Problèmatique II : Quel est le rôle de la signalisation SphK1/S1P au sein des métastases
II. Existe-t-il des interactions paracrines entre l’ostéoblaste et la cellule tumorale prostatique?
Notre hypothèse est que la S1P pourrait être un facteur de communication entre les ostéoblastes et les cellules tumorales au sein d’un foyer de métastase osseuse. Nous avons tout d’abord recherché in vitro, l’existence d’interactions entre nos différentes populations cellulaires.
II.I Les cellules tumorales prostatiques favorisent la différenciation ostéoblastique
Figure E : Coculture MC3T3-E1 / PC3 : induction de la différenciation ostéoblastique
Les lignées ont été ensemmencées en même temps et les cellules ont été cocultivées pendant 20 jours dans du milieu RPMI 10% SVF contenant 20 mM de β-gléro-phosphate. Au terme de la coculture, les cellules ont été fixées et la matrice colorée au rouge d’alizarine pour détecter la présence d’une matrice minérale témoignant de la différenciation des ostéoblastes. a. MC3T3- E1 : 104 cellules à J0 ; b. PC3 : 104 cellules à J0 ; c. MC3T3-E1 : 104 cellules à J0 et PC3 : 103 cellules à J0 ; d. MC3T3-E1 : 104 cellules à J0 et PC3 : 104 cellules à J0 ; e. : MC3T3-E1 : 103 cellules à J0 et PC3 : 105 cellules à J0.
Pour évaluer l’impact des cellules tumorales prostatiques sur la différenciation ostéoblastique, nous avons réalisé des cocultures (Figure E) dans un milieu contenant du β- glycéro-phosphate. Nous avons évalué la différenciation des pré-ostéoblastes en
[LNCaP]
[PC3]
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* *
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déterminant leur capacité à former une matrice minérale détectable au rouge d’alizarine. Alors que les lignées PC3 et MC3T3-E1 seules (Figure E a. et b.) ne forment pas de matrice, la coculture des deux lignées (Figure E c., d. et e.) conduit à l’apparition d’une matrice phospho-calcique. Il existe donc des interactions entre la cellule prostatique et l’ostéoblaste en faveur de la différenciation de ce dernier. Nous avons voulu évaluer l’effet de la coculture MC3T3-E1/LNCaP sur la différenciation (résultats non montrés) mais il est impossible d’évaluer l’effet sur la différenciation ostéoblastique car, dans les conditions expérimentées, les LNCaP adoptent des propriétés ostéo-mimétiques et deviennent seules capables de former une matrice détectée au rouge d’alizarine.
Les études pouvant être réalisées avec les cocultures sont limitées. Nous avons choisi d’utiliser un système de milieu conditionné, permettant d’isoler les populations cellulaires pour réaliser la suite des travaux.
II.II La cellule tumorale soutient la croissance ostéoblastique
Nous avons évalué l’effet des milieux conditionnés prostatiques (PC3 et LNCaP) sur la viabilité des ostéoblastes (Figure F). Les milieux conditionnés par les PC3 comme par les LNCaP sont capables de stimuler la croissance des ostéoblastes. On ne retrouve pas d’effet dose significatif suggérant que le/les facteurs soutenant cette prolifération sont abondamment présents dans les milieux de culture.
a. b.
Figure F : Effets des milieux conditionnés prostatiques sur la viabilité des ostéoblastes
Les MC3T3-E1 sont incubées avec des doses croissantes de milieu conditionné LNCaP (a.) ou PC3 (b.) pendant 24 à 72 heures. La viabilité est évaluée par test MTT.
De nombreux facteurs ont pu être incriminés dans les effets des cellules tumorales sur les ostéoblastes (endothéline-1, IGF-1…). La S1P pourrait être un de ces facteurs. Nous n’avons pas réalisé les expériences permettant de déterminer si le sphingolipide est impliqué
Résultats II : la voie SphK1/S1P dans les interactions cellulaires au sein des foyers de métastases osseuses
107 dans les effets observés, les expériences à mettre en place pour vérifier cette hypothèse sont discutées plus loin.
II.III L’ostéoblaste module la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti- cancéreux
Nous venons de montrer que les milieux conditionnés des cellules prostatiques stimulent la prolifération ostéoblastique. Nous suggérons que la S1P pourrait être un des facteurs impliqué dans ces effets. De manière parallèle, nous avons évalué l’effet des milieux conditionnés MC3T3-E1 sur les PC3 et les LNCaP.
a. Absence d’effet prolifératif
Les milieux conditionnés des cellules MC3T3-E1 ne modulent pas, dans nos conditions, la prolifération des PC3 ni des LNCaP. La littérature suggère pourtant que les ostéoblastes stimulent la prolifération tumorale. On peut supposer que l’absence d’interaction directe et l’absence de matrice (collagène, calcium..) puissent expliquer l’absence d’effet prolifératif des milieux conditionnés.
Figure G : Effet des milieux conditionnés ostéoblastiques sur la prolifération des PC3 et des LNCaP
Les cellules ont été cultivées avec des doses croissantes de milieu conditionné ostéoblastique. La viabilité a été évaluée par test MTT.
ns
[LNCaP]
[PC3]
*
*
*
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b. Les milieux d’ostéoblastes protègent de l’effet des chimiothérapies
Les cancers de la prostate hormono-réfractaires sont traités par chimiothérapies. Ces chimiothérapies peuvent avoir une efficacité différente sur la tumeur primaire et sur les métastases distantes. Dans ce contexte, nous avons évalué l’effet du docétaxel sur des PC3 cultivées en présence de milieu conditionné ostéoblastique (Figure H). Après 72 heures de traitement, la présence de milieu conditionné exerce un effet chimio-protecteur vis-à-vis de l’effet de la drogue.
Figure H : Les milieux ostéoblastiques protègent de l’effet du docétaxel
Les PC3 ont été traitées avec 10 nM de docétaxel et incubées ou non en présence de milieu conditionné. La viabilité cellulaire a été évaluée au bout de 72 heures par test MTT.
Cet effet de protection local pourrait contribuer à la résistance aux traitements de métastases osseuses. Nous avons étendu notre étude et nous montrons de la même manière que les milieux conditionnés d’ostéoblastes protègent de l’effet toxique induit par le traitement au SKI (Figure I).
Figure I : Les milieux ostéoblastiques protègent de l’effet du SKI
Les PC3 ont été traitées avec 2,5µM de SKI et incubées ou non en présence de milieu conditionné. La viabilité cellulaire a été évaluée au bout de 72 heures par test MTT.
Résultats II : la voie SphK1/S1P dans les interactions cellulaires au sein des foyers de métastases osseuses
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Milieu conditionné
Nous avons reproduit des résultats sensiblement identiques avec la lignée C4-2B, en revanche, nous ne sommes pas parvenus à observer ce type d’effet avec la lignée LNCaP.
c. Les milieux conditionnés d’ostéoblastes augmentent le pouvoir clonogénique des cellules prostatiques
Une des caractéristiques de l’agressivité tumorale est le pouvoir clonogénique de la cellule. Il correspond à la capacité d’une cellule à former un clone lorsqu’elle est isolée. Nous avons évalué le pouvoir clonogénique de nos lignées prostatiques. Dans les conditions que nous avons testées, la lignée faiblement métastatique LNCaP et la lignée qui en dérive, la C4-2B, sont incapables de former des clones. La lignée PC3, possédant un fort pouvoir métastatique, conduit à la formation de clones en 7 jours de culture. Nous montrons que l’ajout dans le milieu de culture de milieu conditionné par les ostéoblastes augmente le pouvoir clonogénique des cellules PC3 (Figure J). Le milieu conditionné (20%) permet à lui seul, de restaurer plus de 50% du pouvoir clonogénique de la lignée PC3.
Figure J : Les milieux ostéoblastiques augmentent le pouvoir clonogénique des PC3
Les PC3 ont été ensemencées à faible densité (10 000 cellules/cm²) puis incubées avec des quantités croissantes de milieu conditionné. Les clones formés sont comptés 7 jours après l’ajout du milieu.
Ces résultats (clonogénie, chimioprotection) montrent que l’environnement fourni par l’ostéoblaste favorise la survie de la cellule tumorale prostatique soumise à un stress. L’usage des milieux conditionnés suppose que l’effet est médié par l’existence de molécules capables d’effets paracrines.
* Docétaxel (10nM) ‐ + + + + + * 0% SVF 20% milieu conditionné 20% milieu conditionné + Ac anti S1P(5 μg/ml) 20% milieu conditionné ‘Scramble’
20% milieu conditionné ‘SiRNA anti‐SphK1’ (20nM)