ... 13
III. Régulation de la voie SphK1/S1P ... 14
III.I Facteurs hormonaux, paracrines, environnementaux et molécules exogènes………..14
III.II Mécanismes de régulation de la sphingosine kinase 1………..16
a. Régulation par la localisation intracellulaire ... 16
b. Régulation par la Protéine Kinase C (PKC) ... 17
c. Régulation par la Phospholipase D (PLD) ... 18
d. Régulation de la SphK1 par les interactions protéines-protéines ... 18
e. Régulation par le calcium ... 19
f. Régulation de l’expression ... 20
g. Régulation par protéolyse ... 20
h. Régulation par déphosphorylation ... 21
IV. La voie SphK1 / Sphingosine 1-Phosphate... 21
IV.I La Sphingosine 1-Phosphate : second messager intracellulaire………... ……..21
IV.II S1P, facteur de communication paracrine : ligand de récepteurs membranaires.…...…….22
a. EDG-1 (S1P1) ... 22
b. EDG-3 (S1P3) ... 23
c. EDG-5 (S1P2) ... 24
d. EDG-6 (S1P4) ... 24
e. EDG-8 (S1P5) ... 25
IV.III Importance de la signalisation SphK1/S1P en physiologie et en physiopathologie ... 27
a. Rôles physiologiques de la S1P... 27
b SphK1/S1P et physiopathologie du Cancer ... 29
Chapitre II : Physiologie osseuse... 35
ENCADRE 2 : Développement osseux ... 37
I. Généralités... 38
I.I Structure de l’os ... 38
I.II Composition de l’os... 39
I.III Développement ... 40
II. Homéostasie osseuse : Remodelage et consolidation ... 41
II.I Remodelage osseux : Quels acteurs impliqués ? Quelles régulations ? ... 41
a. Les ostéoclastes : différenciation et activité ... 42
b. Les ostéoblastes : régulateurs majeurs du remodelage osseux ... 44
Sommaire
II.II Remodelage osseux : couplage entre résorption et formation osseuse ... 51
a. Ostéoblaste / ostéoclaste : dialogue moléculaire conduisant au remodelage osseux physiologique ... 51
b. Régulation du processus de remodelage osseux ... 53
ENCADRE 3 : Les androgènes... 59
Problématique I :Quel est le rôle de la sphingosine kinase 1 dans les effets de la modulation androgénique dans l’ostéoblaste ? ... 61
Résultats I : Sphingosine kinase-1 mediates androgen-induced osteoblast cell growth ... 65
Discussion et perspectives I : Quel est le rôle de la sphingosine kinase 1 dans les effets de la modulation androgénique dans l’ostéoblaste ?... 67
Chapitre III : Métastases osseuses du cancer de la prostate ... 73
I. L’os tumoral : les métastases osseuses ... 75
II. Métastases osseuses ostéolytiques ou ostéoblastiques... 75
III. Les métastases osseuses du cancer de la prostate ... 76
III.I Détection des métastases osseuses... 76
III.II Traitements des métastases osseuses ... 77
IV. Processus métastatique : de la tumeur prostatique primaire à la métastase osseuse ... 78
IV.I Prolifération tumorale, néoangiogenèse et lymphangiogenèse ... 79
IV.II Perte d’adhésion locale... 79
IV.III Envahissement du stroma local ... 80
V. Envahissement à distance : spécificité tissulaire du développement métastatique ... 81
V.I L’os : un site privilégié pour le développement des métastases ... 81
V.II La circulation des cellules métastatiques et ciblage osseux ... 82
V.III Interaction avec l’endothélium... 83
VI. Microenvironnement et interactions paracrines au sein des métastases osseuses du cancer de la prostate ... 84
VI.I L’os permet la formation de la métastase prostatique ... 84
a. Facteurs chimiotactiques ... 84
b. Facteurs prolifératifs... 85
c. Facteurs environnementaux... 86
VI.II La cellule tumorale perturbe la physiologie osseuse ... 87
a. Effets sur le compartiment ostéoclastique ... 87
b. Facteurs pro-ostéoblastiques produits par les cellules tumorales prostatiques ... 89
VI.III Approches thérapeutiques : cibler la métastase osseuse ... 92
Problèmatique II : Quel est le rôle de la signalisation SphK1/S1P au sein des métastases osseuses du cancer de la prostate ? ... 95
Sommaire
Résultats II : La voie SphK1/S1P dans les interactions cellulaires au sein des foyers de
métastases osseuses ... 99
I. Caractérisation du comportement des lignées ... 101
I.I L’ostéoblaste possède une très forte activité sphingosine kinase... 102
I.II Chimio-sensibilités des cellules impliquées dans les foyers métastatiques... 103
II. Existe-t-il des interactions paracrines entre l’ostéoblaste et la cellule tumorale prostatique? ... 105
II.I Les cellules tumorales prostatiques favorisent la différenciation ostéoblastique ... 105
II.II La cellule tumorale soutient la croissance ostéoblastique ... 106
II.III L’ostéoblaste module la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux 107 a. Absence d’effet prolifératif... 107
b. Les milieux d’ostéoblastes protègent de l’effet des chimiothérapies... 108
c. Les milieux conditionnés d’ostéoblastes augmentent le pouvoir clonogénique des cellules prostatiques... 109
III. La signalisation SphK1/S1P est impliquée dans les effets protecteurs des ostéoblastes. 110 IV. Mise au point des outils pour l’évaluation du rôle de la voie SphK1/S1P dans les métastases osseuses chez l’animal ... 112
IV.I Implantation et suivi du développement tumoral ... 112
IV.II Résultats préliminaires : Quels effets de la surexpression de la SphK1 prostatique sur les lésions osseuses ?... 114
Discussion et perspectives II : la voie SphK1/S1P dans les interactions cellulaires au sein des foyers de métastases osseuses... 117
Conclusion ... 123
Matériels et Méthodes... 127
I. Lignées cellulaires, culture et traitements ... 129
I.II Culture cellulaire ... 130
I.III Inhibiteurs... 130
a. Inhibiteurs de la Sphk1... 130
b. Inhibiteurs de signalisations cellulaires ... 131
c. Inhibiteurs du récepteur des androgènes (RA) ... 131
I.IV Conditions expérimentales ... 131
II. Protocoles expérimentaux... 132
II.I Etude de la prolifération et de la viabilité cellulaire ... 132
a. Le test MTT ... 132
b. Test de prolifération cellulaire : numération cellulaire ... 132
c. Test de clonogénie... 133
d. Réalisation des milieux conditionnés (tests de clonogénie, chimioprotection et prolifération) ... 133
II.II Détermination de l’activité sphingosine kinase ... 133
a. Préparation des échantillons ... 133
b. Réaction enzymatique... 134
Sommaire
d. Séparation des lipides : chromatographie et détermination de l’activité SphK1... 135
II.III Analyse de l’expression protéique par western blot ... 136
II.IV Etude de la différenciation ostéoblastique : évaluation de la minéralisation par coloration au rouge d’alizarine (cocultures) ... 139
II.V Transfection cellulaire : obtention des lignées C4-2B GFP, C4-2B Néo et C4-2B Sphk1. 139 II.VI Transfection cellulaire : Inhibition de la SphK1 par stratégie d’interférence à l’ARN ... 140
II.VII Expérimentation animale... 140
a. Les animaux... 140
b. Préparation des cellules... 140
c. Anesthésie des animaux ... 140
d. Implantation... 141
e. Suivi des animaux et traitement chimiothérapique... 141
f. Sacrifice ... 141
g. Dosage hebdomadaire du PSA... 141
h. Evaluation du développement tumoral par radiographie... 142
i. Evaluation du remodelage osseux par analyse µ-CT : tomographie par rayon-X... 142
Références bibliographiques ... 145
1
Introduction
Introduction
3 Les sphingolipides sont des constituants cellulaires qui exercent des effets biologiques majeurs et le céramide constitue l’élément central de leur métabolisme. Les sphingolipides sont ainsi impliqués dans la régulation des processus de prolifération cellulaire, de migration ou bien encore d’apoptose. Ils participent à de nombreux processus physiologiques (réponse immunitaire, angiogènese, inflammation) et physiopathologiques (tumorigènese et résistance aux traitements anticancéreux).
Un rappel du métabolisme des sphingolipides est présenté dans l’ENCADRE 1 : Les sphingolipides.
Le travail doctoral présenté ici a porté sur l’étude d’un sphingolipide particulier, la Sphingosine
1-phosphate (S1P), et de l’enzyme intracellulaire qui le produit, - la Sphingosine Kinase (SphK),
au niveau du métabolisme osseux.
L’os est un tissu complexe, en constant renouvellement où s’opèrent de multiples interactions cellulaires directes et paracrines et dont l’activité est également sous le contrôle de régulations endocrines. Peu de données sont aujourd’hui disponibles concernant les effets de sphingolipides au niveau osseux. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons voulu évaluer le rôle des sphingolipides (S1P) dans deux aspects liés à la physiologie et à physiopathologie osseuse:
- d’une part, quel est le rôle de la sphingosine kinase 1 dans l’ostéoblaste, la cellule centrale de la formation de la trame osseuse, et plus particulièrement, quelle est la place de la SphK dans la
régulation de l’ostéoblaste par les androgènes ?
- d’autre part, quels sont les rôles de la signalisation SphK1/S1P dans le modèle physiopathologique des métastases osseuses du cancer de la prostate ?
Le chapitre I de la revue générale présente ainsi les propriétés et les modes de régulation de la SphK ainsi que les rôles majeurs de la S1P dans le métabolisme cellulaire et les communications paracrines inter-cellulaires.
Le chapitre II de ce manuscrit constitue un rappel concernant la physiologie de l’os et la complexité des régulations permettant son renouvellement et le chapitre III fait état des connaissances actuelles concernant les métastases osseuses du cancer de la prostate.
5
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 /
ENCADRE1 : Les sphingolipides
7 Les sphingolipides sont des lipides complexes, isolés et nommés en 1884 par JLW Thudichum. Ce sont des constituants des membranes biologiques. Ils sont constitués d’une base sphingoïde commune, la sphinganine, qui est un alcool à longue chaîne carbonnée qui résulte de la condensation d’un acide gras palmitique (C16) et d’une sérine.
La sphingosine est le dérivé sphingolipidique le plus abondant, elle est retrouvée dans 90% des sphingolipides chez les animaux, la phytosphingosine (4-hydroxysphinganine) est la forme majoritaire chez les végétaux.
Métabolisme des sphingolipides
CDase : céramidase, CK : céramide kinase ; DAG : diacylglycérol ; CGase : glucosylcéramidase ; GCS : Glycosylcéramide synthase ; PC : phosphatidylcholine ; SK : sphingosine kinase ; SMase : sphingomyelinase ; SMS : sphingomyeline synthase ; SPPase : Sphingosine 1-phosphate phosphatase ; SPT : serine palmtoyl transferase
ENCADRE 1 : Les sphingolipides
La synthèse des composés sphingolipidiques peut s’effectuer : -de novo à partir de la condensation d’un acide gras (acide palmitique) et d’une sérine ; - suite à la dégradation des sphingomyélines membranaires ; - par la voie de dégradation des glycosphingolipides. Les sphingolipides sont dégradés de manière irréversible sous forme de phosphoethanolamine et hexadecenal.
Longtemps, les sphingolipides n’ont été considérés que comme de simples constituants de la membrane plasmique pouvant servir de substrat à la β-oxydation et à la glycolyse. On sait aujourd’hui qu’ils exercent des effets biologiques majeurs dans de nombreux processus biologiques.
Le céramide, la sphingosine et la sphingosine-1 phosphate sont reconnus comme des médiateurs impliqués dans la régulation de la prolifération, l’apoptose/la survie, la migration cellulaire, la sénescence ou encore les phénomènes inflammatoires.
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate Céramide Sphingosine • Antimitogénique • Pro-apoptotique Sphingosine 1-phosphate • Mitogénique • Anti-apoptotique Sphingosine Kinase S1P phosphatase
I. La sphingosine kinase : régulateur de la balance sphingosine / S1P
Les seconds messagers sphingolipidiques participent à la régulation de nombreuses voies de signalisation lors des processus de prolifération, de différentiation ou d’apoptose cellulaire. Parmi ceux-ci, le céramide et la sphingosine sont connus pour exercer des effets cellulaires pro-apoptotiques et anti-mitogéniques alors que la sphingosine 1-phosphate (S1P) est impliquée dans les processus de prolifération, de survie, de différenciation et de migration cellulaire.
Les effets opposés de ces deux sphingolipides ont conduit au concept selon lequel la balance dynamique entre les taux de céramide et de S1P représente un facteur déterminant pour le devenir de la cellule (Cuvillier, Pirianov et al. 1996). Un des acteurs majeurs contrôlant cette balance céramide/S1P est la sphingosine kinase (SphK), l’enzyme qui phosphoryle la sphingosine en sphingosine 1-phosphate.
Figure 1 : Le biostat sphingolipidique
La dérégulation de cette balance en faveur de la S1P est impliquée dans les phénomènes d’initiation et de progression tumorale.
Aussi, la signalisation SphK/S1P constitue un élément central du métabolisme sphingolipidique, impliqué dans la régulation de divers processus biologiques tels que la prolifération cellulaire, la différenciation, la résistance aux traitements anti-tumoraux, l’angiogenèse et l’inflammation (Spiegel and Milstien 2003).
La SphK a été identifiée comme étant une lipide kinase oncogénique (Xia, Gamble et al. 2000), elle transfert un groupement phosphate depuis une molécule d’ATP (donneur) vers la sphingosine ; la S1P formée peut ensuite être déphosphorylée en sphingosine par la sphingosine phosphate phosphatase (SPP) ou être dégradée selon un processus irréversible en phospho-ethanolamine et hexadecenal (voir ENCADRE 1 : Les sphingolipides).
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
9 La sphingosine kinase est une enzyme ubiquitaire conservée au cours de l’évolution. Elle a été identifiée chez les principaux organismes modèles : saccharomyces cervisiae (Lanterman and Saba 1998), Tetrahymena pyriformis (Keenan 1972), ou Arabidopsis thaliana et une activité sphingosine kinase a été mise en évidence dans les années 1970, dans le foie de rat (Keenan and Maxam 1969), le cerveau de bœuf (Louie, Kisic et al. 1976) et les plaquettes porcines (Stoffel, Heimann et al. 1973).
La SphK a ensuite été purifiée pour la première fois, dans le rein de rat en 1998 par le groupe de Spiegel (Olivera, Edsall et al. 1999) puis chez la souris (Kohama, Olivera et al. 1998). Chez la souris, deux isoformes sont retrouvées, mSphK1a et mSphK1b constituées respectivement de 381 et 388 acides aminés. Ces deux isoformes résultant vraisemblablement d’un épissage alternatif du même gène.
La sphingosine kinase humaine a été identifiée et clonée par la suite au début des années 2000 (Melendez, Carlos-Dias et al. 2000; Nava, Lacana et al. 2000). L’enzyme humaine (hSphK) présente un poids moléculaire de 42,5 kDa pour 384 acides aminés. Elle possède un fort degré d’homologie avec la protéine murine (mSphK1a) avec laquelle elle partage 85% d’identité et 92% de similarité. Le gène codant la hSphK a été localisé sur le chromosome 17 (17q25.2).
Les travaux de Banno (Banno, Kato et al. 1998), dans un modèle de plaquettes humaines, suggèrent qu’il existe plusieurs isoformes de SphK, ce que confirme le groupe de Spiegel en 2000 (Liu, Sugiura et al. 2000), mettant en évidence l’existence d’une SphK1 et d’une SphK2.
La SphK1 correspond à la première enzyme identifiée ; la SphK2 a alors été purifiée et clonée ; elle présente 618 acides aminés chez l’homme et 617 acides aminés chez la souris pour des poids moléculaires de 65,2 et 65,6 kDa. Les protéines humaines et murines présentent 83% d’identité et 90% de similarité. Le gène codant la SphK2 a été localisé sur le chromosome 19.
La distribution tissulaire et l’expression des SphK1 et Sphk2 ont été évaluées par Northern Blot révélant que la SphK1 est très largement distribuée avec une expression plus forte dans les poumons, la rate, le thymus, les reins et les leucocytes de sang périphérique (Melendez, Carlos-Dias et al. 2000). Le groupe de Nozawa a mis en évidence l’expression de la SphK1 dans la matière blanche du cerveau et du cervelet, le noyau rouge et le pédoncule cérébral du cerveau moyen, les tubules rénaux, les cellules endothéliales, les mégacaryocytes et les plaquettes sanguines (Murate, Banno et al. 2001).
La SphK1 est retrouvée précocement au cours du développement embryonnaire chez la souris (j7) alors que l’expression de la SphK2 est moins importante mais augmente graduellement (expression maximale à j17) (Liu, Wada et al. 2000). La SphK2 est majoritairement retrouvée dans le foie et les reins mais son expression est faible dans les poumons, la rate et le thymus.
Des gènes codant pour la SphK ont également été identifiés chez Saccharomyces cerevisiae (Nagiec, Skrzypek et al. 1998), Caenorhabditis elegans (Kohama, Olivera et al. 1998), Arabidopsis
thaliana (Nishiura, Tamura et al. 2000), Drosphila melanogaster (Herr, Fyrst et al. 2004) et Dictyostelium discoideum (Min, Traynor et al. 2005).
II. Propriétés biochimiques, structurales et localisation
II.I Structure
Les propriétés biochimiques et structurales des sphingosine kinases 1 et 2 ont fait l’objet de nombreuses études. Chez les mammifères, ces enzymes présentent 5 domaines très conservés : C1 à C5 qui ont été identifiés par comparaison de séquences avec les SphK murines et leurs homologues issus de Arabidopsis thaliana (Figures 2 et 3).
Figure 2 : Structures comparées des deux isoformes de Sphingosine Kinase (Spiegel and Milstien 2003)
Les domaines C1 à C3 présentent une forte homologie avec le site de fixation de l’ATP de la diacylglycérol (DAG) kinase et la céramide kinase.
Des travaux de mutagenèse dirigée ont permis d’identifier que les résidus Gly26, Ser79, Gly80, Gly82, Lys103, Gly111, Gly113, et Asp177 sont impliqués dans l’activité catalytique de la SphK1 (Pitson, D'Andrea R et al. 2000; Pitson, Moretti et al. 2001; Pitson, Moretti et al. 2002).
Dans le domaine C1, on retrouve un motif caractéristique, GGKGK pour la SphK1 et GGRGL pour la SphK2 (Liu, Sugiura et al. 2000) ; ce motif avait été tout d’abord envisagé comme faisant partie du site de fixation de l’ATP mais l’existence de différences entre les deux isoformes remet en cause cette hypothèse. Pitson a, par ailleurs, mis en évidence un motif SGDX17-21K contenu dans le domaine C2 qui apparait correspondre au site de fixation de l’ATP (Pitson, Moretti et al. 2002). Ce motif semble spécifique de la famille des protéines SphKs mais présente des similarités de structure et de séquence avec les boucles riches en glycine présentes dans de nombreuses protéines kinases.
Le domaine C4 est caractéristique des SphKs, il semble être impliqué dans la liaison de l’enzyme avec son substrat. Il a été montré que le résidu Asp177 est indispensable à la liaison de la sphingosine, la mutation de cet acide aminé en une asparagine (Asn177) dans la SphK1 murine se traduit par une diminution de l’activité kinase et une perte d’affinité de l’enzyme pour la
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
11 sphingosine sans que soit observée de modification des capacités d’interaction avec l’ATP (Yokota, Taniguchi et al. 2004). La charge négative de l’acide aminé aspartate pourrait être responsable d’une interaction avec la charge positive du groupe aminé de la sphingosine ou bien l’interaction pourrait s’opérer grâce à une liaison hydrogène établie entre l’acide aminé et un groupement hydroxyle de la sphingosine.
La SphK1 humaine présente plusieurs sites potentiels de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC) (Thr54, Ser181, Thr205, Ser371), par la caséine kinase II (Thr130) et il a été montré que la sérine 225 est une cible de la MAP kinase (Mitogen-activated Protein) ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase) (Pitson, Moretti et al. 2003).
Quatre motifs de liaison Calcium/Calmoduline ont été mis en évidence : un motif entre les résidus 290-303, deux motifs chevauchants entre les résidus 134 et 153 et un dernier motif entre les résidus 191 et 206 (Kohama, Olivera et al. 1998; Pitson, Moretti et al. 2000; Sutherland, Moretti et al. 2006).
D’autres sites de modifications post-traductionnelles et/ou d’interaction ont été identifiés : - des sites de N-myristoylation (résidus 5-10, 111-116, 113-118 et 293-298) ; - un site de N-glycosylation (Asn137) ; - un motif d’interaction avec le facteur TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor-2) qui permet l’activation de l’enzyme par le TNF-α (Tumor Necrosis Factor) (PPEE379-382) (Xia, Wang et al. 2002) ; - un motif riche en proline dans la région C-terminale semblable aux domaines de liaison SH3 ; ainsi que deux séquences d’export nucléaire (NES), NES-1 (147-155) et NES-2 (161-169).
La SphK2 contient également des sites de modifications post-traductionnelles : - des sites de phosphorylation par la PKC (Thr66, Thr98, Thr184, Ser319, Thr335, Ser441, et Thr578) ; - de phosphorylation par ERK1/2 (Ser351 et Thr578) (Hait NC, 2007) ; - des sites de phosphorylation par la caséine kinase II (Ser71, Thr106, Ser198, Ser200, Ser305, Ser383) ; - de phosphorylation par une protéine tyrosine kinase (70-78) et une kinase dépendante de l’AMPc et du GMPc ; - des sites de N-myristoylation (résidus amines 20-25, 176-181, 196-201, 236-241, 241-246, 243-248, 325-330, 440-445, 473-478, 538-543, 554-559 et 604-609) ; - de N-glycosylation (Asn267) ainsi que un site de nitrosylation par une tyrosine (100-114) et un site d’amidation (acides aminés 86-89).
La SphK de type 2 présente une séquence de localisation nucléaire (NLS) dans sa région amino-terminale (86-94) (Igarashi, Okada et al. 2003), un domaine riche en proline (344-493) et un motif de 9 acides aminés (215-227) similaire au motif présent dans les protéines pro-apoptotiques BH3-only, qui permettrait l’interaction de la SphK2 avec Bcl-xl (Liu, Toman et al. 2003).
Figure 3 : Séquence peptidique de la SphK1
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
13 II.II Propriétés biochimiques et spécificités de substrats
La SphK1 présente une forte affinité pour la erythro-sphingosine (Km = 10 µM), ainsi que la D-erythro-dihydrosphingosine. Une faible activité kinase est retrouvée envers la phytosphingosine alors que de nombreux dérivés de la sphingosine ne sont pas phosphorylés (D,L-threo-dihydrosphingosine, la N,N-dimethylsphingosine, C2 céramide ou encore le phosphatidylinositol) (Pitson, Moretti et al. 2003). L’activité SphK1 est en revanche inhibée par la D,L-threo-dihydrosphingosine (Ki = 3µM) et la N,N-dimethylsphingosine (DMS) (Ki = 5 µM) (Melendez, Carlos-Dias et al. 2000).
La SphK2 possède une plus forte affinité pour dihydrosphingosine que pour la D-erythro-sphingosine, mais elle est également capable de phosphoryler la phytosphingosine et la D,L -threo-dihydrosphingosine, inhibiteur de la SphK1. Comme pour la SphK1, les autres dérivés sphingolipidiques ne sont phosphorylés et l’activité SphK2 est inhibée par la DMS (Ki = 12 µM). Les deux types de SphK présentent en revanche la même affinité pour l’ATP avec un Km de 80 µM.
L’activité des SphK nécessite la présence d’ions bivalents, (Mg++> Mn++> Ca++), ces enzymes présentent un pH optimum entre 6,5 et 8 et une température optimale de 37°C. La présence de sels exerce des effets opposés sur l’activité des sphingosine kinases : l’activité SphK1 est inhibée de 50% par 200 mM NaCl ou de KCl alors que celle de la SphK2 est stimulée et augmente jusqu’à des concentrations de 400 mM. In vitro, la présence de détergent, le TritonX-100 à une concentration supérieure à 0,005%, inhibe l’activité SphK2 mais stimule celle de l’enzyme de type 1 et l’albumine de sérum de bœuf (BSA), inhibe la SphK2 mais est sans effet sur la SphK1. Les travaux de Pitson révèlent que l’enzyme hSphK1 recombinante, produite par Escherichia coli présente des propriétés biochimiques identiques à celles de l’enzyme native suggérant qu’aucune modification post-traductionnelle ne soit impliquée dans l’activité et l’affinité de l’enzyme pour son substrat.
II.III Localisation
La hSphK1 est une enzyme majoritairement cytosolique mais elle est capable de transloquer à la membrane plasmique en réponse à différentes stimulations telles que les esters de phorbol (Johnson, Becker et al. 2002) suite à sa phosphorylation sur la sérine 225 par ERK1/2 (Pitson, Moretti et al. 2003). Il a également été montré que la S1P pouvait être produite à l’extérieur des cellules endothéliales HUVEC suggérant que la SphK1 pourrait être sécrétée dans l’espace extra-cellulaire (Ancellin, Colmont et al. 2002). Ce processus de sécrétion s’effectuerait selon un mécanisme non classique impliquant le cytosquelette d’actine. La SphK2 est, quant à elle, principalement retrouvée dans le noyau cellulaire où elle transloque grâce à sa séquence NLS.
III. Régulation de la voie SphK1/S1P
La sphingosine kinase de type 1 est l’enzyme qui est la mieux caractérisée aujourd’hui, le paragraphe suivant décrit les acteurs et les mécanismes de régulation connus de cette protéine. Les travaux menés au cours des 20 dernières années ont permis d’identifier de nombreux facteurs et différents modes de régulation de la sphingosine kinase 1 s’opérant au niveau de son expression, de sa localisation intracellulaire ou bien encore de son activité ou de sa dégradation.
III.I Facteurs hormonaux, paracrines, environnementaux et molécules exogènes
La SphK est activée par de multiples agonistes favorisant la survie cellulaire : ces facteurs exercent leurs effets par des signalisations impliquant des RCPG (Récepteurs Couplés aux Protéines G), des petites protéines G, des récepteurs membranaires de type tyrosine kinase, des protéines kinases intracellulaires ou bien encore la modulation du calcium intracellulaire. Ces différents acteurs ainsi que le modèle dans lequel leur effet a été décrit sont résumés dans le tableau 1.
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
15
Activateur Modèle Référence
PDGF Fibroblastes Swiss 3T3 (Olivera and Spiegel 1993)
VEGF Cellules de vessie, cellules
endothéliales
(Shu, Wu et al. 2002)
HGF Cellules endothéliales (Duan, Wu et al. 2004)
EGF Cancer du sein (Doll, Pfeilschifter et al. 2005)
NGF, βFGF Phéochromocytome (Edsall, Pirianov et al. 1997)
IGF-1 IGFBP3 Neuroblastome HUVEC (Gomez-Brouchet, Pchejetski et al. 2007)
(Granata, Trovato et al. 2007) Facteurs de
croissance
Neurotrophine-3 Oligodendrocytes (Saini, Coelho et al. 2005)
mAchR 2 et 3 Fibroblastes (Meyer zu Heringdorf, Lass et
al. 1998) Récepteur au formyl
peptide
Leucémie (Alemany, Meyer zu
Heringdorf et al. 1999) Récepteur du LPA Neuroblastome (Young, Challiss et al. 1999) Récepteur de la
prosaposine
Phéochromocytome (Misasi, Sorice et al. 2001) RPCG
Récepteur de la bradykinine B2
(Blaukat and Dikic 2001)
FCεRI Cellules mastocytaires (Choi, Kim et al. 1996)
Récepteurs des
Immunoglobulines FCγRI (Melendez, Floto et al. 1998)
TPA Fibroblastes (Mazurek, Megidish et al.
1994) Esters de Phorbol
PMA Leucémie (Buehrer, Bardes et al. 1996)
17 β-estradiol Cancer du sein (Sukocheva, Wang et al.
2003) Hormones
Prolactine
Androgènes Cancer de prostate
(Doll, Pfeilschifter et al. 2007) Dayon A. soumis à Oncogene
Cytokines TNF-α IL-1β TGF-β Cellules endothéliales Cellules β pancréatiques Fibroblastes Cancer du poumon
(Xia, Gamble et al. 1998) (Yamanaka, Shegogue et al. 2004; Billich, Bornancin et al. 2005; Mastrandrea, Sessanna et al. 2005)
Anaphylatoxine C5a Neutrophines (Ibrahim, Pang et al. 2004)
LDL oxydés Cellules musculaires lisses (Auge, Santanam et al. 1999)
Lipopolysaccharide Macrophage (Wu, Mosteller et al. 2004)
Vitamine D3 Leucémie (Kleuser, Cuvillier et al. 1998)
AMPc Ostéoblastes (Machwate, Rodan et al.
1998) Fibroblastes Glucocorticoïdes
Kératinocytes (Hammer, Sauer et al. 2004)
Hyperglycémie Cellules endothéliales (Wang, Xing et al. 2005)
Histamine Cellules endothéliales (Huwiler, Doll et al. 2006)
Angiotensine II Artères carotidiennes (Mulders, Hendriks-Balk et al.
2006)
Endothéline-1 Cellules étoilées du foie (Gallois, Davaille et al. 2000)
III.II Mécanismes de régulation de la sphingosine kinase 1
a. Régulation par la localisation intracellulaire
La translocation de la SphK1 du cytosol vers la membrane plasmique est induite par de nombreux facteurs tels que le PMA (Johnson, Becker et al. 2002), le NGF (Nerve Growth Factor) (Toman, Payne et al. 2004), le TNF-α (Tumor necrosis factor) (Pitson, Moretti et al. 2003), le PDGF (Platelet Derived Growth Factor) (Rosenfeldt, Hobson et al. 2001) ou bien encore le calcium intracellulaire (Young, Willets et al. 2003).
Figure 4 : Translocation membranaire de la SphK1 induite par le PMA
Microscopie confocale de cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire par un vecteur codant la SphK1 humaine fusionnée à la GFP (hSphK1/GFP). Ces cellules ont été traitées ou non avec 300 nM de PMA pendant 1 heure. A et A’ représentent la localisation cytosolique de la hSphK1/GFP dans les cellules non traitées. B et B’ représentent la localisation à la membrane plasmique de hSphK1/GFP dans les cellules traitées au PMA (Johnson, Becker et al. 2002).
Le groupe de Obeid a mis en évidence une translocation membranaire de la SphK1 dans les cellules HEK-293, celle-ci n’implique cependant pas que l’enzyme soit activée puisque la forme de l’enzyme mutée dans le site catalytique (G82D) conserve sa capacité de migrer à la membrane (Johnson, Becker et al. 2002). La relocalisation membranaire est associée à une phosphorylation de la SphK1 sur le résidu Ser225 par la kinase ERK1/2 (Pitson, Moretti et al. 2003) qui permet également une augmentation de son activité enzymatique.
A la suite de ce travail, le groupe de Pitson a montré que la translocation membranaire est associée à une augmentation de la prolifération cellulaire et de la production de S1P et que la mutation du site de phosphorylation (S225A) induit la perte du pouvoir oncogénique de la SphK1 lors de sa surexpression (Pitson, Xia et al. 2005).
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
17 Le rôle de translocation membranaire de la SphK1 a également été l’objet des travaux de Safadi-Chamberlain qui ont permis l’obtention d’une SphK1 myristoylée permettant le ciblage de l’enzyme à la membrane. De manière surprenante, cette enzyme modifiée conduit à une diminution de la prolifération cellulaire associée à un arrêt du cycle en phase G1 alors que la surexpression de la SphK1 naïve est corrélée à la stimulation de la transition G1/S. Les hypothèses avancées pour expliquer ces effets opposés seraient l’utilisation de constructions différentes et le fait que des modèles cellulaires différents aient été utilisés pour les tester.
Les résidus Thr54 et Asn89 de l’enzyme seraient, quant à eux impliqués dans l’interaction spécifique de la SphK1 avec les phosphatidylserines (PS) et permettraient la spécificité d’interaction de l’enzyme avec la membrane plasmique (Stahelin, Hwang et al. 2005). Les travaux de Young ont mis en évidence le rôle du calcium dans la régulation du trafic intracellulaire de la SphK1 (Young, Willets et al. 2003) dans un modèle de neuroblastome après stimulation par des agonistes des récepteurs muscariniques et par l’acide lysophosphatidique (LPA). Sutherland a montré par la suite que le complexe Ca++/calmoduline intracellulaire interagit avec les résidus Phe197 et Leu198 de la SphK1 et empêche la translocation de l’enzyme à la membrane (Sutherland, Moretti et al. 2006).
La translocation membranaire de la SphK1 a été mise en évidence dans des macrophages activés par le LPS (Lipopolysaccharide), dans les cellules du système immunitaire en réponse à l’anaphylatoxine C5a ou bien encore dans un modèle d’étude de l’extension des neurites en réponse au NGF.
La SphK1 peut avoir d’autres localisations que le cytosol ou la membrane plasmique : la SphK1 peut être relocalisée dans le noyau (Kleuser, Maceyka et al. 2001) ; elle peut également être exportée à l’extérieur de la cellule, se comporter comme une ectokinase et générer de la S1P extracellulaire (Ancellin, Colmont et al. 2002).
b. Régulation par la Protéine Kinase C (PKC)
La protéine kinase C a été mise en évidence dans l’activation de la SphK1 dès 1996, dans les cellules leucémiques myeloïdes aïgues. Dans ce modèle, l’ester de phorbol PMA conduit à l’activation de la kinase selon un mécanisme dépendant de la PKC. Plusieurs sites potentiels de phosphorylation par la PKC ont été identifiés dans la séquence de la SphK (Buehrer, Bardes et al. 1996), pourtant la protéine kinase C ne semble pas exercer d’effet direct in vitro sur l’activité de la SphK. La phosphorylation PKC-dépendante de la SphK1, vraisemblablement médiée par les kinases ERK1/2 est un événement important de sa translocation vers la membrane plasmique et de son activation (Pitson, Moretti et al. 2002; Pitson, Moretti et al. 2003). La SphK1 peut également être régulée de façon transcriptionnelle par la PKC. Dans les cellules leucémiques humaines (MEG-01), le PMA induit une augmentation de l’ARN messager de la SphK1 selon un
mécanisme impliquant la voie PKC / ERK1/2 (Nakade, Banno et al. 2003). L’histamine est un autre activateur de l’expression et de l’activité de la SphK1 de manière dépendante de la PKC dans les cellules endothéliales d’artères humaines (Huwiler, Doll et al. 2006).
c. Régulation par la Phospholipase D (PLD)
L’implication de la PLD, responsable de la production d’acide phosphatidique dans la régulation de l’activité SphK, a été établie dès 1996 dans des modèles d’étude de la mobilisation du calcium induite par l’agrégation des récepteurs aux immunoglobulines E et G (IgE et IgG). Dans les mastocytes humains, l’équipe de Kinet a montré que l’activation des récepteurs FcεRI aux IgE induisait la mobilisation du Calcium selon un mécanisme impliquant non seulement la voie conventionnelle de l’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) mais également -et de façon majoritaire- la S1P produite par l’activité SphK (Choi, Kim et al. 1996). L’agrégation du récepteur FcγRI aux IgG dans les monocytes conduit également à l’activation de la SphK1 selon un mécanisme dépendant de la PLD (Melendez, Floto et al. 1998) et cette agrégation est exclusivement dépendante de la production de S1P intracellulaire puisque cette agrégation n’est pas couplée à l’activation de la Phospho Lipase C (PLC) génératrice d’IP3. Il a par ailleurs été mis en évidence que la SphK1 est activée par l’acide phosphatidique (produit de la PLD) mais ne l’est pas par le DAG (produit de la PLC) (Olivera, Rosenthal et al. 1996; Kohama, Olivera et al. 1998).
Un mécanisme d’activation de la SphK1 par la PLD a été proposé : suite à l’activation de la PLD, la SphK1 serait transloquée au niveau de membranes enrichies en acide phosphatidique avec lesquels elle interagirait ; cette interaction conduirait alors à l’induction de l’activité enzymatique.
d. Régulation de la SphK1 par les interactions protéines-protéines
La SphK1 peut être régulée par des interactions directes avec différentes protéines, ces interactions pouvant conduire à l’activation ou à l’inhibition de la SphK1.
Interactions activatrices
TRAF2 est une protéine impliquée dans la transduction du signal initié par TNF-α. Dans les
cellules HEK293, TRAF2 interagit avec la SphK1, le site de liaison est localisé dans le domaine C-terminal de la SphK1 (PPEE379-382), cette interaction est nécessaire à l’activation de NF-κB (Nuclear Factor kappa B) et à l’effet anti-apototique du TNF-α (Xia, Wang et al. 2002).
Lyn est une protéine tyrosine kinase qui entraîne l’augmentation de l’activité SphK1 via le
récepteur aux IgE FcεRI dans les cellules mastocytaires (Urtz, Olivera et al. 2004).
δ-caténine ou NPARP (Neural Plakophilin-Relatd Armadillo repeat Protein) est une protéine impliquée dans l’organisation des jonctions cellulaires. La δ-caténine active la SphK1 et la production de S1P in vitro, elle augmente in vivo la motilité cellulaire (Fujita, Okada et al. 2004).
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
19
eEF1a (Elongation Factor 1a) a pour principale fonction de participer à la synthèse protéique, il a
été montré que ce facteur peut réguler l’activité de certaines enzymes comme la SphK1 (Leclercq, Moretti et al. 2008).
Interactions inhibitrices
SKIP (sphingosine kinase interacting protein) est une protéine qui présente un fort degré de
similarité avec les protéines de la famille AKAP (Protein Kinase A Anchor Protein). Elle interagit avec la SphK1 dont elle ne régule pas l’expression mais dont elle inhibe les propriétés anti-apoptotiques et pro-mitogéniques (Lacana, Maceyka et al. 2002).
PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1) est une glycoprotéine transmembranaire
impliquée dans la régulation de nombreux processus biologiques comme l’angiogenèse, la régulation des réponses inflammatoires et immnunes. PECAM-1 est exprimée à la surface des cellules endothéliales, des plaquettes et de certaines cellules du système immunitaire et peut interagir avec la SphK1. L’association entre la SphK1 et PECAM-1 conduit à une inhibition de l’activité de la kinase mais la phosphorylation de PECAM-1 diminue son affinité pour la SphK1. L’association/dissociation de PCAM-1/SphK1 pourrait être impliqué dans le contrôle de la localisation de la SphK1 (Fukuda, Aoyama et al. 2004).
FHL-2 (four and half LIM domain-2)/SLIM3 appartient à la famille des protéines adaptatrices de
type LIM. Il a été montré dans les cardiomyocytes que FHL-2 interagit avec la SphK1. Le site d’interaction est localisé dans la région C-terminale de la SphK1 et cette association conduit à l’inhibition de la SphK1 et à l’abolition de son effet anti-apoptotique (Sun, Yan et al. 2006).
Acy-1 (aminoacyclase-1) est une métalloenzyme exprimée dans le système nerveux central. Des
études double-hybride ont montré que Acy-1 peut interagir avec la SphK1. Il existe deux formes de Acy-1 capables de s’associer avec la SphK1 : une forme entière et une forme C-terminale tronquée. La liaison de l’une ou l’autre de ces protéines exerce des effets opposés : la forme tronquée inhibe les effets de la SphK1 sur la prolifération et la survie cellulaire alors que la forme entière les amplifie (Maceyka, Nava et al. 2004).
RPK118 est une autre protéine identifiée par double-hybride et capable d’interagir avec la SphK1.
RPK118 possède deux domaines Pseudo Kinase (PK) et l’un d’entre eux est impliqué dans la liaison de la SphK1. RPK118 dont la fonction n’est pas encore déterminée n’altère ni l’activité de la SphK1 ni le taux intracellulaire de S1P suggérant que la RPK118 puisse être une protéine adaptatrice pour la SphK1 (Hayashi, Okada et al. 2002).
e. Régulation par le calcium
Comme indiqué précédemment, le calcium intracellulaire est impliqué dans la régulation de la localisation subcellulaire de la SphK1, la mobilisation calcique à partir des stocks intracellulaires en réponse à certains stimuli conduit à la formation du complexe calcium/Calmoduline qui induit
une relocalisation de la SphK1 depuis le cytosol vers la membrane plasmique (Young, Willets et al. 2003).
La SphK1 présente quatre sites potentiels de liaison du complexe Ca++/Calmoduline (Pitson, D'Andrea R et al. 2000) il apparaît néanmoins que l’activité de l’enzyme n’est pas directement stimulée par le calcium (Young, Willets et al. 2003). La liaison de la calmoduline au niveau des résidus Phe197 et Leu198 (Sutherland, Moretti et al. 2006) n’exerce pas d’effet sur l’activité catalytique de la SphK1. De nombreux stimuli ont été identifiés comme capables de réguler la SphK1 selon un mécanisme dépendant de la signalisation calcique, parmi ceux-ci, on trouve l’activation des récepteurs aux Immunoglobulines FcεRI et FcγgRI dans des mastocytes de rat (Choi, Kim et al. 1996) et dans un modèle de monocyte (Melendez, Floto et al. 1998) ; l’activation du récepteur à l’EGF (Epithelial Growth Factor) dans les cellules HEK 293 (Meyer zu Heringdorf, Lass et al. 1998) ou bien encore la stimulation de la lignée de neuroblastomes SHSY-5Y par le LPA (Young, Challiss et al. 1999).
f. Régulation de l’expression
L’activité de la SphK1 peut être régulée de manière rapide par de nombreux stimuli. Il existe pourtant d’autres modes de régulation, plus tardifs, qui affectent la transcription et la traduction de la SphK. La régulation transcriptionnelle de la SphK1 a été mise en évidence pour la première fois dans la lignée leucémique MEG-01 en réponse au PMA (Nakade, Banno et al. 2003). L’histamine peut également réguler la transcription de la SphK1 dans les cellules endothéliales EA.hy 926 (Huwiler, Doll et al. 2006) et le 17β-estradiol est capable d’activer la SphK1 de façon biphasique dans les cellules d’adécarcinome mammaire MCF-7. L’œstrogène conduit à une activation rapide et transitoire de la SphK1 et à une activation tardive et prolongée impliquant la régulation transcriptionnelle de la protéine (Sukocheva, Wang et al. 2003). Dans les cellules d’adécarcinome prostatique (PC-3), il apparaît également que la camptothécine module la transcription de la SphK1 (Akao, Banno et al. 2006).
g. Régulation par protéolyse
L’étude de la régulation de la SphK1 s’est récemment intéressée à l’inhibition de l’activité SphK1 par la dégradation de la protéine. L’actinomycine D cause des dommages de l’ADN qui conduisent à une inhibition de l’activité de la SphK1 associée à une diminution de la quantité de protéine SphK1 dans les cellules MCF-7 et Molt-4 (Taha, Osta et al. 2004). D’autres agents induisant des dommages à l’ADN exercent les mêmes effets sur la SphK1 comme la doxorubicine, l’étoposide ou bien encore les radiations γ. Il a été mis en évidence l’existence d’un pool intracellulaire de SphK1 colocalisé avec la cathepsine B lysosomale dans les cellules MCF-7 (Taha, Kitatani et al. 2005). In vitro, il a été montré que cette protéase peut cliver la SphK1 au niveau de deux sites
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
21 (His122 et Arg199) (Taha, El-Alwani et al. 2006) et le clivage par la cathepsine B s’effectue au niveau du résidu His122, localisé entre le site de fixation de l’ATP et le résidu Asp177 requis pour la liaison du substrat, la sphingosine. Le clivage de la SphK1 par la cathepsine B conduit vraisemblablement ainsi à une inhibition complète de l’activité SphK1.
h. Régulation par déphosphorylation
Les récents travaux de Barr révèlent un nouveau mode de régulation de la SphK1 par déphosphorylation. La SphK1 active, phosphorylée sur la sérine 225 peut être déphosphorylée par la PP2A (protein phosphatase 2A). Des expériences de GST-pull down et de co-immunoprécipitation ont montré que la sous unité catalytique de la PP2A est capable d’interagir directement avec la SphK1. Cette interaction conduit à une déphosphorylation de la SphK1 basale ou induite par le TNF-α (Barr, Lynn et al. 2008).
IV. La voie SphK1 / Sphingosine 1-Phosphate
La sphingosine kinase 1 est activée par de nombreux stimuli et cette activité est associée à de multiples effets biologiques. La SphK n’a cependant pas été identifiée jusqu’alors comme le médiateur direct de ces effets. Le produit activité enzymatique, la sphingosine 1-phosphate (S1P) apparaît comme étant la molécule responsable des propriétés prolifératives et anti-apoptotiques de la signalisation SphK1/S1P. La S1P est un lipide qui possède la caractéristique d’exercer des effets intra-cellulaires mais qui peut également être sécrété et se comporter alors comme un facteur de signalisation paracrine en se fixant sur ses récepteurs spécifiques exprimés à la surface des cellules cibles.
IV.I La Sphingosine 1-Phosphate : second messager intracellulaire
C’est au début des années 1990, que la S1P a pu être impliquée en tant qu’acteur de la signalisation intracellulaire. Le groupe de Spiegel a montré l’implication de la S1P dans la régulation de la prolifération cellulaire (Zhang, Buckley et al. 1990; Zhang, Desai et al. 1991). La S1P intracellulaire est également capable de conduire à une mobilisation du calcium intracellulaire (Ghosh, Bian et al. 1990) et d’exercer des effets anti-apoptotiques (Cuvillier, Pirianov et al. 1996). De nombreux arguments permettent d’impliquer la S1P comme second messager : la S1P exogène exerce des effets biologiques à des concentrations de l’ordre du micromolaire alors que seulement quelques nanomolaires de S1P suffisent pour observer un effet par l’intermédiaire des récepteurs (Van Brocklyn, Lee et al. 1998) ; par ailleurs, l’introduction de S1P dans le cytosol (microinjection ou S1P encapsulée) a les mêmes effets sur la prolifération et la mobilisation du calcium que l’addition exogène de S1P (Van Brocklyn, Lee et al. 1998; Wang, Van Brocklyn et al.
1999; van Koppen, Meyer zu Heringdorf et al. 2001) ; enfin chez la levure et chez les plantes qui n’expriment pas de récepteurs à la S1P, l’ajout du sphingolipide de manière exogène entraîne les mêmes effets sur la mobilisation calcique et la prolifération que chez les eucaryotes prouvant ainsi le rôle intracellulaire et indépendant des récepteurs de la S1P (Birchwood, Saba et al. 2001; Ng, Carr et al. 2001).
L’accumulation de S1P intracellulaire a pu être identifiée en réponse à la stimulation mitogénique des fibroblastes Swiss 3T3 par le PDGF et le sérum (Olivera and Spiegel 1993) ou bien encore en réponse à la stimulation des récepteurs muscariniques de l’acétylcholine (van Koppen, Meyer zu Heringdorf et al. 2001) conduisant à la mobilisation du calcium. Goodemote et al. montrent que la toxine pertussique, inhibiteur des RCPG (Gi) couplés à la production d’AMP cyclique, est capable d’inhiber l’effet mitogénique de la S1P dans un modèle de fibroblaste (Goodemote, Mattie et al. 1995).
La S1P est donc un second messager intracellulaire produit en réponse à de nombreux stimuli extracellulaires, elle est impliquée dans la signalisation calcique, l’activation de voies de survie et de prolifération et la suppression de l’apoptose cellulaire (Goodemote, Mattie et al. 1995; Cuvillier, Pirianov et al. 1996; Cuvillier, Rosenthal et al. 1998).
IV.II S1P, facteur de communication paracrine : ligand de récepteurs membranaires
La S1P est impliquée dans la régulation de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, la migration, et la différenciation cellulaire. Elle est un ligand naturel de récepteurs membranaires, les récepteurs EDG (Endothelial Differentiation Gene) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G exprimés par de multiples types cellulaires. Il existe 5 récepteurs à la S1P identifiés jusqu’alors : EDG-1 (S1P1), EDG-3 (S1P3), EDG-5 (S1P2) EDG-6 (S1P4) et EDG-8 (S1P5). Les récepteurs EDG regroupent les récepteurs de 2 ligands, les récepteurs de la S1P (listés ci-dessus) et les récepteurs qui lient l’acide lyso-phosphatidique (LPA).
Les récepteurs de la S1P sont couplés à différentes protéines G et présentent des profils d’expression tissulaire spécifiques, aussi la grande variété des effets biologiques engendrés par la S1P peut être expliquée par l’hétérogénéité d’expression relative de chaque récepteur et par la variabilité des voies de signalisation qui leur sont couplées.
a. EDG-1 (S1P1)
EDG-1 a été découvert dans le début des années 1990 dans les cellules endothéliales humaines (Hla and Maciag 1990). Chez l’homme, ce récepteur est largement exprimé dans différents tissus. Chez le rat et la souris, le récepteur EDG-1 est retrouvé avec une forte expression au niveau du foie, de la rate, du cœur, du cerveau, du poumon ainsi que au cours de l’embryogenèse avec une expression importante au niveau des centres d’ossification (Liu and Hla 1997).
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
23 Le récepteur S1P1 est un récepteur couplé aux protéines G de type Giα (Lee, Evans et al. 1996) qui lie la S1P avec une forte affinité (Kd = 8,1 nM) et une forte spécificité (Lee, Van Brocklyn et al. 1998). Il apparaît que EDG-1 peut également lier avec une moindre affinité le LPA (Lee, Thangada et al. 1998) et la sphingosylphosphorylcholine (SPC) (Okamoto, Takuwa et al. 1998).
L’étude des effets extracellulaires de la S1P révèlent que la liaison du sphingolipide avec EDG-1 induit la phosphorylation du récepteur, l’inhibition de l’adénylate cyclase (AC) et de la production d’AMPc (Zondag, Postma et al. 1998; Van Brocklyn, Tu et al. 1999), l’activation des MAP kinases (Zondag, Postma et al. 1998; Van Brocklyn, Tu et al. 1999) l’augmentation du calcium intracellulaire (Okamoto, Takuwa et al. 1998), l’activation de la petite GTPase Rac (Liu, Wada et al. 2000) ou bien encore l’activation de la voie de survie PI3K/AKT (Lee, Thangada et al. 1999; Morales-Ruiz, Lee et al. 2001) de prolifération (Young and Van Brocklyn 2007), de migration cellulaire via PI3K et Rac (Lee, Thangada et al. 1999; Okamoto, Takuwa et al. 2000). L’obtention de souris KO pour le gène edg-1 a permis la mise en évidence du rôle de ce récepteur dans le processus de vasculogenèse, la délétion du récepteur étant létale chez la souris à 13 jours de développement embryonnaire à cause d’un défaut de maturation du système vasculaire (Liu, Wada et al. 2000).
b. EDG-3 (S1P3)
Le récepteur EDG-3 a été identifié en 1996 (Yamaguchi, Tokuda et al. 1996), ce récepteur présente une grande similarité de séquence avec EDG-1. Il est retrouvé exprimé principalement au niveau du cœur, du placenta, du rein, du poumon, du pancréas, du thymus de la rate, du tissu adipeux, de l’utérus, des testicules et du foie (Yamaguchi, Tokuda et al. 1996; Ishii, Friedman et al. 2001). La caractérisation de ce récepteur a montré que celui-ci lie la S1P et, dans une moindre mesure la SPC mais ne lie pas le LPA (Okamoto, Takuwa et al. 1999) et que le récepteur est couplé à des voies de signalisation en partie différentes de EDG-1. Le récepteur EDG-3 peut interagir avec les protéines G de type Gi, Gq (Ancellin and Hla 1999) et G13 (Windh, Lee et al. 1999).
Dans des cellules surexprimant S1P3, la S1P induit l’activation de la production d’inositol phosphate et la mobilisation du calcium, l’activation des MAPKinases, la prolifération et la survie cellulaire (Gonda, Okamoto et al. 1999; Okamoto, Takuwa et al. 1999; An, Zheng et al. 2000). La fixation de la S1P sur le récepteur EDG-3 induit l’activation du facteur de survie NF-κB (Siehler, Wang et al. 2001), l’inhibition de l’AC (Okamoto, Takuwa et al. 1999). Dans le modèle de cellules leucémiques HL-60, le récepteur EDG-3 est négativement régulé au cours du processus de différenciation cellulaire (Sato, Murata et al. 1998), ce récepteur est également impliqué dans le processus de rétractation des neurites et la modification de la morphologie cellulaire associée à la perte d’adhérence (Van Brocklyn, Tu et al. 1999) ainsi que dans les processus de migration cellulaire (Kon, Sato et al. 1999). Les souris KO pour EDG-3 (lpB3) ne présentent pas de
phénotype (Ishii, Friedman et al. 2001) suggérant que le rôle de EDG-3 n’est pas essentiel au développement et que les autres récepteurs EDG puissent compenser sa délétion.
c. EDG-5 (S1P2)
Les travaux de MacLennan ont permis l’identification de ce récepteur, sous le nom de H218 chez le rat en 1994 (MacLennan, Browe et al. 1994), son ARN messager est retrouvé dans le cerveau au cours de l’embryogenèse et dans le corps cellulaire et les axones des neurones en développement (MacLennan, Browe et al. 1994; Maclennan, Marks et al. 1997). Le récepteur EDG-5 est également exprimé au niveau de nombreux tissus, dont le cœur, le cerveau, le thymus, l’estomac, la rate, l’intestin, les reins, les glandes surrénales, le tissu adipeux, l’utérus, les testicules et le foie (Okamoto, Takuwa et al. 2000; Ishii, Friedman et al. 2001). Le récepteur EDG-5 est capable de s’associer aux protéines G de type Gi, Gq et G13 (Ancellin and Hla 1999; Windh, Lee et al. 1999) et il est impliqué dans l’activation des MAP kinases (Gonda, Okamoto et al. 1999), l’activation de la cascade de signalisation PI3K/AKT(Okamoto, Takuwa et al. 2000), de la voie Rho/ROCK (Gonda, Okamoto et al. 1999; Okamoto, Takuwa et al. 2000; Lepley, Paik et al. 2005) et de la PLC associée à l’augmentation de production d’IP3 et l’augmentation du calcium intracellulaire (Gonda, Okamoto et al. 1999; An, Zheng et al. 2000; Okamoto, Takuwa et al. 2000; Lepley, Paik et al. 2005). La fixation de la S1P sur le récepteur EDG-5 est associé à l’inhibition de la migration et de la prolifération cellulaire (Van Brocklyn, Tu et al. 1999; Okamoto, Takuwa et al. 2000; Ikeda, Satoh et al. 2003; Lepley, Paik et al. 2005). A l’opposé, An et al. ont montré que l’interaction S1P/EDG-5 exerce un effet positif sur la survie (An, Zheng et al. 2000) et le groupe de Van Brooklyn suggère que cette interaction favorise la migration et l’agressivité des cellules tumorales (Young and Van Brocklyn 2007). Les souris KO pour EDG-5 ont permis de démontrer le rôle de ce récepteur dans le développement neuronal (MacLennan, Carney et al. 2001).
d. EDG-6 (S1P4)
Le récepteur EDG-6 a été identifié et caractérisé par le groupe de Lipp, il est exprimé spécifiquement dans les tissus lymphoïdes et hématopoïétiques fœtaux et adultes et dans le poumon (Graler, Bernhardt et al. 1998). La S1P lie ce récepteur avec une haute affinité (Kd = 63 nM) en revanche, EDG-6 ne lie la SPC qu’à des concentrations élevées et il se révèle incapable de fixer le LPA (Van Brocklyn, Graler et al. 2000). L’interaction S1P/EDG-6 conduit à l’activation de ERK1/2 selon un mécanisme impliquant Gi/o (Van Brocklyn, Graler et al. 2000) et permet une augmentation du Ca++ intracellulaire et de la production d’inositol phosphate impliquant la PLC (Yamazaki, Kon et al. 2000).
Chapitre I : La voie Sphingosine kinase 1 / Sphingosine 1-Phosphate
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e. EDG-8 (S1P5)
Le récepteur EDG-8 a été identifié au départ sous le nom de NRG-1 (Nerve Growth Factor-regulated G protein-coupled receptor) à la fin des années 1990 (Glickman, Malek et al. 1999), et sa caractérisation par le groupe de Lynch a mis en évidence sa haute affinité pour la S1P (Kd = 2 nM) (Im, Heise et al. 2000). EDG-8 est exprimé dans les cellules du système nerveux central (Im, Heise et al. 2000; Terai, Soga et al. 2003) et son ARN messager est retrouvé dans la rate, les leucocytes de sang périphérique, le placenta, le poumon, l’aorte et les tissus fœtaux chez l’homme (Im, Clemens et al. 2001). L’interaction S1P/EDG-8 permet l’association du récepteur avec Gi/o, G12/13, la signalisation Rho/ROCK (Im, Clemens et al. 2001; Malek, Toman et al. 2001; Novgorodov, El-Alwani et al. 2007) et conduit à l’activation de multiples voies de signalisation : l’inhibition de l’AC et de la production d’AMPc (Im, Clemens et al. 2001; Malek, Toman et al. 2001), l’inhibition de ERK1/2 (Malek, Toman et al. 2001) qui sont associées à l’inhibition de la migration (Novgorodov, El-Alwani et al. 2007) ou bien encore à la régulation de la survie des cellules nerveuses (Jaillard, Harrison et al. 2005).
Les autres récepteurs EDG identifiés ont pour ligand l’acide lysophosphatidique, les effets de ce lysophospholipide sur ses récepteurs sont également très variés. Le LPA participe à la régulation du tonus vasculaire, au processus de cicatrisation, il est également impliqué en physiopathologie dans le cas du cancer ou de l’obésité (pour revue : Meyer zu Heringdorf 2007 et Saulnier-Blache 2004).
S1P1 S1P2 S1P3 S1P4 S1P5
Gi Gi Gq G12/13 Gi G12/13
Gi Gq G12/13
PLC Ras PI3K AC PLC
PKC ERK1/2 AKT Rac PKC Rho
AC JNK
AC JNK
ERK 1/2
[Ca2+] [AMPc] [Ca2+]
PROLIFERATION SURVIE MIGRATION
JONCTIONS CELLULAIRES
S1P
Figure 5 : Modes d’action extracellulaire de la S1P
D’après Dayon A, 2008, manuscrit de thèse « rôle de la sphingosine kinase-1 dans la survie et la progression des cellules tumorales prostatiques LNCaP vers l’androgéno-indépendance ».
