TPL3BIOGENMIC

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Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biotechnologie

Licence L3 Biotechnologie microbienne Semestre1

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T.P. N°01

 Matière: Génie microbienne

 Intitulé : Préparation des milieux de culture pour micro-organismes

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte) :

1. Etapes de préparation des milieux de culture. 1.1. Préparation de la Gélose nutritive (GN). 1.2. Préparation du Bouillon nutritif.

1.3. Préparation du BCPL (bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol). 1.4. Préparation du milieu Hektoen.

1.5. Préparation du milieu VF (gélose profonde- Viande foie). 1.4. Préparation de l’OGA (oxytétracycline glucose agar). 1.5. Préparation du PDA (pomme de terre dextrose agar). 1.6. Préparation du MH (Mueller Hinton).

1.7. Préparation de l’eau physiologique.

1.8. Préparation du MRS/M17 (Man Rogosa Sharp/ M17). 2. Autoclavage des milieux de culture.

3. Conservation des milieux de cultures.

Produits chimiques Petit Matériel/Consommable Appareillage

 Extrait de levure  Extrait de viande  Peptone  NaCl  Glucose  Agar  eau distillée  Extrait de malt  NaOH  HCl  Bécher  Eprouvettes  Boîtes de Pétri  Verres de montre

 Tubes à essais avec bouchons  Papier filtre

 Pipettes et aspires pipettes  Pipettes Pasteur  Tétines  Barreaux magnétiques  Papier pH  Membranes millipores 0,22 µm et 0,45µm  Flacons 200mL bouchons  Spatules  Bécher (50-2000mL)  Entonnoirs  Bain Marie  Balance, balance de précision  Agitateur  Plaque chauffante  Bain Marie  Becs Bunsen  Autoclave  pH mètre  Lampe UV germicide  Distillateur  Réfrigérateur  Four Pasteur

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T.P. N°02

 Intitulé : Les entérobactéries

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte):

1. Isolement des entérobactéries, sur milieu Hektoen, à partir des intestins de poissons. 2. Mise en évidence des coliformes totaux et fécaux sur milieu BCPL.

3. Culture d’Escherichia coli sur milieu GN

4. Mise en évidence du type respiratoire des entérobactéries (Escherichia coli) sur gélose profonde VF.

5. Coloration de Gram et observation au microscope photonique d’une souche pure d’entérobactérie (Escherichia coli) :

6. Conservation d’une souche pure d’entérobactérie (Escherichia coli), de courtes et de longues durées.

 Violet de Gentiane  Fushcine basique  Ethanol 90°,  Lugol près à l’emploi  Huile à immersion  Glycérol  VF prêt à l’emploi  GN prêt à l’emploi  BN prêt à l’emploi  Hektoen prêt à l’emploi  BCPL prêt à l’emploi.

 Trousse à dissection avec pinces/ bistouris et lames  Anses à ensemencer  Verres de montre  Becs Bunsen  Boites de Pétri  Pipettes graduées 1Ml  Pipettes Pasteur  Lames d’observation  Lamelles couvre-objet 22X50mm  Pissettes

 Tubes à essai avec bouchons  Tubes Eppendorf

 Cryotubes

 Tubes Falcon 50Ml  Tubes Falcon 25Ml  Grand bac de coloration.

 Vortex  Microscope photonique  Bain Marie  Réfrigérateur  Congélateur  Etuve 37°C  Etuve 45°C  Jarre d’anaérobiose  Loupe binoculaire  Lyophilisateur  Autoclave  Four Pasteur  Distillateur

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T.P. N°03

 Intitulé : Les levures et les moisissures

 Protocole :

 Principe:

1. Les levures

1.1) Isolement et purification de la levure Saccharomyces cerevisiaesous hotte bactériologique.

1.2) Observation au microscope photonique après coloration au bleu de méthylène 1.3) Dénombrement des levures par hématimètre.

1.4) Conservation de la souche pure de levure

2) Les moisissures

2.1. Isolement de la moisissure d’un produit alimentaire. 2.2. Repiquage des souches de moisissures.

2.3. Identification microscopique des moisissures. 2.4. Conservation des souches pures de moisissures.

 Violet de Gentiane  Bleu de méthylène  PDA prêt à l’emploi  Ethanol 90°  Huile à immersion  Anses à ensemencer  Spatules  Bistouris  Pinces en inox  Boites de Pétri  Membranes millipores  Lames/Lamelles  Huile à immersion  Ethanol 90°  Hématimètre de Thoma  Pipettes Pasteur  Pipettes 1Ml graduée  Verres de montre  Vortex  Etuve 25°C  Microscope photonique  Bain Marie  Réfrigérateur  Congélateur  Loupe binoculaire  Lyophilisateur  Autoclave  Four Pasteur  Distillateur

T.P. N°04

 Intitulé : Les actinobactéries

 Protocole :

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1. Isolement des actinomycètes à partir du sol.

2. Ensemencement et culture de souches d’actinobactéries pures sur le milieu ISP2. 3. Observation microscopique de souches d’actinobactéries : coloration de Gram,

coloration de Ziehl-Neelsen.

4. Mise en évidence des substances antimicrobiennes des actinobactéries. 5. Mise en évidence de l’activité cellulolytique de l’actinomycète.

6. Conservation de la souche d’actinomycète pure pour une courte durée.

 Violet de Gentiane  Fushcine basique  Ethanol 90°,  Lugol près à l’emploi  Huile à immersion  Glycérol  VF prêt à l’emploi  GN prêt à l’emploi  BN prêt à l’emploi  MH prêt à l’emploi  Acide sulfurique  Rouge Congo  Spatules

 Boites de Pétri en verre  Mortier et pilon

 Tubes à essai avec bouchons  Pipettes 1Ml graduées  Grand bac de coloration  Ecouvillons

 Anses

 Pipettes Pasteur

 Micropipette 1000µL avec pointes bleues adaptée  Papier filtre  Balance  Vortex  Etuve 28°C  Etuve 37°C  Loupe binoculaire  Compteur de colonies  Réfrigérateur  Congélateur  Lyophilisateur  Autoclave  Four Pasteur  Bain Marie  Microscope photonique  Distillateur

T.P. N°05

 Intitulé : Les microalgues

 Protocole :

 Principe:

1. Préparation d’un milieu d’usage pour les microalgues 2. Isolement sous hotte bactériologique.

3. Mise en culture en milieu liquide agité et statique. Estimation de la croissance par mesure de la densité optique.

4. Observation au microscope optique.

5. Mise en culture en fermenteur en présence de photopériode réglée.

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 CaCl2  K2HPO4  KH2PO4  MgSO4  7H2O  NaCl  EDTA  acide éthylène-diamine-tétra-acétique  KOH  FeSO4(7H2O)  acide sulfurique  acide borique (H3BO3)  ZnSO4(7H2O)  MnCl2(H2O)  MoO3  CuSO4(5H2O)  Co(NO3)2 6H2O  Papier filtre  Erlenmeyer 100mL  Pipettes Pasteur  Pipettes 1mL graduées incubator)  Spectrophotomètre UV-visible  Fermenteur

 Chambre de culture avec néons et photopériode  Microscope photonique  Autoclave  Four Pasteur  Vortex  Distillateur

T.P. N°06

 Intitulé : Les champignons comestibles

 Protocole :

 Principe:

1) Isolement de la souche mycélienne à partir de la suspension sporale du champignon comestible sous hotte bactériologique.

2) Réalisation de la sporée.

3) Ensemencement de la souche mycélienne pure du champignon comestible sur le milieu PDA.

4) Inoculation du substrat de colonisation et incubation à 25°C. 5) Inoculation du substrat de fructification et incubation à 15°C. 6) Utilisation du KIT de fructification du champignon de Paris.

4) Observation du mycélium de la souche pure et du sporophore du champignon comestible au microscope photonique.

5) Conservation de la souche mycélienne pure du champignon comestible pour une courte durée.

 Glucose  Agar

 PDA prêt à l’emploi  Ethanol 90°

 Cuves pour Spatules  Boîtes de Pétri en verre  Mortier et pilon

 Tubes à essai avec bouchons  Pipettes 1mL graduées  Grand bac de coloration

 Vortex  Bec Bunsen  Etuve à 25°C  Réfrigérateur  Congélateur  Microscope photonique

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 Ecouvillons  Anses

 Pipettes Pasteur Micropipette 1000µL avec pointes bleues adaptées  Papier filtre  Autoclave  Hotte bactériologique  Four Pasteur  Distillateur

T.P. N°07

 Intitulé : Les bactéries lactiques

 Protocole :

 Principe:

1. Isolement de bactéries lactiques à partir d’un produit laitier.

2. Observation microscopique de bactéries lactiques après coloration de Gram.

3. Culture d’une souche pure de lactobacille sur milieu MRS gélosé / liquide (incubation en présence de faible concentration d’oxygène).

4. Estimation de la production d’acide lactique par les bactéries lactiques dans un lait fermenté par titration.

5. Conservation d’une souche de lactobacille sur MRS geéloseé inclineé.

 Boîîtes de Peétri

 Tubes aà essai avec bouchons  Beécher

 Barreaux magneétiques  Burette

 Potence

 Bac aà coloration  Lames/lamelles  Anses  Jarre d’anaeérobiose  Etuve aà 30°C  Autoclave  Four Pasteur  Microscope photonique  Distillateur