Implication de MEK1 et MEK2 dans la morphogenèse du
placenta de souris
Thèse
Valérie Nadeau
Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
iii
Résumé
Le génome des mammifères contient deux gènes ERK/MAP kinase kinase, soient Mek1 (Map2k1) et
Mek2 (Map2k2), qui codent pour des enzymes responsables de l’activation de ERK1/2. Chez la
souris, la perte de fonction de Mek1 engendre une mortalité embryonnaire, tandis que les mutants
Mek2 survivent sans aucun phénotype apparent. Afin d’élucider les fonctions potentielles associées à
MEK2 durant l’embryogenèse, la perte de Mek2 a été étudiée en présence d’une haplo-insuffisance de Mek1. La majorité des embryons Mek1+/-Mek2+/- meurent durant la gestation due à des défauts
placentaires affectant les tissus extraembryonnaires. Ainsi, bien que Mek1 joue un rôle prédominant, ces résultats mettre en lumière l’implication de Mek2 durant le développement du placenta. La caractérisation histologique des placentas Mek1+/-Mek2+/- a révélé une diminution de la
vascularisation et la formation aberrante de cellules trophoblastiques géantes multinucléées (MTG). Des expériences génétiques de traçage cellulaire in vivo ont démontré que les cellules MTG dérivent d’une différenciation aberrante des SynT-II et que leur formation découle en partie d’un effet cellule autonome.
Un second objectif de cette thèse était de mieux caractériser le ou les types cellulaires nécessitant une activation de la voie ERK/MAPK essentielle au développement placentaire. Des analyses génétiques et histologiques ont démontré que la formation des cellules MTG résulte d’une fusion ectopique entre les deux couches de SynT qui participent normalement de façon indépendante à la barrière hématoplacentaire. La barrière hématoplacentaire est constituée d’une double couche de SynT et de cellules dérivées de l’allantoïs, soient les cellules endothéliales et leurs péricytes. La délétion d’un allèle supplémentaire de Mek1 dans l’allantoïs des mutants Mek1+/-Mek2+/- augmente la
pénétrance et l’expressivité du phénotype placentaire. De plus, les expériences d’ablation cellulaire
in vivo ont permis de démontrer que le développement des SynT-I en une fine couche de cellules
multinucléées dépend de la présence de la deuxième couche de SynT. Finalement, par approche de gènes candidats et par analyse de biopuces dans les placentas mutants Mek1Mek2, nous avons montré une expression dérégulée de cibles potentielles de ERK1/2 impliquées dans la déterination, la polarité et la fusion cellulaire, ce qui contribue à la compréhension du phénotype observé.
v
Abstract
The mammalian genome contains two ERK/MAP kinase kinase genes, Mek1 and Mek2, which encode dual-specificity kinases responsible for ERK/MAP kinase activation. In the mouse, the loss of
Mek1 function causes embryonic lethality, whereas Mek2 mutants survive with a normal lifespan,
suggesting that Mek1 rescues the lack of Mek2 function. The first objective of my thesis was to clarify potential functions of Mek2 during mouse embryogenesis. To do, I have analyzed the loss of Mek2 function in the presence of Mek1 haploinsufficiency. Most Mek1+/-Mek2+/- embryos die during
gestation from placenta defects affecting extra-embryonic tissues. Thus, even though Mek1 plays a predominant role, these results enlightened the function of Mek2 in placenta development. The histological characterization of Mek1+/-Mek2+/- placentas revealed a diminution of the vascularization
and an aberrant formation of multinucleated trophoblast giant (MTG) cells. Genetic experiments on the SynT-II cellular lineage in vivo demonstrated that MTG cells derive from the aberrant SynT-II differentiation and that their formation results from a cell-autonomous effect.
The second objective of my thesis was to determine in which cell types the ERK/MAPK activation is essential for placenta development. Genetic analyses combined with histological studies revealed that MTG formation resulted from the ectopic fusion between both layers of SynT, which normally participate in an independent way in the blood-placental barrier. The blood-placental barrier is constituted of a double layer of SynT and by the cells derived from the allantois, the endothelial cells and their perycites. The deletion of both Mek1 alleles in allantois-derived tissues in a Mek1+/-Mek2
+/-placenta environment increases the penetrance and the expressivity of the MTG phenotype. These results demonstrate the role of the ERK/MAPK pathway in defined embryonic and extraembryonic cell populations for correct placenta formation. Using mouse genetics, we also demonstrated that the normal development of syncytiotrophoblasts type I into a thin layer of multinucleated cells depends on the presence of the syncytiotrophoblasts type II. Finally, the combined mutations of Mek1 and
Mek2 genes alter the expression of several genes involved in cell fate specification, cell fusion and
cell polarity that likely explain the underdeveloped placenta and the MTG phenotype seen in
vii
Tables des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Tables des matières ... vii
Liste des tableaux ... xv
Liste des figures ... xvii
Liste des abréviations ... xxi
Liste des synonymes ... xxv
Avant-propos ... xxix
Chapitre 1. Introduction ... 1
1.1 Les voies de signalisation des MAPK ... 1
1.1.2 Les voies de signalisation classiques des MAPK ... 2
1.1.2.1 La voie de signalisation ERK1/2 ... 2
1.1.2.2 La voie de signalisation p38 ... 5
1.1.2.3 La voie de signalisation JNK ... 7
1.1.2.4 La voie de signalisation ERK5 ... 8
1.1.3 Les voies de signalisation atypiques des MAPK ... 9
1.1.3.1 La voie de signalisation ERK3/4 ... 9
1.1.3.2 La voie de signalisation NLK ... 10
1.1.3.3 La voie de signalisation ERK7 ... 11
1.2 Détermination de la spécificité de la voie de signalisation ERK/MAPK ... 12
1.2.1 La présence de plusieurs membres à chaque niveau de la cascade d’activation ... 13
1.2.1.1 MEK1 et MEK2 ... 13
1.2.1.2 ERK1 et ERK2 ... 16
1.2.2 La durée et la force d’activation ... 17
1.2.3 Les protéines d’échafaudage ... 19
1.2.4 Compartimentation des membres de la voie de signalisation ERK1/2 ... 19
1.2.5 L’interrelation avec d’autres voies de signalisation ... 23
1.3 Fonctions et substrats de ERK1/2 ... 24
viii
1.3.2 ERK1/2 et la différenciation cellulaire ... 26
1.3.3 ERK1/2 et la survie cellulaire ... 27
1.3.4 ERK1/2 et l’induction de la mort cellulaire ... 28
1.3.5 ERK1/2 et la migration cellulaire ... 29
1.3.6 ERK1/2 et la polarité cellulaire ... 31
1.4 Le développement placentaire ... 32
1.4.1 Fertilisation de l’œuf et formation de la morula ... 32
1.4.2 Spécification cellulaire du TE préalablement à la formation du blastocyste ... 35
1.4.3 Formation du blastocyste ... 36
1.4.3.1 Facteurs de transcription impliqués dans la première ségrégation cellulaire: MCI versus TE ... 36
1.4.4 Implantation du blastocyste et dérivés embryonnaires et extraembryonnaires ... 39
1.4.4.1 Le labyrinthe placentaire ... 40
1.4.4.1.2 Initiation de l’arborescence à l’interface chorion-allantoïs ... 41
1.4.5 Le placenta mature ... 41
1.4.5.1 Les trophoblastes du placenta ... 42
1.4.5.1 Les trophoblastes du placenta ... 43
1.4.5.1.1 Les trophoblastes du labyrinthe ... 43
1.5 Caractérisation d’un phénotype embryonnaire ... 47
1.5.1. Génération de souris chimères ... 47
1.5.2 Délétion conditionnelle d’un gène ... 51
1.6 Implication de la voie ERK/MAPK dans le développement placentaire ... 55
1.6.1 Les mutants Mek1 ... 57
1.7 Problématiques et objectifs ... 61
Chapitre 2. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. ...67
2.1 Avant-propos ... 69
2.2 Résumé ... 71
2.3 Abstract ... 73
2.4 Introduction ... 75
2.5 Materials and methods ... 77
ix
2.5.2 Histological and immunohistochemical analyses ... 78
2.5.3 In situ hybridization and β-galactosidase staining ... 78
3.5.4 Western blot analysis ... 79
3.5.5 Statistical analyses ... 79
2.6 Results ... 79
2.6.1 Map2k2 haploinsufficiency jeopardizes normal embryonic development in the absence of one Map2k1 allele ... 79
2.6.2 Map2k1+/-Map2k2+/- embryos present placenta defects ... 80
2.6.3 Rescue of extra-embryonic components restores survival of Map2k1Map2k2 haploinsufficient conceptuses ... 83
2.6.4 Unequal gene dosage-dependent contribution of Map2k1 and Map2k2 to placenta development ... 85
2.6.5 The gene dosage-dependent placenta defects correlate with a decrease in ERK/MAPK activation... 87
2.6.6 Aberrant formation of multinucleated trophoblast giant cells derived from the SynT layer II ... 88
2.6.7 The formation of MTG cells is a cell-autonomous defect ... 91
2.7 Discussion ... 92
2.8 Acknowledgements ... 100
2.9 References ... 100
2.10 Supplementary material ... 105
Chapitre 3: Essential role of the ERK/MAPK pathway in blood-placental barrier formation ... 109
3.1 Avant-propos ... 111
3.2 Résumé ... 113
3.3 Abstract... 115
3.4 Introduction ... 117
3.5 Results ... 119
3.5.1 Map2k1 gene deletion in SynT-II does not compromise embryo survival and placenta development ... 119
3.5.2 Contribution of ERK/MAPK signaling in allantois-derived tissues for SynT-II differentiation ... 121
3.5.3 MTG have a double identity ... 123
x
3.5.5 Cellular ablation of SynT-II prevents SynT-I fusion ... 125
3.5.6 Molecular repercussions of the deregulation of the ERK/MAPK pathway in the labyrinth 126 3.6 Discussion ... 134
3.7 Materials and methods ... 146
3.5.1 Mice, genotyping and tissue collection ... 146
3.5.2 Histological, immunohistochemical (IHC) and immunofluorescence (IF) analyses... 147
3.5.3 In situ hybridization and ß-galactosidase staining ... 147
3.5.4 RNA isolation, microarray analysis and quantitative RT-PCR (qRT-PCR) ... 147
3.5.5 Statistical analyses ... 148
3.8 Acknowledgements ... 148
3.9 Author contributions ... 148
3.10 References ... 148
3.11 Supplementary material ... 154
Chapitre 4 : Discussion générale et perspectives ...161
4.1 Implication différentielle de MEK1 et MEK2 lors du développement embryonnaire ... 161
4.1.1 Patrons d’expression de MEK1 et MEK2 ... 162
4.1.2 Nécessité de Mek1 dans les tissus extraembryonnaires ... 163
4.1.3 Activité enzymatique de MEK1 et MEK2 ... 165
4.2 Fonctions associées à l’activation de la voie ERK/MAPK dans différents types cellulaires placentaires ... 166
4.2.1 La signalisation ERK/MAPK dans les progéniteurs des trophoblastes du labyrinthe ... 166
4.2.2 La signalisation ERK/MAPK dans les syncytiotrophoblastes ... 171
4.2.2.1 Interdépendance de la double couche de syncytiotrophoblastes ... 177
4.2.3 La signalisation ERK/MAPK dans les trophoblastes mononucléés sinusoïdaux géants . 179 4.2.3 La signalisation ERK/MAPK dans les cellules dérivées de l’allantoïs ... 180
4.3 Processus biologiques associés à la voie de signalisation ERK/MAPK dans le placenta ... 182
4.4 Conclusion ... 184
Bibliographie des chapitres 1 et 4 ...187
Annexe I: Crucial requirement of ERK/MAPK signaling in respiratory tract development ...217
I.1 Avant-propos ... 219
xi
I.3 Abstract... 223
I.4 Introduction ... 225
I.5 Results ... 226
I.5.1 Mek1 mesenchymal inactivation in a Mek2 null background causes pulmonary hypoplasia ... 226
I.5.2 Normal epithelial cell differentiation and vascular development in lungs from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre embryos ... 228
I.5.3 Molecular repercussions of the mesenchymal inactivation of Mek1 in a Mek2 null background in the developing lung ... 228
I.5.4 Pulmonary hypoplasia in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre specimens: a secondary consequence? ... 234
I.5.5 Mek1 epithelial inactivation in a Mek2 null background results in lung agenesis ... 235
I.5.6 Trachea formation requires both mesenchymal and epithelial ERK/MAPK signaling ... 236
I.5.7 Epithelial inactivation of the Erk1 and Erk2 genes reproduces the Mek1;Mek2 lung epithelial phenotype ... 244
I.6 Discussion ... 244
I.7 Materials and methods... 253
I.7.1 Mouse strains, genotyping and tissue collection ... 253
I.7.2 Mouse embryo lung explant cultures ... 256
I.7.3 Histology, immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) analyses ... 256
I.7.4 Proliferation and apoptosis analyses ... 256
I.7.5 β-galactosidase staining ... 256
I.7.6 In situ hybridization ... 257
I.7.7 Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) experiments ... 257
I.7.8 Microarray analysis ... 257
I.7.9 Morphometry analyses ... 257
I.7.10 Statistical analyses ... 257
I.8 Acknowledgements ... 258
I.9 Author contributions ... 258
I.10 References ... 258
xii
Annexe II: Implication of MEK1 and MEK2 in the establishment of the blood–placenta barrier during
placentogenesis in mouse ...277
II.1 Avant-propos ... 279
II.2 Résumé ... 281
II.3 Abstract ... 283
II.4 Introduction ... 285
II.5 The ERK/MAPK signalling cascade ... 288
II.6 The development of the murine placenta ... 289
II.7 The role of the ERK/MAPK cascade in trophoblast cell lineages ... 292
II.8 The extraembryonic origin of the placenta defects in mutants affecting the ERK/MAPK cascade ... 293
II.9 The role of the ERK/MAPK cascade in SynT-II ... 296
II.10 Pparγ and Lbp-1a: potential targets of the ERK/MAPK pathway in the formation of the placenta ... 297
II.11 Conclusion ... 299
II.12 Acknowledgements ... 299
II.13 References ... 299
Annexe III : Le rôle des kinases Mek1 et Mek2 dans la formation de la barrière hématoplacentaire chez la souris ...307
III.1 Avant-propos ... 309
III.2 Résumé ... 311
III.3 Abstract ... 313
III.4 Fonctions essentielles de la voie ERK/MAPK lors du développement placentaire murin ... 314
III.4.1 La voie de signalisation ERK/MAPK ... 314
III.4.2 Le développement du placenta chez la souris ... 315
III.5 Défauts des lignées trophoblastiques chez les mutants de la voie ERK ... 317
III.5.1 Mutations de gènes de la voie de signalisation ERK/MAPK et développement labyrinthique ... 317
III.5.2 Distribution spatiale des protéines MEK1 et MEK2 ... 318
III.5.3 Voie ERK/MAPK et expression du VEGF ... 318
III.6 Rôle de la voie ERK/MAPK dans les SynT-II ... 321
xiii III.8 Conclusion ... 323 III.9 Remerciements ... 324 III.10 Références ... 324
xv
Liste des tableaux
Tableau 1-1. Phénotypes placentaires des souris mutantes pour des protéines impliquées dans la
voie ERK/MAPK……….……….…...64
Table 2-1. Reduced viability of Map2k1+/−Map2k2+/− embryos and mice………....86
Table 2-2. Rescue of Map2k1+/− Map2k2+/− embryos with a specific Map2k1 deletion in embryonic tissues………..91
Table 2-3. Gradation of the placental phenotype in function of the number of Map2k mutant alleles...92
Table 2-4. Characterization of the MTG in Map2k1+/−Map2k2+/− placentas……….96
Table 3-1. Contribution of the different placenta cell type to the formation of the MTG………...126
Table 3-S1. Primary and secondary antibodies used for IHC and IF……….160
Table 3-S2. List of qRT-PCR primer sequences………161
Table 3-S3. Diphtheria toxin A-mediated SynT-II cell ablation compromises placenta development and embryo survival………161
Table II-1. Placental phenotypes seen in mutant mice for genes involved in the ERK/MAPK pathway……….293
Tableau III- I. Phénotype placentaire des souris mutantes pour des protéines impliquées dans la voie ERK/MAPK………..………322
xvii
Liste des figures
Figure 1-1. Classification des voies de signalisation des MAPK ……….…….………..9 Figure 1-2. Représentation schématique de la voie de signalisation ERK/MAPK………..11 Figure 1-3. Représentation schématique de la séquence protéique de MEK1 et MEK2…………...20 Figure 1-4. Distribution des membres associés à la voie de signalisation ERK1/2 dans différents compartiments intracellulaires...27 Figure1-5. Les protéines des complexes CRUMB, PAR3 et SCRIBBLE interviennent dans l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale...39 Figure 1-6. Spécification des premières lignées cellulaires suivant la fertilisation chez la souris....43 Figure 1-7. La signalisation Hippo contrôle la différenciation dépendamment de la position cellulaire...44 Figure 1-8. Développement de l’allantoïs et du chorion chez l’embryon de souris...48 Figure 1-9. Morphogenèse du labyrinthe placentaire murin...50 Figure 1-10. Structure du placenta murin: organisation des différentes couches cellulaires de la région du labyrinthe chez la souris...51 Figure 1-11. Modèle moléculaire de la formation du labyrinthe placentaire murin...54 Figure 1-12. Polarité de la double couche de syncytiotrophoblastes chez la souris...55 Figure 1-13. Expériences d’agrégations tétraploïdes afin de déterminer le site d’action d’un gène...60 Figure 1-14. La régulation de l’expression de la β-galactosidase par le système Cre/LoxP...62 Figure 1-15. Délétion génique conditionnelle exclusivement dans l’embryon par le biais de l’utilisation des souris transgéniques Sox2Cre...63 Figure 1-16. Atrophie du labyrinthe des placentas Mek1-/-...65
xviii
Figure 1-17. Hypovascularisation du labyrinthe des placentas Mek1-/-...67
Figure 2-1. Underdevelopment of the labyrinth region in the placenta from Map2k1Map2k2 DH mutants...87
Figure 2-2. The underdevelopment of the labyrinth region in Map2k1+/-Map2k2+/- placenta results from reduced proliferation and increased apoptosis...89
Figure 2-3. Abnormal vascularization of Map2k1+/-Map2k2+/- placenta labyrinth………...90
Figure 2-4. Placenta phenotype of Map2k1Map2k2 compound mutants……...93
Figure 2-5. ERK/MAPK activation in Map2k1Map2k2 compound mutants and differential expression of MAP2K1 and MAP2K2 proteins in the placenta………...95
Figure 2-6. Characterization of the MTG cells in Map2k1+/-Map2k2+/- placentas...101
Figure 2-7. The MTG cells derive from Gcm1-positive SynT and result from a cell-autonomous defect...102
Figure 2-8. Lack of MAPK1 and MAPK3 activation in MTG cells...105
Figure 2-S1. MAP2K protein sequence comparison...111
Figure 2-S2. Normal development of the labyrinth region………...112
Figure 2-S3. Efficient deletion of the Map2k1flox allele in embryonic tissues by the Sox2Cre transgene...113
Figure 3-1. Placenta phenotypes in Map2k1Map2k2 allelic series generated by Cre-mediated recombination...128
Figure 3-2. Characterization of MTG in placenta from E12.5 Map2k1+/–Map2k2+/– embryos...135
Figure 3-3. MTG express markers characteristic of SynT-I and SynT-II cells...137
Figure 3-4. Protein mislocalization in MTG...139
Figure 3-5. The genetic ablation of SynT-II cells impacts on SynT-I cell fusion………....143 Figure 3-6. Downregulation of PPARγ and GCM1 expression in Map2k1+/-Map2k2+/- placenta…145
xix Figure 3-7. Differential gene expression in placenta from E12.5 Map2k1+/-Map2k2+/- and Map2k1flox/–
Map2k2+/-Tg+/Sox2Cre embryos...145
Figure 3-8. A model for the action of ERK/MAPK pathway in blood-placental barrier formation...150
Figure 3-S1. Validation of the activity and tissue-specificity of the Sox2Cre, Dermo1Cre and Gcm1Cre recombinases in placenta...163
Figure 3-S2. Placenta development in Map2k1flox/-Tg+/Gcm1Cre and Map2k1flox/-Tg+/Gcm1CreTg+/Sox2Cre mutants...164
Figure 3-S3. PAX8 is expressed in SynT-I cells……….………....165
Figure 3-S4. Co-localization of MCT1 and MCT4 proteins at the membrane of MTG…………...166
Figure 3-S5. PKCζ is expressed in SynT-I cells...166
Figure 4-1. Caractérisation histologique des placentas Pax8Cre/Cre...180
Figure I-1. Mek mesenchymal mutations affect intrauterine growth and cause multiple phenotypes...237
Figure I-2. Lung hypoplasia in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre neonates………...239
Figure I-3. Differential gene expression in lungs from E15.5 Mek1+/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre and Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre embryos………...245
Figure I-4. In vitro rescue of the lung branching defect of Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1Cre/+ embryos...247
Figure I-5. Lung agenesis in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Shh+/Cre embryos...249
Figure I-6. Patterning defects of the trachea cartilage rings from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre embryos...253
Figure I-7. Mek genes control upper airway epithelial cell differentiation...254
Figure I-8. Lung agenesis and defective epithelial cell differentiation phenotypes are recapitulated after Erk specific deletion in lung epithelium...255
xx
Figure I-9. A model for the action of the ERK/MAPK pathway during the development of the respiratory tract...261 Figure I-S1. Cre recombinase specificity in R26+/LacZ;Dermo1+/Cre and R26+/LacZ;Shh+/Cre
embryos...270 Figure I-S2. The loss of Mek function in mesenchyme affects placental development and causes craniofacial dysmorphogenesis and skeletal abnormalities...273 Figure I-S3. Integrity of the respiratory epithelium and lung microvasculature in E18.5
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre embryos...275
Figure I-S4. Efficiency of Mek1 deletion by the Dermo1Cre and ShhCre alleles in the developing
lung...277 Figure I-S5. Over-representation of biological processes in lungs from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre
embryos...278 Figure I-S6. Reduced Bmp4 expression in bronchial buds from E12.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Shh+/Cre
embryos...279 Figure I-S7. Mek epithelial function is essential for the maintenance of SOX2-positive cells and for basal cell differentiation...281 Figure II-1. Structure of the mouse placenta and organization of the different cell layers in the labyrinth...297 Figure II-2. Differential activation of ERK/MAPK and p38/MAPK pathways in the cells of the labyrinth...301 Figure III-1. Structure du placenta de la souris : organisation des différentes couches cellulaires de la région du labyrinthe de souris...325 Figure III-2. Activation différentielle des voies ERK et p38 MAPK dans les cellules du
xxi
Liste des abréviations
ADN: Acide désoxyribonucléique ASK2: Apoptosis stimulating kinase 2 ATF: Activating transcription factor
BAD: BCL2-associated agonist of cell death CDK: Cyclin-dependent kinase
CDX2: Caudal type homeobox 2 c-FOS: FBJ osteosarcoma oncogene c-MYC: Myelocytomatosis oncogene DAPK: Death associated protein kinase 1 EDS: ERK docking site
EGF: Epidermal growth factor
ELK: Member of ETS oncogene family ERK: Extracellular signal regulated kinase ERR2: Estrogen related receptor, beta ES: Embryonnaire souche
FAK: Focal adhésion kinase FGF: Fibroblast growth factor
FGFR: Fibroblast growth factor receptor FLOX: Flanked by loxP sites
FOXO3a: Forkhead box O3
GCM1: Glial cells missing homolog 1 GDP: Guanosine di-phosphate GFP: Green fluorescent protein GLUT: Facilitated glucose transporter GPCR: G-protein-coupled receptor GTP: Guanosine tri-phosphate HGF: Hepatocyte growth factor IFNγ: Interferon gamma IL: Interleukin
IQGAP1: IQ motif containing GTPase activating protein 1 JNK: c-Jun N-terminal protein kinase
LSP1: Lymphocyte specific 1
LZK1: C3HC4-type zinc finger protein MAPK: Mitogen-activated protein kinase MAPKAPK : MAPK-activated protein kinase MAP2K: MAPK Kinase
MAP3K: MAPK Kinase Kinase MBP: Myelin basic protein MCI: Masse cellulaire interne
xxii
MCT1: Monocarboxylic acid transporters member 1 MCT4: Monocarboxylic acid transporters member 3 MDM2: Transformed mouse 3T3 cell double minute 2 MEK: Mitogen-activated protein kinase kinase MKK: MEK kinase kinase
MKP: MAPK phosphatases MLCK: Myosin light chain kinase MOS: Moloney sarcoma oncogene MP1: MEK partner 1
mTOR: Mechanistic target of rapamycin (serine/threonine kinase) MYOD: Myogenic differentiation
NANOG: Nanog homeobox NES: Nuclear export signal NGF: Nerve growth factor NLK: Nemo like kinase Nt: NH2 terminal
OCT4: Octamer-binding transcription factor 4
PAK: P21 activated kinase
PDGF: Platelet derived growth factor
PEA-15: Phosphoprotein enriched in astrocytes 15A PECAM: Platelet endothelial cell adhésion molecule PKC: Protein kinase C
PLA2: Phospholipase A2
PPARγ: Peroxisome proliferator activated receptor gamma RCPG : Protéines G couplés aux récepteurs
RNA: Ribonucleic acid
RTK: Recepteur tyrosine kinase SOS: Son of sevenless
SOX2: SRY (sex determining region Y)-box 2
STAT3: Signal transducer and activator of transcription 3 SYNT: Syncytiotrophoblasts
TE: Trophectoderm
TEAD4: TEA domain family member 4 TGF-β: Transforming growth factor, beta TNF-a: Tumor necrotic factor-a
TPL2: Tumor Progression Locus 2 TS: Trophoblast stem cells TSC1: Tuberous sclerosis 1
UBF: Upstream binding transcription factor, RNA polymerase I UBP1: Upstream binding protein 1
xxiii VDAC: Voltage-dependent anion channel
VEGF: Vascular endothelial growth factor WNT: Wingless-related MMTV integration site YAP1: Yes-associated protein 1
xxv
Liste des synonymes
LBP1-a= UBP1 MAPK1= ERK2 MAPK3= ERK1 MAP2K1= MEK1 MAP2K2= MEK2 MEKK1= MAP3K1 MLK1=MAP3K9 PECAM1= CD31 TPL2= MAP3K8
xxvii
A mes proches, pour leur soutien. Particulièrement à ma mère Marthe et mon conjoint Jean-Philippe.
xxix
Avant-propos
Le travail présenté dans cette thèse découle de plusieurs années passées au Centre de Recherche de L’Hôtel-Dieu de Québec. Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de recherche le Dr Jean Charron qui m’a supervisé tout au long de mon cheminement. Le Dr Charron m’a offert ma toute première chance d’œuvrer dans le milieu scientifique en m’accordant sa confiance alors que j’étais encore étudiante sous-graduée. Il m’a accueilli alors que je ne connaissais rien au travail scientifique et c’est donc dans son laboratoire que j’ai appris tout ce que j’ai acquis durant ces années. Je ne trouve pas de mots assez justes pour représenter ma reconnaissance envers votre confiance, votre soutien et votre disponibilité durant ce projet de recherche. Merci également de m’avoir permise de participer à plusieurs congrès où j’ai vécu des moments incroyables. Je tiens également à remercier la Dre. Lucie Jeannotte qui a représenté pour moi comme une codirectrice dans mon cheminement en me supportant, me conseillant et surtout en s’intéressant sincèrement à mon projet de recherche. Je tiens non seulement à vous remercier pour votre aide scientifique, mais également pour votre écoute et votre support. Merci du fond du cœur à vous deux et j’estime que vous m’avez apporté toute les outils nécessaires afin de détenir une bonne formation scientifique.
Au fil de ces années, j’ai eu la chance de rencontrer des collègues formidables et même de développer des amitiés sincères. Je tiens tout d’abord à remercier mes anciens collègues que j’ai côtoyés durant mes premières années au laboratoire. Je tiens à remercier Sophie Roy qui est une professionnelle de recherche très travaillante et qui m’as fortement inspiré durant ma formation. Sophie tu m’as énormément appris et ça été un vrai plaisir de travailler avec toi. Malgré que nous ne travaillions plus ensemble depues années, tu es devenue une grande amie. Je me rappellerai toujours du succès de mon premier karaoké chez toi et de nos fous rires lors de nos nombreux 5 à 7 Sacrilège-Victor. Je tiens aussi à remercier Stéphanie Guillemette qui été ma première superviseure de stage et qui m’as donc aidé dans mes premiers pas au laboratoire. Stéphanie était une travaillante très rigoureuse et des années après son départ au laboratoire nous consultons encore fréquemment ses chefs-d'œuvre de cahiers de laboratoire. Je tiens également à remercier Éric Potvin et Annie Maltais pour leur aide durant ma thèse. Je n’oublierai jamais le plaisir que nous avons eu à travailler ensemble ! Merci à Vickram Bissonauth qui a également participé à ma
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première formation au laboratoire et avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir à travailler. Le projet de recherche que j’ai effectué découlait en grande partie des nombreux résultats de Vickram.
Merci à mes collègues actuels pour votre aide précieuse et pour avoir enduré mes hauts et bas durant la rédaction de cette thèse! Tout d’abord, merci à ma consœur de bureau Rifdat Aoidi qui effectue présentement son doctorat dans ce laboratoire. Merci Rif pour ton aide scientifique, mais aussi pour ton optimiste et ta bonne humeur qui te caractérise. Je suis certaine que tu auras du succès avec ton projet de recherche et je te souhaite le meilleur pour le futur. Tu vas beaucoup me manquer et j’espère rester en contact avec toi longtemps. Merci à Laurent Beuret pour son aide, ses conseils et sa disponibilité lors de cette recherche. Un merci tout spécial à ma très grande amie Julie Plante. Julie et moi avons effectué nos études graduées ensemble. Elle a passée quelques années au laboratoire en tant que professionnelle de recherche et ça été un plaisir pour moi de pouvoir travailler avec elle. Je tiens aussi à te remercier Julie pour avoir toujours été là pour moi. Tu m’as encouragé et soutenu et sincèrement je tiens à te remercier du fond du cœur. Saches que je serai toujours là pour toi et je te souhaite beaucoup de succès dans ta carrière.
L’équipe n’est pas seulement constituée des membres du labo du Dr Charron, mais également de ceux associés au Dre. Lucie Jeannotte. Je tiens à remercier Félix-Antoine Bérubé-Simard qui a commencé son cheminement dans ce laboratoire environ en même temps que moi. J’ai donc eu la chance de travailler avec Félix de nombreuses années. Merci Félix pour ta bonne humeur et ta disponibilité, c’est un réel plaisir de te côtoyer. Merci également pour avoir fait de notre congrès en Angleterre un séjour des plus agréables dont je me souviendrai toujours. Merci à Olivier Boucherat avec qui j’ai eu la chance de collaborer sur un projet de recherche. Olivier, je ne voudrais surtout pas t’enfler la tête alors j’hésite à trop te complimenter, mais je dois avouer que tu m’as beaucoup appris et tes conseils se sont avérés très utiles lors de ma recherche. Je dois également dire que j’ai eu énormément de plaisir à travailler avec toi et je me souviendrai de tous ces fous rire lors de nos pauses. Merci également à Nicolas Houde qui a toujours été disponible pour aider et toujours là pour créer des fous rires. Je tiens également à remercier sincèrement les anciens membres du laboratoire du Dre. Lucie Jeannotte pour leur aide inestimable durant mesmières années au laboratoire. Merci à Josée Aubin, Margot Lemieux et Marcelle Carter pour votre soutien et votre aide. Merci à Pascal Ontchangalt avec qui j’ai eu la chance de travailler et qui est maintenant devenue une bonne amie. Bonne chance dans ta nouvelle carrière!
xxxi Je tiens également à remercier les gens qui m’ont permis de pouvoir m’impliquer dans différents aspects de la vie académique au Centre de Recherche de L’Hôtel-Dieu de Québec. Un merci spécial à Anne Loranger qui est responsable des ateliers d’animations scientifiques pour les jeunes. Ton implication dans ce beau projet est incroyable et j’ai adoré y participer avec toi. Un merci spécial également au Dr Luc Bélanger pour ses encouragements, son soutien et son aide durant mes implications académiques au centre de recherche.
Je remercie également les examinateurs, les Drs. Jean Charron, Lucie Jeannotte, Madeleine Carreau et Daniel Dufort pour avoir accepté d’évaluer ma thèse.
Je tiens à remercier du fond du cœur mes parents. Merci pour votre soutien moral et financier sans quoi la réalisation de cet objectif n’aurait eu lieu. Merci d’avoir cru en moi et de m’avoir encouragé à persévérer.
Finalement, je remercie mon conjoint de vie Jean-Philippe. Merci pour ta patience, tes encouragements et ton aide. Merci tout simplement d’être dans ma vie.
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Chapitre 1. Introduction
Les travaux effectués au cours de ce projet de recherche ont porté sur la caractérisation fonctionnelle des kinases MEK1 et MEK2 (également connues sous le nom de MAP2K1 et MAP2K2 respectivement) lors du développement embryonnaire chez la souris. L’invalidation génique complète de Mek1 ou de celle de Mek2 en présence d’une haplo-insuffisance de Mek1 engendre une mortalité embryonnaire. Les problèmes gestationnels qui affectent ces mutants découlent d’un développement inadéquat du placenta. Afin de bien comprendre ce travail, une introduction détaillée de la voie de signalisation ERK/MAPK, du développement placentaire ainsi que des techniques de manipulations génétiques chez la souris est présentée.
1.1 Les voies de signalisation des MAPK
Les MAPK sont des Ser/Thr kinases qui permettent de convertir une multitude de signaux extracellulaires en différentes réponses cellulaires telles que la prolifération, la différenciation, la survie, l’apoptose et la migration cellulaire (Cargnello and Roux, 2011). Elles font partie d’une des plus anciennes voies de signalisation utilisées par les cellules afin de coordonner diverses fonctions physiologiques (Widmann et al., 1999). Les voies de signalisation des MAPK consistent en une cascade de phosphorylation et d’activation de protéines kinases (Seger and Krebs, 1995) . Le sentier d’activation typique des MAPK est composé de trois kinases principales qui s’activent séquentiellement par phosphorylation: les MAP3K, les MAP2K et les MAPK (Figure 1-1) (Cargnello and Roux, 2011).
La signalisation MAPK a lieu lorsqu’un stimulus extracellulaire induit l’activation des MAP3K qui sont des Ser/Thr kinases. Leur activation se fait par l’intermédiaire d’une phosphorylation par des kinases en amont ou par interaction avec les petites protéines G de la famille Rho/Ras. Par la suite, les MAP3K activent par phosphorylation les MAP2K. Les MAP2K sont des kinases à double spécificité puisqu’en plus d’appartenir au groupe des Ser/Thr kinases, elles peuvent également phosphoryler des résidus tyrosines. Les MAPK2K effectuent une double phosphorylation sur les résidus Ser/Thr et Tyr de leurs substrats les MAPK ce qui les activent. Les MAPK sont également des Ser/Thr kinases qui activent leurs substrats par phosphorylation de résidus Ser ou Thr qui sont suivis d’une proline. Des substrats bien caractérisés des MAPK incluent les membres de la famille des protéines kinases
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appelés les MAPKAPK. Les MAPKAPK sont des Ser/Thr kinases qui répondent à une stimulation extracellulaire seulement suite à leur activation par phosphorylation par les MAPK. Par contre, une très grande variété de substrats sont régulés par les MAPK ce qui se répercute sur plusieurs fonctions cellulaires (Cargnello and Roux, 2011; Pearson et al., 2001b; Seger and Krebs, 1995). A ce jour, les voies de signalisation MAPK ont été classifiées en sept groupes divisés en voies MAPK classiques ou atypiques (Cargnello and Roux, 2011). Certains membres sont partagés entre ces différentes voies ce qui permet une interaction entre ces signalisations pouvant mener à des effets additifs ou inhibiteurs. Par ailleurs, plusieurs mécanismes existent afin de permettent une spécificité de signalisation. Par exemple, des protéines d’échafaudage ou d’ancrage spécifiques à différents membres peuvent permettent de rapprocher les composants de la cascade de signalisation entre eux à des endroits spécifiques dans la cellule (section 1.2). Ainsi, les voies classiques et atypiques des MAPK seront présentées afin de bien situer les kinases d’intérêt de cette thèse, soient MEK1 et MEK2, qui sont responsables de l’activation de la voie ERK/MAPK. Par conséquent, une emphase particulière sera mise sur la compréhension de la signalisation ERK/MAPK.
1.1.2 Les voies de signalisation classiques des MAPK
Chaque groupe appartenant aux voies de signalisation classiques des MAPK est composé de trois kinases conservées dans l’évolution et agissant de façon séquentielle dans l’activation de la voie, les MAP3K, les MAP2K et les MAPK. Les MAPK classiques incluent les voies de signalisation ERK, JNK, p38 et celle de ERK5 (Figure 1-1). Certaines kinases sont partagées entre les différentes voies, mais selon leur niveau d’expression et leur association avec d’autres partenaires, ces kinases seront plus efficace à phosphoryler certains substrats plutôt que d’autres. Ainsi, chacune de ces voies différe dans les réponses biologiques induites suivant son activation. Par exemple, la voie ERK est associée à la prolifération et la différenciation cellulaire, alors que les voies JNK et p38 interviennent majoritairement dans la réponse au stress et l’apoptose. Par ailleurs, dépendant du type cellulaire et du contexte environnemental, ces voies de signalisation partagent des fonctions communes.
1.1.2.1 La voie de signalisation ERK1/2
La cascade d’activation de ERK est la première voie de signalisation MAPK à avoir été caractérisée et étudiée en détails (Cargnello and Roux, 2011; Seger and Krebs, 1995; Wortzel and Seger, 2011).
3 Figure 1-1. Classification des voies de signalisation des MAPK. Représentation schématique des voies de signalisation classiques et atypiques des MAPK. Différents stimuli, par exemple les mitogènes, les cytokines et le stress cellulaire, promeuvent l’activation des MAP3K qui activent à leur tour par phosphorylation les MAP2K. Les MAP2K activées phosphorylent et activent les MAPK. Les MAPK activées vont phosphoryler une très grande variété de substrats, incluant les MAPKAPK. La ligne pointillée de ce schéma indique que même si les MAPKAPK (RSK1 à 4) ont été rapportées comme substrats de ERK5, leur régulation par cette MAPK reste à démontrer. Figure adaptée de (Cargnello and Roux, 2011).
Elle constitue la voie majeure dans la réponse aux facteurs de croissance tels que FGF, EGF, PDGF et NGF (Figure 1-2) (Boulton et al., 1990; Cargnello and Roux, 2011; Rubinfeld and Seger, 2005). Elle peut aussi être activée par plusieurs autres stimuli extracellulaires tels que les hormones, les neurotransmetteurs, les cytokines, les stress osmotiques et la désorganisation des microtubules (Cargnello and Roux, 2011; Raman et al., 2007; Rubinfeld and Seger, 2005). Cette variété de facteurs extracellulaires qui mènent à l’activation de ERK va agir principalement via les récepteurs à activité tyrosine kinase, les protéines G couplés aux récepteurs et les canaux ioniques (Figure 1-2)
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(Marmor et al., 2004; Naor et al., 2000; Rane, 1999; Seger and Krebs, 1995). Suivant son activation, cette cascade régule plusieurs fonctions cellulaires telles que la prolifération, la croissance, la survie, la migration et la différenciation cellulaire (Lewis et al., 1998; Seger and Krebs, 1995; Shaul and Seger, 2007; Torii et al., 2004b; Viala and Pouyssegur, 2004).
Le module central de la signalisation typique de ERK chez les mammifères comprend les MAP3K (A-RAF, B-RAF et RAF-1), les MAP2K (MEK1 et MEK2) et les MAPK (ERK1 et ERK2). Les isoformes de Raf sont les principales MAP3K associées à l’activation de la voie ERK, par contre d’autres kinases telles que MEKK1, c-MOS et TPL2 sont d’additionnelles MAP3K utilisées lors de stimulus spécifiques ou dans des types cellulaires restreints (Gotoh and Nishida, 1995; Lange-Carter et al., 1993; Salmeron et al., 1996; Shaul and Seger, 2007).L’activation de cette voie nécessite souvent la participation de protéines adaptatrices à domaine SH2 ou PTB comme GRB2. GRB2 associée aux récepteurs interagit avec 1, un facteur d’échange GDP/GTP de la petite protéine G RAS. SOS-1 permet le relargage du GDP associé à RAS ce qui permet la fixation du GTP et l’activation de RAS (Figure 1-2) (Cargnello and Roux, 2011; Rubinfeld and Seger, 2005; Seger and Krebs, 1995). RAS activée permet le recrutement et l’activation des MAP3K, puis celles-ci vont activer MEK1/2 par phosphorylation sur les résidus sérines situés dans un motif typique conservé à l’intérieur de leur boucle d’activation (Ser 218 et 222 sur MEK1 et Ser222 et 226 sur MEK2) (Alessi et al., 1994). Suivant leur activation, les kinases à double spécificité (sérine/thréonine et tyrosine), MEK1 et MEK2, vont effectuer une double phosphorylation sur les résidus Tyr et Thr dans un motif de reconnaissance précis Thr–Glu–Tyr (TEY) de leur uniques substrats connus à ce jour, ERK1 et ERK2 (Figure 1-2) (Rubinfeld and Seger, 2005). ERK1 et ERK2 sont des Ser/Thr kinases qui vont phosphoryler des centaines de substrats localisés dans différents compartiments cellulaires, ce qui démontre l’énorme complexité de cette voie de signalisation et la grande variété de processus biologiques qu’elle contrôle. Des exemples précis de substrats de ERK1/2 et des fonctions biologiques qui leurs sont associées seront discuté en détails à la section 1.3, mais ceux-ci incluent plusieurs membres de la famille des MAPKAPK (Figure1-1) (Cargnello and Roux, 2011; Rubinfeld and Seger, 2005).
5 Figure 1-2. Représentation schématique de la voie de signalisation ERK/MAPK. L’activation de la voie a lieu suite à la liaison d’un facteur de croissance au récepteur tyrosine kinase ce qui enclenche une cascade de phosphorylations et d’activations des MAP3K, des MAP2K (MEK1 et MEK2) et des MAPK (ERK1 et ERK2). Les MAPK activées possèdent une affinité pour une multitude de substrats localisés dans différents compartiments cellulaires ce qui se répercutera sur plusieurs fonctions cellulaires, telles que la prolifération, la différenciation et la survie. FC, facteur de croissance; RTK, récepteur tyrosine kinase. Figure adaptée de (Fremin and Meloche, 2010).
1.1.2.2 La voie de signalisation p38
Le sentier de signalisation p38 est activé principalement en réponse à des stress cellulaires variés et des cytokines inflammatoires, incluant les stress osmotiques et oxydatifs, les radiations ultraviolettes, l’hypoxie, l’interleukine-1 et le TNF. Cette voie de signalisation peut également être activée par les facteurs de croissance et les récepteurs couplés aux protéines G (Bagrodia et al., 1995; Cargnello and Roux, 2011; Cuadrado and Nebreda, 2010; Goldsmith and Dhanasekaran, 2007; Kyriakis and Avruch, 2001; Raman et al., 2007). Suivant son activation, la signalisation p38 intervient de façon majeure dans la réponse inflammatoire et immunitaire, ainsi que dans la survie, la prolifération et la
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différenciation cellulaire (Cuadrado and Nebreda, 2010; Nebreda and Porras, 2000; Raman et al., 2007).
Une quinzaine de kinases font partie des MAP3K associées à cette voie, mais leurs fonctions individuelles sont encore mal comprises (Cuadrado and Nebreda, 2010; Rubinfeld and Seger, 2005; Uhlik et al., 2004). De plus, plusieurs de ces MAP3K associées à la voie p38 permettent l’activation de la voie JNK (Figure1-1) (Brancho et al., 2003; Cargnello and Roux, 2011; Cuadrado and Nebreda, 2010; Doza et al., 1995). Les MAP2K, MEK3 et MEK6, sont les principales kinases responsables de l’activation de p38. Par contre, les MAP2K responsables de l’activation de la voie signalisation JNK, MEK4 et MEK7, peuvent également intervenir dans l’activation de la signalisation p38 (Figure 1-1) (Cargnello and Roux, 2011; Cuadrado and Nebreda, 2010; Derijard et al., 1995; Han et al., 1996; Meier et al., 1996; Rubinfeld and Seger, 2005; Stein et al., 1996). La contribution de chacune de ces MAP2K dans l’activation de la voie p38 dépend de la nature du stimulus et du type cellulaire (Alonso et al., 2000; Brancho et al., 2003; Cuadrado and Nebreda, 2010). Ces MAP2K sont activées par phosphorylation de deux sites Ser/Thr conservés dans un motif de reconnaissance précis localisés dans leur boucle d’activation. Suivant leur activation, elles vont activer à leur tour les MAPK p38 par phosphorylation sur les résidus Thr et Tyr dans un site de reconnaissance TGY situé dans leur boucle d’activation (Cargnello and Roux, 2011; Cuadrado and Nebreda, 2010; Rubinfeld and Seger, 2005). Le premier membre MAPK découvert associé à cette voie est p38α, qui est l’homologue de la protéine Hog1 chez la levure, un important régulateur du choc osmotique (Han et al., 1994; Lee et al., 1994; Rouse et al., 1994). Par la suite, trois autres MAPK associées à cette voie ont été caractérisé soient les isoformes β, γ et . Ces quatre MAPK p38 sont encodées par différents gènes qui expriment aussi des transcrits alternatifs augmentant à dix le nombre d’isoformes associés à ce groupe de MAPK. Les isoformes α et β de p38 sont exprimés dans plusieurs types cellulaires tandis que les isoformes γ et ont un patron d’expression plus restreint. La p38α est exprimée de façon plus abondante que p38β et la majorité de la littérature sur la signalisation p38 fait référence à cet isoforme (Cargnello and Roux, 2011; Cuadrado and Nebreda, 2010; Jiang et al., 1996). De plus, certaines MAP2K sont plus sélectives, par exemple MEK3 active les isoformes α ,γ et mais pas β (Cargnello and Roux, 2011; Cuadrado and Nebreda, 2010). Une fois activées, les MAPK p38α/β vont phosphoryler une grande variété de substrats incluant des MAPKAPK, telles que MSK1/2 et MK2/3, qui sont également des cibles partagées avec les voies de signalisation ERK1/2 et JNK, (McLaughlin
7 et al., 1996; New et al., 1998; Rubinfeld and Seger, 2005; Stokoe et al., 1992). Elles vont aussi phosphoryler des molécules de régulation (PLA2) (Kramer et al., 1996), des protéines de choc thermique (Rouse et al., 1994), des facteurs de transcription (ATF1/2/6 (activating transcription factor 1,2,6), ELK1, p53) ainsi que d’autres substrats (Cuadrado and Nebreda, 2010; Roux and Blenis, 2004). De plus, l’activation de la voie de signalisation p38 mène souvent à l’inactivation de la voie ERK1/2 par interaction directe entre les deux MAPK ou en stimulant l’association entre la phosphatase PP2A et le complexe MEK1/2-ERK1/2, ce qui résulte en la déphosphorylation des MAP2K et l’arrêt de la signalisation (Brancho et al., 2003; Junttila MR, 2008).
1.1.2.3 La voie de signalisation JNK
A l’instar de la voie de signalisation p38, la voie JNK est fortement activée en réponse à plusieurs stress cellulaires, incluant les chocs thermiques et oxydatifs, les radiations ionisantes, les dommages à l’ADN, les cytokines et moindrement aux facteurs de croissance, au sérum et aux ligands des RCPGs (Bogoyevitch et al., 2010; Cargnello and Roux, 2011; Davis, 2000). La signalisation JNK intervient majoritairement dans le contrôle de la prolifération, de l’apoptose et de la différenciation cellulaire (Bogoyevitch et al., 2010; Dhanasekaran and Reddy, 2008; Sabapathy et al., 2004; Tournier et al., 2000). La plupart des MAP3K associées à cette voie de signalisation sont partagées avec celle de p38, mais certaines sont spécifiques à la voie JNK (ASK2, LZK1, MLK1 et ZAK) (Rubinfeld and Seger, 2005). Ces MAP3K permettent l’activation des MAP2K associées à cette voie, principalement MEK4 et MEK7, par phosphorylation des résidus Ser/Thr situés dans un motif typique de leur boucle d’activation (Figure 1-1) (Dan et al., 2001; Lawler et al., 1998; Rubinfeld and Seger, 2005; Tournier et al., 2000; Yan et al., 1994). MEK4/7 activées vont activer à leur tour JNK par une double phosphorylation des résidus Thr et Tyr situés dans le motif TPY conservé de leur boucle d’activation (Cargnello and Roux, 2011). Trois isoformes de JNK sont connus, soit JNK1 à 3, qui sont encodées par trois gènes différents. (Derijard et al., 1994; Gupta et al., 1996; Kyriakis et al., 1994). JNK1 et JNK2 sont exprimées largement alors que JNK3 est exprimée plus spécifiquement dans les tissus neuronaux, les testicules et les myocytes cardiaques (Bode and Dong, 2007; Cargnello and Roux, 2011; Rubinfeld and Seger, 2005). JNK activée va phosphoryler plusieurs facteurs de transcription, tels que c-Jun, p53, ATF2, Elk-1, STAT3, c-Myc et JunB (Bogoyevitch et al., 2010; Cargnello and Roux, 2011; Sabapathy et al., 2004; Weston and Davis, 2002). Par ailleurs, contrairement aux voies de signalisation ERK et p38, seulement deux membres de la famille des
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MAPKAPK sont connus pour être directement activés par JNK, soit MK2 et MK3 (Figure 1-1) (Cargnello and Roux, 2011).
1.1.2.4 La voie de signalisation ERK5
La voie de signalisation ERK5 est activée en réponse à des stress oxydatifs et à l’hyperosmolarité (Lee et al., 1995; Wang et al., 2006). Tout comme la voie de signalisation ERK, elle est activée en réponse au sérum et aux facteurs de croissance tels EGF et NGF (Kato et al., 2000; Kato et al., 1998; Pearson et al., 2001b; Rubinfeld and Seger, 2005). A ce jour, cette voie de signalisation est connue pour contrôler majoritairement la prolifération et la survie cellulaire (Cargnello and Roux, 2011; Hayashi and Lee, 2004; Mulloy et al., 2003). Suite à une stimulation appropriée, les Ser/Thr kinases MEKK2 et MEKK3 vont phosphoryler et activer MEK5 (Camarillo et al., 1997; Chao et al., 1999; Chayama et al., 2001; Rubinfeld and Seger, 2005). Ces MAP3K associées à l’activation de ERK5 permettent également l’activation de la voie JNK et p38. Par contre, la MAP2K associée à cette voie de signalisation est spécifique à l’activation de ERK5 (Figure 1-1). En effet, aucune autre MAP2K que MEK5 n’est connue pour pouvoir activer ERK5. Ainsi, MEK5 effectuera une double phosphorylation sur les résidus Thr et Tyr dans un motif conservé TGY de la boucle d’activation de ERK5 (Cargnello and Roux, 2011; Chayama et al., 2001; Nishimoto and Nishida, 2006; Rubinfeld and Seger, 2005). Cette MAPK est similaire à ERK dans sa région N-terminale, alors que sa région C-terminale est unique et contient un NLS et une région riche en prolines. Elle est exprimée largement dans plusieurs tissus avec des niveaux élevés d’expression dans le cerveau, le thymus et la rate (Yan et al., 2003). Une fois activée, ERK5 va phosphoryler les RSKs, qui font partie de la grande famille des MAPKAPK (Figure 1-1). De plus, ERK5 va phosphoryler plusieurs facteurs de transcription qui sont également des substrats connus de ERK1/2, tels que SAP-1 et c-MYC (English et al., 1998; Kamakura et al., 1999; Pearson et al., 2001a). A l’instar de la signalisation ERK1/2, ERK5 activée permet l’induction de l’expression des gènes immédiats précoces, comme fos et
c-Jun (Kamakura et al., 1999; Kato et al., 1997). D’autres substrats connus de ERK5 sont SGK, la
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1.1.3 Les voies de signalisation atypiques des MAPK
Les membres des MAPK possèdent tous au moins 40% d’identité dans leur séquence d’acides aminés avec le domaine kinase de ERK. Ainsi, les MAPK possèdent plusieurs caractéristiques communes dans leur structure et dans leur régulation, mais elles se différencient par des attributs uniques. Une caractéristique commune des MAPK classiques est la présence dans leur boucle d’activation d’un motif qui est reconnu et phosphorylé par les MAP2K. Par contre, à ce jour cette caractéristique n’est pas partagée avec ERK3, ERK4, NLK et ERK7 qui sont par conséquent classifiés comme des MAPK atypiques (Coulombe and Meloche, 2007).
1.1.3.1 La voie de signalisation ERK3/4
ERK3 et ERK4 partagent respectivement 45% et 42% d’identité avec le domaine kinase de ERK1 (Coulombe and Meloche, 2007). Elles ont une structure protéique très similaire et partagent un domaine kinase en N-terminale à 73 % identique. ERK3 et ERK4 ont une taille plus importante (100 kDa et 70 KDa respectivement) que leurs homologues ERK1/2, entre autres à cause d’une extension dans leur séquence d’acides aminés en C-terminal (Cargnello and Roux, 2011; Coulombe and Meloche, 2007). Le rôle de cette extension en C-terminal de ERK3 et ERK4 n’est pas bien compris, mais la caractérisation de cette région suggère une fonction dans leur ciblage intracellulaire (Julien et al., 2003). Une différence notable entre ERK3 et ERK4 se situe au niveau de la stabilité protéique; ERK3 étant très instable avec une demie-vie d’environ 30-45 minutes alors que ERK4 est une protéine très stable (Coulombe et al., 2003; Mikalsen et al., 2005). La portion N-terminale de ERK3 est impliquée dans sa dégradation via le protéasome suite à son ubiquitinylation (Coulombe et al., 2004). ERK3 est exprimée ubiquitairement dans les tissus de mammifères avec des niveaux d’expression plus élevés dans le cerveau, les muscles squelettiques et le tractus gastro-intestinal (Cargnello and Roux, 2011). Pour sa part, ERK4 est exprimée dans le cerveau, le colon, les yeux, le cœur, les reins, les poumons, les ovaires, le pancréas, le placenta, la prostate et la peau. Par contre, l’expression la plus forte de ERK4 est détectée au cerveau (Garcia et al., 1996; Gonzalez et al., 1992). Une distinction additionnelle entre ERK3 et ERK4 se situe au niveau de leur localisation intracellulaire. ERK3 est retrouvée aux niveaux cytoplasmique et nucléaire dans plusieurs types de cellules prolifératives, alors que ERK4 est détectée seulement au cytoplasme (Bind et al., 2004; Coulombe and Meloche, 2007; Julien et al., 2003; Schumacher et al., 2004; Seternes et al., 2004).
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Les mécanismes d’activation de cette voie de signalisation sont peu caractérisés. En effet, même si ERK3 est phosphorylée dans sa boucle d’activation, aucun stimulus n’est connu pour promouvoir sa phosphorylation, son activité ou sa relocalisation intracellulaire (Cheng et al., 1996a; Coulombe et al., 2003; Deleris et al., 2008; Julien et al., 2003). De plus, aucune MAP2K n’est connue pour phosphoryler ERK3/4 et la phosphorylation de ERK3 pourrait provenir d’une autophosphorylation ou d’une kinase non identifiée à ce jour (Cheng et al., 1996a; Cheng et al., 1996b). MK5, qui fait partie de la grande famille des MAPKAPK, est le seul substrat connu de ERK3/4, mais les mécanismes d’activation et les fonctions biologiques associées à MK5 sont peu connus (Figure 1-1) (Aberg et al., 2006; Kant et al., 2006; Schumacher et al., 2004; Seternes et al., 2004). Les fonctions cellulaires de ERK4 sont encore méconnues, mais un peu plus d’information est disponible sur celles associés à ERK3. En effet, ERK3 pourrait participer à la progression du cycle cellulaire et à la différenciation. Il a été démontré que l’expression de ERK3 augmente suivant l’état de différenciation de lignées de cellules musculaires ou neuronales (Boulton et al., 1991; Coulombe et al., 2003). De plus, l’expression de ERK3 est induite dans des conditions cellulaires alors que la prolifération cellulaire est inhibée (Crowe, 2004; Kleines et al., 2000). Finalement, la surexpression de ERK3 inhibe la progression en phase S de plusieurs types cellulaires (Coulombe et al., 2003; Julien et al., 2003; Schumacher et al., 2004). Ces observations suggèrent que ERK3 pourrait réguler négativement la progression dans le cycle cellulaire en favorisant la différenciation, du moins pour certains types cellulaires (Cargnello and Roux, 2011; Coulombe and Meloche, 2007).
1.1.3.2 La voie de signalisation NLK
NLK est l’orthologue de Nemo identifié chez la drosophile (Brott et al., 1998). Cette enzyme partage plus de 45% d’identité avec ERK2 dans son domaine kinase. Par contre, son extension en N-terminale et en C-N-terminale, ainsi que l’absence du motif typique des MAPK dans sa boucle d’activation la classifie comme une MAPK atypique (Cargnello and Roux, 2011; Coulombe and Meloche, 2007). La fonction de la portion N-terminale de NLK n’est pas encore caractérisée, mais sa partie C-terminale pourrait contribuer à la spécificité d’interaction de cette kinase avec ses substrats (Ishitani et al., 1999; Yamada et al., 2003; Yamada et al., 2006). NLK est exprimée dans la plupart des tissus chez la souris avec des niveaux d’expression plus élevés dans le cerveau et les organes lymphoïdes (Brott et al., 1998). La localisation intracellulaire de NLK n’est pas encore bien caractérisée, mais son expression ectopique dans la cellule engendre une localisation qui est
11 majoritairement nucléaire (Brott et al., 1998; Kanei-Ishii et al., 2004). Par ailleurs, il n’est pas connu si l’activation de NLK cause sa redistribution intracellulaire. (Coulombe and Meloche, 2007). NLK est activée par des ligands de la voie WNT, tels que WNT-1 et WNT-5a (Kanei-Ishii et al., 2004). De plus, la stimulation avec des cytokines, telles que IL-6, GSF et les membres de la famille TGF-β, permettent également l’activation de NLK (Kojima et al., 2005; Ohkawara et al., 2004). Finalement, le niveau intracellulaire de Ca2+ est suffisant pour l’activer dans certains types cellulaires (Ishitani et al.,
2003). A ce jour, aucune MAP2K n’est connue pour phosphoryler et activer NLK dans sa boucle d’activation, mais NLK peut s’autophosphoryler in vitro (Brott et al., 1998; Cargnello and Roux, 2011; Kanei-Ishii et al., 2004). Par ailleurs, la MAP3K TAK-1 interviendrait indirectement dans son activation (Figure 1-1) (Ishitani et al., 1999; Meneghini et al., 1999; Ohkawara et al., 2004; Shin et al., 1999; Smit et al., 2004). Des facteurs de transcription ont été caractérisés comme étant des substrats de NLK, tels que STAT-3 et TCF/LEF (Ishitani et al., 1999; Kojima et al., 2005). De plus, lors de l’activation de la voie Wnt, NLK régule la β-caténine et phosphoryle c-MYB ce qui contribue à sa dégradation (Ishitani et al., 1999; Kanei-Ishii et al., 2004; Smit et al., 2004). À ce jour aucune MAPKAPK n’a été identifiée comme étant un substrat de NLK (Cargnello and Roux, 2011).
1.1.3.3 La voie de signalisation ERK7
ERK7 partage 45% d’identité avec ERK1 dans son domaine kinase et sa boucle d’activation contient le motif classique des MAPK. ERK8, qui est l’orthologue humain de ERK7, partage seulement 69% d’identité avec ERK7, ce qui est beaucoup moins que l’homologie typique entre humain et rongeurs. ERK7 est considérée atypique car son extension en C-terminalE n’est pas présente chez les MAPK conventionnelles. De plus, cette séquence ne partage aucune similarité avec les autres membres de la famille des MAPK (Cargnello and Roux, 2011; Coulombe and Meloche, 2007). Dans cette extension en C-terminale se trouve une séquence potentielle de localisation nucléaire qui permet l’expression de ERK7 majoritairement au noyau (Abe et al., 1999). De plus, cette extension en C-terminale est suspectée pour intervenir dans l’auto-activation de ERK7. En effet, il est suggéré que ERK7 autophosphoryle le motif TEY de sa boucle d’activation et que son activité enzymatique est requise pour sa propre régulation (Abe et al., 2001; Abe et al., 1999). A l’instar de ERK3, la portion N-terminale de ERK7 contribue à sa dégradation par le protéasome lorsqu’il y a ubiquitinylation. Ainsi, lorsque ERK7 est exprimée de façon ectopique dans des cellules prolifératives, elle est rapidement ubiquitinylée et dégradée (Kuo et al., 2004). Par contre, sa distribution intracellulaire
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semble indépendante de son activité catalytique (Coulombe and Meloche, 2007). Par ailleurs, aucune information n’est disponible sur la localisation cellulaire de ERK7 endogène. La voie d’activation de ERK7 est très peu caractérisée et aucune MAP2K n’a été identifié comme ayant la capacité de phosphoryler et d’activer ERK7 dans sa boucle d’activation (Figure 1-1) (Abe et al., 2001; Abe et al., 1999).
Des études préliminaires ont démontré que la phosphorylation de ERK7 ne serait pas modulée par des stimuli conventionnels activant les MAPK classiques, comme les facteurs de croissance, le phorbol ester et les stress chimiques (Abe et al., 1999). Par ailleurs, des analyses plus récentes ont démontré que les stress oxydatifs et certains mitogènes stimulent la phosphorylation de ERK8 chez l’humain (Abe et al., 2002; Klevernic et al., 2006). A ce jour, aucun substrat physiologique de ERK7 n’a été identifié, mais in vitro ERK7 peut phosphoryler MBP, c-FOS et c-MYC (Abe et al., 1999). De façon intrigante, les résidus phosphorylés de MBP par ERK7 diffèrent de ceux catalysés par ERK1/2 ce qui suggère une certaine spécificité de substrats pour ERK7 (Coulombe and Meloche, 2007; Erickson et al., 1990). Malgré l’absence de substrats physiologiques identifiés pour ERK7, il est connu que cette MAPK joue d’importants rôles dans la prolifération cellulaire et en réponse aux œstrogènes et aux glucocorticoïdes (Abe et al., 1999; Cargnello and Roux, 2011; Henrich et al., 2003). De plus, aucune MAPKAPK n’a été démontrée comme étant un substrat modulable par ERK7 (Figure 1-1) (Cargnello and Roux, 2011).
1.2 Détermination de la spécificité de la voie de
signalisation ERK/MAPK
L’activation de la voie ERK/MAPK peut induire une multitude de réponses biologiques différentes et parfois opposées selon le type cellulaire et la nature du stimulus. Ainsi, afin d’accomplir ses diverses fonctions, cette voie utilise plusieurs mécanismes pour obtenir une spécificité de signalisation. Cette spécificité est régulée par la présence de plusieurs membres à chaque niveau de la cascade, la durée et la force d’activation, les interactions avec des protéines d’échafaudage, la compartimentation de la voie dans différentes organelles ou régions intracellulaires ainsi que l’interférence avec d’autres voies de signalisation.
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1.2.1 La présence de plusieurs membres à chaque niveau de la
cascade d’activation
La présence de membres distincts possédant des fonctions ou des modes de régulation différents à chaque niveau de la cascade est un important mécanisme par lequel la spécificité et la propagation de la signalisation ERK1/2 est obtenue. Comme mentionné précédemment (section 1.1.2.1), il existe plusieurs MAP3K, tels que RAFs (RAF-1, B-RAF, A-RAF), MEKK1, COT et MOS, qui peuvent intervenir dans l’activation de la signalisation ERK1/2 dépendamment du type et du contexte cellulaire (Cavigelli et al., 1995; Rubinfeld and Seger, 2005; Shaul and Seger, 2007; Wortzel and Seger, 2011).
1.2.1.1 MEK1 et MEK2
Au niveau des MAP2K, les kinases hautement homologues MEK1 et MEK2 sont responsables de l’activation de ERK1 et ERK2. MEK1 et MEK2 sont similaires à 80% dans la totalité de leur séquence et 90% similaire dans leur domaine kinase (Figure 1-3) (Roskoski, 2012). Ainsi, il a été démontré que ces deux kinases possèdent des fonctions redondantes dans l’épiderme (Scholl et al., 2007). Par contre, il existe deux régions de MEK1 où l’homologie avec MEK2 est réduite, soit dans la portion N-terminale et dans sa région riche en prolines située dans le domaine catalytique (Figure 1-3) (Rubinfeld and Seger, 2005). Ces deux domaines sont essentiels aux fonctions de MEK1/2 puisqu’’ils affectent leur localisation intracellulaire ainsi que leur efficacité à phosphoryler ERK1/2 (Rubinfeld and Seger, 2005).
La portion riche en prolines de MEK1 contient un site de phosphorylation S298 catalysé par PAK1 qui est important dans certains contextes cellulaires (Figure 1-3) (Coles and Shaw, 2002). Bien que ce résidu soit également présent sur MEK2, il ne semble pas être reconnu et phosphorylé par PAK1 (Catalanotti et al., 2009; Park et al., 2007). La phosphorylation de la S298 de MEK1 n’est pas régulée par les facteurs de croissance (Catling et al., 1995; Slack-Davis et al., 2003). Par contre, elle est fortement stimulée durant l’adhésion aux protéines de la matrice extracellulaire et requise pour l’activation de MEK1 en réponse à la fibronectine (Eblen et al., 2002; Slack-Davis et al., 2003). Cette phosphorylation du résidu Ser298 de MEK1 par PAK1 pourrait sensibiliser MEK1 à son activation par RAF et ainsi permettre d’augmenter l’efficacité de la signalisation ERK1/2 (Coles and Shaw, 2002; Frost et al., 1997). De plus, PAK1 peut activer directement MEK1 par un mécanisme indépendant de
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l’activation conventionnelle par RAS/RAF. Plus précisément, la phosphorylation in vitro de la Ser298 de MEK1 par PAK1 stimule l’autophosphorylation de MEK1 dans sa boucle d’activation ce qui favorise la phosphorylation et l’activation de ERK1/2 .
Figure 1-3. Représentation schématique de la séquence protéique de MEK1 et MEK2. La séquence protéique de MEK2 est similaire à 90% à celle de MEK1. Deux régions de MEK1 démontrent une homologie réduite avec MEK2, soit la partie N-terminale et le domaine riche en prolines. La partie N-terminale de MEK1/2 contient un site d’ancrage pour ERK1/2 (EDS) et une séquence d’export nucléaire (NES). Le domaine riche en prolines est impliqué dans les interactions avec les membres de la famille RAF. Le domaine riche en proline de MEK1 contient un site de phosphorylation par PAK1 (Ser298) qui stimule son activité enzymatique. Par ailleurs, les résidus Thr situés en positions 286 et 292 sont impliqués dans une boucle de rétroaction négative lorsque ERK1/2 est activée. De plus, les résidus Ser 298, Thr 286 et Thr292 situés dans le domaine riche en proline de MEK1 ne sont pas conservés dans la séquence protéique de MEK2. N-t, N-terminal; EDS, ERK docking sites = site de liaison à ERK; NES, nuclear export signal = séquence d’export nucléaire; BA, boucle d’activation; Pr, région riche en proline; C-t, C-terminal.
Ce domaine riche en prolines est également impliqué dans l’interaction avec les membres de la famille RAF (Catling et al., 1995; Dang et al., 1998; Eblen et al., 2002; Nantel et al., 1998; Papin et al., 1996). Plus précisément, la phosphorylation de la Th292 de MEK1 est impliquée dans l’interaction entre MEK1 et RAF-1 (Catling et al., 1995). Cette formation de complexes entre les membres de la voie ERK augmente l’efficacité de signalisation. PAK1 peut favoriser la phosphorylation des résidus Th292 et S298 de MEK1 in vivo impliqués dans la formation du complexe entre MEK1 et RAF-1 (Frost et al., 1997). MEK2 n’est pas apte à former ces complexes tertiaires puisqu’il n’a pas ces résidus phosphorylables dans sa région riche en prolines (Figure 1-3) (Jelinek et al., 1994).
