Développement d'un modèle de culture d'explants de prostates humaine et de rat: Etude de l'effet de diverses hormones.
Par
NGUYEN LE XUAN KHAI
Département d'anatomie et de biologie cellulaire
Mémoire présenté à la Faculté de Médécine en vue de l'obtention du grade
de maitre ès sciences (M.Sc.)
l+I
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ISBN 0-315-98731-6
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ClUOlE-SUJET
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HUMANITÉS ET SCIENCES SOCIALES COMMUNICATIONS ET LES ARTS
Architecture ... 0729 Beaux-arts ... 0357 Bibliothéconomie ... 0399 Cinéma ... 0900 Communication verbale ... 0459 Communications ... 0708 Danse ... 0378 Histoire de l'art ... 0377 Journalisme ... 0391 Musique ... 0413 Sciences de l'information ... 0723 Théâtre ... 0465 ÉDUCATION Généralités ... 515 Administration ... 0514 Art··· ... 0273 Collèges communautaires ... 0275 ' Çommerce ... 0688 Çconomie domestique ... 0278 i;ducation permanente . . . ... 0516 J;ducation préscolaire ... 0518 Education sanitaire ... 0680 Enseignement agricole ... 0517 Enseignement b~ingue et mulliculturel ... 0282 Enseignement industriel ... 0521 Enseignement primaire ... 0524 Enseignement professionnel ... 07 47 Enseignement religieux ... 0527 Enseignement secondaire ... 0533 Enseignement spécial ... 0529 l;nseignemenl supérieur ... 07 45 Evaluation ... 0288 Finances ... 0277
Formation des enseignants ... 0530
Histoire de l'éducation ... 0520 Langues et littérature ... 0279 Lecture ... 0535 Mathématiques ... 0280 Musique ... 0522 Orientation et consultation ... 0519 Philosophie de l'éducation ... 0998 Physique ... 0523 Programmes d'études et ensei_gnement ... 0727 Psychologie ... 0525 Sciences ... 0714 Sciences sociales ... 0534 Sociologie de l'éducation ... 0340 Technol0gie ... 0710 lANGUE, LITTÉRATURE ET LINGUISTIQUE Lan~~éralités ... 0679 Anciennes ... 0289 Linguistique ... 0290 Moèlemes ... 0291 Littérature Généralités ... 0401 Anciennes ... 0294 Comr.arée ... 0295 Med1évale ... 0297 Moderne ... 0298 Africaine ... 0316 Américaine ... 0591 Anglaise ... 0593 t;~~âi~~~-~-. A~9i~i~~i. :: :: :: :: g~~g Canadienne !Française) ... 0355 Germanique ... 0311 Latino-américaine ... 0312 Moyen-orientale ... 0315 Romane ... 0313 Slave et est-européenne ... 0314 SCIENCES ET INGÉNIERIE SCIENCES BIOLOGIQUES Agriculture Généralités ... 0473 !fl~;n~Ï~~ ·~ïi;;;;h~~kigi~· . 0285 alimentaire ... 0359 Çulture ... 0479 Eleva9e et alimentation ... 0475
~lo1tation des P,éturages ... 0777
Pathologie animale ... 0476 Patholçigie v~étale ... 0480 Physiolpgie vegétale ... 0817 Syiyiculture et faune ... 0478 Technologie du bois ... 0746 Biologie Généralités ... 0306 Anatomie ... 0287 Biologie (Statisti~ues) ... 0308 Biol~ie moléculaire ... 0307 Botanique . ... .. .. ... .. .. ... .. .. ... 0309 Çellule ... 0379 Ecologie ... 0329 Entomologie ... 0353 Génétique ... 0369 Limnologie .. .. . .. ... ... . ... .. .. . . . 0793 Microbiologie ... 0410 Neurologie ... 0317 Océanographie ... 0416 Physiologie ... 0433 Radiation ... 0821 Science vétérinaire ... 0778 Zoologie ... 0472 Biophysique Généralités ... 0786 Medicale ... 0760 SCIENCES DE lA TERRE Biogéochimie ... 0425 GéOchimie ... 0996 Géodésie ... 0370 Géographie physique ... 0368 Géologie ... 0372 Géapliysique ... 0373 Hydrol99ie ... 0388 Minéralogie ... 0411 Océanographie physique ... 0415 Paléabotamque . . . .. ... .. . . ... 0345 Paléoécolog_ie ... 0426 Paléontolpg1e ... 0418 Paléozoologie ... 0985 Palynologie ... 0427 SCIENCES DE lA SANTÉ ET DE L'ENVIRONNEMENT Économie domestique ... 0386 Sciences de l'environnement ... 0768 Sciences de la santé Généralités ... 0566
Administration des hipitaux .. 0769
Alimentation el nutrition ... 0570 Audiologie ... 0300 Chimiothérapie ... 0992 Dentisterie ... 0567 Développement humain ... 0758 Enseignement ... 0350 Immunologie ... 0982 Loisirs ... 0575 Médecine du travail et thérapie ... 0354 Médecine et chirur9ie ... 0564 Obstétrique et gynecologie .. 0380 Ophtalmologie ... 0381 Orthophonie ... 0460 Pathologie ... 0571 Pharmacie ... 0572 Pharmacologie ... 0419 Physiothérapie ... 0382 Radiologie ... 0574 Santé mentale ... 0347 Santé publi<Jue ... 0573 Soins infirmiers ... 0569 Toxicologie ... 0383 PHILOSOPHIE, RELIGION ET THEOLOGIE Philosophie ... 0422 Religion Généralités ... 0318 Çlergé ... 0319 Etudes bibliques ... 0321
Histoire des reli_gions ... 0320
Philosophie de la religion ... 0322 Théologie ... 0469 SCIENCES SOCIALES
An~ft°~~~ie
... 0324 Culturelle ... 0326 Physique ... 0327 Oroit ... 0398 Economie Généralités ... 0501 Çommerce-Allaires ... 0505 Çconomie agricole ... 0503 Economie du travail ... 0510 Finances ... 0508 Histoire ... 0509 . Théorie ... 0511 Çtudes américaines ... 0323 i;tudes canadiennes ... 0385 Etudes féministes ... 0453 Folklore . . .. .. .. ... .. .. .. . . ... .. . . . .. . .. 0358 (;éographie ... 0366 Gérontol99ie ... 0351Gestion des affaires Généralités ... 0310 Administration ... 0454 Banques ... 0770 Comptabilité ... 0272 Marl<eting ... 0338 Histoire Histoire générale ... 0578 SCIENCES PHYSIQUES Sciences Pures Chimie Genéralités .... . ... 0485 Biochimie ... 487 Chimie agricole ... 07 49 Chimie anoriigue ... 0486 Chimie minera le ... 0488 Chimie nucléaire ... 0738 Chimie organique ... 0490 Chimie pliarmaceutique ... 0491 Physique ... 0494 PoiymÇres ... 0495 Raaiation ... 0754 Mathématiques ... 0405 Physi~ue Généralités ... 0605 Acoustique ... 0986 Astronomie et astrophysique ... 0606 Electronique et électricité ... 0607 Fluides et plasma ... 0759 Météorologie ... 0608 Optique ... . ... .. ... .. ... . ... 07 52 Particules (Physique nucléaire) ... 0798 Physique atomique ... 07 48 Physique de l'état solide ... 0611
Physique moléculaire ... 0609 Physique nucléaire ... 0610 Radiation ... 0756 Statistiques ... 0463 Sciences ~pliqués Et Technologie Informatique ... 0984 Ingénierie Généralités ... 0537 Agricole ... 0539 Automobile ... 0540
lo[1W
&
1
U·M·I
CODE DE SUJET Ancienne ... 0579Médiévale ... 0581
Moderne ... 0582
Histoire des noirs ... 0328
Africaine ... 0331 Çanadienne ... 0334 Etats-Unis ... 0337 Européenne ... 0335 Moyen-orientale ... 0333 Latino-américaine ... 0336
Asie, Australie et Océanie ... 0332
Histoire des sciences ... 0585
Loisirs ... OB 14 Planification urbaine el régionale ... 0999 Science politique Généralités ... 0615 Administrotion publique ... 0617 Droit et relations intemotionales ... 0616 Sociologie Généralités ... 0626
Aide et bien-àtre social ... 0630
Criminologie et étoblissements pénitentioires .. . . ... 0627 OémograRhie ... 0938 Etudes de I' individu et . de la Famille ... 0628
Etudes des relotions interethniques et des relotions raciales ... 0631
Structure et développement social ... 0700 Théorie et méthodes ... 0344 Travail et relations industrielles . .. . . . ... 0629 T rans8orts ... 0709 Travail sociol ... 0452 Biomédicale ... 0541 Chaleur et ther mc9rnamique ... 0348 Conditionnement (Emballage) ... . ... 0549 Génie aérospatiol .. . . ... 0538 Génie chimique ... 0542 Génie civil ... 0543 Génie électronique el électrique ... 0544 Génie inilustriel ... 0546 Génie mécomque ... 0548 Génie nucléaire . . . . 0552
ln!Jénierie des systëmes ... 0790
Mecanique navale ... 0547
Métallurgie . . . ... 07 43 Science aes matériaux ... 0794
Technique du flétrole ... 0765 Technique minière .... .. . .. 0551 Techniques sanitaires et municipales. . ... 0554 Technologie hydroulique ... 0545 Mécanique appliquée ... 0346 Géatechnolog1e ... 0428 Matières plastiques (Technologie) ... 0795 Recherche opérationnelle ... 0796
Textiles et tissus (Technologie) ... 0794
PSYCHOLOGIE Généralités ... 0621 Personnalité ... 0625 Psychobiologie ... 0349 Psychologie clinique ... 0622 Psychologie du comportement .... 0384 Psychologie du dévelopP!!ment . 0620 Psychologie expérimentale ... 0623 Psychologie industrielle ... 0624 Psychologie phxsiologique ... 0989 Psycholo9ie sociale ... 0451 Psychometrie ... 0632
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U·M-1
SUBJECT TERM SUBJECT CODE
Subject Categories
THE HUMANITIES AND SOCIAL SCIENCES
COMMUNICATIONS AND THE ARTS Psychology 0525 PHILOSOPHY, RELIGION AND Ancrent 0579 Architecture 0729 Reod"ng . 0535 THEOLOGY Med1evol 0581
Art H1story .... 0377 Rel gious 0527 Phrlosophy 0422 Modern 0582
Cinemo .. 0900 Sciences 0714 Re ~n Block 0328
Dance 0378 Secondory 0533 ne roi 0318 Africon 0331
Fine Arts 0357 Soc1ol Sciences 0534 B"blrcol Stud es 0321 As10, Austrol o ond Oceonio 0332 lnlormohon. Sc"ence . 0723 Soc"ology of 0340 Cergy .0319 Co nad· an 0334 Journolism . 0391 Speciol ... . 0529 Hrstory of 0320 Europeon 0335 Libre')' Sc ence.. .. .:. 0399 T eocher Tra ning . . 0530 P losophy of 0322 Latin Americon 0336 Moss Commun"cotions 0708 Technol:d% . 0710 Theology ... 0469 Middle Eastern 0333
Music 0413 Tests on eosurements 0288 United States 0337
S~eech Communicot1~~ . 0459 Vocotionol 0747 SOCIAL SCIENCES H1story of Sc ence 0585
T eoter .... 0465 Amencon Studres 0323 Law . 0398
lANGUAGE, LITERATURE AND Anthropologk Po t col Science
EDUCATION LINGUISTICS Archoeoogy 0324 Gene roi 0615
Gene roi 0515 International Law and
Administrai n 0514 Lon~ge Cultural 0326 Relations 0616
Adult and Continuing . .0516 Ancient nerol 0679 0289 Bus ness Admin1strot1on Physrcol 0327 Public Administration 0617 Agnculturol ... 0517 L ngu stics 0290 Gene roi 0310 Recreotion 0814
Art 0273 Social Work 0452
Brlinguol and Multiculturol 0282 Literoture Modern 0291 Accounting Bon king 0272 0770 Sociology
Business 0688 Generol 0401 Management 0454 Gene ra 0626
Community College .. 0275 Clossrcol 0294 Marketing 0338 Cnminol~ and Penology 0627 Curriculum and Instruction 0727 Comporotrve 0295 Conod on Stud es 0385 Demogrop
lc
0938 Eorly Chrldhood 0518 Medrevol 0297 Economies Ethnie and ociol Studres 0631 Elementory 0524 Modern 0298 Generol 0501 lnd1v1duol and FomrlyF nonce 0277 Africon 0316 Agnculturol 0503 Studres 0628
Guidance and Coun~e-ling 0519 lndustnol and Lobor
Heolth 0680 Amencon As on 0591 0305 Commerce Business F nonce 0505 0508 Relot ons 0629 H1gher 0745 Canadien !Englrsh) 0352 H story 0509 Public and Social Wellore 0630
H1story of 0520 Social Structure and
Home Ec nom s 0278 Conod on French) Engl1sh 0355 0593 Theory Lo bar 0510 0511 Development . 0700 lndustnol 0521 Germanie 0311 Fo k ore 0358 Theory and Methods 0344 Lon~uoge a d L teroture 0279 Latin Amer con 0312 Geogrophy 0366 T ronsportot on 0709 Mo emotics 0280 Middle Eastern 0315 Gerontology 0351 Urban and Rjronol Planning 0999
Music 0522 Romance 0313 H story Women' s Stu es 0453
Phrlosophy of 0998 Slovrc and East Europeon 0314 Generol 0578 Physrcol 0523
THE SCIENCES AND ENGINEERING
BIOLOGICAL SCIENCES Geodesy 0370 Speech Pothology 0460 Engineenn~
Agriculture Geol~y 0372 Tox cology 0383 Gene ra 0537
Gene ra 0473 Geopliys1cs 0373 Home Econom s 0386 AerosRCJce 0538
Agronomy 0285 ~drology . 0388 Agnculturo 0539
An ma u ture and nerology 0411 PHYSICAL SCIENCES Auto motive 0540 Nutnt on 0475 Poleobotony 0345 Pure Sciences B1omed1co 0541
An ma Potho~ 0476 Poleoecology 0426 Chem1col 0542
Food Sc ence and Po eonto ogy 0418 Chem stry Generol 0485 (vil 0543
Technol~ 0359 Poleozoology 0985 Agnculturol 0749 Electronrcs and Electricol 0544
ForestG n Wrldlrfe 0478 Paynolffi 0427 Heot and Thermodynomrcs 0348 Plant ulture ... 0479 Physrcol eogrophy 0368 Ana yt1col 0486 Hydroul1c 0545 Plant Po h ogy 0480 Phys col Oceonogrophy 0415 B ocliemistry 0487 lndustnol 0546
Plant Phy ology 0817 nor}!an c 0488 Manne 0547
0777 HEALTH AND ENVIRONMENTAL Nue eor 0738 Motenols Sc ence 0794
Ronge Management Orgon c 0490
Woèid e nology 0746 SCIENCES Mechonico 0548
Brol~ nera 0306 Envrronmentol Sciences 0768 Phormoceutrcol Phhs1col 0491 0494 Metollurgy 0743
Heo th Sciences PoY,mer 0495 Mining 0551
Anotomy 0287 Generol 0566 Roarotion 0754 Nucleor 0552
Biostofst 0308 Audol~ 0300 Mothemotics 0405 Pockoging 0549
Botony 0309 Chemot eropy 0992 Physrcs Petroleum 0765
Cell 0379 Sanitory and Mun1c1pol 0554
Ecology 0329 Dentistry 0567 Generol 0605 Sy lem Science 0790
0353 Education 0350 Acoust1cs 0986 Geotechnology 0428
Entomoogy Hospital Management 0769 Astronomy and
Genetics 0369 Operotions Reseorch 0796
Lrmno~ 0793 Humon Development 0758 Astrohhys es 0606 Post cs Tech no ogy 0795 M1crob10 ogy 0410 lmmunology Medicine and Surgery 0982 0564 Atrnosp enc Science Atomrc 0608 0748 Textile T echnology 0994 Molec a 0307 Mental Heolth 0347 E ectronics and Electr1c ~ 0607 PSYCHOLOGY
Neuroscience 0317 Nursing 0569 E ementory Portrcles on
Oceonogrophy 04 6 Nutrrton 0570 HJ!h Energy 0798 Gene roi 0621 Behov1orol 0384 Phys ology 0433 Obstetrrcs and. Gynecol:JD'
Radiation 0821 0380 F u1 and Plasma 0759 Clinicol 0622 Veter nory Sc ence 0778 Occupohonol Heolth on Moleculor 0609 Developmentol 0620 Zoology ... 0472 Therofry 0354 Nue eor . 0610 Excknmentol 0623 B"ophy 1c Ophtho mology 0381 Optics 0752 ln ustr1ol 0624
0786 Pothology 0571 R d oton 0756 Personolrty 0625
Gene a Phormocology .. 0419 Solrd Stole 0611
Medrcol 0760 Phormot 0572 Stot s es 0463 Phys olpgrcol 0989
Phbs1co heropy 0382 Psychobrology 0349
EARTH SCIENCES Pu Ire Heolth 0573 Applied Sciences Psychometncs 0632 Brogeo hem stry 0425 Rodrology 0574 App ed Mechonics 0346 Soco 0451
l'amour, la confiance et le courage
TABLE DES MATIERES
Titre ... i
Table des matières ... ii
Liste des illustrations ...•... vii
Liste des abréviations ... xi
Résumé ...•...•...•.•...•...••••...•. xiii
I - INTRODUCTION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1 II- MATÉRIELS ET MÉTHODES ••••••••••••••••••••••••••••••• 18 1. 1.1 1.2 2. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.4.1 2.4.2 2.5 3 . 3.1 3.2 Matériels ...•...•... 18 Anima 1 ....•...••..••....•.•..•••.•..•.•••...• 18 Humain •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18 Méthodes de culture .••...••... 19 Instruments ...•...•... 19 Milieux de culture ... 20
Les gaz utilisés en culture ...•... 20
Mise en culture ...•...•... 20
Modèle animal .•...• · •.•••••...•••.•...••...•....• 2 0 Modèle humain ...•.•.••...•..•...•. 21
Incorporation de précurseurs radioactifs ... 22
Analyses rnorphologiques ... 23
Fixation, déshydratation, et inclusion ... 23
3.3 Autoradiographie ... 24
4. Analyses biochimiques ... 24
4. 1 Homogénéisation . ... 24
4.2 Mesure de la synthèse d'ADN ... 25
4.3 Mesure de la synthèse de protéines ... 26
4. 4 Dosages enzymatiques ... 2 6 4.4.1 Phosphatase acide ... 26
4.4.2 Phosphatase alcaline ... 26
4.5 Expression des résultats ... 27
4. 6 Statistiques . ... 2 7 III- RÉSULTATS 1. Développement d'un modèle de culture organotypique de prostate de rat ... 28 1.1 Observations macroscopiques ... 28 1.2 1. 2 .1 1. 2. 2 1. 2. 3 1. 3 1. 3 .1 1. 3. 2 1.4 1. 4 .1 Observations microscopiques ... 29 Microscopie optique ... 29
Microscopie électronique à transmission ... 30
Microscopie électronique à balayage ... 31
Comparaison de deux milieux ... 31
Comparaison des milieux L-15 et CMRL avec le mé-lange de gaz 95%02 - 5%C02 ••••••••••••••••••••••• 32 Comparaison des milieux L-15 et CMRL avec le mélange de gaz 50%N2 - 45%02 -5%C02 •••••••••••••• 32 Comparaison de deux mélanges de gaz ... 33 Comparaison de deux mélanges de gaz avec le
mi-lieu L-15 ... 33
1.4.2 Comparaison de deux mélanges de gaz avec le milieu CMRL ••..••.••...•...•••.••...••... 3 3 2. Effet de l'insuline sur la croissance prostatique en culture . ... 34 2.1 Synthèse d'ADN ... 34 2.2 Synthèse de protéines ... 34 2.3 Activités enzymatiques ... 35 2.4 Autoradiographie ... 35 2.5 Observations microscopiques ... 36
3. Effet de la transferrine sur la croissance prosta-tique en culture ... 36
3.1 Synthèse d'ADN ... . 37
3.2 Synthèse de protéines ... 37
3.3 Activités enzymatiques ... 37
3.4 Observations microscopiques ... 37
4. Effet de la combinaison insuline-transferrine ... 38
4.1 Synthèse d'ADN ... 38 4.2 Synthèse de protéines ... 38 4. 3 Activités enzymatiques ... 39 4. 4 Observations microscopiques ... 39 5. Effet de l'androstanediol ... 39 5 .1 Synthèse d 'ADN . ... 40 5.2 Synthèse de protéines ... 40 5.3 Activités enzymatiques ... 40 5.4 Combinaison androstanediol-insuline-transferrine .. 40
6. Effet de la testostérone ... 41 6.1 Synthèse d'ADN ... 41 6.2 Synthèse de protéines ... 41 6.3 Activités enzymatiques ... 41 6.4 Observations microscopiques ... 41 6.5 Combinaison testostérone-transferrine-insuline .... 42 6.6 Observations macroscopiques ... 42 7. Effet du DHT . ... 42 7.1 Synthèse d'ADN ... 43 7.2 Synthèse de protéines ... 43 7. 3 Activités enzymatiques ... 43 7.4 Combinaison DHT-transferrine-insuline ... 43 7.5 ùbservations microscopiques ... 44
8. Développement d'un modèle de culture prostatique .. 44
8.1 Viabilité ... 45
8. 2 Morphologie . ... 45
8.3 Combinaison transferrine-insuline ... 46
8.3.1 Synthèse d'ADN ... 46
8.3.2 Synthèse de protéines ... 47
8.4 Effet de l'androstanediol,DHT et testostrone ... 47
8.5 Activités enzymatiques ... 47
8.6 Observations microscopiques ... 48
8.6.1 Microscopie optique ... 48
IV DISCUSSION . ... 49
2. Étude sur la prostate de rat en culture ... 55 2 . 1 Morphologie . ... 5 6 2 .1.1 2 .1. 2 2 .1. 3 3. Microscopie optique ... 56 Microscopie électronique ... 58 Microscopie à balayage ... 60
Étude de l'effet de l'insuline et transferrine sur la prostate de rat ... 61
3.1 Prolifération cellulaire ... 63
3. 2 Morphologie . ... 65
3.3 Synthèse protéique et activités enzymatiques ... 66
4. Étude de l'effet des androgènes sur la prostate
en culture . ... 68
4.1 Prolifération cellulaire ... 70
4. 2 Morphologie . ... 7 3
4.3 Synthèse protéique et activités enzymatiques ... 74
5. Étude de la prostate humaine en culture ... 75
5. 1 Morphologie . ... 7 6
5.2 Etude de l'influence des facteurs sur la prostate
humaine en culture ... 77 V- CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 80 REMERCIEMENTS •..••..•.•...•••••.•••••....•.•...••• 8 5 BIBLIOGRAPHIE . ... 87 FIGURES ANNEXES
LISTE DES· ILLUSTRATIONS Figures 1 et 2 3 et 5 6 et 7 8 et 9 10 et 11
Morphologie de la prostate de rat au début de la culture (jour O; plus 6 heures de culture) avec le milieu L-15
Morphologie de la prostate de rat après 5 jours de culture avec le milieu L-15
L'effet de l'insuline et de la combinaison insuline-transf errine sur la morphologie de la prostate de rat
L'effet de la transferrine sur la morphologie de la prostate de rat
Effet de la testostérone et de la combinaison testostérone-insuline-transf errine
morphologie de la prostate de rat
sur la
12 et 13 Effet du DHT et de la combinaison DHT-insuline-transferrine sur la morphologie de la prostate de rat
la culture (jour O, plus 6 heures de culture): analyse au microscope électronique
23 et 24 L'ultrastructure de la prostate au début et après 5 jours de culture: analyse au microscope
électronique
29 et 30 Etude de la comparaison de 2 milieux en culture prostatique: L-15 de Leibovitz et CMRL
31 et 32 Etude de la comparaison de 2 mélanges de gaz en culture prostatique
33 Différentes concentrations de transferrine et d'insuline sur la culture de la prostate de rat
34 et 35 Effets de l'insuline et de la transferrine sur la prolifération cellulaire de la prostate de rat en culture:synthèse d'ADN et de protéines
36 et 37 Effet de l'insuline et transferrine sur les activités enzymatiques
38 Différentes concentrations d'androstanediol sur l'incorporation de thymidine-H3
cellulaire de prostate en culture: synthèse d'ADN et de protéines
41 et 42 Effet de l'androstanediol sur les activités
43
spécifiques de la phosphatase acide et de la phosphatase alcaline
Différentes concentrations de testostérone et DHT sur la culture prostatique
44 et 45 Effet de l'insuline et testostérone sur la prolifération cellulaire prostatique: synthèse d'ADN et de protéines
46 et 47 Effet de l'insuline et testostérone sur les activités spécifiques de la phosphatase acide et de la phosphatase alcaline
48 et 49 Effet de l'insuline, la transferrine et la testostérone sur la prolifération cellulaire: synthèse d'ADN et protéines
50 et 51 Effet de la combinaison insuline-DHT sur la prolifération cellulaire :synthèse d'ADN et
52 et 53 Effet de la combinaison insuline-transf errine-DHT sur la prolifération cellulaire de prostate en culture: synthèse d'ADN et de protéines
54 et 55 Effet de la combinaison insuline-transf errine-DHT sur les activités spécifiques de la phosphatase acide et la phosphatase alcaline
56 Culture de la prostate humaine durant 2 semaines: synthèse d'ADN
57 et 58 Effet de l'insuline et transferrine sur la prolifération cellulaire de prostate humaine en culture:synthèse d'ADN et de protéines
59 et 60 Effet de différentes hormones sur la prolifération cellulaire de la prostate en culture: synthèse d'ADN et protéines
61 et 62 Effet de différents facteurs sur les activités spécifiques de la phosphatase acide et la
LISTE DES ABREVIATIONS Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique Androstanediol Bioxyde de carbone Concentration molaire Concentration normale
Connaught Medical Research Laboratories Curie
Degré Celsius
Désintégration par minute Dihydrotestostérone Figure Figures Gramme Heure Insuline Insuline-dihydrotestostérone Insuline-transf errine Insuline-transf errine-androstanediol Insuline-transf errine-Dihydrotestostérone Insuline-transf errine-testostérone Kilodalton Leucine tritiée Microgramme Micro litre ADN ARN A
co
2 M N CMRL Cioc
DPM DHT fig. f igs gr h I I-DHT I-Tr I-Tr-A I-Tr-DHT I-Tr-T kD Leu-H3 µg µlMicromole
Milieu de culture-formulation de Leibovitz Millilitre
Millimètre Mil li unité Minute Nanogramme
Pression des ions hydrogène Révolutions par minute
Testostérone Thymidine tritiée '.L'ransferrine µmole L-15 ml mm
mu
min ng pH RPM T TdR-H3 TrRESUME
Les objectifs de notre projet à court terme sont de développer un modèle de culture de prostates humaine et de rat et d'étudier les effets de différents facteurs. Cette première partie se veut une étape vers l'atteinte d'un objectif à plus long terme: soit d'identifier un marqueur permettant de déterminer le potentiel évolutif de spécimens prostatiques tumoraux. Nous avons donc travaillé avec un modèle de culture organotypique de prostates de rat et humaine permettant d'isoler l'organe des influences complexes de l'organisme. Notre modèle de culture permettait de travailler dans un environnement entièrement contrôlé grâce à un milieu exempt de sérum et d'hormones. Avec ce modèle, nous avons vérifié les effets de certains facteurs: l'insuline, la transferrine, l'androstanediol, la testostérone et la dihydrotestostérone sur la prolifération cellulaire, les activités enzymatiques et sur la morphologie de prostates de rat et humaine.
Des explants de prostates de rat et humaine ont été maintenus en culture pendant 5 jours dans le milieu L-15 de Leibovitz et dans un atmosphère de 95% 02 -5% Co2 La synthèse d'ADN a été stimulée par les 3 androgènes; soit seul ou en combinaison avec l'insuline et la transferrine. La transferrine seule n'influence pas la synthèse d'ADN; mais
lorsque combinée avec l'insuline, l'effet de cette dernière.
elle vient potentialiser
La synthèse des protéines n'est pas modifiée par ces
facteurs individuels, à l'exception du DHT; seulement les
combinaisons I- DHT; I-Tr-DHT et I-Tr-T stimulent la synthèse
des protéines après 5 jours de culture. Les activités
enzymatiques ne sont pas influencées par ces facteurs. La phosphatase acide se maintient au cours de la culture, alors que la phosphatase alcaline est augmentée après 5 jours. La morphologie de la prostate de rat a été bien conservée en culture en présence de: I-Tr, dihydrotestostérone et la
testostérone. En effet, ces hormones agissent sur
l'épithélium au cours de la culture. L'épithélium demeure haut cylindrique, et la lumière contient des produits de sécrétion. L 'ul trastructure a été également bien conservée
après 5 jours de culture. Le cytoplasme des cellules
épithéliales est rempli par du réticulum endoplasmique
rugueux et des organites denses aux électrons, lesquels sont
probablement des lysosomes. On observe aussi la présence
abondante de microvillosités apicales. Les observations au
microscope électronique à balayage révèlent bien la présence
de microvillosités et qu'il existe plusieurs formes de cellules épithéliales: ronde, ovale et allongée.
D'après nos expériences, notre modèle permet de maintenir les explants de prostates de rat in vitro et d'étudier la prolifération cellulaire par des techniques biochimiques. Donc, ce modèle permettra peut- être l'atteinte de l'objectif à long terme soit l'identification d'un ou des marqueurs permettant de déterminer le potentiel évolutif du cancer de la prostate.
D'autre part, nos résultats préliminaires ont démontré pour la première fois que des explants prostatiques humains peuvent être cultivés dans du milieu L-15 de Leibovitz sans sérum, pendant 2 semaines. Nous avons également étudié les effets de plusieurs hormones sur la prolifération cellulaire. Nos résultats ont démontré qu'aucun des facteurs étudiés (insuline, transferrine, androstanediol, testostérone et dihydrotestostérone) influençait la synthèse d 'ADN et des protéines. Les activités enzymatiques de la phosphatase acide et de la phosphatase alcaline se maintiennent tout au long de la culture, mais ne sont pas modifiées par ces facteurs. Les données restent encore à confirmer. Nous croyons que cette deuxième partie du projet est très intéressante et nous souhaitons que d'autres travaux viendront compléter ceux-ci pour permettre de trouver un nouveau paramètre qui rendra possible la détection du cancer de la prostate à un stade plus précoce, et la détermination de son potentiel évolutif.
1- INTRODUCTION
Le cancer de la prostate est une cause importante de mortalité chez les hommes; et quatre-vingt-dix pourcent (90%) de ces cancers sont des adénocarcinomes. Ils se développent en général après 45 ans, à l'âge ou s'amorce l'hypertrophie bénigne (adénome). On ne connait pas pour l'instant la relation entre l'hypertrophie bénigne et le cancer. On compte chaque année, seulement aux États-Unis, environ 70 cas de cancer par 100 000 habitants(Young et al.1985). Le taux de mortalité des personnes atteintes peut aller jusqu'à 50%(Young et al. 1985) et il représente la deuxième cause de mortalité après celui des poumons. On dénote aussi une différence importante du taux de mortalité par le cancer de la prostate selon les races et les régions étudiées ( Catalona et Scott 1986). Cependant, le statut socio-économique, l'activité sexuelle, les maladies vénériennes ne sont pas impliqués dans l'augmentation du risque du développement du cancer prostatique(Wynder et al 1984). Plusieurs études suggèrent que la consommation de gras peut être un facteur de risque important(Rotkin 1977, Berg 1975). Des études récentes montrent que les liens génétiques peuvent être un facteur de risque; ceci est surtout relié au statut hormonal et notamment au contenu plasmatique en androgènes. On a noté une concentration de testostérone plasmatique se situant dans la limite inférieure des valeurs normales chez les hommes qui ont
un lien familial avec des patients atteints du cancer prostatique(Meike et al. 1985). Cependant, il est encore trop tôt pour montrer une relation entre ces facteurs de risque et la cause de la maladie elle-même. Pour l'instant, la plupart des efforts sont concentrés sur les méthodes de détection et de traitement du cancer de la prostate et les méthodes de dépistage sont: l) Mesure du PSA sérique 2) toucher rectal et 3) échographie transrectale. Une des principales raisons du diagnostic tardif du cancer de la prostate est l'absence de douleurs ou autres symptômes au cours des nombreuses années pendant lesquelles la tumeur progresse au niveau de la prostate elle-même. Si l'on désire mettre en évidence le cancer de la prostate à un stade précoce, l'on ne doit pas compter sur une stratégie reposant sur l'apparition de symptômes ou de signes cliniques. En effet, lorsque les symptômes ou les signes cliniques deviennent perceptibles, il est habituellement trop tard pour offrir un traitement curatif. Toutefois, il est possible qu'un diagnostique précoce, à un moment où le cancer est encore limité à la prostate, permettrait l'utilisation de techniques curatives qui ne sont pas disponibles à un stade plus avancé de la maladie, soit la prostatectomie radicale, et la radiothérapie.
Le moyen de contrôle le plus important pour le traitement du cancer prostatique est la détection précoce de la tumeur lors des premiers stades évolutifs, alors qu'il y a absence de métastases et que la capsule prostatique est encore intacte. Des changements anatomiques, histologiques et biochimiques accompagnent la progression de la tumeur, mais souvent de tels changements passent inaperçus au cours des premiers stades de la maladie, alors qu'il y a absence de signes cliniques évidents. En 1956, Whitmore fut le premier à classifier l'état de propagation de la tumeur selon son stade évolutif, en stade A,B,C,D. Il faut noter qu'aux stades A,B et C ,la tumeur est localisée à la prostate. Le stade A est diagnostiqué par le pathologiste après une chirurgie chez des patients atteints d'hyperplasie prostatique . La présence de foyers dans moins de 5% du tissu examiné, définit le stade A-1 et dans plus de 5% du tissu examiné, définit le stade A-2. Au stade B la tumeur est palpable; la présence de nodule dans un seul lobe de moins 1,5 cm de diamètre, définit le stade B-1 et s'il est plus gros que 1,5 cm ou qu'il touche les deux lobes , il s'agit du stade B-2.
STADE C: la tumeur est au stade
c,
quand il y a extension des foyers tumoraux hors de la capsule prostatique, et/ou dans la vésicule séminale. Le stade D est subdivisé enstades:
quatre
mais avec un APS (antigène prostatique spécifique) élevé. D-1 se définit par l'absence d'extension locale autre que les vésicules séminales et/ou la présence de métastases ganglionnaires.
D-2 se définit par la présence de métastases à distances (osseuse ou viscérale).
D-3 se définit par un stade métastasique à distance qui après une réponse positive aux traitements hormonaux échappe à l'action du traitement.
L'HYPERTROPHIE BÉNIGNE DE LA PROSTATE: L'hypertrophie de la prostate est le désordre le plus commun chez les hommes âgés de 50 ans et plus. 75% des mâles dépassant cet âge manifestent des signes d'hyperplasie bénigne de la prostate ( HBP) . Cet état est caractérisé par la formation de nodules(60 à 200 gr) dans la région transitionnelle périurétrale de la prostate, ce qui comprime le canal urétral et cause souvent une obstruction partielle ou complète de l'urètre. Bien que la cause exacte de ce développement demeure incertaine, plusieurs données suggèrent une implication des androgènes et des oestrogènes; d'autres facteurs non hormonaux peuvent aussi être impliqués.
L'âge et la présence des testicules sont deux éléments essentiels à l'apparition de l'HBP. Plusieurs études démontrent qu'avec l'âge, il y a une augmentation graduelle du poids moyen de la prostate. Ceci est accompagné par une
augmentation significative du taux d'apparition d'HBP. Les nodules hyperplasiques sont rares chez les mâles âgés de moins de 40 ans et inexistants chez les hommes dont l'âge est inférieur à la trentaine. En 1940 Huggins fut le premier à postuler une implication des gonades dans l'apparition de l'hyperplasie prostatique. Il a constaté que l'HBP est rare et quasi inexistante chez les hommes castrés avant l'âge de 40 ans. D'autres ont rapporté que la castration cause une régression de la tumeur hyperplasique, mais ce ne sont pas tous les patients castrés qui répondent à ce traitement. Dans tous les cas étudiés, on note une atrophie des acini prostatiques et la phase sécrétoire des tissus glandulaires est absente(Wendel et al. 1972).
ANATOMIE ET PHYSIOLOGIE DE LA PROSTATE:
La prostate est un organe complexe, principalement glandulaire qui entoure la partie initiale de l'urètre chez les hommes. Elle est située au- dessous de la vessie, en avant du rectum et repose sur le plancher périnéal; elle pèse environ 20 grammes chez le jeune adulte.
La prostate est la cible de plusieurs maladies infectieuses et néoplasiques, mais ceci n'empêche pas de la considérer jusqu'à date comme la glande la moins comprise du corps humain. Organe sexuel secondaire, elle joue un rôle important dans la biologie de la reproduction, elle donne aux
spermatozoides produits par les testicules certains éléments de base qui assurent la viabilité et la mobilité. La prostate est formée d'alvéoles essentiellement composées de cellules épithéliales formant des acini sécréteurs et des tubules qui assurent le drainage des sécrétions prostatiques vers l'urètre. Les alvéoles sont ancrées dans un stroma fibromusculaire. La constitution anatomique de la prostate a suscité beaucoup de controverse, selon Gil- Vernet: il existe une portion inférieure caudale et une portion supérieure craniale séparée par une zone de transition: La prostate intermédiaire. La prostate caudale représente l'ensemble des acini glandulaires dont les canaux excréteurs s'ouvrent dans l'urètre au- dessous d'un plan horizontal. Ces acini glandulaires se répartissent en trois lobes: un lobe antérieur et deux lobes postéro-latéraux. La prostate craniale, représentée par l'ensemble des acini qui s'abouchent au-dessus de la partie médiane du colliculus séminal(et c'est dans cette zone que l'on trouve l'adénome de la prostate). Finalement, la glande intermédiaire est l'ensemble des glandes prostatiques dont les canaux excréteurs s'ouvrent dans l'urètre. Cette division anatomique de Gil-Vernet a été modifiée par le travail de Mcneal, lequel fait une étude de la composition interne de la prostate qui est sans doute plus facile à reproduire en pratique médicale puisqu'elle représente fidèlement ce que l'on retrouve en transrectale. Mcneal décrit la prostate comme étant divisée en cinque zones
différentes (Mcneal 1981): l)le stroma antérieur, de nature fibromusculaire, couvrant totalement la section antérieure de la prostate qui représente le tiers de cet organe et il est dépourvu d'éléments glandulaires. 2) la zone périphérique représente la plus grande division anatomique de la prostate; cette zone contient 75% du total des tissus glandulaires de la prostate. Ses acini sont petits avec des contours réguliers; c'est dans cette région que prennent naissance des foyers du cancer de la prostate. 3) la zone centrale, plus petite que les deux zones décrites ci-haut; elle représente 25% de la masse prostatique et se caractérise par des acini larges avec des contours irréguliers; l'apparition du cancer est très rare dans cette zone. 4) le tissu préprostatique, formé d'un mélange de tissus stromal et glandulaire; il entoure la partie antérieure de l'urètre et joue le rôle d'un sphincter qui empêche l'entrée du liquide séminal dans la vessie lors de l'éjaculation; cette zone contient moins de 1% de la masse glandulaire prostatique. 5) la zone de transition représente 5% de la partie glandulaire, ses canaux sont plus branchés que ceux de la zone prostatique. Les deux dernières zones mentionnées, malgré leur petite taille représentent les sites exclusifs de l'apparition de l'hyperplasie bénigne de la prostate.
HISTOLOGIE DE LA PROSTATE:
tissus, l'épithélium et le stroma. Les études embryologiques et morphologiques(Aumuller 1983 ) ont montré que ces deux types de tissus ne peuvent pas être vus comme deux entités séparées, car une liaison physique, assurée par des facteurs endogènes font de ces deux types tissulaires une seule unité fonctionnelle.
Quantitativement, la partie stromale de la prostate normale est égale à 45%, alors que l'épithélium ne représente pas plus de 21%. Cependant c'est ce dernier qui donne à la prostate son rôle glandulaire.
L'ÉPITHÉLIUM PROSTATIQUE: L'épithélium prostatique est composé de deux types de cellules: a)les cellules sécrétrices et les cellules basales. Les cellules sécrétrices sont des cellules épithéliales matures, bien différenciées, cylindriques avec un noyau sphérique localisé près de la base de la cellule. Les appareils de Golgi sont très abondants.(Aumuller 1983, Brandes et Groth. 1963). Ces cellules confèrent à la prostate sa principale activité sécrétrice,une fonction qui dépend largement de la présence d'androgènes. Plusieurs marqueurs de la sécrétion prostatique sont déjà connus. Les plus importants sont: la phosphatase acide et le APS (antigène prostatique spécifique).
moins abondantes que les cellules sécrétrices, représentent 10% des cellules épithéliales. Morphologiquement, elles sont rondes ayant un cytoplasme peu abondant et un noyau volumineux qui se caractérise par son contour irrégulier. Ces cellules sont peu différenciées et ne contiennent pas de produits de sécrétion (Brandes et Groth 1963). Elles sont des cellules de remplacement.
LE STROMA PROSTATIQUE: Le stroma prostatique est constitué de tissu conjonctif assez dense, de vaisseaux sanguins, de nerfs et surtout de fibres musculaires lisses d'orientations diverses. Le rôle fonctionnel du stroma prostatique n'est pas encore élucidé. Chez l'adulte il forme par ses cellules musculaires, un facteur stabilisant de la structure de la partie glandulaire. Le stroma sert aussi comme élément de propulsion des sécrétions prostatiques. Les fibroblastes du stroma produisent du collagène qui joue un rôle important dans la multiplication des cellules épithéliales. Durant l'ernbryogénèse, le mésenchyme du sinus urogénital(précurseur du stroma prostatique), joue un rôle déterminant lors de la formation de la partie glandulaire de la prostate(Cunha 1984).
CONTROLE HORMONAL DE LA PROSTATE: La prostate est un organe hormona-dépendant et la présence de testostérone est essentielle à son développement et à sa différenciation;
cependant plusieurs autres facteurs entrent en ligne de compte pour sa croissance .
L'hypophyse produit sous l'effet du LHRH provenant de l 'hypothalamus, quatre hormones peptidiques. La LH qui stimule les testicules à produire de la testostérone et la FSH qui .stimule la spermatogénèse. La prolactine qui joue un rôle plus ou moins direct dans le développement et la différenciation prostatique. L 'ACTH stimule la production de l 'androstènedione par le cortex surrénalien. De plus l 'estradiol, qui est produit principalement chez les mâles par la conversion périphérique d'une faible quantité de testostérone et d'androstènedione par l'aromatase joue un rôle lors du développement prostatique(Macdonald et al. 1979).
Les concentrations périphériques d'androgènes et d' oestrogènes contrôlent par rétro-inhibition la sécrétion des hormones peptidiques hypophysaires (Sheridan et al. 1979). Chez l'homme la testostérone est le principal actif circulant dans le sang, elle est produite par les testicules à 95%. D'autres stéroides tels que l'androstènedione et la dihydroépiandrostérone peuvent être convertis dans le sang périphérique chez l'homme. Donc, après la synthèse, la testostérone est sécrétée dans le sang et transportée vers les cellules cibles pour exercer son action biologique. La majeure partie, soit 95% de la testostérone circulante est liée à des
protéines plasmatiques globulin), l'albumine
dont: le SHBG(sex hormone binding et le CBG(corticostéroid binding globulin). Dans la prostate, la testostérone pénètre dans la cellule cible par diffusion passive ôu elle sera convertie en DHT(dihydrotestostérone); plus précisément dans la partie stromale par un enzyme, la 5 a- réductase. Cette réduction est essentielle à l'action biologique. Cependant, dans plusieurs organes cibles, où il y a absence de 5 a- réductase, la testostérone agit probablement d'une façon directe. Dans notre projet de recherche, nous avons travaillé avec 3 de ces
androgènes:l'androstènedione, dihydrotestostérone.
la testostérone
ROLES PHYSIOLOGIQUES DES ANDROGENES:
et la
La testostérone et d'autres androgènes ont certaines activités biologiques au niveau de plusieurs tissus du corps; leurs actions les plus importantes sont:
1) la production d'une différenciation des canaux de Wolff.
2) La stimulation de la rétention d'azote pour le développement musculaire et du gain de poids chez l'adolescent et l'adulte.
3) Le développement et la maturation des organes
génitaux primaires et secondaires( pénis, scrotum, prostate, vésicule séminale, etc.).
4) La stimulation du développement des caractères sexuels secondaires chez les mâles, tels que le développementdu larynx, l'élargissement des cordes vocales, l'apparition des poils,etc.
5) L'augmentation du potentiel sexuel chez l'homme, et
le développement de comportements d'agressivité, bien que ce dernier effet soit encore controversé.
Tous les effets qui régissent la croissance des organes génitaux et le développement des caractéristiques sexuelles sont appelés actions androgéniques et les effets sur les cellules somatiques en général sont appelés actions anaboliques.
Comme nous l'avons déjà mentionné, certains cancers prostatiques n'évoluent pas ou très peu pendant des années, même sans traitement. Lorsqu'un nodule de 0,5 cm est découvert chez un homme, ou qu'un APS (antigène prostatique spécifique) élevé conduit à une biopsie prostatique positive, alors il se pose un dilemme:!) ne rien faire et surveiller l'évolution tumorale ou 2) proposer un traitement(chirurgie ou
radiothérapie). Alors il se pose un problème d'éthique dans le premier cas c'est à dire ne pas traiter un cancer diagnostiqué et dans le deuxième cas, un problème de logique: c'est à dire traiter un patient pour une tumeur peu évolutive avec des moyens pouvant conduire à des complications sévères
(impuissance, incontinence etc ... ).
Seul un marqueur d' évolutivité tumoral pourrait permettre de résoudre ce dilemne, nous essayons donc de rechercher et de trouver un marqueur d'évolutivité au niveau de la culture organotypique prostatique.
La littérature sur la culture organotypique de la prostate animale et humaine s'avère extrêmement pauvre. Par contre, des cultures d'explants de prostate de rat dans un milieu sans sérum ont été réalisés pendant plus de deux semaines (Martikainen 1987) . Un autre groupe ( Heatfield et al. 1980) a réussi à garder en culture des morceaux provenant de tumeurs prostatiques et a établi des corrélations entre la croissance "in vitro" et "in vivo". Les résultats sont prometteurs mais sont encore très préliminaires.
Donc, notre premier objectif est de développer un modèle de culture organotypique permettant de maintenir en culture des explants de prostate de rat dans un milieu sans sérum et de vérifier les différents effets de certaines hormones ou androgènes sur divers paramètres connus (synthèse d 'ADN; synthèse de protéines; activités enzymatiques ... ). Deuxièment, nous désirons utiliser ces résultats sur le modèle humain afin de déterminer un facteur d' évolutivité de la tumeur. Ce facteur pourrait être impliqué au niveau de la multiplication
cellulaire, ou un marqueur retrouvé dans le milieu de culture ou encore un facteur exogène.
Mais l'identification de ces facteurs d' évolutivité ou de ces marqueurs "in vivo" représente une tâche très difficile à réaliser en raison de la richesse des constituants biologiques en circulation de même que des multiples intéractions synergiques existant dans l'organisme. Donc, pour atteindre l'objectif voulu, nous avons isolé le tissu des nombreuses influences de l'organisme; et pour bien discriminer les effets individuels des facteurs de croissance, des hormones ou des androgènes, il est important que la composition du milieu de la culture soit connue et que toutes les conditions environnementales soient identifiées et contrôlées. La plupart des milieux de culture utilisés sont riches et nécessitent la présence de sérum.
Dans ce projet, nous avons utilisé le modèle développé par Brière (1987) et celui de Heatfield et al.( 1980) décrits comme des modèles favorables pour la culture prostatique humaine normale et cancéreuse pendant plus de deux semaines. Ces deux milieux; soient le L-15 de Leibovitz et le CMRL ( Connaught Medical Research Laboratories) sont des milieux synthétiquement pauvres, sans sérum, ni hormones. La composition des milieux est entièrement définie et les conditions de culture sont contrôlées.
L'étude de l'effet d'hormones sur la prostate humaine normale et cancéreuse en culture est un sujet peu étudié, car la prostate étant une glande androgène-dépendante et la plupart des recherches se sont limitées aux androgènes. Mais depuis les dernières années, des études ont été faites avec plusieurs hormones ou facteurs de croissance sur la prostate humaine et animale "in vivo'' et "in vitro". Dans notre étude, nous avons travaillé avec deux régulateurs importants et trois androgènes déjà discutés précédemment. Notre choix s'est porté sur la transferrine et l'insuline. Des revues ont été consacrées au mécanisme d'action de ces régulateurs et leurs actions sur des cultures de cellules ont été determinées.
Selon Fernandez et al.(1986), les concentrations de transferrine sont plus élevées dans l'urine de patients étant atteints de carcinome prostatique. La transferrine est une glycoprotéine sérique(PM 80 kD) reconnue comme essentielle pour les cultures sans sérum , contrôlant la prolifération (Barnes et Sato,1980) et la différenciation cellulaire. (Ekblom et al.,1983). La prolifération cellulaire est reliée intimement à l'expression du récepteur et ses récepteurs membranaires ont été beaucoup étudiés(May et Cuatrecassac, 1985). La transferrine transporte le fer à l'intérieur de la cellule et cet élément est suffisant pour stimuler la prolifération. D'après Shapiro et Wagner (1988), le nombre de récepteurs de la transferrine est augmenté par l'insuline,
lorsque celle- ci milieu sans sérum,
est ajoutée à la transferrine dans un elle stimule la croissance cellulaire. L'insuline est un facteur que l'on considère comme un produit des îlots de Langerhans. D'après Colca et Hazelwood (1976),
l'insuline est exprimée dès les premiers stades de l'organogénèse du poulet. L'insuline est également considérée comme un facteur essentiel "in vitro" ( Santti et Johansson 1973); elle stimule la sécrétion de l'acide citrique et les enzymes et elle augmente la synthèse des protéines. Morphologiquement, l'insuline maintient l'intégrité de l'épithélium prostatique en culture et lorsque combinée avec les androgènes, l'épithélium redevient similaire à celui ''in vivo".
En résumé; notre projet de recherche consistait d'abord à mettre au point un modèle de culture organotypique de prostate de rat dans un milieu défini et contrôlé; ensuite d'appliquer ces résultats sur le modèle humain et finalement si le temps nous le permettait, nous tenterons d'identifier le marqueur permettant de déterminer un potentiel évolutif de spécimens prostatiques cancéreux.
N.B: Malgré la rareté des tissus prostatiques humains que nous avons obtenus au cours de ce projet de recherche, il nous a quand même été possible d'obtenir quelques résultats préliminaires pour cette partie ardue et difficile . La suite de cette partie pourrait être complétée dans le cadre d'un projet de doctorat. Par contre, le protocole concernant la partie animale a été bien respecté au cours de ce travail qui a eu lieu au département d'anatomie et biologie cellulaire de la faculté de médécine de l'Université de Sherbrooke.
11-MATERIB.S ET METHODES
1.0.MATERIELS:
Pour ce projet nous avons utilisé des tissus animaux et humains.
1.1.MODÈLE ANIMAL:
Nous avons utilisé des rats mâles de race Wistar,pesant entre 200 et 250 grammes provenant de Charles River (ST-Constant).
1.2. MODÈLE HUMAIN:
Des tissus provenant de prostates normales, sièges d'hyperplasie bénigne ou de cancer ont été prélevés chez des patients de l 'Hôpital Royal- Victoria et Hôpital Juif de Montréal ont été utilisés pour cette étude. La culture se faisait au laboratoire du département d'urologie de l'Hôpital Royal- Victoria.
2. MÉTHODE DE CULTURE
2.1. INSTRUMENTS:
Les instruments de dissection étaient stérilisés à l'autoclave avant l'utilisation et changés périodiquement pendant les manipulations.
Les vases de Pétri de type Falcon (Falcon plastics, Los Angeles, CA) étaient également stérilisés au gaz avant la mise en place d'une grille en acier inoxydable recouverte d'un morceau de papier - lentille recouvrant le puits central de la boite de Pétri Falcon.
2.2 LES MILIEUX DE CULTURE:
Les mileux de culture, le L-15 de Leibovitz et le CMRL ont été achetés chez Gibco (Grand Island Biological Co. of Canada, Burlington, Ontario). La composition est entièrement définie (voir annexes). Deux antibiotiques ont été ajoutés à
la concentration de 40 µg/ml pour chacun (mycostatin et garamycine).
2.3 LES GAZ UTILISÉS EN CULTURE:
Les mélanges gazeux:95%02 - 5%C02 tel qu'utilisé dans le modèle de Brière ( 1982) ou 50%N2 - 45%02 - 5%C02 tel qu' utilisé dans le modèle de Heatfield (1980) ont été utilisés afin de déterminer lequel permettait la meilleure conservation des explants de prostate en culture pendant 5 jours, selon des paramètres bien définis.
2.4 MISE EN CULTURE:
2.4.1 MODÈLE ANIMAL:
Après l'anesthésie des rats à l'éther, les prostates étaient prélevées par laparatomie dans des conditions
stériles et étaient coupées en explants ( 2x2 mm) lesquels étaient déposés sur du papier lentille (10 - 12 explants par vase de Pétri) placé sur une grille en acier inoxydable recouvrant le puits central du
milieu de culture.
2.4.2 MODÈLE HUMAIN:
vase de Pétri,contenant le
Des morceaux ou des biopsies de prostates étaient obtenus après une prostatectomie radicale et apportés immédiatement au laboratoire. Les tissus prostatiques étaient coupés en explants et mis en culture immédiatement, afin de minimiser les altérations tissulaires.
Les explants étaient maintenus en culture pendant 5 jours et plus dans les milieux L-15 de Leibovitz ou CMRL, sans sérum à 37°C dans une atmosphère humide. A la fin des manipulations, le niveau du milieu était ajusté, afin que le tissu croisse à
l'interface milieu-gaz.Après une période de stabilisation de 2 heures, les facteurs étaient ajoutés au milieu, seuls ou en combinaisons .
Les facteurs fournisseurs: FACTEURS Insuline Transferrine Dihydrotestostérone Testostérone Androstanediol
étaient achetés chez différents
FOURNISSEURS Connaught Laboratoiries(Toronto,Ont.) Id. Sigma(ST-Louis,USA) Id. Id.
Les milieux étaient renouvellés aux 48 heures et la maturation du tissu était évaluée après O et 5 jours de culture.
2.SINCORPORATION DE PRÉCURSEURS RADIOACTIFS:
Pour évaluer le taux de synthèse d'ADN, nous avons incubé les explants en présence de thymidine tritiée (77,8 Ci/mmole, New England Nuclear Corporation, Boston, MA) à la concentration de 5 µCi par ml de milieu.
Pour évaluer la synthèse des protéines, nous avons incubé les explants en présence de leucine tritiée ( 8 µCi/ml de milieu ;60 Ci/mmole).
Les précurseurs sont ajoutés à la fin des périodes de culture et incorporés durant 4 heures.
3.ANALYSES MORPHOLOGIQUES OPTIQUES ET ULTRASTRUCTURALES:
3.lFIXATION, DESHYDRATATION ET INCLUSION:
Les explants étaient fixés après la période de stabilisation de deux heures (jour 0), alors que les autres étaient fixés après 5 jours de culture. La fixation dure une nuit à 4°C (le fixateur est une solution de glutaraldéhyde 2.8% tamponnée avec du cacodylate de sodium O.lM à pH 7.2). Ensuite, les explants sont lavés trois fois (15 minutes chacun) dans du tampon cacodylate- sucrase 7.5% O.lM à pH 7.2 à 4°C. La post-fixation se fait dans une solution de tétroxyde d'osmium 2% dans du tampon cacodylate de sodium O.lM pendant 1.5 heures à 4°C. Ensuite, les explants sont lavés 2 fois (10 minutes chacun) dans du tampon cacodylate sucrase 7.5% O.lM à pH 7. 2 à la température de la pièce. Les tissus sont déshydratés dans l'alcool 70% pendant 10 minutes
'
.
dans l'alcool 95% (2 x 10 minutes) et dans l'alcool 100% (3 x 15 minutes) à la température de la pièce. Les tissus sont ensuite déshydratés dans l'oxyde de propylène (3 x 15 minutes) et une fois pendant 12 heures toujours à la température de la pièce. Finalement les explants sont inclus dans l'épon et déposés dans l'étuve à 60°C pendant 3 jours.3.2COUPES ET COLORATIONS:
été obtenues à l'aide de couteaux de verre montés sur l 'ul tramicrotome. Les coupes étaient colorées au bleu de méthylène et montées avec un milieu synthétique.
Pour la microscopie électronique, des coupes fines ont été obtenues à l'aide d'un couteau en diamant monté sur l'ultramicrotome. Les coupes étaient recueillies sur des grilles de cuivre de 200 mesh, et étaient colorées à l'acétate d'uranyle 1% dans l'eau et ensuite au citrate de plomb. Les coupes étaient examinées au microscope électronique Philips 300.
3.3AUTORADIOGRAPHIE:
Certains des explants incubés en présence de thymidine tri tiée étaient fixés, inclus dansl' épon et coupés (semi-f ines) selon la procédure décrite précédemment pour identi(semi-fier les sites de synthèse de l'ADN. Les lames étaient recouvertes d'émulsion liquide NTB2 de Kodak à la noiceur. Après séchage, elles étaient déposées dans des boites fermées et exposées dans le noir pendant 6 semaines. Les lames étaient développées dans le révélateurs Kodak (16°C), fixées dans le Dektol et colorées au rouge de safranine 0.1% et montées.
4.ANALYSES BIOCHIMIQUES:
D'autres explants ayant été incubés en présence de thymidine-H3 étaient pesés et déposés dans des tubes de
plastique (Vanguard, Neptune,NJ) contenant 200 µl d'eau distillée et congelés à -70 °C. Au moment déterminé pour les dosages, les tissus étaient dilués selon le rapport 10 mg/ml d' H20 et homogénéisés avec un appareil de type polytron
(Brink.man Instruments, Rexdale, Ontario).
4.2 MESURE DE LA SYNTHÈSE D'ADN:
L'ADN est extrait selon la technique de Malo et al.(1983): 3 lavages successifs dans TCA 20% - 10% - 5% avec centrifugations de 10 minutes à 1800 RPM. La dernière centrifugation est suivie d'une ébullition de 30 minutes. Une partie du surnageant sert à mesurer le contenu en ADN et l'autre portion était mélangée avec du liquide à scintillation (Ready Solvant, Beck.man) et la radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur Beck.man 2S6800 (Fullerton, CA).
Le dosage de l'ADN est effectué selon la technique de Burton (1956) modifiée par Giles et Myers (1965). Les mesures d'absorbance sont établies à deux longeurs d'onde soit à 595nm et à 700nm avec un spectrophotomètre de type spectronic 21
4.3. MESURE DE LA SYNTHESE DES PROTÉINES:
Le dosage des protéines est d'abord réalisé dans l'homogénat initial par la méthode de Lowry et al. (1951). La densité optique est mesurée à 750 nm.
Pour les mesures d'incorporation de leucine tritiée, les protéines sont extraites par 3 lavages: TCA 20% - 10% et NaOH 0,5N. L'extrait est bouilli pendant 10 minutes. Le contenu en protéines est dosé dans cet extrait dont on conservera un aliquot pour mesurer la radioactivité incorporée.
4.4. DOSAGES ENZYMATIQUES: (COLORIMÉTRIQUES)
4.4.1. LA PHOSPHATASE ACIDE: Une longeur d'onde de 410nm est utilisée pour la lecture de la densité optique au spectrophotomètre. La courbe standard est établie à partir de diverses concentrations de P-nitrophénol phosphate en fonction de leur densité optique obtenue avec le spectrophotomètre .
4.4.2. PHOSPHATASE ALCALINE: L'activité de la phosphatase alcaline a été dosée selon la méthode d'Eichholz (1967). Une longeur d'onde de 450 nm est utilisée pour la lecture de la densité optique au spectrophotomètre. La courbe standard est établie à partir de diverses concentrations de P-nitrophénol
phosphate en fonction de leur densité optique obtenue avec le spectrophotomètre .
4.5 EXPRESSION DES RÉSULTATS:
Les contenus en ADN et en protéines sont exprimés en µg/mg de tissu et la quantité de précurseurs incorporés dans l'ADN ou les protéines est exprimée en DPM (désintégrations par minute)/µg.
Les activités enzymatiques sont calculées en Unités Internationales (UI). Dans ce projet, les résultats sont exprimés en µmoles de p-nitrophénol libérées par minute (UI) par gramme de protéine.
4.6 STATISTIQUES:
La moyenne et l'erreur standard sur la moyenne pour toutes les conditions expérimentales sont déterminées et la comparaison entre ces groupes a été établie par le test "t" de Student (non-pairé). Une valeur de P<0.05 est jugée significative.
Ill-
RESULTATS
1. Développement d'un modèle de culture organotypigue de prostate de rat
Nous avons fixé les prostates de rat, au début et après la période de culture (après 5 jours) dans le milieu L-15 et nous les avons préparées pour l'observation au microscope optique. Nous avons pu ainsi comparer les explants témoins avec les explants traités à une même période de culture. Ces observations nous ont renseignés sur la morphologie générale de la prostate.
1.1. Observations macroscopiques
Nous avons observé que la prostate de rat de type Wistar se présente sous la forme d'un coeur allongé, de couleur blanchâtre, et les lobes sont nettement délimités. La glande prostatique est composée en majorité de tissu conjonctif très lâche.
Après deux jours de culture, les explants sont plus mous, leur couleur demeure inchangée et ils ont perdu une partie de leur contenu sanguin. Le poids de ces explants semble avoir peu diminué et la présence de certains facteurs (insuline, transferrine) dans le milieu n'influence pas ces paramètres. Au cinquième jour de la culture, le poids des explants diminue de plus de la moitié de son poids initial, la surface est
aplatie et ils ont perdu une grande partie de leur contenu sanguin.
Après deux semaines de culture, la nécrose est observable, les explants sont très pâles et le milieu devient rosé.
1.2 Observations microscopiques
Avant et après la période de culture dans le milieu L-15 de Leibovitz, nous avons fixé les prostates et nous les avons préparées pour l'observation au microscope.
1.2.1 Microscopie optique
Au jour 0 (après six heures de culture), l'apparence histologique de la prostate est identique à celle de la prostate normale in "vivo".
la glande est composée
En effet, nous avons observé que surtout d'un épithélium haut cylindrique, les noyaux sont ronds et situés à la base de l'épithélium (fig.1). La lumière est large et vide (fig.2), le stroma est peu abondant ainsi que le tissu entre les acini.
Au jour 5 de la culture, en présence seulement du milieu L-15, nous observons une dégénérescence de l'épithélium (fig.3), celui- ci devient cubique bas; le stroma est relativement abondant, la lumière des acini est large et contient des produits de sécrétion (fig.4). Nous avons observé également que l'épithélium se retrouve surtout à la périphérie
