MÉCANISMES D’IMMUNOMODULATION PAR LES
ALCANOLS ALIPHATIQUES
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval dans le cadre du programme de doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
Les alcanols aliphatiques sont des substances ubiquitaires utilisées dans une multitude d’applications domestiques et industrielles. Bien que les effets de l’éthanol sur différentes composantes du système immunitaire soient bien connus, il n’existait presqu’aucune donnée concernant les autres alcanols avant le présent travail. Le premier objectif du projet a été d’étudier les impacts immunologiques d’une exposition aigue aux deux autres alcanols les plus utilisés : l’isopropanol et le méthanol. Nous avons trouvé que l’isopropanol compromet les fonctions effectrices des lymphocytes T, des cellules NK, des monocytes et des macrophages. Par contre, le méthanol agit en synergie avec les stimuli activateurs des lymphocytes T et accroît leur production de cytokines pro-inflammatoires. Les effets biologiques sur ces cellules n’impliquent pas les événements de signalisation précoce en aval des récepteurs activateurs, ils résultent d’une dérégulation sélective de l’activation de facteurs de transcription NFAT avec ou sans la participation d’AP-1. Dans les monocytes activés au LPS, l’isopropanol ne modifie pas les sentiers de signalisation de NF-κB et des MAPK p38 et JNK, mais compromet l’activation de ERK2. Il en résulte une activation défective des sous-unités d’AP-1 c-Fos et JunB.
La deuxième partie du projet a été de vérifier si les n-alcanols (de C1 à C12) avaient des
effets immunologiques qui suivent la règle de Meyer-Overton. Cette règle établie une corrélation entre le potentiel anesthésique d’une molécule et son hydrophobicité. Nous avons trouvé que les n-alcanols de C2 à C10 inhibent la sécrétion d’IFN-γ par les
lymphocytes T activés d’une manière reliée à leur degré d’hydrophobicité, mais cette corrélation s’interrompt à C11. Les n-alcanols exercent leur effet en aval de la membrane
plasmique en altérant progressivement et en fonction de leur taille l’activation du facteur de transcription NFAT; cette tendance s’interrompt aussi à C11. L’activation de la voie NF-κB
est altérée par les n-alcanols, mais leur effet s’arrête avant, aux environs de C8. Ces derniers
résultats suggèrent l’existence de pochettes d’intéraction de dimensions définies sur des cibles protéiques qui compromettent l’activation de NFAT et NF-κB et altèrent la fonction effectrice des lymphocytes T. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension de l’activité biologique des alcanols.
Abstract
Aliphatic alkanols are ubiquitous substances used in a variety of household and industrial applications. Although the effects of ethanol on the immune system have been extensively studied, far fewer data is available for the other alkanols. The first objective of the project was to study the immunological impact of acute exposure to the two other most frequently used alkanols, namely isopropanol and methanol. We found that isopropanol is detrimental to the effector functions of T lymphocytes, NK cells, monocytes, and macrophages; they produce less pro-inflammatory cytokines in presence of this alcohol and, in the case of macrophages, phagocytosis is also reduced. Methanol synergizes with activating stimuli to increase their cytokine production. These changes do not involve early signaling events downstream of the cell membrane; they result from the selective dysregulation of the activation of discrete members of the NFAT family of transcription factors with or without the involvement of AP-1. In LPS-activated monocytes, isopropanol does not alter NF-κB and p38/JNK MAPK signaling cascades, but impairs ERK2 activation. The result is a deficient activation of AP-1 subunits c-Fos and JunB. Aliphatic n-alkanols also display anesthetic properties in accordance to their degree of hydrophobicity, following the Meyer-Overton rule. The second part of the project was to determine whether these structurally similar molecules (from C1 to C12) had immunological effects following the same rule. We
found that n-alkanols from C2 to C10 inhibit IFN-γ release by activated T lymphocytes in
correlation with their hydrophobicity but a cutoff effect was evident at C11. n-Alkanols act
downstream of the cell membrane by progressively down-regulating the activation of NFAT in accordance to the size of their aliphatic chain with a clear downward trend that is interrupted at C11. NF-κB signaling is also compromised but the cutoff appears earlier, in
the vicinity of C8. Our results suggest the existence of interaction pockets of defined
dimensions within intracellular targets that compromise the activation of the NFAT and NF-κB transcription factors and ultimately modulate the effector function of T lymphocytes. Altogether, this work contributes to a better understanding of the biological activity of alkanols.
Les chapitres 2 à 5 de cette thèse sont des articles insérés.
Au chapitre 2, on retrouve l’article intitulé : Immunosuppressive effect of isopropanol: down-regulation of cytokine production results from the alteration of discrete transcriptional pathways in activated lymphocytes. Cet article a été publié dans le Journal of Immunology et les auteurs sont: Olivier Désy, Damien Carignan, Manuel Caruso et Pedro O. de Campos-Lima. J’ai contribué aux expérimentations qui ont été effectuées par le premier auteur. J’ai aussi participé à l’élaboration des expériences, à l’analyse des résultats, à la révision et à la correction du manuscript.
Au chapitre 3, l’article: Methanol induces a discrete transcriptional dysregulation that leads to cytokine overproduction in activated lymphocytes a été publié dans le journal Toxicological Sciences. Olivier Désy, Damien Carignan, Manuel Caruso et Pedro O. de Campos-Lima en sont aussi les auteurs. Olivier Désy a réalisé la majeure partie des expériences, mais j’y ai aussi contribué de façon significative en élaborant des protocoles, en réalisant les expériences associées et en analysant les données obtenues. J’ai aussi participé au montage de 2 figures, à la révision et à la correction du manuscript.
Au chapitre 4, The dysregulation of the monocyte/macrophage effector function induced by isopropanol is mediated by the defective activation of distinct members of the AP-1 family of transcription factors, a aussi été publié dans Toxicological Sciences. Les auteurs sont Damien Carignan, Olivier Désy et Pedro O. de Campos-Lima. Je suis co-auteur principal de cet article avec Olivier Désy. Nous avons tous deux contribué pour environ la moitié du travail expérimental contenu dans cet ouvrage. J’ai fait le design de plusieurs expériences, j’ai élaboré de nouveaux protocoles, j’ai analysé les données et monté les figures. J’ai aussi contribué à la rédaction, à la révision et à la correction du manuscript.
Au chapitre 5, le manuscript intitulé The size of the unbranched aliphatic chain determines the immunomodulatory potency of short and long-chain n-alkanols, dont je suis l’auteur principal, n’a pas encore été soumis pour publication. Les co-auteurs sont Olivier Désy,
Manuel Caruso et Pedro O. de Campos-Lima. Pour cet article, j’ai fait le design de la plupart des expériences, élaboré la presque totalité des protocoles et fait la majeure partie du travail expérimental. J’ai analysé les données et fait le montage de la plupart des figures. J’ai aussi participé à la rédaction du manuscript et bien sûr à sa révision et à sa correction.
Nous (Olivier Désy, Damien Carignan et Pedro O de Campos-Lima) avons aussi publié un article de revue intitulé Short-term immunological effects of non-ethanolic short-chain alcohols dans le journal Toxicology Letters. Des portions de cet article m’ont servi de point de départ pour la rédaction de segments de mon introduction et de ma discussion. On trouvera une copie du manuscript de cet ouvrage en annexe de cette thèse.
Résumé ... i
Abstract ... ii
Avant-Propos ... iii
Table des matières ... vi
Liste des tableaux ... ix
Liste des figures ... x
Liste des abbréviations ... xii
1. Introduction ... 1
Immunotoxicologie de l’Éthanol ... 4
Effets de l’éthanol sur les cellules de l’immunité innée ... 5
Effets de l’éthanol sur les cellules de l’immunité adaptative ... 6
Effets aigus versus effets chroniques ... 8
Mécanismes moléculaires des effets de l’éthanol sur la fonction immune ... 9
Mécanismes généraux des effets biologiques des alcools ... 12
Hypothèses lipidiques ... 13
Hypothèse protéique ... 15
Problématique, Hypothèses et Objectifs ... 22
2. Immunosuppressive effect of isopropanol: down-regulation of cytokine production results from the alteration of discrete transcriptional pathways in activated lymphocytes .. 24
Résumé ... 25
Abstract ... 26
Introduction ... 26
Materials and Methods ... 27
Results ... 31
Discussion ... 36
References ... 41
Figures and Legends ... 47
3. Methanol induces a discrete transcriptional dysregulation that leads to cytokine overproduction in activated lymphocytes ... 56
Résumé ... 57
Abstract ... 58
Introduction ... 58
Materials and Methods ... 60
Results ... 64
Discussion ... 69
References ... 75
Figures and Legends ... 82
4. The dysregulation of the monocyte/macrophage effector function induced by isopropanol is mediated by the defective activation of distinct members of the AP-1 family of transcription factors ... 93
Résumé ... 94
Abstract ... 95
Introduction ... 95
Materials and Methods ... 97
Results ... 102
Discussion ... 107
References ... 114
Figures and Legends ... 123
5. The size of the unbranched aliphatic chain determines the immunomodulatory potency of short and long-chain n-alkanols. ... 133
Résumé ... 134
Abstract ... 135
Introduction ... 135
Materials and Methods ... 137
Results ... 140
Discussion ... 144
References ... 149
Figures and Legends ... 155
Réflexions sur les mécanismes de dérèglement des lymphocytes T par les alcanols ... 163
Réflexions sur les mécanismes de dérèglement des cellules de l’immunité innée par les alcanols ... 168
Considérations cliniques et conséquences médicales ... 172
Conclusion ... 179
Bibliographie ... 181
Tableau 1.1 – Production et principaux usages des alcools étudiés ... 2 Tableau 1.2 – Protéines dont la fonction est altérée par des alcools. ... 18 Table 5.1 - Correlation between primary alcohol carbon-chain length and T lymphocyte
Figure 1.1 – Expositions aiguës aux alcools en Amérique du Nord. ... 4
Figure 1.2 - L’éthanol altère l’immunité innée et adaptative. ... 9
Figure 1.3 Effets d’une exposition aiguë ou chronique à l’éthanol sur l’activation du TLR4 par le LPS. ... 11
Figure 1.4 – Corrélation de Meyer-Overton ... 13
Figure 1.5 – Concentration de n-alcanols requise pour inhiber de 50% l’activité luciférase. ... 16
Figure 1.6 – Caractéristiques de base des pochettes de liaison aux alcools dans les protéines. ... 20
Figure 1.7 - Structure moléculaire des composés co-cristallisés en interaction avec des canaux ioniques. ... 21
Figure 2.1 - Biological effect of Isopropanol treatment in vitro. ... 47
Figure 2.2 - Isopropanol and early TCR signaling ... 48
Figure 2.3 - Transcriptional effect of isopropanol. ... 49
Figure 2.4 - Down-modulation of the effector function of human lymphocytes exposed to isopropanol in vitro. ... 51
Figure 2.5 - Immunosuppressive effect of isopropanol in vivo. ... 53
Figure 3.1 - Biological effect of methanol treatment on human T lymphocytes in vitro. ... 82
Figure 3.2 - Methanol impact on early TCR signaling and on transcription factor activation. ... 84
Figure 3.3 - Differential modulation of NFAT family members by methanol exposure in vitro. ... 86
Figure 3.4 - Effect of methanol on proinflammatory cytokine release by human peripheral blood T lymphocytes in vitro. ... 89
Figure 3.5 - Immunological impact of methanol in vivo. ... 91
Figure 3.6 - Hypothetical model of the methanol transcriptional effect. ... 92
Figure 4.1 - Biological effect of isopropanol treatment in vitro on human monocytes. .... 123
Figure 4.3 - Isopropanol acts downstream of the cell membrane and does not compromise the NF-B signaling pathway. ... 127 Figure 4.4 - Isopropanol induces a selective defect in the MAPK signaling cascade and
alters the activation of discrete AP-1 family members. ... 129 Figure 4.5 - Isopropanol-induced immunosuppression in vivo. ... 131 Figure 5.1 - Individual profiles of the immunomodulatory activity of primary alcohols. . 155 Figure 5.2 - Collective profile of the immunomodulatory activity of the homologous series
of primary alcohols. ... 156 Figure 5.3 - Primary alcohols and TCR early signaling. ... 157 Figure 5.4 - Primary alcohols affect NFAT activation. ... 159 Figure 5.5 - Impact of primary alcohols on NF-B activation in human primary
lymphocytes ... 161 Figure 6.1 – Modèles d’action hypothétiques des alcanols sur des cellules immunitaires. ... 171 Figure 6.2 – L’acide octanoïque inhibe la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T. ... 177
Liste des abbréviations
AP-1 activator protein-1
ARNm ARN messager
CD cluster of differentiation
Cellules NK cellules Natural Killer
CINC cytokine-induced neutrophil chemoattractant
ConA Concanavaline A
EC50 moitié de la concentration maximale effective
ED50 dose effective médiane
ERK extracellular signal-regulated kinase
GABAA acide gamme-amino-butyrique de type A
GLIC Gloeobacter violaceus pentameric ligand-gated ion channel
HGF hepatocyte gowth factor
IC50 moitié de la concentration inhibitrice maximale
IFN interferon
IL Interleukine
IPA Isopropanol
IRAK IL-1R-associated kinase
IRK1 G-protein-insensitive inwardly rectifying potassium channel
JNK c-Jun N-terminal kinase
LPS lipopolysaccharide
MAPK mitogen activated protein kinase
MCP-1 monocyte chemotactic protein-1
MeOH Méthanol
MIP-2 macrophage inflammatory protein-2
nAchR récepteur nicotinique de l’acétylcholine
NFAT nuclear factor of activated T cells
NF-κB nuclear factor-kappa B
PHA phytohémagglutinine
PKC protéine kinase C
PMA phorbol 12-myristate 13-acétate
Poly(I:C) Polyinosinic-polycytidylic acid
SEB entérotoxine staphylococcique B
TGFβ transforming growth factor β
Th T helper
TIR Toll/IL-1R
TLR Toll-like receptors
1. Introduction
L’expérience de l’humanité avec des produits contenant de l’alcool peut être retracé au moins jusqu’au 7e millénaire avant Jésus-Christ. Les plus anciennes évidences biochimiques et archéologiques proviennent de l’analyse de fragments de poteries trouvés dans un campement néolithique des plaines centrales de Chine, qui ont révélé des traces d’une concoction fermentée faite de riz, de miel et possiblement de fruits d’aubépine ou de raisins (McGovern et al., 2004). Le développement subséquent du processus de distillation par des alchimistes d’Alexandrie au 1er siècle avant Jésus-Christ, et vraisemblablement longtemps avant par les chinois, a pavé la voie à la caractérisation de l’éthanol et à l’isolation et à la synthèse d’autres alcools (Simmonds, 1919). Avec les années, il est devenu évident que les alcools constituent une large famille de molécules dont les applications s’étendent bien au-delà des premiers usages rituels, récréatifs et médicinaux associés aux boissons contenant de l’éthanol.
Ainsi, Robert Boyle a été le premier, au dix-septième siècle, à montrer que la distillation du bois donnait un alcool – le méthanol – qu’il a appellé esprit anonyme, esprit de bois inflammable ou esprit adiaphorétique (adiaphorous spirit) (Hoefer, 1869). De nos jours, le méthanol est surtout produit de manière synthétique et utilisé comme matière première pour la production d’autres produits chimiques; il est aussi aisément disponible pour les consommateurs en tant que constituant de produits familiers tels que des vernis, peintures, liquides lave-glace, antigels et adhésifs (Jammalamadaka and Raissi, 2010). De manière similaire, l’isopropanol - un alcool secondaire - a trouvé sa place dans de nombreux processus industriels depuis sa synthèse au milieu du dix-neuvième siècle par Marcellin Berthelot et Charles Friedel, indépendamment l’un de l’autre. Maintenant la population en général a facilement accès à l’isopropanol sous forme d’alcool à friction et comme ingrédient de gels désinfectants pour les mains et d’autres produits domestiques d’usage courant (Kraut and Kurtz, 2008; Jammalamadaka and Raissi, 2010).
Les alcools aliphatiques primaires, comprenant de trois à douze atomes de carbone, ont des usages moins communs que ceux du méthanol, de l’éthanol et de l’isopropanol. Toutefois, plusieurs d’entre eux sont utilisés comme solvants pour des applications industrielles tandis que d’autres sont employés pour la fabrication de parfum et de produits cosmétiques. On
retrouve un résumé des ces usages de même que la production annuelle de ces alcools dans le tableau 1.1.
Tableau 1.1 – Production et principaux usages des alcools étudiés
Alcanol Production Usages Références
Methanol Environ 20 millions de tonnes
dans le monde en 1991 Production industrielle d’autres composés chimiques, composant de plusieurs produits disponibles dans le commerce.
(EHC 196, 1997)
Isopropanol 1 800 000 tonnes dans le monde en 1995
Solvant répandu, composant de produits domestiques et d’usage personnel, manufacture d’autres produits chimiques.
(EHC 103, 1990) (OECD-SIDS, 2002) Propanol Plus de 130 000 tonnes dans le
monde en 1979. Solvant multi-usages industriel et domestique. Intermédiaire dans la manufacture de composés chimiques.
(EHC 102, 1990)
Butanol 784 000 tonnes aux États-Unis
en 1997. Intermédiaire industriel, Solvant, manufacture de produits pharmaceutiques, parfums, agent aromatisant pour aliments et boissons.
(OECD-SIDS, 2001)
Pentanol 35 000 tonnes dans le monde en 1997 (alcool amylique primaire)
Industrie pharmaceutique, parfums, arômes, solvants, fabrication d’explosifs, chimie de synthèse, additif alimentaire.
(OECD-SIDS, 2006) (Nelson et al., 1989) Hexanol 1 580 000 tonnes dans le
monde § Solvant, intermédiaire industriel. (OECD-SIDS, 2006) (Nelson et al., 1989)
Heptanol Non-disponible Expériences d’électrophysiologie cardiaque, cosmétiques
(Takens-Kwak et al., 1992)
Octanol 1 580 000 tonnes dans le
monde § Parfumerie traitement expérimental pour le et cosmétiques,
tremblement essentiel, fabrication de plastifiants.
(Opdyke, 1973) (Bushara et al., 2004) (OECD-SIDS, 2006) (Nelson et al., 1990)
Nonanol Non-disponible Cosmétiques
Fabrication de plastifiants. (Opdyke, (Nelson et al., 1990) 1973) Décanol 1 580 000 tonnes dans le
monde § Cosmétiques Fabrication de plastifiants. (Opdyke, (OECD-SIDS, 2006) 1973)
(Nelson et al., 1990) Undécanol 1 580 000 tonnes dans le
monde § Cosmétiques, additif alimentaire. (OECD-SIDS, 2006) (Opdyke, 1973)
Burdock GA (1997) Dodécanol 60 000 tonnes en Europe en
1993 intermédiaire pour la synthèse de composés chimiques, ingrédients de produits industriels, produits nettoyants, produits cosmétiques.
(Opdyke, 1973) (OECD-SIDS, 2002) § 1 580 000 tonnes pour un esemble de 15 alcools à longue chaîne comprenant l’hexanol, l’octanol, le décanol et le undécanol.
L’utilisation des alcools est désormais très répandue dans les sphères sociale, professionnelle et domestique de la vie moderne. L’accès facile à ces substances et leur
présence ubiquitaire dans une multitude de produits créent beaucoup d’opportunités d’empoisonnement. Afin de mieux cerner l’amplitude du problème, il est intéressant de s’attarder au nombre de cas d’expositions aigues rapportés chaque année à des centres antipoison en Amérique du Nord, soit près de 120 000 (Bronstein et al., 2010) (Figure 1.1). Sans surprise, l’éthanol représente la première cause d’empoisonnement avec 85 000 cas d’expositions aigues dont 34 000 non-liés à la consommation de boissons alcoolisées. Il est suivi de l’isopropanol avec un peu moins de 21 000 cas répartis en trois sous-groupes : les alcools à friction, les produits nettoyants et les produits non à friction/non-nettoyant. Les glycols comptent près de 10 000 cas, la plupart liés à des produits d’entretien automobile. En ce qui concerne le méthanol, l’exposition à cette substance à partir de sources alimentaires ou environnementales ne cause généralement pas de problème. Cependant, le méthanol demeure tout de même une importante cause d’intoxication aux alcools et les taux de mortalité qui y sont associé peuvent atteindre 15-36% dans les cas les plus sévères (Liu et al., 1998; Brent et al., 2001). En terme numérique, les centres antipoison reçoivent un peu plus de 2000 rapports de cas d’intoxication aiguë au méthanol par année. L’exposition à d’autres alcools compte environ 1200 cas annuellement.
L’exposition systémique aux alcools produit plusieurs effets biologiques, notamment des dérèglements neurologiques et comportementaux (Kraut and Kurtz, 2008; Jammalamadaka and Raissi, 2010). Il n’est donc pas surprenant que la longue histoire de l’utilisation et de l’abus de l’éthanol dans notre société ait stimulé un intérêt considérable pour sa toxicologie de même que pour son immunotoxicité (OECD-SIDS, 2004). Nous examinerons maintenant les conséquences immunologiques d’une intoxication aiguë à l’éthanol.
Figure 1.1 – Expositions aiguës aux alcools en Amérique du Nord.
Les nombres entre parenthèses représentent le nombre de cas rapportés annuellement à l’association américaine des centres antipoison. Les mélanges de glycols et de méthanol (188 cas) ont été inclus dans la tranche du méthanol.
Immunotoxicologie de l’Éthanol
Une bonne portion de la littérature consacrée aux effets immunologiques de l’éthanol porte sur les effets de cette substance sur la réponse inflammatoire. L’inflammation est une caractéristique de l’immunité innée. Elle est la réponse du corps à une agression physique ou pathogénique, comme un traumatisme ou une blessure, et constitue la première ligne de défense contre les microorganismes pathogènes (Goral et al., 2008). De plus, les processus inflammatoires sont essentiels à l’induction d’une réponse immunitaire adaptative à l’infection.
Il est maintenant bien établi qu’une exposition aiguë à l’éthanol chez l’homme et dans des modèles animaux réduit considérablement la chimiotaxie et l’inflammation en diminuant la production de chimiokines et de cytokines pro-inflammatoires. Compte tenu de l’importance de ces mécanismes pour l’immunité innée, ces changements sont donc
associés à une plus grande susceptibilité aux infections (Pruett et al., 2004). Les prochaines sections décrivent les effets de l’éthanol sur différentes composantes des branches innée et adaptative du système immunitaire.
Effets de l’éthanol sur les cellules de l’immunité innée
Les cellules de l’immunité innée telles que les leucocytes polynucléaires, les monocytes/macrophages et les cellules natural killer (NK) sont équipées de différents récepteurs capables de reconnaître des motifs moléculaires associées aux pathogènes et de répondre rapidement aux signaux transmis par ceux-ci afin de combattre l’infection. Les récepteurs de ce type les mieux connus sont les Toll-like receptors (TLR) qui reconnaissent une variété de composantes microbiennes et amorcent la signalisation menant à l’activation des fonctions effectrices des cellules de l’immunité innée, comme la phagocytose ou la sécrétion de cytokines et de chimiokines. Les effets de l’éthanol sur l’activation de cellules de l’immunité innée par des ligands de différents TLR ont été largement étudiés et seront brièvement passées en revue dans les paragraphes suivants.
De nombreuses études in vivo et in vitro ont montrés qu’un traitement aigu à l’éthanol est capable d’inhiber la production de cytokines pro-inflammatoires en réponse à ces composantes. Par exemple, l’éthanol réduit la sécrétion de tumor necrosis factor-α (TNF-α) et d’interleukine-1β (IL-1β) par des macrophages alvéolaires de souris et des monocytes de sang périphérique humain en réponse au lipopolysaccharide (LPS), un ligand du TLR4 (Nelson et al., 1989), (Verma et al., 1993). Il diminue aussi la production d’IL-6 et d’IL-12 induite par le polyinosinic :polycytidylic acid (poly I:C), un ligand du TLR3, par des macrophages péritonéaux de souris (Pruett et al., 2004). Enfin, des macrophages spléniques murins produisent moins de TNF-α et d’IL-6 lorsque traités à l’éthanol et stimulés au LPS, au peptidoglycane (TLR2) ou à l’ADN microbien (CpG) non-méthylé (TLR9) (Goral and Kovacs, 2005).
De plus, l’éthanol réduit aussi la production des chimiokines monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) et IL-8 par les monocytes humains en réponse à une stimulation à
l’entérotoxine B staphylococcique (SEB), au phytohémagglutinine (PHA) ou à l’interféron (IFN)-γ (Szabo et al., 1999). Dans un modèle d’infection pulmonaire, l’éthanol inhibe également les chimiokines macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) et cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC), ce qui, par conséquent, réduit l’influx de neutrophiles (Boe et al., 2003).
Les neutrophiles eux-mêmes sont d’ailleurs affectés par une exposition aiguë à l’éthanol : ils sécrètent moins des cytokines IL-8 et TNF-α et la dégranulation de hepatocyte growth factor (HGF) et d’élastase, des molécules responsables du remodelage des tissus environnants, est réduite (Taieb et al., 2002).
Les cellules endothéliales, qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, sont aussi très importantes lors d’une réponse immunitaire. Une fois activées par des médiateurs pro-inflammatoires, elles permettent l’adhésion et le passage de cellules immunitaires vers le site inflammatoire ou infectieux. Elles sécrètent aussi d’avantage de cytokines et de chimiokines. Une intoxication aiguë à l’éthanol diminue le recrutement de leucocytes, la production de chimiokines et l’expression de molécules d’adhésion par les cellules endothéliales in vivo et in vitro (Saeed et al., 2004).
Les effets d’une exposition aiguë à l’éthanol sur les cellules NK sont aussi délétères à leur activité. Dans un modèle de propagation de métastases sensible aux cellules NK chez le rat, une exposition aiguë à l’éthanol inhibe l’activité de ces cellules et accroît le nombre de métastases (Ben-Eliyahu et al., 1996). De plus, dans un modèle murin de consommation aiguë d’alcool, l’activité cytolytique des cellules NK stimulées par le poly (I :C) est réduite (Hebert and Pruett, 2002).
Effets de l’éthanol sur les cellules de l’immunité adaptative
Tel que mentionnée précédemment, l’inflammation contribue au déclenchement de la réponse immunitaire adaptative contre un pathogène donné. Vu les effets délétères
susmentionnés de l’éthanol sur la réponse inflammatoire, il est donc cohérent que des composantes importantes de l’immunité acquise soient aussi affectés par une exposition à cet alcool.
Ainsi, il a été montré que l’éthanol réduit la prolifération de lymphocytes T spécifiques à un antigène en diminuant la capacité de présentation de cet antigène par les monocytes. Cet effet est causé par la diminution de production d’IL-1β et l’augmentation de transforming growth factor β (TGFβ) et d’IL-10 par les monocytes, les précurseurs des cellules dendritiques (Szabo et al., 1993; Mandrekar et al., 1996).
Les cellules dendritiques myéloïdes comptent parmi les plus puissantes présentatrices d’antigènes. Elles expriment une variété de molécules d’adhésion et de co-stimulation et produisent des cytokines régulatrices ce qui leur permet d’activer efficacement les lymphocytes T naïfs. Or, des cellules dendritiques générées en présence d’éthanol montrent un phénotype inhibiteur. Elles sont déficientes dans les fonctions associées à la présentation de l’antigène (capture, apprêtement et présentation) aux lymphocytes T. Elles ont aussi une expression réduite de molécules de co-stimulation en plus de produire moins d’IL-12 et d’avantage d’IL-10. Ces cellules dendritiques induisent l’anergie des lymphocytes T et inhibent la réponse T helper (Th)1 (Mandrekar et al., 2004).
Les effets observés d’une exposition aiguë à l’éthanol sur la fonction des lymphocytes T eux-mêmes sont contradictoires. Dans un modèle murin d’intoxication aigue, la prolifération de splénocytes en réponse à la concanavaline A (ConA) demeure à peu près inchangée (Kawakami et al., 1991). Une autre étude montre que l’éthanol augmente la prolifération de cellules de sang périphérique mononuclées (PBMC) stimulées in vitro par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) ou la ConA (Szabo et al., 1993). D’autres ont plutôt observé une réduction de la production d’IL-2 et de la prolifération de PBMC traitées à la ConA en présence d’éthanol (Chiappelli et al., 1995). Plus récemment, un autre groupe a montré une réduction de la sécrétion et de la quantité d’ARN messager de l’IL-2 dans des
cellules Jurkat et des lymphocytes T CD4 primaires stimulés au PHA ou avec des anticorps contre CD3 et CD28 en présence d’éthanol (Ghare et al., 2011).
Effets aigus versus effets chroniques
Jusqu’ici, les effets décrits de l’éthanol sur la fonction immune ont été ceux causé par une exposition aiguë à cette substance. Or, l’exposition chronique à l’éthanol est fréquente chez les individus alcooliques. Il est bien connu maintenant que ces deux types d’exposition à l’éthanol ont des effets opposés sur la fonction immune : une exposition aiguë est inhibitrice alors que l’exposition chronique augmente la réponse inflammatoire (Goral et al., 2008; Szabo and Mandrekar, 2009). Par exemple, une intoxication chronique à l’éthanol accroît la production de TNF-α par les cellules de Kupffer – des macrophages du foie – en réponse à une stimulation au LPS (Nagy, 2003).
La figure 1.2 présentée plus loin résume les effets modulateurs de l’éthanol sur la fonction de différentes cellules immunitaires et leur habileté à répondre à un pathogène. La production de cytokines pro-inflammatoires (comme l’IL-1 et le TNF-α) est inhibé par l’éthanol aigu alors que l’alcool chronique l’augmente. La fonction de présentation de l’antigène des monocytes et des cellules dendritiques est altérée par les deux formes d’exposition à l’éthanol ce qui contribue à l’activation déficiente des lymphocytes T. La production d’IL-12 est aussi réduite. Il en résulte des changements dans la balance entre les cytokines de type Th1 (IFNγ) et Th2 (IL-10). Collectivement, ces changements induits par l’éthanol nuisent à l’élimination des pathogènes et à l’induction d’une réponse adaptative à l’infection chez l’individu exposé à l’alcool (Szabo and Mandrekar, 2009).
Figure 1.2 - L’éthanol altère l’immunité innée et adaptative.
Les expositions chroniques et aiguës à l’éthanol ont de larges effets immunorégulateurs. Adapté de (Szabo and Mandrekar, 2009, Alcoholism Clinical & Experimental Research)
Mécanismes moléculaires des effets de l’éthanol sur la fonction immune
La plupart des mécanismes moléculaires connus expliquant les effets immunomodulateurs de l’éthanol sont liés à l’activation des cellules immunitaires par les TLR (Pruett et al., 2004; Goral et al., 2008). Ces TLR possèdent un court domaine intracellulaire Toll/IL-1R (TIR) qui, suite à la liaison d’un ligand, recrute des molécules adaptatrices et induit les événements de signalisation en aval. Comme plusieurs autres TLR, TLR4 interagit avec la molécule adaptatrice MyD88 qui à son tour recrute IL-1R-associated kinase (IRAK) 4. IRAK4 phosphoryle et active IRAK1 qui va s’associer au TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6). L’association entre IRAK1 et TRAF6 est régulée négativement par la protéine IRAK-monocyte (IRAK-M) (Kobayashi et al., 2002). Les cascades de signalisation intracellulaire induite ensuite par le complexe IRAK1/TRAF6 comprennent l’activation du
facteur de transcription activator protein-1 (AP-1) via les mitogen-activated protein kinases (MAPK) et l’activation du facteur de transcription nuclear factor-κB (NF-κB) (Takeda and Akira, 2005). Ces deux voies de signalisation sont altérées par une exposition aiguë à l’éthanol. De fait, cet alcool réduit la phosphorylation de p38 et l’activation de NF-κB induites par le LPS dans des leucocytes humains (Arbabi et al., 1999; Mandrekar et al., 1999). L’activation de p38, de NF-κB et de la sous-unité c-Jun du facteur de transcription AP-1 sont inhibés par l’alcool dans des macrophages péritonéaux de souris activés via TLR3 par le poly (I:C) (Pruett et al., 2004). De plus, l’éthanol réduit la phosphorylation de p38 et de l’extracellular-signal regulated kinase (ERK)-1/2 dans des macrophages murins stimulés par des ligands pour les TLR2, 4 et 9 (Goral and Kovacs, 2005). Une étape importante de la signalisation précoce induite par les TLR est l’activation de la protéine IRAK1 et son hyperphosphorylation qui, ultimement, mène à sa dégradation par le protéosome. Il a été montré que l’activité kinase d’IRAK1 est réduite en présence d’éthanol dans des monocytes humains stimulés via TLR4 par le LPS. Par contre, cet effet est absent lorsque les cellules sont stimulées via TLR2 (Oak et al., 2006). Dans une lignée de macrophages murins, la dégradation d’IRAK1 suite à l’activation des cellules par le LPS est diminuée en présence d’éthanol (Dai et al., 2005).
Une analyse de l’expression des gènes modifiés par une exposition aiguë à l’éthanol par micropuce à ADN a permis d’identifier, chez des macrophages péritonéaux de souris stimulés au poly(I :C), la suppression d’une boucle d’amplification lié à l’interféron (Pruett et al., 2004). Non seulement l’ARNm de l’IFN et la protéine IFNα sont diminués, mais on note aussi que l’expression de molécules responsables de la signalisation produite par l’IFN et de molécules directement induites par l’IFN est réduite.
Tel que mentionné précédemment, une exposition chronique à l’éthanol accroît la production de cytokines pro-inflammatoires. Il a été montré que l’augmentation de la production de TNF-α par les cellules de Kupffer en réponse au LPS était associée à un accroissement de l’activité de p38 et ERK1/2 (Kishore et al., 2001; Kishore et al., 2002). L’ensemble de ces mécanismes est résumé dans la figure 1.3.
Il a aussi été proposé que l’éthanol puisse agir au niveau le plus précoce des événements de signalisation en altérant la structure et/ou la fonction des radeaux lipidiques. De fait, suite à
la stimulation avec des ligands spécifiques, des TLR membranaires, comme TLR2 et TLR4, sont recrutés dans des radeaux lipidiques. CD14, un composant du complexe du récepteur TLR4, est aussi redistribué dans les microdomaines membranaires suite à la liaison du LPS (Szabo et al., 2007). Des études indiquent qu’une exposition aigüe à l’éthanol altère la redistribution induite par le LPS aux radeaux lipidiques de TLR4 et CD14. Ces changements sont associés à une diminution de la sécrétion de TNF-α et à une réduction de l’activation du facteur de transcription NF-κB. De plus, le traitement de cellules de type macrophages avec des drogues qui perturbent les radeaux lipidiques a des effets similaires (Dai et al., 2005; Dolganiuc et al., 2006).
Figure 1.3 Effets d’une exposition aiguë ou chronique à l’éthanol sur l’activation du TLR4 par le LPS.
Adapté de (Goral et al., 2008, Alcohol)
Éthanol aigu Éthanol chronique
Cytoplasme
Mécanismes généraux des effets biologiques des alcools
Les événements moléculaires qui sous-tendent les effets biologiques de l'alcool sont complexes, mais une image plus complète commence à émerger, du moins en partie, en empruntant certains concepts clés d'études réalisées sur des composés anesthésiques (Eckenhoff, 2001; Streiff et al., 2006; Vedula et al., 2009). Notre compréhension de la façon dont fonctionnent les alcools (et d’autres anesthésiques plus efficaces et/ou moins toxiques) a été porté principalement sur la membrane cellulaire au cours de la majeure partie du XXe siècle (Seeman et al., 1971; Roth and Seeman, 1972; Pringle et al., 1981). Le premier aperçu du mécanisme d'action présumé des alcools est venu de l'observation qu'ils suivent la règle de Meyer-Overton, tout comme d'autres anesthésiques généraux. Cette règle établie une corrélation entre le pouvoir anesthésiant d’un composé donné et son coefficient de partition huile : eau; ainsi, les molécules dotées de chaînes carbonées plus longues ont tendance à être plus puissantes comparativement à celles qui sont moins hydrophobes (Figure 1.4). L'opinion prédominante était que la dissolution des molécules lipophiles dans la bicouche lipidique allait changer ses propriétés physiques compromettant ainsi indirectement la fonction des protéines intégrées (Seeman, 1972; Eckenhoff, 2001). Il existe cependant des exceptions à cette corrélation, la plus notable étant la coupure de l’effet anesthésique (cut-off) après l’atteinte d’une taille moléculaire précise pour une série de molécules homologues. Par exemple, pour la série homologue des n-alcools aliphatiques saturés, le pouvoir anesthésiant augmente progressivement avec la longueur de la chaîne carbonée et atteint un maximum à 12 carbones; après ce point les alcools successifs sont dépourvus d’activité anesthésique malgré qu’ils soient plus hydrophobes que les précédents (Alifimoff et al., 1989).
Figure 1.4 – Corrélation de Meyer-Overton
Relation entre la puissance de différents anesthésiques (montré comme la réciproque de leur EC50 molaire pour l’anesthésie) et leur coefficient de partition huile :eau. Tiré de
(Franks, 2006, British Journal of Pharmacology)
Hypothèses lipidiques
Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer les mécanismes responsables des perturbations de la bicouche lipidique qui pourraient induire l’anesthésie dont l’expansion du volume membranaire, le désordonnement de la membrane cellulaire et le changement dans les transitions de phase lipidique (Peoples et al., 1996).
Selon le modèle de l’expansion du volume membranaire, les alcools ou autres anesthétiques produisent leurs effets comportementaux en occupant un espace précis dans la membrane des neurones, ce qui aurait pour effet d’accroître le volume membranaire. Cette expansion de volume serait attribuable aux effets des molécules d’alcools ou d’anesthétiques sur les lipides et possiblement aussi les protéines membranaires. En conséquence, il résulterait une augmentation des forces latérales dans la membrane qui altérerait le fonctionnement des
protéines membranaires intégrales (Seeman, 1972). Toutefois, les changements de volume membranaire induits par des concentrations pertinentes d’alcools (qui induisent l’anesthésie) sont extrêmement petits et peuvent être reproduits par des élévations de température de seulement quelques degrés Celsius. Or, de tels changements de température n’induisent pas d’anesthésie ou de signes d’effets comportementaux d’une intoxication à l’alcool (Franks and Lieb, 1982).
Le modèle des transitions de phases lipidiques s’attarde essentiellement au changement de point de fusion des lipides membranaires. Il a été proposé que les alcools et les anesthésiques pourrait altérer l’équilibre entre les phases ordonné et désordonné des lipides membranaires (Lee, 1976; Trudell, 1977). Ainsi, les lipides entourant une protéine telle qu’un canal ionique pourrait devoir être dans un état moins ordonné et plus compressible permettant au canal de s’ouvrir. Donc selon cette hypothèse, les alcools et les anesthésiques affecteraient la fonction des canaux ioniques en réduisant la température à laquelle les lipides entrent dans la phase ordonnée. Cependant, des concentrations cliniques d’anesthésiques diminuent cette température de seulement 1-2°C : une perturbation analogue à celle provoquée par une augmentation de la température corporelle de même magnitude (Eckenhoff, 2001).
Selon le modèle du désordre ou de la fluidité membranaire, l’hypothèse fut émise que le désordonnement de l’essentiel de la phase lipidique de la membrane cellulaire par les alcools pourrait perturber la fonction normale de protéines intégrées, telles que les canaux ioniques (Goldstein, 1984). De fait, il a été démontré que la dissolution de n-alcools anesthétiques (octanol, décanol, dodécanol) dans des membranes synaptiques accroît leur désordre tandis que la dissolution de n-alcools plus longs et non-anesthétiques n’a pas d’effet (tetradécanol) ou a même l’effet inverse (hexadécanol, octadécanol). Cela permettrait donc d’expliquer la coupure (cut-off) observée de l’effet anesthésique de la série homologue des n-alcools après le dodécanol (Miller et al., 1989). Cependant, plusieurs réserves existent quant à la validité de cette hypothèse. D’abord, les effets des alcools sur le désordonnement de la membrane cellulaire ne sont généralement mesurables qu’à des concentrations nettement plus élevées que celles de la gamme pharmacologique. Il serait donc difficile d’envisager que des concentrations pertinentes d’un point de vue
pharmacologique puissent avoir un effet significatif sur ce désordonnement. D’ailleurs, à des concentrations associées à l’anesthésie, on estime qu’il n’y aurait qu’une seule molécule d’alcool pour 200 molécules de lipides dans la membrane plasmique (Peoples et al., 1996). Ensuite, comme pour l’expansion de la membrane et les transitions de phase lipidique, les changements de désordre membranaire induits par les alcools ou les anesthésiques peuvent être imités par une légère augmentation de température (Pang et al., 1980). Puisqu’une fièvre légère n’induit pas la perte de sensibilité, il s’avère improbable que les hypothèses lipidiques fournissent une explication unitaire de l’anesthésie.
Hypothèse protéique
Une autre interprétation n'impliquant pas la modification de la bicouche lipidique, mais qui envisage plutôt des protéines en tant que cibles directes des alcools, reçu un soutien considérable après qu’il fut montré que des alcools primaires lient la luciférase in vitro en absence d’un contexte lipidique (Franks and Lieb, 1984; Franks and Lieb, 1985). Les alcools compétitionnent avec le substrat luciférine et inhibent l’activité enzymatique en fonction de la taille de leur chaîne carbonée et à des concentrations très similaires à celles induisant l’anesthésie dans des modèles animaux. Puisque les alcools plus longs tel que le n-décanol sont des inhibiteurs de la luciférase plus puissants de plusieurs ordres de grandeurs que les plus petits et moins hydrophobes n-propanol ou éthanol, la règle de Meyer-Overton peut être extrapolée au-delà de la dissolution dans la bicouche lipidique au niveau de sous-domaines protéiques hydrophobes. D’autant plus que les n-alcools lient la luciférase de mieux en mieux à mesure de la croissance de leur chaîne carbonée jusqu’au n-hexanol et au n-heptanol, qui ont une affinité très similaire. La corrélation entre la longueur de la chaîne de carbone et la liaison reprend avec le octanol et se poursuit jusqu’au n-dodécanol, après quoi elle disparaît à nouveau (figure 1.5). Ces découvertes suggèrent l’existence d’une pochette de liaison hydrophobe qui aurait la capacité d’accommoder deux molécules de n-hexanol ou une seule de n-dodécanol tandis que les alcools plus longs resteraient partiellement exposés au solvant (Franks and Lieb, 2004). Ces observations fournissent une alternative valable aux hypothèses lipidiques en plus d’une explication
simple au respect de la règle de Meyer-Overton. D’ailleurs des sites de liaisons aux anesthésiques qui suivent aussi cette corrélation ont été découvert sur d’autres enzymes : la cytochrome c oxydase (Hasinoff and Davey, 1989) et la protéine kinase C (Slater et al., 1993). Le cut-off de l’effet anesthésique des n-alcools peut aussi être expliqué simplement par la liaison de ces molécules à des pochettes ou des crevasses de dimensions définis sur des cibles protéiques.
Figure 1.5 – Concentration de n-alcanols requise pour inhiber de 50% l’activité luciférase. ED50 pour l’inhibition de la luciférase en fonction du nombre d’atomes de carbones de la molécule. La ligne csat représente la solubilité maximale des différents alcanols en solution
aqueuse. Tiré de (Franks and Lieb, 1985, Nature)
Des travaux ultérieurs impliquant la mutagenèse d’acides aminés spécifiques ont contribué à définir les sites putatifs de liaison aux alcools dans diverses protéines (tableau 1.2). Par exemple, pour l’enzyme adénylate cyclase, dont l’activité est augmentée par l’éthanol, il a été montré que deux régions définies de la protéine sont responsables de cet effet : les 28 premiers acides aminés de la région N-terminale du domaine C1a et les 140 acides aminés
de la région C-terminale de la molécule (Yoshimura et al., 2006). En ce qui concerne le récepteur nicotinique de l’acétylcholine (nAchR), des mutations de résidus spécifiques dans le domaine M2 qui forme le pore du récepteur change la sensibilité de la protéine aux anesthésiques (isoflurane, n-hexanol et n-octanol). Plus les acides aminés introduits sont hydrophobes, plus le nAchR est inhibé par ces substances (Forman et al., 1995). Dans le même ordre d’idée, la sensibilité à l’éthanol des récepteurs au glutamate N-méthyl-D-aspartate (NMDA), dont la fonction est inhibée par l’alcool, dépend de résidus précis situés dans les domaines tranmembranaires (TM) 3 et TM4 de la sous-unité NR1. La mutation de ces acides aminés altère la sensibilité à l’éthanol des récepteurs NMDA (Smothers and Woodward, 2006).
La plupart des protéines présentées dans le tableau 1.2 sont impliquées dans des processus neurobiologiques et n’ont pas un impact immunologique direct; cependant, il est intéressant de constater qu’il existe peut-être une interrelation entre les événements moléculaires causés par l’alcool qui produisent des effets neurobiologiques et ceux qui mènent à des effets immunologiques. À cet égard, il a été rapporté récemment que l’expression du TLR4 est régulée par le récepteur à l’acide γ-aminobutyrique de type A (GABAA) dans le noyau
central de l’amygdale et que ce procédé est associé à la consommation excessive d’alcool (taux d'alcoolémie ≥ 0,08 g% dans une période de 2 h) (Liu et al., 2011). Le récepteur GABAA possède une cavité de liaison à l'alcool formée par des acides aminés provenant de
quatre domaines transmembranaires et a longtemps été considérée comme une cible pour les effets de l'alcool dans le système nerveux central (Harris et al., 2008).
Tableau 1.2 – Protéines dont la fonction est altérée par des alcools.
Cibles définies par des analyses biochimiques et de mutagénèse
Molécules co-cristallisées Référence
Récepteurs canaux pentamériques (pLGIC)
Récepteur GABAA (Jung et al., 2005)
Récepteur glycine (Lobo et al., 2008)
Récepteur nicotinique de l’acétylcholine (Forman et al., 1995)
Récepteur au glutamate N-méthyl-D-aspartate (Smothers and
Woodward, 2006) Homologue bactérien de pLGIC (GLIC) Propofol, desflurane (Nury et al., 2011) Canaux potassiques
Shaw2 (Shahidullah et al.,
2003)
G protein inwardly rectifying potassium channel 2 (Aryal et al., 2009)
IRK1 2-méthyl-2,4-pentanediol (Pegan et al., 2006)
Molécules d’adhésion
L1 (Dou et al., 2011)
Protéine de liaison d’odorants
LUSH Éthanol, 1-propanol,
1-butanol
(Kruse et al., 2003) Enzymes
Luciférase Bromoforme (Franks et al., 1998)
Alcool déshydrogénase Alcool pentafluorobenzylique,
trifluoroéthanol
(Ramaswamy et al., 1994)
Adénylate cyclase (Yoshimura et al.,
2006)
Plus important encore, les données de mutagenèse ont consolidé les résultats obtenus avec le modèle luciférase à établir le principe que les alcools peuvent interagir directement avec des protéines qui appartiennent à des groupes fonctionnels très différents à condition qu'elles affichent des pochettes de liaison appropriées.
L'anatomie de ces poches de liaison peut être déduite des caractéristiques les plus fondamentales de la molécule d'alcool soit l'existence d'un groupe hydroxyle lié à un atome
de carbone. Le groupe hydroxyle permet aux alcools de se comporter comme des acides faibles et des donneurs de liaisons hydrogène, tandis que la chaîne aliphatique est responsable de leurs propriétés hydrophobes (Ballinger, 1960; Dwyer and Bradley, 2000). Il a été suggéré que les alcools lieraient un site miroir dans les protéines cibles (Dwyer and Bradley, 2000). Selon ce point de vue, on pourrait s'attendre à trouver dans un voisinage proche: (i) un site accepteur de liaison hydrogène, (ii) une charge nette positive localisée pour interagir avec l'atome électronégatif du groupe hydroxyle, et (iii) un sillon hydrophobe qui pourraient résulter de l’empilement d’hélices-α. Ainsi, les alcools déplaceraient les molécules d’eau de ces pochettes et établiraient des interactions atomiques avec les protéines via des liaisons hydrogènes qui seraient stabilisées par des forces de van der Waals au sein du sillon hydrophobe (Klemm, 1998). La déformation locale causée par cette interaction moléculaire pourrait mener à une altération de la fonction des protéines (figure 1.6). Par exemple, le canal potassique neuronal de la drosophile Shaw 2 est inhibé par des concentrations physiologiques de n-alcanols. Ceux-ci se lient probablement à une région formée de 13 acides aminés situés dans la sous-unité formant le pore de la protéine et stabilisent l’état fermé du canal ionique. Des interactions hydrophobes et des forces polaires faibles déterminent la puissance de liaison des alcools à ce site circonscrit. D’ailleurs, la structure α-hélicoïdale de cette région semble critique pour la liaison des alcools et/ou pour l’inhibition allostérique de l’ouverture du canal par les alcanols (Shahidullah et al., 2003).
Les caractéristiques structurelles prédites ci-dessus ont été largement confirmées par des données cristallographiques à propos de complexes protéines-alcools (tableau 1.2). La protéine de liaison d’odorants de la drosophile LUSH sert de modèle pour les sites de liaisons aux alcools. LUSH est une protéine non-enzymatique requise pour les réponses comportementales et électrophysiologiques des neurones olfactifs de la drosophile aux n-alcools. La résolution de la structure cristalline de LUSH en présence de 30-50 mM de différents n-alcools (éthanol, propanol et butanol) a révélé la présence d’un seul site de liaison aux alcools situé dans une cavité hydrophobe d’environ 390 Å3. Cette cavité est remplie de molécules d’eau et se situe entre un ensemble d’hélices-α (Kruse et al., 2003). En plus de plusieurs résidus hydrophobes, ce site de liaison présente un jeu de résidus
polaires qui forment un réseau de ponts hydrogènes avec les alcools et l’eau. Ainsi, le groupe hydroxyle des alcools établis un lien hydrogène fort avec la thréonine 57 (T57) et un plus faible avec la sérine 52 (S52). L’arrangement optimal aurait T57 donnant un lien hydrogène à l’alcool, qui, à son tour, en donne un à S52, tandis que S52 en donne un au groupe carbonyle de la chaîne principale (Thode et al., 2008).
Figure 1.6 – Caractéristiques de base des pochettes de liaison aux alcools dans les protéines. Tiré de (Désy et al., 2012, Toxicology Letters)
Le schéma décrit l’interaction du n-propanol avec un site protéique hypothétique par une liaison hydrogène et des forces de van der Waals. Les résidus hydrophobes (cercles noirs) aux pourtours de la cavité stabilisent la molécule d’alcool par des forces de van der Waals (ombres bleutées). Le site accepteur de liaison hydrogène est représenté par un croissant orange et le lien hydrogène lui-même par une ligne pointillée orange. Le déplacement des molécules d’eau en dehors de la pochette induit par la liaison de l’alcool est indiqué par des flèches pointillées bleues.
Des cavités similaires ont été découvertes par la résolution de la structure cristalline de la G protein-insensitive inwardly rectifying potassium channel (IRK1) et du Gloeobacter
violaceus pentameric ligand-gated ion channel(GLIC) en intéraction avec le 2-méthyl-2,4-pentanediol (MPD) et le propofol/desflurane respectivement (Pegan et al., 2006), (Nury et al., 2011).
Figure 1.7 - Structure moléculaire des composés co-cristallisés en interaction avec des canaux ioniques.
(A) 2-méthyl-2,4-pentanediol; (B) Desflurane; (C) Propofol.
La pochette de liaison aux alcools d’IRK1 est formée par les chaînes latérales d’acides aminés hydrophobes (F47, L232, L245, L330 et Y337) et aussi de résidus permettant la formation d’un réseau de liens hydrogènes entre les groupes hydroxyles du MPD et des groupes carbonyles ou hydroxyles de P244, Y242 et Y337 (Aryal et al., 2009). En ce qui concerne GLIC, il a été montré que le desflurane (un anesthésique général volatil) se trouve enfoui profondément à l’intérieur de la cavité et établi des interactions hydrophobiques avec plusieurs résidus (I201, I202, I258, T255, V242); de plus, son atome d’oxygène se trouve à une distance de pont hydrogène de T255. Le propofol (un anesthésique administré par voie intraveineuse) se situe plus près de l’entrée de la cavité et interagi principalement avec T255 et Y254 par des contacts de van der Waals. Le groupe hydroxyle du propofol pourrait former un lien hydrogène avec Y254 (Nury et al., 2011).
Enfin, le site de liaison aux alcanols de l’alcool déshydrogénase est bien connu : la cavité est de nature hydrophobe comme celle des protéines décrites précédemment, mais elle est la seule qui utilise un atome de zinc pour lier le groupe hydroxyle (Ramaswamy et al., 1994). Cette particularité pourrait expliquer l’affinité de liaison aux alcools substantiellement plus élevée pour cette enzyme, soit environ 1 mM.
Problématique, Hypothèses et Objectifs
Il est désormais bien établi que la consommation d’éthanol a des conséquences sur le système immunitaire. Les expositions aigues et chroniques à cet alcool modifient la réponse immune normale aux pathogènes bactériens et viraux. Cependant, les propriétés immunomodulatrices d’autres alcools à courte chaîne d’usage courant, ou même des alcanols en général, demeurent inconnues. En se basant sur des motifs structuraux, nous avons émis l’hypothèse que l’isopropanol et le méthanol, d’autres alcools à courte chaîne dont l’utilisation est répandue, partageraient les effets immunomodulateurs de l’éthanol lors d’une exposition aigue. Nous nous sommes donc fixés comme objectifs d’examiner les effets immunomodulateurs de l’isopropanol et du méthanol et ensuite d’identifier les mécanismes moléculaires responsables des effets observés.
Les alcanols aliphatiques possèdent des propriétés anesthésiantes qui suivent la règle de Meyer-Overton; c'est-à-dire que leur potentiel anesthésique est corrélé à leur degré d’hydrophobicité. Dans cet ordre d’idée, des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont indiqué que l’isopropanol est plus efficace que l’éthanol pour altérer les fonctions effectrices des lymphocytes T. Par ailleurs, la caractérisation des événements moléculaires responsables des effets neurobiologiques des alcools, tel que l’anesthésie, est beaucoup plus avancée que ce qui est connu concernant leurs effets immunologiques. Ainsi, il a été montré par des études biochimiques et structurelles que les alcools pouvaient lier et moduler l’activité de cibles protéiques comme des canaux ioniques ou des molécules d’adhésion, ce qui explique de façon plausible leurs effets neurobiologiques. Par contre, l’identification de cibles protéiques directes dans les cellules immunitaires ne fait que
commencer; et les possibles impacts des alcools sur les lipides membranaires ne sont pas écartés non plus (Szabo et al., 2007). La majorité de l’information disponible à ce sujet ne concerne d’ailleurs que l’éthanol.
Ces observations nous ont amené à émettre comme seconde hypothèse que, à l’instar de leurs effets anesthésiques, les n-alcanols possèderaient aussi des effets immunomodulateurs corrélés à la longueur de leur chaîne carbonée, respectant ainsi la règle de Meyer-Overton. Les objectifs associés à cette hypothèse étaient, en premier lieu, d’examiner les effets sur la fonction effectrice des lymphocytes T de la série des n-alcanols comprenant de un à douze carbones; et ensuite, de dégager les mécanismes moléculaires à la base de ces effets. Nous avions aussi comme but d’identifier une ou des cibles protéiques d’intérêt immunologique auxquelles les alcanols pourraient se lier.
2. Immunosuppressive effect of isopropanol:
down-regulation of cytokine production results from the
alteration of discrete transcriptional pathways in
activated lymphocytes
Olivier Désy, Damien Carignan, Manuel Caruso, and Pedro O. de Campos-Lima2
Laval University Cancer Research Center, Quebec City, Quebec, G1R 2J6, Canada
Journal of Immunology, 2008 Aug 15;181(4):2348-55.
Running title: Immunosuppressive properties of isopropanol.
Manuscript information: 63,873 characters, 5 figures, 48 references.
Keywords: immunosuppression, alcohol, T lymphocyte, NK cell, isopropanol.
Résumé
L’isopropanol employé couramment pour des usages domestiques et représente la plus importante cause d’empoisonnement aigu aux alcools après l’éthanol. Bien que les effets de l’éthanol sur le système immunitaire aient été abondamment étudiés, il n’existe presqu’aucune donnée au sujet de l’isopropanol. Vu la structure similaire des deux molécules, nous avons émis l’hypothèse que l’isopropanol possédait aussi des propriétés immunomodulatrices. De fait, une exposition aiguë à l’isopropanol in vitro est néfaste pour l’activité des lymphocytes T et des cellules NK à des concentrations aussi faibles que 0,08-0,16% (13-26 mM). Le traitement à l’IPA ne perturbe pas la signalisation précoce en aval du récepteur, mais a un effet reproductible et dose-dépendant sur la translocation nucléaire des facteurs de transcription NFAT et AP-1.
De plus, dans un modèle d’intoxication aiguë à l’isopropanol, les animaux traités à l’alcool subissent une immunosuppression mesurée par la réduction de la présence d’IL-2 et d’IFN-γ dans le sérum en réponse à l’entérotoxine B staphylococcique. L’isopropanol a aussi réduit assez fortement la production de TNF-α de façon à faire survivre des souris à un choc toxique autrement létal induit par l’entérotoxine.
Ces résultats suggèrent que l’isopropanol est potentiellement immunosuppresseur pour les systèmes inné et adaptatif et ils ont une portée significative étant donné l’exposition fréquente de la population à ce produit chimique.
Abstract
Isopropanol (IPA) is widely used in household applications and constitutes a leading cause of acute alcohol intoxication second only to ethanol. Although the effects of ethanol on the immune system have been extensively studied, much less data is available on IPA. Given the structural similarity between the two molecules, we hypothesized that IPA could as well have immune modulatory properties. We report here that acute IPA exposure is detrimental to human T lymphocyte and NK cell activity in vitro in concentrations as low as 0.08-0.16% (13-26 mM). IPA treatment did not affect receptor-mediated early signaling but had a reproducible and dose-dependent effect on the nuclear translocation of the nuclear factor of activated T cells (NFAT) and activator protein-1 (AP-1). Furthermore, we show in a model of acute IPA intoxication that animals became immunosuppressed as judged by their reduced ability to release IL-2 and IFN-γ in the serum in response to the staphylococcal enterotoxin B. This effect was also associated to the down-regulation of TNF-α production and was sufficiently strong to rescue susceptible animals from enterotoxin-induced toxic shock. Our results suggest that IPA is potentially immunosuppressive to the adaptive and innate immune system and have broad significance given the exposure of the general population to this ubiquitous chemical.
Introduction
Short-chain alcohols have a multitude of biological effects, including cardiac and central nervous system depression. In addition, a considerable body of evidence indicates that ethanol is capable of modulating the immune function mediated by T cells, monocytes, macrophages and neutrophils (1-4). Ethanol also inhibits the leukocyte/endothelial cell interaction thereby limiting the inflammatory response (4). Although the in vitro and in vivo effects of ethanol have been well characterized, much less data is available on other alcohols. Isopropanol (IPA) 3 exposure is the second most common cause of acute alcohol intoxication in North America with about 20,000 cases reported each year to poison centers (5). IPA is readily available to most consumers as rubbing alcohol and as an ingredient of hand-sanitizing gels and other commonly used household solutions. In addition, IPA is
widely utilized in hospitals as an antiseptic for surgical scrub and for patient care. Occupational exposure may also occur in numerous industrial applications. Previous studies addressed the impact of IPA exposure on the central nervous system, general hematologic parameters, carcinogenesis, vascular permeability, urinary system, reproduction and development (6-9). However, no detailed analysis of the potential impact of IPA on the immune system is available.
Given the structural similarity between IPA and ethanol, we hypothesized that IPA could also have immune modulatory properties. We report here that IPA is detrimental to human T lymphocyte and NK cell activity in vitro in concentrations as low as 0.08-0.16% w/v (or 13-26 mM). These results were further substantiated in a mouse model of acute IPA intoxication in which animals were immunosupressed as judged by their reduced capacity to produce inflammatory cytokines. This immunosupression was sufficiently strong to protect susceptible animals from superantigen-induced lethal shock. Our results have broad significance taking into account the potential exposure of the general population to this ubiquitous chemical.
Materials and Methods
Cell Isolation, Culture, Activation and Proliferation Analysis
Mononuclear cells were prepared from peripheral blood from healthy volunteers by density gradient centrifugation using Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Written informed consent was obtained from all donors. More than 95% pure populations of human NK cells (CD56+) and T cells (CD8+/CD4+) were obtained by using antibody-based EasySep® separation kits with magnetic nanoparticles according to the manufacturer’s instructions (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Cells were kept in complete medium: RPMI 1640 (Invitrogen Canada, Burlington, Canada) supplemented with 10% heat-inactivated FBS (BioCell Inc., Drummondville, Canada). Isopropanol was purchased from BDH (Toronto, Canada)
In most experiments, T cells were activated for 5 h at 37°C with anti-CD3/CD28 antibody-coated magnetic beads (Invitrogen). When indicated, alternative T cell activation protocols
