Antigènes de surface : caractérisation, localisation et rôle chez les végétaux

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DESS

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DESS

Informat ique

Documentaire

N O T B

D E

S Y N T H E S E

ANTIGENES DE SURFAGE : CAPACTERISATION, LOCALISATION ET ROLE CHEZ LES VEGETAUX.

F r a n o o i s e MONOT

PRESENTATION DU SUJET

-Ce travail m'a ete propose par Monsieur C. DUMAS, chercheur

du Laboratoire d1Histophysiologie de l a Secretion vegetale, de

1'Universite LYON - I .

Ce laboratoire t r a v a i l l e a mieux connaitre :

- d'une part l e s mecanismes qui regissent l e s symbioses micro-organismes-racines permettant a certains vegetaux d ' u t i l i s e r 1'azote athmospherique,

- d'autre part l e s mecanismes impliques dans l e s phenomenes

d1incompatibilite entre pollens e t stigmates observes chez

l e s plantes a f l e u r s .

1 ' o b j e c t i f commun etant 11amelioration des especes vegetales.

Dans l e s deux cas, des mecanismes de reconnaissance cellulaire sont mis en jeu, qui font intervenir des echanges d'informations entre cellules, informations portees par des molecules de surfaces c e l l u l a i r e s .

La comprehension des mecanismes de l a reconnaissance c e l l u l a i r e

suppose l a determination du mode d1action de ces molecules, e t pour

cela une bonne connaissance de leur nature e t de leur localisation est necessaire.

On s'interesse i c i aux antigenes de surface en ce sens que beaucoup de molecules de surface sont des antigenes chez l e s a n i -maux, e t que l e s techniques immunologiques vont fournir des

metho-des d1investigation performantes.

I I s ' e s t agi de f a i r e l e point sur l a maniere dont 1'etude des molecules antigeniques vegetales intervenant dans l e s processus de reconnaissance cellulaire a ete abordee par l e s chercheurs ces dernieres annees.(II a ete decide de se limiter aux travaux poste-r i e u poste-r s a 1978).

Les references ont ete obtenues :

- par interrogation des bases de donnees automatisees PASCAL et BIOSIS,

RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE

1 Interrogation des bases de donnees automatisees

-Une recherche manuelle prealable dans l e s Biologicals Abstracts s ' e s t v i t e revelee peu performante, l e s "entrees"

proposees n1etant pas du tout adaptees au s u j e t .

La premiere etape de l a recherche a donc consiste en une interrogation en ligne des bases de donnees dans l e cadre d'une i n i t i a t i o n a l a recherche documentaire automatisee.

A - Interrogation de l a B.D. PASCAL

Produite par l e C.N.R.S., PASCAL e s t une banque de donnees pluridisciplinaire.

Nous avons interroge cette base en passant par l e serveur franqais QUESTEL de TELESYSTEME e t en u t i l i s a n t l e reseau TSANSPAC.

PASCAL possedait deux sous-fichiers :

- PASCA73 qui repertorie l e s documents de 1973 a 1976 - PASCAL qui contient l e s documents a p a r t i r de 1977 Comme nous cherchons des travaux posterieurs a 1978, seul l e sous-fichier PASCAL a ete interroge.

Le choix des termes de 1'interrogation a ete guide par l e s deux o u t i l s mis a notre disposition : l e lexique et l e plan de classement des Sciences de l a Vie.

La strategie de recherche a ete l a suivante :

ETAPE DE RECHERCHE : 1 V i G t T A ? ? OU P L A N T E ? ETAPE 0 E RECHERCHE : 2 1 £T RECONNAISSANCE • EFAPE 0E RECHERCHE : 3 ! 1 ET ANTIGEN?? ! 1 ETAPE DE RECHERCHE : A

PDLLEN OU INCOWPATIBILITE OU RELATIuN MICX00RGANISME VEGETAL UU GREFFE

EFAPE D t RECHcRCHE : 5 Prt YTOPATHOGENE OU M E T H O O E I-liMUN J L O G i a U E O U I M M U N O C H I « I E O U I M M U N O C YT O C H I'11 £. E T A P E DE RECHcRCHE : 6 3 ET ( 4 UU 5 ) ETAPE DE RECHERCHE : 7 6 SAUF ALLERGIE? R c S U L T A T S : 10 6J i eJr°pc *

Cette strategie a ete etablie apres un "essai" realise dans l e cadre d'un stage a 1'URFIST, qui avait permis de constater que :

° plusieurs termes etaient u t i l i s a b l e s pour exprimer l a notion de reconnaissance c e l l u l a i r e , l e lexique proposant :

reconnaissance c e l l u l a i r e , mais aussi reconnaissance i n t e r -c e l l u l a i r e , re-connaissan-ce-soi, re-connaissan-ce hdte. C'est pourquoi l a troncature "reconnaissance +" a ete retenue.

0 un seul document presentait simultanement l e s deux termes

reconnaissance e t antigene, c ' e s t pourquoi on a procede a l a selection de deux groupes de documents : 1'intersection entre ces deux groupes selectionnes respectivement par l e s etapes 2 e t 7 ne comprend qu'un seul document.

° l a combinaison des notions antigenes et vegetal apportait 213 documents. I I e t a i t necessaire d'introduire des concepts plus precis permettant de reduire ce nombre, d'ou l e s terme.s proposes aux etapes 4 e t 5 essayant de couvrir l e s notions impliquees dans l e s u j e t .

On a constate d'autre part que de nombreux documents concer-naient en f a i t l e s problemes d'allergies'provoquees chez

1'homme par l e s antigenes polliniques. Une etape "sauf a l l e r g i e " a pu § t r e introduite, dans l a mesure ou nous avons constate

que ce terme e t a i t u t i l i s e essentiellement pour des a r t i c l e s t r a i t a n t des maladies allergiques en elles-m8mes, avec 1'homme comme objet, a l o r s que l e s a r t i c l e s t r a i t a n t des allergenes vegetaux etaient plutdt indexes par l e terme allergene. B - Interrogation de l a B.D. BIOSIS

Cette base de donnees bibliographiques produite par

Bioscience Information Service aux U.S.A., qui publie aussi l e s Biologicals Abstracts, couvre l e domaine biologique et medical.

L'acces a cette B.D. s ' e s t f a i t par l e serveur europeen ASE (Agence Spaciale Europeenne) situe a Frascati en I t a l i e , gr&ce au langage QUEST, par 1'intermediaire du reseau TRANSPAC.

La strategie de recherche a ete elaboree a 1'aide du "Biosis search guide". BIOSIS permet d ' u t i l i s e r des descripteurs, des "concepts codes" (CC) e t des "biosystematic codes" (BC)

En pratique, l a strategie de recherche elaboree pour 1 ' i n t e r -rogation de BIOSIS ne s ' e s t pas revelee satisfaisante, puisque sur l e s 4-1 references obtenues, 4 seulement repondaient au s u j e t . Les references obtenues ont montre que nous n'avons pas "vise" juste

l e s references concernant essentiellement des antigenes animaux, bien que l a notion de vegetal a i t 6te introduite par l e s "biosys-tematics codes".

A notre decharge, i l faut souligner l e s conditions de l ' i n -terrogation de l a base BIOSIS, qui s ' e s t deroulee dans l e cadre d'une journee de presentation de cette base au cours de laquelle i l a ete procede a un grand nombre d'interrogations, donc avec une certaine precipitation. La personne "specialiste" de BIOSIS a eu quelques d i f f i c u l t e s a cerner l e s u j e t .

Cette experience m'a permis de verifier combien est necessaire une bonne connaissance des caracteristiques de l a base i n t e r r o -gee, associee a une bonne connaissance du domaine considere.

2 Recherche manuelle

-La recherche automatisee s ' e s t revelee insuffisante..

A ete consulte l e fichier manuel du laboratoire mandataire de l a question.

La consultation des bibliographies des a r t i c l e s a permis aussi de detecter quelques references.

3 Acces aux documents primaires

-Les documents selectionnes ont ete localises grace au

Catalogue des Periodiques du Rhone, qui se revele § t r e un o u t i l t r e s pratique mis a notre disposition dans l e s Bibliotheques. Cependant certains a r t i c l e s n'ont pu §tre l o c a l i s e s .

Un certain nombre de docu^ments etaient possedes par l a bibliotheque du Laboratoire d'Histophysiologie des secretions vegetales. Les autres ont ete recuperes a l a B.U. de La Doua ou a l a B.U. de Rockfeller. Quelques a r t i c l e s demandes par

N O T E

D E

S Y N T H E S E

ANTIGENES DE SURFACE : CARACTERISATION, LOCALISATION ET ROLE CHEZ LES VEGETAUX.

INTRODUCTION

I CARACTERISATION DES ANTIGENES VEGETAUX

-1 - Isolation de -11antigene

-1°) Extraction de 1'antigene 2° ) Purification des antigenes Z - Caracterisation de 1'antigene

1°) Techniques physico-chimiques 2°) Techniques imraunologiques :

® Precipitation sur gel

A. Immunodiffusion radiale simple B. Double diffusion d'Ouchterlony C. Immunoelectrophorese

° Immunoelectrophorese de GRABAR & WILLIAMS ° Immunoelectrophorese de LAURELL

0 Immunoelectrophorese bidimensionnelle

• Radio-immuno-essai

• Problemes de l a specificite I I - LOCALISATION DES ANTIGENES VEGETAUX

Introduction

-1 - Principe de -1'immunocytochimie £ - Problemes particuliers

1°) Specificite des anticorps 2°) Preparation des t i s s u s

I I I - RQLE DES ANTIGENES DE SURFACE DANS LA RECONNAISSANCE CELLULAIRE

• Correlation antigene - a l l e l e S.

• Action biologique des antigenes S specifiques. CONCLUSION

I N T R O D U C T I O N

-Les vegetaux sont capables de discriminer l e "soi" du

"non-soi", comme l e montrent l e s phenomenes de r e j e t ou d'accep-tation q u ' i l s presentent dans differentes situations de l a vie vegetale (greffe, reproduction sexuee, defense contre l e s patho-g e n e s , . . . ) .

Si l a reconnaissance cellulaire a ete intensivement exploree chez l e s animaux, l e s vegetaux ont ete t r e s negliges, e t l e s pro-cessus qui interviennent sont encore peu connus.

I l s mettent en jeu des molecules extracellulaires qui i n -cluent des determinants antigeniques, des lectines, des arabino-galactane-proteines, des arabinoxylases e t des allergenes.

La comprehension des mecanismes de l a reconnaissance cellu-l a i r e passe donc par une meicellu-lcellu-leure connaissance des mocellu-lecucellu-les impliquees. I I s ' a g i t de repondre aux questions suivantes :

• Que sont ces molecules? = CARACTERISATION

• Ou se trouvent-elles ? = LOCALISATION

• Comment agissent-elles ? = ROLE

De nombreux travaux ont ete developpes pour tenter de repon-dre a ces questions. Un grand pas a ete franchi quand 1 ' i d e e e s t apparue que beaucoup de proteines, glycoproteines et polysaccharides vegetaux etaient des antigenes chez l e s animaux, et que l ' o n pouvait donc u t i l i s e r leurs proprietes antigeniques. L'apport des methodes

immunologiques jusqu1alors developpees en biologie animale a ete

considerable.

On se propose i c i de montrer comment l e s auteurs ont essaye de repondre aux questions posees ci-dessus, en presentant l e s methodes d1etude u t i l i s e e s e t l e s problemes rencontres.

I CARACTERISATION DES ANTIGENES VEGETAUX 1 Isolation de 1'antigene

-Dans toute etude visant a une meilleure comprehension de l a nature des macromolScules antigeniques, l e premier probleme pose e s t celui de 1 ' i s o l a t i o n de 1'antigene considere, isolation qui met en jeu deux etapes :

- 1•extraction de 1'antigene des t i s s u s vegetaux,

- l a purification de l a preparation antigenique a i n s i obtenue par elimination des composants contaminants.

1°) E x t r a c t i o n de 1'antigene

-Differentes methodes sont u t i l i s e e s . L1extrait antigenique

peut §tre :

- l e diffusat obtenu par incubation des t i s s u s vegetaux dans une solution tampon aqueuse;

- l e f i l t r a t de culture cellulaire contenant l e s macromolecu-l e s de surface ou des produits secretes;

- un broyat d1organes, t i s s u s ou cellules vegetales;

- l a fraction soluble apres centrifugation (KNOX & Coll. 1980) Le protocole l e plus approprie est etabli pour chaque cas

precis. En e f f e t , l e s r e s u l t a t s obtenus par l a suite sont condi-tionnes par l a procedure suivie l o r s de 1'extraction :

Ainsi, FERRARI & Coll. (1°81), pour extraire 1'antigene S2 des stigmates de Brassicae oleracea, ont t e s t e differents protoco-l e s e t ont constate que :

- 2 a 10 fois plus d'antigenes etaient e x t r a i t s par incubation dans l ' a a u ou dans une solution de sucrose que par incubation en milieu NaCl

-- jusqu'a 10 fois plus d'antigenes etaient liberes par broyage des tissus plutSt que par simple lavage - mais qu'on avait aussi 10 fois plus de molecules contaminantes : 1'extraction par lavage des t i s s u s avait 1'avantage d1etre une etape p r e l i -minaire de purification.

VIANDER & Coll. (1979), travaillant sur l e s antigenes du pollen de bouleau, ont t e s t e differents temps d'extraction :

EIUTI ol cxuat iiim lime 011 thc amuuni of loial proieins aiul small pcpiides, ihe llu I niosial>lr 11S) aniigcn aiul alliTgcuic auiviiy in hiivli pollcn cxuatt antl its main allergcnic Iractions aftcr gel filuaiiiin 011 Scphatlcx G-100 hxliaciioii1 Protcins l> Pcptidc s' Aniigen (% of refercnce)1' Allt-im iin ai liv itv ll,0 r/inl' 1

tmic 6/1 _{F-C Ninh. Whole Peak C Wholc Peak C}

nnnol/l inmol/l cxtract fractions cxiratl fractions

15 min 2.9 0.51 8.7 18 0.08 33VU0 30

30 min 3.3 0.56 8.9 26 0.38 56 500 130

3 h 3.6 0.57 12.9 33 0.92 80000 770

24 h 7.4 1.15 20.9 34 1.18 53b00 930

"Birch pollen (1/10 w/v) in 0.15 M PBS (slow rotation at +4°C). Freshly collectcd fertilc pollcn 17 U.IMIW.I, ''Concemration of lotal protcins in thc wliole extract according to Lowry et al. (19).

1 Conccntration of pcplitlcs in the wholc cxtract after reinoval of the proteins by TCA precipitation; F-C = Folin-Ciocalteau; Ninh. = ninhydrin method, performed as described in (16).

dConccntration of thcrmostable (TS) antigcn ineasured by rocket immunoelectrophoresis using heat-treated samplc* and hcat-trcatcd (100°C for 15 min) birch pollcii cxtract (BP cxtract, 1/10 w/v; matiii.il aml nidhotU as a

standartl. I

cToial allcrgcnic activity in thc whole cxtract antl in thc poolcd pcak C fractions aftcr gel lihration ol ihc cxtraci. 1 hc mcan values ol two separatc tlcicrminations varictl lcss tlian 5%.

Le doublement de l a quantite de peptides et l a diminution de 1 ' a c t i v i t e allergenique observes avec 11extrait t o t a l pour un

temps long d1extraction (24h) pose l e probleme d'une possible

de-gradation enzymatique des proteines au cours de 11extraction,

degradation qui ne semble pas, i c i , toucher l e s antigenes prin-cipaux.

Un exemple de 1'importance du mode d'extraction est donne par l e s travaux de HUSSAIN & Coll. (1981) : Travaillant sur l e s allergenes du pollen d'Ambrosia e l a t i o r , i l s ont pu mettre en evidence l a difference de composition des e x t r a i t s polliniques suivant q u ' i l s ' a g i t d'une extraction de longue duree (24h) ou de courte duree (I6mn) e t suivant que l e pollen u t i l i s e est prealablement degraisse a 1 ' e t h e r ou non.

TABLE I. Properties of ragweed extracts

Extracts (10% w/v)

Nondialyzable

solids (/ig/ml) AgE

Antigen content (ftg/ml) Ra3 Ra5 Skin reactivity mean wheal diameter (mm)* Nondcfattcd l6-niiii 5.200 9.0 8.3 28.9 4.8

Dcfaiied 16-min s.yoo 9.1 8..1 28.9 4.7

Dcfatted 24-hr 9.01X) 489 89.3 31.3 Nol lcslcd

Standarii deviations for mcusuremcnts of nnndialyzahlc snlnls and antiycn contents wcrc ± V< to 10'i

C'est 11analyse de l " e x t r a i t l6mn" qui a permis de mettre en evidence l a presence d^antigenes basiaues jusqu'alors ignores car non decelables dans l e s " e x t r a i t s 2ifh" qui, eux, avaient

permis 11 identification des antigenes acides AgE, Ra3» Ra/f,Ra5»

l o r s de travaux anterieurs.

2°) Purification des antigenes

-Le but e s t d1eliminer au maximum l e s composes contaminants

presents dans l e s e x t r a i t s , pour obtenir l e s preparations antige-niques les plus pures possibles, permettant d ' i d e n t i f i e r e t de caracteriser au mieux l e s antigenes concernes.

Les protocoles experimentaux de purification font appel aux procedures biochimiques conventionnelles, permettant de separer l e s macromolecules presentes dans une solution par leurs poids moleculaires e t par l e u r s proprietes electriques.

Sont a i n s i generalement u t i l i s e s :

- l e fractionnement par precipitation des proteines au sulfate

d1ammonium (separation basee sur l e s di fferences de

solubi-l i t e ) .

- l a f i l t r a t i o n sur gel : Sephadex ou Biogel (separation selon l e poids moleculaire).

- l a chromatographie par echange d•ions (separation selon l a charge electrique), avec l e s echangeurs :

- de cations : carboxymethyl cellulose (CMcellulose)

- d1anions : diethylaminoethyl cellulose (DEAE_cellulose)

comme l e montrent l e s deux exemples ci-dessous : Stylc cxlracl

Crude Kxlract , I

80''/, ammonium sulfate precipitate DKAE- cellulose (Tris- HCI pH 7. 8) 0. 05M Kr A 0. 05M > 1. 0M NaCI Kr B CM - cellulose 0. 01M acetate pH 5.0 Kr C 0. 1M phosphaie + 0.3M NaCI pH 7.0 Fr D | Sephadex (*• 150 Kr E (antigen SBP) isoelectric focusing SBP a I Sephadex G-100 ~1 SBP-b Ammonium sulphalc rraclionalion (30-45%) (Nll4)2S04 1'raciion (70 mg) contains | Antigcns S and P ! G-200 Scphadcx (Supcrfinc) i sizc Iractionation i

Fractions 12-27 (l-ig. 4) contains Antigcns S and P | Conccntratc | dcsalt on Scphadcx G-25 High-MW matcrial | Dl£AE-Scpharosc pll 8.0 lon-cxchangc Iraciionaiion : (Fig. 5) unbound SHP- a, SBP-a, SBP-b, SBP-h,

FIG. 1. Schematic diagram of the isolation of antigen SBP and its four subfractions from Japanese cedar pollen.

(

r

Dcsalt on Biogel P2

Antigcn S Two major componcms scvcral minor components (< 2 mg) bound | Elutc with j 0-0.5 M NaCl j Dcsalt on Biogcl P2 1 Antigen P Apparently singlc componcnt (< 2 mg)

Fig. I. Flow' sheet illustrating scquencc ol" stcps in purifying Antigens S and P from P. arium style extracts (genotype .S',.S"4)

La mise au point du protocole d'isolation de 1'antigene repose sur l a definition des conditions optimales permettant cette i s o l a -tion : des informa-tions concernant l e s caracteristiques physico-chimiques e t l e s proprietes antigeniques des fractions isolees

sont necessaires pour "guider" 11experimentateur. Des analyses

permettant de caracteriser l e s differentes fractions isolees sont donc menees parallelement pour contrdler l a purification.

g Caracterisation de 1'antigene

-La caracterisation des antigenes met en jeu :

- l e s techniques physico-chimiques "conventionnelles"; - l e s techniques immunologiques.

I I s ' a g i t de combiner au mieux l e s methodes disponibles e t de confronter l e s r e s u l t a t s , afin d'interpreter l e s donnees dans leur ensemble.

1°) Techniques physicochimiques -Sont communement u t i l i s e e s :

- l a determination de l a teneur en proteines e t en polysaccha-rides des e x t r a i t s etudies, par des methodes colorimetriques e t enzymatiques;

- l a determination des poids moleculaires, par -ultracentrifugation,

- f i l t r a t i o n sur gel,

- electrophorede sur gel de polyacrilamide (PAGE),

- l a determination du point isoelectrique (PI) par focalisa-tion isoelectrique (IEF).

PAGE et IEF permettent d'analyser l e s composants presents dans l e s e x t r a i t s en separant ces composants en fonction de leur

poids moleculaire (PAGE) ou en fonction de leur PI (IEF).

Ainsi par exemple, une electrophorese sur gel de poLyacrilamide permet a HOWLF.T e t CLARKF de controler l a purification dv deux

glycoproteines isolees du pollen de Lolium perenne (HOWLl' TT^CLARKE

lal (61 VIEF-SDS/PAGE Glycoproteln 1 Amphollnes pH range

U-

Fig. 3. («) SDS/polyacrylamide-gel electrophoresis of Glycoprotein 1 (A, B), Glycoprotein 2 (C), pollen extract (D). molecular-weight markers 94000, 67000, 43000, 30000, 20100 and 14400 (E) and (6) two-dimensional gel

electrophoresis of Glycoprotein 1

(a) Gels containing 12.5% acrylamide and 0.1% SDS were stained with Coomassie Blue. (6) First dimension:

isoelectric focusing (IEF) in 8 M-urea, pH gradient 4-7; second dimension: SDS/polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS/PAGE).

Un seul composant apparait, aussi bien pour l a glycoproteine 1 (A, B,

que pour l a glycoproteine 2(C) - l e s contaminants presents dans 11

ex-t r a i ex-t non purifie (D) enex-t effecex-tivemenex-t eex-te elimines.

La determination des poids moleculaires se f a i t par reference a des temoins standard (E). Une analyse par focalisation isoelectrique permet de constater que l a glycoproteine 1 , qui apparait comme un seul composant par 1'electrophorese sur gel, correspond en f a i t a t r o i s composants, qui different legerement par l a valeur de leur PI. Le PI de l a glycoproteine 2 n ' a pu Stre determinee i c i dans l a mesure ou i l e s t superieur a 9 .

On cherchera, bien sdr, a determiner l a composition moleculaire des substances isolees. La composition en amino-acides e t en poly-saccharides, e t 1'arrangement des residus seront determines selon l e s methodes classiques d'analyse quand cela e s t possible (hydrolyse chimique e t enzymatique, methodes colorimetriques, chromatographie sur papier, chromatographie gazeuse, . . . . ) .

Dans certains cas ou l e s quantites d'antigenes disponibles ne sont pas suffisantes, des informations peuvent § t r e deduites par 1 'analyse des interactions macromolecules-lectineri et

macromolecu-les-antiserums (HOWLETT et CLARKE - 1981).

Ainsi, par exemplo, l a liaison d1une glycoproteino avec l a

Con A indique l a presence de residus manose ou glucose, soit en position terminale, s o i t en liaison

C'est pourquoi certains experimentateurs introduisent dans leur protocole des chromatographies d'affinite pour les lectines.

La chromatographie d ' a f f i n i t e pour une lectine apparait d ' a i l -l e u r s comme un o u t i -l de p-lus pour -l a separation e t 1'iso-lement des glycoproteines, comme l e montrent l e s travaux de KARLSTAM e t NILS-SON (1982), qui ont employe l a chromatographie d ' a f f i n i t e pour l a Con A pour separer l e s allergenes du pollen de differentes especes vegetales.

Dans leurs travaux, HOWLETT e t CLARKE (1981) proposent une methode simple pour 1'etude des interactions glycoproteine—lectine qui permet de detecter rapidement des quantites nanometriques de lectines l i e e e s .

2°) Techniques immunologiques

-A ce stade, l e s techniques immunologiques vont apparaitre comme un o u t i l particulierement precieux.

Les techniques immunologiques u t i l i s e n t l e s anticorps produits par un animal (lapin, chevre, souris, . . . ) en reponse immunitaire

a l a penetration d'un antigene. Elles s1appuient sur l a propriete

qu'ont ces anticorps de se l i e r de fagon specifique aux antigenes qui leur ont donne naissance.

^ Differentes techniques sont u t i l i s e e s , qui font appel a l a reaction de precipitation qui se produit quand un rapport de

concentration favorable existe entre antigene e t anticorps. Cette reaction de precipitati.on peut §tre visualisee dans des gels, l e s precipites formes etant reveles par coloration (le plus souvent au Bleu de Coomasie).

• a - Immunodiffusion radiale simple (RID)

-La reaction s'effectue sur une plaque recouverte d'une gelose dans laquelle a ete incorpore 1'antiserum. L'antigene est depose dans des puits creuses dans l a gelose et diffuse. Des disques de

precipitation se forment progressivement e t se s t a b i l i s e n t . La t a i l l e de 1'anneau de precipitation obtonu est proportionnelle A l a quantite d'antigene presente dans l e puits. L'etablissement d'une courbe etalon peut donc permettre un dosage precis de l a concentration en antigenes.

9-LEE e t DICKINSON (1979) ont u t i l i s S cette methode pour etudier l'Ag E (ou du materiel apparente a l'Ag E) dans l e pollen de diverses espdces proches de Ambrosia artemisiifolia.

(Ag E = allergene maj.eur de A« artemisiifolia).

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.Tv>fc •>.... j£>

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m

i a « i

RID STANDARD CURVE

50 100 200 400 800

AgE CONCENTRATION, / z g / m l

Fig. 4. Antigen E standard curve. The best-fitting straight line was calculated (see Mi TIUIDS). The values are trom Fig. 2.

2. RID plate shouing

precipitin rings from pollen of various Ambrosia species and purified AgE Irom A. artcmisiifolia. Antigen ditTused into the •mtibody-containing agarose from vxells that contained concentrated pollen extract (equ.valent to 2.6 mg pollen. or various concentrations of AgE from A. artcmisiifolia. Pollen uas Irom Greer l.ab. Spec.es and lot numbers were /»<i annuMtfolni ,470201-10). Antbrosia acanthkarpa (353M185-91. A. psilostarhyu (55N5S-VI. Onl> a single lot ot each ofthe other spcUo ttas obtained. Information for these species and a key to abbrex iations aie g.ven .n r.ible I.

. _B_ Double diffusion dj OUCHTERLONY

-Antigenes e t anticorps deposes dans des puits creuses dans l a gelose diffusent l e s uns vers l e s autres e t precipitent en formant une ligne opaque dans l a region ou i l s se rencontrent en

propor-tions optimales. I I s ' a g i t d1une methode qualitative dont l e but

principal e s t de comparer entre e l l e s des solutions antigeniques. En plagant l e s solutions antigeniques a etudier dans des puits adjacents, l e type de precipite obtenu permet de determiner s i l e s antigenes concernes sont identiques ( a ) , completement differents (b) ou s ' i l s presentent entre eux une reaction croisee ( c ) .

Cette technique simple a mettre en oeuvre est frequemment u t i l i s e e : YASUEDA & Coll. (1983) ont ainsi pu t e s t e r l a purete de 1'Ag SBP i s o l e du pollen de Cryptomeria japonica. La procedure d'extraction ( c f . Fig.p'*-) conduit bien & 1'elimination des compo-sants contaminants. On constate d'autre part que l e s quatre frac-tions obtenues en phase finale presentent l a m6me i d e n t i t e immuno-logique.

FIG. 7. Immunodiffusiori analyses. a, CE in well 1 (10 mg/ml); antigen SBP in well 2 (0.1 mg/ml); rabbit anti-CE serum in well 3; rabbit anti-SBP serum in well 4. b, SBP-a„ a» b„ and b2in wells 1,

2, 3, and 4, respectively (0.1 mg/ml); rabbit anti-SBP serum in well 5.

MAU & Coll. (1982) mettent en evidence l a composition antigeni-que des e x t r a i t s s t y l a i r e s de differentes varietes de Prunus avium. On constate que s i l ' u n des antigenes est present chez l e s quatre varietes testees i c i (bande interne), 1'autre n ' e s t present que dans l e s deux varietes de genotype S3 S4.

Fig. 2A-D. Antigcnic componcnts of Prumts aritmi styles. A,

B Antigens were prcpared from extracts of mature stvles of

diffcrcnt P. twium cultivars. B. Sedford (S,S2); ER. Early Rivcrs (S,52); L. Lamberi (S,S4); /V. Napolcon (S_,S4). Antise-rum was raised to 80% ammonium sulphatc prccipitatcs of extracts prcparcd from maturc stylcs of cv. Lambert (S,S4). (Antiscrum to slylc cxtract.) A Immunodiffusion showing inncr diffusc band (Antigen P) common to all cultivars tcsted; a strong outcr band (Antigcn S) is produced xvith antigen prcpa-rations from cultivars of the samc gcnotype as thc eliciling antigcn uscd 1'or antiscrum production (S,S4). A faint. but dc-tectable band corresponding lo thc outer (Antigen S) band was produced using antigen preparalions from S,S2 varieties; this band is not visiblc in the photograph (unstaincd gcl). B Immu» C Immunoe.lectrophorese (IE)

-Lorsqu'on a a f f a i r e a des melanges antigeniques complexes, l e s methodes presentees cidessus ne sont pas performantes. Une s e -paration prealable des antigenes presents par electrophorese avant diffusion et precipitation va permettre une rneilleure identi fication des composants.

Differentes versions se sont developpees : + Immunoelectrophorese de GRABAR et WILLIAMS

-5o li/flert (\ * h ?

1)separation electro-phoretique de l a solution antigenique

A^uuv> u O V J

pUcx i1 o^)r /)e/vni 2)diffusion des antigenes

et des anticorps precipitation 00 O J J , ;'V i *:

t

": V

3. Prcscnve of AyK-hkc miitci i.ils

in pullen cxtracts of Amhnism spccics as dcmonstrated by conxcntivn.il immunovlcvlrophorcsis. \\ holc pollcn cvtiavts ucrv vlcctrophorcscd 2 hr at 2 V cm (anodc at rightl. 3.V. photoyraph: 3B. skctvh of prccipitin hands. Troughs ucrv tillcd with shccp antiscrum for purificd antigcn H from A. iirti miuifolia. and thc photograph uas takcn 48 hr latcr. Scc Tahlc ! for kcy to ahhrcviations and the tcxt for expcrimental dctails.

•S. si?2

^ O s

O P

MAU e t Coll. 1 982

Xwwxunoclccirophorcsis at pH 8.8 showing scparation of Antigcns S and P. Antigcn S, detcctcd only in thc .S VS4 antigcn prepara-tions, is positively charged. and Antigcn P, common to both •S|.S% and 5,S4 antigens is ncgativcly charged (unstained gcl). C Immunoclcctrophorcsis at pH 8.8 of purificd Antigcn S (uppcr ccll) and purificd Antigcn P (lowcr wcll) usitig antiscrum lo stylc cxtrucl (slained gcl). Thc Atitigcn S prcparation con-tains two positively chargcd. closcly rclatcd componcnts vvhich corrcspond to Antigcn S in 2B. Thc Antigcn P prcparation gives a single ncgativcly chargcd componcnl which corrcsponds to Antigcn P in 2B..D Immunodiffusion showing singlc hands

Les informations fournies sont qualitatives.

+ Immunoelectrophorese de LAURELL (Rocket immunoelectrophorese (RIE)) C'est une methode quantitative qui consiste en 1'electrophorese de 1'antigene dans un gel contenant 1'anticorps.

5C, tro lrr\

veoo/a ii*0 n 3 air tij? Cj ^ e 5 La hauteur du pic (rocket) de precipitation est proportionnelle a l a concentration de 1'antigene. Un dosage des antigenes e s t donc

possible par reference a une gamme etalon.

Une modification de cette methode e s t parfois employee : Les preparations antigeniques a etudier sont appliquees dans l e s puits creuses dans un gel depourvu d'anticorps e t on l a i s s e ainsi diffuser

l e s antigenes pendant une certaine periode avant de proceder a 11

electrophorese dans un gel contenant 1'anticopps. De cette faqon, l e s l i -gnes de precipitation des antigenes communs aux differentes prepara-tions fusionnent. C'est pourquoi on parle de "Fused-Rocket-Immunoelec-trophorese" (FRIE). 1500 pl Am.e.76 tli.i.iiiMtti» MW(xlO~ ) 1500 u l Am.e.76

" Quan,lla"vo 'mmunoel<-ctr.>|.li()i,.|n: (Ult) iinalysis ol trnctions ,.| Ani (a.i.nns! ant.-Am .v/ti. I:) „l cnv)alt,-r chromatoqiapliy on Si*phad«>« U,'!> ' '* |uo,s '' "'i ,rom ,hl' 'Himbered colimin tractions wrrr apptied 111 a,t|a, ,-nt w,.|is ,iml allowcil to clittiis,' (I hr) tivtor,' bpiruj suli|,., t,.ti to tusixl-rovkot irnmunocliM Irophorosis (11. hr at 2 V ,-m) into ,|..|s , ont.iminii anti-Am (• ?l', An.roximat, lv m vv ( >. 10 ') ot Iho nntmons ar.' imliratiM 0. CLIt liaction No b.t was

L O \xze AJ5 T£ /A/ et M

Dans cet exemple, LOWENSTEIN e t MARSH u t i l i s e n t cette methode pour etudier l e s differentes fractions obtenues apres chromatographie Sephadex de 1 ' e x t r a i t pollinique d^Ambrosia e l a t i o r . En respectant 1'ordre d'obtention des fractions par chromatographie Sephadex l o r s

de 1•application des solutions dans l e s puits, on conserve l a corres-pondance antigene-poids moleculaire. Parmi l e s antigenes avec un poids moleculaire inferieur a 10.000, huit sont basiques e t seulement deux acides. Tous l e s antigenes ayant un poids moleculaire superieur a 40.000 sont acides. (LOWENSTEIN e t MARSH 1981)

+ . Immunoelectrophorese bi-dimensionnelle (crossed immunoelectrophorese Yc i e )

Une premiere separation electrophoretique du melange d'antigenes e s t suivie par une deuxieme electrophorese perpendiculaire a l a pre-miere, qui se f a i t en gel contenant 1'anticorps. Cette methode four-n i t des resultats a l a fois q u a l i f i c a t i f s e t quafour-ntitatifs : Ofour-n obtiefour-nt des lignes de precipitation correspondant a chacun des systemes

antigene-anticorps; ces lignes ont une forme de pic dont l a hauteur e s t proportionnelle a l a concentration d'antigenes.

Ainsi LOWENSTEIN e t MARSH ont u t i l i s e 1'immunoelectrophorese

bi-dimensionnelle pour analyser 11extrait pollinique d(Ambrosia

e l a t i o r :

2 2 5 y l aAm.e. 7 6

aAm.e. 7 6

i .• ;VL/'

Figurc 1 Ciossod immunoelpctrophoretic (CIE) analysis ol the reference raqwoccl pollen extract, Am.e.76. against anti-Am.e.76 and anti-Am.e.78. CIE was

performcd in 1". atjnrosi' ij«'' containing 0.073 M Tris. 0.02-1 M harbitnl, 0.0006 M cnlc»um lactate, and 0.0003 M sodium azide (pH 8.6. 25nC) at 15°C using 10 V/ cm for 30 min in thc? Ist dimension and 2 V cm for 15 hr in thr 2nd dimension (12) Anodes were to the right for the 1 st dimension and at the top for the 2nd dimension An intvrmndMtd gol tonfatnin') no antnion or antilnidK.-s was placvd hiMwoon the 1 st dimension gel and the anodic antibody-contaimng gel in order to iniprovc rusolution in ttu- ?\ui dimcm.ion A, D. and C, arnoonts and types of nnliijens and antibodies are indicated on the figures. Figure 8 is overexposed in order (r, revoal Itn- inaxinuiin Muniticr ut lusic: pr(y.:ipitat<*s O, drawuu) «»t tfie rcjforiMu e pr»*c ipitation pattern (Am.e 76 vs antiAm.e 76) with classification numbers tor the preupitatoii and corrc.pundiruj .intMiens L, trxp.inded drawintj ol Ihp procipit.ited c.ithodic-fnoving antigens

12-Une bonne separation des antigenes a et6 obtenue en faisant

varier l e s temps e t l a position du puits d'application de lfantigene

pour l a premiere electrophorese e t en faisant varier l e s concentra-tions d'antigenes e t d'a'ntic"orps.

L'analyse revele ainsi l a presence de 52 antigenes, dont 33 migrent vers 1'anode e t 16 vers l a cathode. Cette methode se montre

t r e s sensible, e t bien qu'elle ne puisse pretendre a deceler tous l e s antigenes presents, c ' e s t un o u t i l particulierement performant pour

11etude des melanges complexes d'antigenes.(LOWENSTEIN-MARSH 1981 ) .

Une variante de cette methode est parfois u t i l i s e e , couplee a une CIE "normale", pour i d e n t i f i e r l e s antigenes presents dans Tine preparation antigenique purifiee. On parle de "crossed-line-immuno-electrophorese" (CLIE). La procedure est l a m§me que pour l a CIE, mais l o r s de l a deuxieme electrophorese, un gel contenant l a frac-tion purifiee e s t introduit entre l e gel resultant de l a premiere electrophorese e t l e gel impregne par 1'antiserum. On compare a l o r s l e s lignes de precipitations obtenues dans ce cas au schema de preci-pitation de reference obtenu avec l a CIE "normale".

B. CLIE: fraction No. 28 was incorporated into the intermedlate gel between 1st dimension gel and the cathodic antibody-containing gel and Am.e.76 in the well. C,'control for S without antigen incorporated into the intermediate gel. Arrows iltustrate antlgen identification as fotlows: * . 10E, . 2 . and , 26, which was obtained by comparing the fused-line- and crossed-immunoprecipltates In 8 with the crossed-immunoprecipitates In C.

LOWEITSTEIN 8< Coll. ont abondamment u t i l i s e cette methode pour 1'etude des antigenes du pollen d'Ambrosia e l a t i o r (LOWENSTEIN et

MARSH 1981 / - LOWENSTEIN & Coll. 1981 ) .

On trouve aussi dans certaines etudes l a realisation de CIE "tandem" : LEE e t DICKINSON ont soumis 1'extrajt pollinique de Ambrosia artemisiifolia a cette technique :

Fig. 1-3. 1. Crossed immunoclectrophoresis plate of a whole pollen vxtract of.4. orn miuifolia alone (leftl and in tandem ttith purified AgE from A. artvmhiifoiia (right). 1A. photograph: IB. sketch ofpreapitm hands. The tirst dimension consisted 1,1 clevtrophoresis |2 hr at 2 V.cm) in buffered agarose and the anode «as to the right of the three xxells in vshich samples were placed initially. The second dimension consisted of electrophoresis 115 hr ,,t 1.5 V cml into agarose which contained nihbit antiserum against whole pollen extract of A. artcmisiifoliu. and the anode xtas at the top. The wells laheled " rt" received concentrated pollen e.xtract which represented 2.6 mg of pollen. The xu-ll that is labeled "E" received 7/ug of AcE The photograph «as taken 48 hr aftcr termination of electrophoresis. Sec tcxt for other details. |

(LEF, e t DICKINSON 1 979)

L'extrait pollinique est soumis a 1'electrophorese en tandem

avec 11antigene E purifie pour determiner quelle bande de 1 ' e x t r a i t

correspond a 1'Ag E. Les antigenes identiques de puits differents produiront une seule bande de precipitation fusionnee au l i e u de deux bandes de precipitations qui se chevauchent. Ainsi l a ligne de precipitation de 1'AgE fusionne avec l a ligne notee A. Cependant l a partie gauche de l a ligna A existe encore : l a fusion avec 1'AgE n es t que p a r t i e l l e . La bande A contient 1'Ag E, mais aussi au moins un autre antigene different de Ag E.

On peut aussi constater qu'une fusion partielle existe entre l a ligne B et l a ligne A pour 1 ' e x t r a i t t o t a l , ce qui indique que l e pollen possede des substances presentant une meme specificite antigenique, mais avec des mobilites electrophoretiques differentes.

Dans leurs travaux, VIK & Coll. (1983) ont u t i l i s e l e s techniques de CLIE e t CIE "tandem" pour e t a b l i r l e s relations immunologiques

existant entre l e s differentes fractions allergeniques du pollen de bouleau.

* U n e a u t r e technique assez souvent u t i l i s e e dans l e s etudes

immunologiques des antigenes vegetaux est le radio-immuno-essai

e n phase solide, qui repose sur l e principe suivant :

L ' a n t i . j j o n t e s t a b s o r b e s u r u n s u p p o r t s o l i d e ( o n u t i l i s e b o a u c o u p m a m t e n a n t l e s p l a q u e s a m i c r o t i t r o c n p o l y v i n y l c h l o i i d e f l e x i

-b l e ) ; p u i s u n e i n c u b a t l o n a v e c 1 « a n t . i n r r u m p e r m e t a u x a n t i c o r p s d o

s e f i x e r s u r l e u r s a n t i i r o n e s s d p c i f-i ^ T ,, ^ , ,

,, " u optun.v.k.,. Les co.-nplvxo;;

anticorps sont reveles par des immunoglobulines anti-anticorps

marques l e plus souvent par mais aussi parfois par un

en-zyme. Ainsi VIANDER & Coll.(l979) font appel a un enzymo-immuno-essai (EIA) pour l a detection semi-quantitative des antigenes dans l e s differentes fractions obtenues apres f i l t r a t i o n sur g e l .

P r o t e i n A n t i g e n 0 . 4 0 . 2 200 0 4 0 0 600 E L U T I O N V C L U M E ( M L ) Kig. I. Sephadcx G-IOU gel lilli.ilioii ol biich pollrn cxli.ul inl, Kl-1 iv/x). Proivin ((iiuciitrations ol ihc h.ntioiix ipcaks A. H, C, L) and K1. arc slunvn bv solid linc l ). Binding ol rabbit amibodics io ihc dillcicm Ivaiiious 11-1A. ahsoibancv ai 40.i niii - OI>vn; pcaks Wi. W,. \'r,. \'.-( and V..,) is shown b\ dois conncctcd bva linc t 1. li.u kgrouiul biuduig ol aniibodics lioin a noniial rabbii sci uin is indicatcd bv doiicd linc < 1.

Remarque Probleme de l a specificite

-Si l e s methodes immunologiques apportent une aide precieuse, i l est necessaire, pour une bonne u t i l i s a t i o n de celles-ci e t pour une interpretation correcte des r e s u l t a t s , de bien connaitre l a nature des inter-actions antigenes-anticorps et en particulier ce que recouvre l a notion de specificite antigenique.

L'existence des reactions croisees (1'ant.icorps peut reconnaitre un antigene autre que son immunogene s i cet antigene possede des

determinants antigeniques identiques - ou de structure voisine - a ceux de 1'immunogene) impose des limites a l a notion de s p e c i f i c i t e . L'idee d'une specifite plus ou moins e t r o i t e invite a l a prudence dans 1'interpretation des r e s u l t a t s .

E n p a r t i c u l i e r s e p o s e l e p r o b l e m e d e l a s p e c i f i c i t e d e s a n t i -c o r p s u t i l i s e s . L e s a n t i s e r u m s q u i s o n t o b t e n u s p a r i n j e -c t i o n A u n a n i m a l ( l e p l u s s o u v e n t u n l a n i n , m a i n a u s s i . u n m o u t o n , u n e c h d v r e , u n e s o u r i s , . . . ) d ' u n e p r e p a r a t i o n a n t i g e n i q u e c o n t i e n n c n t g e n e r a l e m e n t d e s p o p u l a t i o n s d ' a n t i c o r p s q u i r e a g i s s e n t c o n t r e u n l a r g e e v e n -t a i l d e d e -t e r m i n a n -t s a n -t i g e n i q u e s . i . e s a n -t i c o r p s p r- s e n t s s o n t

15

susceptibles de se l i e r a des antigenes identiques a ceux prdsents dans l a pr6paration antigenique (et dans ce cas eventuellement a des antigdnes mineurs contaminants cette preparation), mais aussi a des antigenes n'existant pas dans cette preparation, mais ayant des determinants communs avec l e s antigenes immunogenes.

(KNOX & Coll. 1980 - KNOX 1982) Ainsi HOWLETT e t CLARKE (1981 (2)), u t i l i s a n t des anticorps

marques a 11a v e c l a technique des radio-immuno-essais sur

plaque-microtitre de polyvinylchloride, ont mis en evidence une reactivite croisee importante entre differentes glycoproteines vegetales. L'antiserum de l a glycoproteine 2 isolee du pollen de Lolium perenne se l i e a diverses glycoproteines vegetales, dont d'autres glycoproteines de pollen comme l a glycoproteine l.Les auteurs ont montre que l e s determinants antigeniques mis en jeu dans cette reactivite croisee etaient probablement des sequences de saccharides incluant arabinose e t galactose. I l s considerent que cette reactivite croisee entre l e s glycoproteines vegetales peut etre un phenomene t r e s general qui impose des r e s t r i c t i o n s a 1'interpretation des resultats obtenus en immunochimie e t immunocytochimie.

C1est pourquoi, d'une maniere generale, l a specificite des

anticorps doit §tre testee pour essayer de determiner au mieux l e s proprietes immunologiques du materiel employe.

Les recents perfectionnements apportes aux techniques d'analyses des interactions antigenesanticorps presentees c i

-dessus permettent aujourd'hui d1evaluer qualitativement et

quan-titativement ces interactions avec un haut niveau de precision, l e s techniques disponibles etant modifiees e t adaptees pour r e -pondre aux besoins particuliers.

Un grand espoir face aux problemes de specificite est appor-t e par l e developpemenappor-t recenappor-t d'une nouvelle appor-technique de produc-tion des anticorps, offrant l a possibilite d'obtenir des anticorps d'un seul type ou anticorps monoclonaux. Cette technique recemment developpee en biologie animale devrait, dans l e s prochaines annees, trouver des applications en immunologie vegetale e t permettre de surmonter certaines d i f f i c u l t e s .

I I .LOCALISATION DES ANTIGENES VEGETAUX Introduction

-Les techniques immunologiques offrent des possibilites de detection des macromolecules des organes, tissus et cellules, plus specifiques que l e s methodes cytochimiques conventionnelles(KNOX-1982)

S ' i l a fallu attendre l e s annees 70 pour voir l e s premieres

investigations immunocytochimiques chez l e s plantes, aujourd1hui

1'immunocytochimie e s t bien etablie comme un o u t i l hautement speci-f;ique pour l a localisation des proteines, glycoproteines e t poly-•saccharides des t i s s u s vegetaux aussi bien a l a surface cellulaire que dans l e s cellules.(KNOX & Coll. 1980).

Les auteurs se sont efforces d'adapter l e s methodes developpees en biologie animale pour leur application chez l e s vegetaux, en

essayant de resoudre l e s problemes specifiques poses par l e material vegetal.

Le tableau de l a page suivante presente une l i s t e de quelques une des travaux qui ont ete menes concernant l a localisation

des antigenes vegetaux extracellulaires. _1 Principe de 1'immunocytochimie

-L1immunocytochimie u t i l i s e l a specifite de l a liaison

antigene-anticorps pour visualiser l e s antigenes "in s i t u " , au sein des cellu-l e s e t t i s s u s vegetaux. Les anticorps mis en incubation avec ces cellules ou t i s s u s iront se fixer sur leurs recepteurs specifiques s i ceux-ci sont presents, un marqueur permettant de reperer l e

complexe ainsi forme.

• Trois methodes differentes sont u t i l i s e e s : methode directe (1 etapa)

i

n

W

iQh fr< ,er\e- Rh/f<

e-VX6-^ ' ' ' ' ' molecob poirfewh

' 1 l M i < wvar^veuir

La methode 'tiu sandvd.ch" offre une plus grande specificite,mais

Table 2. Selected list of extracellular antigens of plants located by immunocytochemical methods. Abbreviations as Table 1.

Organ, ttssue or cell Antigen Fixation Sectioning Technique/ Cellular site of Reference probe antigen Pollen Gladiolus Diffusible Ragweed, antigens Cosmos, Poplar, Phalaris, Malvaviscus

Phalaris, Cosmos, Diffusible

Ragweed, (pollinated stigmas) Birch Ragweed Rvoj;rass Stignia Kale Stom Svvd Jack bvan Brown alga Fucus Slinn- mi>uld Dicti/ostclium antigens Diffusible antigens Antigen E Group 1 allvrgvn, Antigvn A Diffusiblv antigvns Cvllulosv (Buffvr-insolublv) Ureasv None None None Freeze-substitution Mvthanol or frvvzv-drivd Nonv Form and glut Nono

Alginic acid Nonv

Frozen or I-RITC 'pollen prints' I-FITC in agarose None Paraffin JB-4 plastic Nonv Razor bladv svctions Frvvzv-svctioning I-FITC

Wall sites; Knox et a l . (1970) exine and intine Knox (1971)

Knox & Heslop-Harrison (1971a,b); K n ox e t a l .

(1972); Heslop-Harrison

etal. (1973)

PoIIen surface, Knox & Heslop-Harrison pollen tube, (1971); Knox (1973) and adjacent

stigma surface

Whole grains I-FITC Pollen surface Belin & Rowley (1971) I-FITC D-FITC l-Fvrr i-Fr

rc

Pollen wall and surface cytoplasm

Howlett et a l . (1973)

Knox et a/. (1980) 1'his papvr Howlet e/ a/.

(1981) Vithanage et a/. (1980) Surfacv Cvll wall and pvriplasmic spacv Interccllular space

GMA plastic I-FITC Cvll walls

rvsin

Hvslop-Harrison ct ul. (1975)

Bal ct ,il. (1976)

Murrav & Knox (1977)

Vrvvlnnd (1472)

Discoidin Glut Nonv I-Fvrr Cvll surfacv Chang <•/ nl. (1975)

Fixation - formaldchyde (Form); glutaraldvhydv (Glut). Technique - direct (D) or indirect (I) with fluorescent markers: Fluorescein isothiocyanate (FITC);

Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC); Lissamine Rhodamine B (LRB); or electron-dense markers for transmission electron microscopy [ferritin (Ferr)].

KNOX & Coll. 1980

des quantites importantes d'antigenes purifies doivent §tre disponi-bles.

La methode indirecte permet une meilleure resolution : l a

fluorescence est amplifiee, plusieurs anti-immunoglobulines pouvant se, fixer sur une molecule anticorps. De plus, l e s anti-anticorps sont disponibles commercialement, e t l e m§me reactif une f o i s marque peut Stre employe pour plusieurs reactions, alors que l a methode directe demande a ce que 1'anticorps specifique de chaque antigene etudie s o i t conjugue individuellement avec l e marqueur, ce qui alour-d i t l a procealour-dure.(KNOX & Coll. 1980).

D'une fagon generale, l a methode indirecte est l a plus frequem-ment retenue ( c f . tableau).

. Les marqueurs

-Les differents marqueurs classiquement employes en immunocyto-chimie vegetale sont passes en revue par KNOX (1982), qui presente aussi quelques innovations recemment developpees.

Peuvent e t r e u t i l i s e s : - des fluorochromes :

- l a fluoresceine isothiocyanate (FITC)

- l a tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TfiTTC) - l a lissamine rhodamine B (LRB)

- l e stilbene isothiocyanate (SITC) - des enzymes :

- l a peroxidase, - l a phosphatase.

- des produits denses aux electrons : - l a f e r r i t i n e ,

- 1 ' o r colloldal.

Les fluorochromes sont l e s plus frequemment u t i l i s e s (cf.tableau I l s ont 1'avantage de permettre l a meilleure resolution en

microsco-pie optique. Mais i l faut faire face au probleme de 11

autofluorescen-ce de autofluorescen-certains composants des t i s s u s vegetaux, (en particulier l a

fluorescence des polyphenols est importante aux longueurs d1onde

d1excitation de l a FITC).

L'autofluorescence peut §tre minimisee en jouant sur l e s

lon-gueurs d'onde d1excitation, mais en tout etat de cause, des contrSles

devront § t r e f a i t s parallelement aux essais proprement d i t s pour differencier l a fluorescence specifique de 1'autofluorescence.

Enfin, i l e s t necessaire, apres conjugaison du reactif avec l e marqueur, de v e r i f i e r que l a capacite de liaison avcc Le recepteur

2 - Problemes(particuliers

-Deux points particuliers sont a souligner concernant l e s metho-des immunocytochimiques :

- Ces methodes etant basees sur l a reconnaissance specifique

antigene-anticorps, i l e s t important de s'assurer de l a "qualite" de cette specificite, qui conditionne leur f i a b i l i t e ;

- Le probleme majeur reste probablement celui de l a preparation des t i s s u s pour permettre 1'acces des anticorps vers leurs

s i t e s recepteurs tout en preservant l a structure fine des cellules.

1°) Specificite des anticorps

-Nous avons vu ( c f . p15) que l e s antiserums obtenus par l a

methode conventionnelle d1immunisation d'un animal pouvaient

presen-t e r une specificipresen-te plus ou moins .large (anpresen-tigene conpresen-taminanpresen-t dans l a preparation antigenique purifiee, reactions c r o i s e e s , . . . ) . L'existence des reactions croisees impose des restrictions sur 1 ' i n t e r p r e -tation des etudes immunocytochimiques.

I I e s t necessaire d1evaluer l a specificite des antiserums avant

u t i l i s a t i o n en immunocytochimie dans l e but de reduire au maximum l e s liaisons non specifiques. Les techniques d'analyses disponibles

permettent actuellement d1evaluer l a specificite avec un relativement

haut niveau de precision.

Differentes methodes sont disponibles pour accroitre l a specificite de 1'antiserum :

+ Immunoadsorption : L'antiserum peut Stre adsorbe avec un ex-t r a i ex-t ex-t i s s u l a i r e apparenex-te pour eliminer l e s anex-ticorps communs. Ainsi FERRARI & Coll (1981), pour i s o l e r 11antigene S specifique du genotype S2S2 des stigmates de Brassicae oleracea, adsorbent 1'antiserum avec des e x t r a i t s de stigmates de genotype S1 S1 afin

d'eliminer l e s anticorps communs e t de ne garder que l e s anticorps specifiques du genotype S2S2.

+ Purification t o t a l e ou p a r t i e l l e de l a fraction Ig G de 1 ' a n t i -serura :

- precipitation au sulfate d1ammonium suivie d'une

chromatogra-phie par echange d'ions (chromatograchromatogra-phie-DEAE)

- chromatographie d ' a f f i n i t e pour l a proteine A de Staphylocoque suivant l a methode de HELM & Coll.(1972)

+ obtention des anticorps monosp6cifiques par chromatographie d^affinite pour 1'antigene.

2°) Preparation des tissus

Le succes des methodes immunocytochimiques depend de 1 ' i n t e g r i -t e des de-terminan-ts an-tigeniques qui l i e n -t l e s an-ticorps. Les me-thodes employees pour l a preparation des t i s s u s doivent donc eviter d ' a l t e r e r cette i n t e g r i t e .

Deux types de procedure sont u t i l i s e s :

- Dans un cas l e s cellules ou l e s coupes t i s s u l a i r e s sont expo-sees directement aux anticorps specifiques ( avec ou sans proce-dure de fixation) = "pre-embbeding staining method".

- Dans 1 ' a u t r e cas, l e s tissus ou cellules sont fixes, puis inclus dans une masse plastique e t des coupes fines sont effectuees, qui sont mises a incuber en presence des molecules a n t i -corps-="post embbeding staining method".

- La premiere methode, techniquement moins lourde, reste peu ernployee pour l a localisation des antigenes vegetaux, car on est alors confron-t e au probleme de l a peneconfron-traconfron-tion des anconfron-ticorps dans l e s cellules non coupees : l a paroi cellulaire des cellules vegetales apparait comme un obstacle genant cette penetration, d'ou des r e s u l t a t s f a l s i f i e s . Cependant l e s progres developpes recemment et qui trouvent leur

expression dans l a methode de WICK & Coll. u t i l i s e e pour l a l o c a l i s a -tion de tubuline dans des cellules racinaires de 1'oignon, ouvrent de nouvelles perspectives pour 1 ' u t i l i s a t i o n de cette methode dans l a localisation des antigenes i n t r a c e l l u l a i r e s (KNOX 1982).

- La deuxieme technique a ete largement u t i l i s e e dans l a mesure ou e l l e permet 1'acces direct des anticorps aux s i t e s antigeniques. Elle e s t u t i l i s a b l e aussi bien en microscopie optique qu'en microsco-pie'

electronique.

Les etapes mises en jeu e t l e s problemes qui peuvent se poser l o r s de 1 ' u t i l i s a t i o n de cette methode sont resumes dans l e schema de l a page suivante, e t sont discutes dans l e s a r t i c l e s de KNOX.

(KNOX & Coll.1980 , KNOX 1982)

Fixetion Embedding plastic resin Incubation m labetied-antibody Antigen sites Section cutting Extracelluiar antigens diffuse into aqueous fixabves antigens denatured Non-specdic binding of labelled-antibody to fectins or poiy-phenols in tissue Soiuble antigens difhise mto iqueous mounting soiution

Fig. 2. Scheme showing the post-embedding staining procedure for immunofluorescence, and

some of the artifacts that may occur at the various stages of processing with plant tissues.

KNOX & Coll. 1980

• Les e f f e t s des differents traitements de fixation sur l e s i n t e r -actions antigenes-anticorps restent encore largement a §tre explo-r e s . Les etudes menees jusqu'a maintenant explo-restent ponctuelles et l a situation observee i n vitro n ' e s t pas forcement representative de ce qui se passe i n s i t u .

I I apparait que 1 ' e f f e t des fixateurs aldehyques sur l e s antige-nes vegetaux varie selon l e s systemes etudies.

HOWLETT e t CLARKE (1981) ont etudie l e s e f f e t s de differents traitements fixateurs sur l a liaison antigene-anticorps de deux glycoproteines en u t i l i s a n t une modification de l a technique des radio-immunoessais sur plaque-microtitre en polyvinylchloride. Seul l e glutaraldehyde se revele avoir un effet inhibiteur s i g n i f i -c a t i f , mais 1'inhibition se limite a 13%.

c 16 2 14 K I '2 U 1 10 I 6 1 6

I

FIG. 5. Effects of various fixation treatments on antibody binding of Group 1 allergen and Antigen A of ryegrass pollen as detected by radioimmunoassay. Microtitre tray wells were coated with L perenne pollen extract, Group 1 allergen or Antigen A and then fixation treatments performed in the antigen coated wells. Treatments: (1) un-treated antigen; (2) antigens freeze dried for 16 h; (3) anhydrous methanol for 1 h at 4°C; (4) 4% paraformaldehyde for 1 h at 4°C; (5) 2-5% glutaraldehyde for 1 h at 4°C. After each treatment homologous IgG was added and binding was detected by [,25l]-Protein A (20 x 103 c.p.m. per well). (a-d) refer to the antigen-antibody system:

(a) Group 1 allergen—anti Group 1 IgG; (b) L perenne pollen extract—anti Group 1 IgG; (c) Antigen A—anti Antigen A IgG; (d) L perenne pollen extract—anti Antigen A IgG. The histogram shows counts of [12BIJ-Protein A bound and markers indicate

standard error of mean of at least fourreplicates. For (a) and (c) treatment (5) was significantly different from the other treatments (p = 0-01) uslng a one-way analysis

of variance (from Howlett et al., 1981).

D'autres auteurs ont constate une inhibition beaucoup plus forte

a de faibles concentrations e t pour des temps d'exposition courts.

• Les problemes poses par l a denaturation des antigenes l o r s de l a phase d'inclusions ont ete partiellement resolus par 1 ' u t i l i s a t i o n de resines ne necessitant pas de traitement a l a chaleur ou aux u l t r a - v i o l e t s pour leur polymerisation (comme l a resine JB4). • Un autre probleme est pose par l a diffusion des antigenes

solu-bles l o r s de l a preparation des t i s s u s . C'est pour prevenir cette diffusion que HOWLETT & Coll. ont developpe une methode ou l a fixa-tion par congelafixa-tion , suivie rapidement de 1'inclusion a basse temperature des t i s s u s en resine JB4, dans un envirouinement non aqueux, a permis l a localisation des glycoproteines hydrosolubles du pollen de Lolium perenne. La methode a ete appliquee avec succes a l a localisation par immunofluorescence (HOWLETT & Coll. 1981), mais e l l e a aussi ete adaptee aux observations en microscopie

electronique avec marquage a l a Ferritine (VITHANAGE & Coll. 1980)

Le succes de 11application de cette methode ouvre l a voie pour

son adaptation a d'autres systemes vegetaux.

III - ROLE DES ANTIGENES DE SURFACE DANS LA RECONNAISSANCE CELLULAIRE"^

L'implication des antigenes de surface dans l e s mecanismes de reconnaissance cellulaire chez l e s vegetaux a ete revelee par

un certain nombre d1observations. CLARKE et KNOX (1978) ont

dresse un bilan de 1 ' e t a t des connaissances concernant l a recon-naissance cellulaire chez l e s plantes a fleurs, ou i l s passent en revue un certain nombre de situations dans lesquelles des mecanismes de reconnaissance sont impliquees (reconnaissance greffon-sujet, plante-pathogene, plante-parasite, plante-symbion-t e , pollen-splante-symbion-tigmaplante-symbion-te). I l s discuplante-symbion-tenplante-symbion-t en parplante-symbion-ticulier l e s bases moleculaires de l a reconnaissance cellulaire e t presentent alors differentes observations montrant que l e s antigenes sont des mediateurs probables de l a reconnaissance cellulaire;

" Les preuves l e s plus convaincantes de l a nature antigeni-"que des molecules de reconnaissance ont ete apportees par l e s "etudes immunologiques des pollens e t stigmates dans l e s systemes

"d'incompatibiliteV (CLARKEet KNOX 1978).

Nous avons vu que l a presence d1antigenes dans l e s e x t r a i t s polliniques e t l e s e x t r a i t s stigmatiques a pu §tre montree chez de nombreuses especes, et que ces antigenes ont dans certains cas pu &tre l o c a l i s e s . Nous allons montrer sur quelques exemples

comment certains travaux ont permis d ' e t a b l i r l a correlation entre ces molecules antigeniques e t l e s problemes de reconnaissance

pollen-stigmate.

• Correlation antigeneallele S

-Des etudes genetiques ont revelees que 11

auto-incompatibili-t e chez l e s cruciferes esauto-incompatibili-t caracauto-incompatibili-terisee par un conauto-incompatibili-trdle sporophy-tique (inhibition de l a penetration du tube pollinique dans l e stigmate) des a l l e l e s multiples du locus S. La surface stigmati-que est consideree comme l e s i t e de reconnaissance entre pollen e t p i s t i l . HINATA et NISHIO (1978) ont mis en evidence l e s corre-lations entre l e s a l l e l e s S et des proteines stigmatiques chez l e s differentes familles de Brassicae oleracea e t Brassicae

cam-pestris en u t i l i s a n t des individus de genotypes S differents. Les proteines stigmatiques des differents individus ont ete analysees par focalisation isoelectrique et l e s genotypes S ont ete determi-nes par 1'etude de l a penetration des tubes polliniques dans l e s stigmates.

Stlg^N^

1 6 10 11 11 16 17

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0-171-23-1

0-171-23-3

PH 5

Fio. 1.—Data of thc diallel pollinations in family, 0-171-23 (fig. la, lcft) and thc presencc (f) or absence (.) of diffcrential bands in each plant (fig. la, right), and the densi-tomctries of the stained gels of representative plants (fig. Ib). Scorc + +, abundant pollcn tubcs penetrating; +, many pollcn tubes penetrating but somc failed; ±, <20 pollen tubes penetrating; —, <5 or no poUen tubcs penetrating. S-gcnotypes (SaSa, Sye, etc.) were assigned to the plants of each mating group assuming a i-locus

sporo-phytic system with co-dominance. * are exceptional cascs whcre Sa is dominant to

5»

P

I 3 M

Ainsi, dans l a famille 0-171-23, i l s ont ou montrer que tous l e s homozygotes SaSa presentaient l a bande proteique B3, l e s homo-zygotes SbSb l e s deux bandes B1 et B2, et l e s heterohomo-zygotes SaSb l e s t r o i s bandes. I l s ont ainsi demontre que parmi ces glycoprotei-nes ( l e s t r o i s bandes sont PAS-positives), l a glycoproteine B3 est associee a 1 ' a l l e l e Sa et l e s glycoproteines B1 et B2 a 1 ' a l l e l e Sb, I l s ont aussi constate qu'en moyenne, pour chaque bande, l a teneur en proteines e s t significativement plus elevee pour l e s homozygotes que pour l e s heterozygotes. Treize a l l e l e s ont ete analysees et une correlation a l l e l o S-proteine a ete trouvee pour sept de ces a l l e l e s , suggerant que ces glycoprotoines pourraient § t r e lespro-duits des a l l e l e s S et auraient donc un r6le dans l e s mecanismes de reconnaissance cellulaire.