LES DIFFERENTS MICROBIOTES DE L’HOLOBIONTE GRAND COREGONE (COREGONUS CLUPEAFORMIS) DANS UN CONTEXTE DE SPECIATION
Thèse Maelle Sevellec Doctorat en biologie Philosophiae doctor (Ph. D.) Québec, Canada © Maelle Sevellec, 2018
LES DIFFERENTS MICROBIOTES DE L’HOLOBIONTE GRAND COREGONE (COREGONUS CLUPEAFORMIS) DANS UN CONTEXTE DE SPECIATION
Thèse
Maelle Sevellec
Sous la direction de :
Louis Bernatchez directeur de recherche Nicolas Derome, codirecteur de recherche
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Résumé
Les animaux ont toujours évolué avec leur microbiote. Toutefois, peu d’études ont analysé le rôle des bactéries sur la spéciation. Il a été démontré que le microbiote oriente la spéciation de son hôte. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer l’influence des bactéries sur la spéciation du grand corégone (Coregonus clupeaformis). Sous certaines conditions, il existe deux espèces de corégone qui ont évolué de façon parallèle ; l’espèce naine et l’espèce normale qui sont caractérisées par des niches trophique et écologique différentes. Plusieurs types d’interaction hôte-bactéries ont été analysés au niveau de populations de corégones sauvages et de corégones captifs, qui ont été élevés dans des conditions identiques. Chez les corégones sauvages, les résultats supportent un effet de parallélisme au niveau de la diversité bactérienne, mais cet effet n’a pas été observé au niveau de la structure des communautés bactériennes entre l’espèce naine et normale. La présence d’un noyau bactérien très conservé au niveau du microbiote intestinal démontre une influence marquée de l'hôte sur ses communautés bactériennes. L’ensemble de ces résultats soulignent la complexité de l'holobionte (hôte + bactéries) en démontrant que la direction de sélection peut différer entre l'hôte et son microbiote. Chez les corégones captifs, la différence de la structure bactérienne chez les nains, les normaux et les hybrides F1 réciproques met en évidence l’influence de l’hôte sur le microbiote. Finalement, cette étude pionnière des communautés bactériennes du grand corégone ouvre la voie à des nouvelles directions de recherche liées à l’évolution de l’holobionte.
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Abstract
Animals have evolved with their microbiota. However, little is known about the role of bacteria over the course of this evolution. These last few years, it has been shown that the microbiota influences speciation by controlling the pre-zygotic and post-zygotic reproductive isolation. The main goal of the thesis is to analysis for the first time the influence of the microbiota on the Lake Whitefish (Coregonus clupeaformis) which represents a continuum in the early stage of ecological speciation. Some species pairs of dwarf (limnetic niche specialist) and normal (benthic niche specialist) evolved in parallel inside several lakes in northeastern North America. Bacterial communities have been compared among five wild sympatric species pairs of whitefish as well as captive dwarf, normal and hybrids whitefish reared in identical controlled conditions. For the wild fish, difference of the bacterial community structure was highlighted in the three studied interactions between the bacterial community and the host: host-pathogen, host-symbiont and host-transient bacteria. Although no parallelism was detected for the bacterial community structure for these interactions, it was highlighted at the bacterial diversity level. Moreover, parallelism was not observed within the bacteria community structure, likely because the water bacterial communities, studied in this thesis, and the biotic and abiotic factors were characterized by important variation between the lake populations of whitefish. Furthermore, results revealed a strong influence of the host (dwarf or normal) on the bacterial communities with pronounced conservation of the core intestinal microbiota. Finally, our result highlighted the complexity of the holobiont (host + bacteria), suggesting that the direction of selection could differ between the host and its microbiota. In fact, three evolutionary directions have been highlighted between the fish and its bacterial communities. For the captive whitefish, an influence of host (normal, dwarf and hybrids) was also detected on bacterial taxonomic composition. Hybrid microbiota was not intermediate and its composition fell outside of that observed in the parental forms. This pioneer study on the bacterial communities of the Lake whitefish opens new research fields related to the evolution of the holobiont.
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Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iiv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ………...vii
Liste des figures ... viii
Liste des abréviations ... iix
Remerciements ... xi
Chapitre 1 : Introduction ... 1
1.1 Le surprenant potentiel des microorganisms ... 2
1.1.1 Chez les animaux et les plantes ... 2
1.1.2 Dans les cycles biogéochimiques ... 2
1.1.3 Découverte des bactéries par l’Homme ... 3
1.2 Les différents types d’interaction hôte-bactéries ... 3
1.3 Le concept de l’hologénome et l’évolution ... 5
1.3.1 Le concept de l’hologénome ... 5
1.3.2 Diversité et abondance du microbiote ... 5
1.3.3 La transmission de génération en génération du microbiote ... 7
1.3.4 Les propriétés du microbiote sur la valeur sélective ... 7
1.4 Evolution de l’holobionte : cas de la spéciation... 8
1.5 Le Grand corégone ... 10
1.6 Objectifs de la thèse ... 12
Chapitre 2 : Microbiome investigation in the ecological speciation context of Lake Whitefish (Coregonus clupeaformis) using next generation sequencing ... 15
2.1 Résumé... 16
2.2 Abstract ... 17
2.3 Introduction ... 18
2.4 Material and methods ... 21
2.5 Results ... 25 2.6 Discussion ... 29 2.7 Conclusion ... 38 2.8 Acknowledgments ... 39 2.9 Data Accessibility ... 40 2.10 Tables ... 41 2.11 Figures ... 46
Chapitre 3 : Holobionts and ecological speciation: the intestinal microbiota of Lake Whitefish species pairs. ... 51
3.1 Résumé... 52 3.2 Abstract ... 53 3.3 Introduction ... 54 3.4 Methods ... 57 3.5 Results ... 61 3.6 Discussion ... 66 3.7 Conclusion ... 73
3.8 Availability of data and material ... 74
3.9 Acknowledgements ... 75
3.10 Tables ... 76
3.11 Figures ... 79
vi
Chapitre 4 : Intestinal microbiota of whitefish (Coregonus sp.) species pairs and their
hybrids in natural and controlled environment. ... 88
4.1 Résumé... 89
4.2 Abstract ... 90
4.3 Introduction ... 91
4.4 Material and methods ... 94
4.5 Results ... 99 4.6 Discussion ... 103 4.7 Conclusion ... 108 4.8 Acknowledgement ... 109 4.9 Tables ... 110 4.10 Figures ... 113 4.11 Supplementary Data ... 119 4.12 Supplementary Tables ... 121 4.13 Supplementary Figures ... 131 Chapitre 5 : Conclusion ... 132 5.1 Principaux résultats ... 133 5.2 Perspectives ... 136 Chapitre 6 : Bibliographie ... 138
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Liste des tableaux
Table 2. 1 :Number of infected and non-infected whitefish for each form in each lake according to the results of double nested PCR. ... 41 Table 2. 2 : PCR primers used for the double nested PCR. ... 42 Table 2. 3 : Statistic values on the number of infected and non-infected whitefish for lake according the results of double nested PCR. ... 43 Table 2. 4 : eighteen pathogenic species of 10 identified putative pathogen genera which were identified using the BLAST algorithm. ... 44 Table 2. 5 : Number of putative pathogens and opportunistic bacteria in whitefish according to 454 sequencing results. ... 45 Table 3. 1 : Number and location of samples, sampling dates, FST and core microbiota for
each species in each lake. ... 76 Table 3. 2 : Summary of weighted Unifrac and the PERMANOVA test statistics. ... 77 Table 3. 3 : Summary of GLM and ANOVA test statistics on the alpha diversity within- and between-lakes of whitefish species microbiota. ... 78 Table S 3. 1 : Steps used to reduce sequencing and PCR errors... 83 Table S 3. 2 : Bacterial taxa found in the PCR negative control. ... 84 Table S 3. 3 :Bacterial species specific to a single whitefish species within lake obtained with Metastats and BLAST. ... 86 Table 4. 1 : Number and locations of samples, sampling dates for each captive and wild whitefish populations or group. ... 110 Table 4. 2 : Summary of PERMANOVA test statistics on microbiota taxonomic composition. ... 111 Table S 4. 1 : Steps used to reduce sequencing and PCR errors... 121 Table S 4. 2 : Matrix of bacterial abundance and Good’s coverage per captive whitefish sample. ... 122 Table S 4. 3 : Summary of ANOVA test statistics on microbiota alpha diversity (inverse Simpson index). ... 124 Table S 4. 4 : Four Metastats tables with details of one-species-specific genera. ... 125
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Liste des figures
Figure 2. 1 : Map of the study area. ... 46 Figure 2. 2 : Plot of bacterial diversity estimated with the Simpson index for all ten populations. ... 47 Figure 2. 3 : Relative abundance of phyla members found in kidney whitefish bacterial community for dwarf and normal whitefish in each lake. ... 48 Figure 2. 4 : Principal components analysis per rank (PCA per rank) of Operational Taxonomic Units (OTU) present in whitefish kidney differentiated by lake. ... 49 Figure 2. 5 : Differences between dwarf and normal whitefish kidney in selected pathogenic genera. ... 50 Figure 3. 1 : Taxonomic composition at the phylum and genus levels. ... 79 Figure 3. 2 : Principal coordinate analyses (PCoAs) of all the bacterial communities. ... 80 Figure 3. 3 : Network analysis of intestinal microbiota for dwarf and normal whitefish within- and between-lakes... 81 Figure 3. 4 : Heatmap of relative abundances of the most important metabolic pathways inferred by PICRUSt in the whitefish intestinal microbiota for each sample in all lakes. ... 82 Figure 4. 1 : Network analysis of intestinal microbiota of dwarf and normal wild whitefish and intestinal microbiota of dwarf, normal and hybrids captive whitefish. ... 113 Figure 4. 2 : Relative abundance of phyla representatives found in intestinal microbiota for dwarf and normal wild whitefish in each lake as well as in intestinal microbiota for dwarf, normal and hybrids captive whitefish. ... 114 Figure 4. 3 : Discriminant analysis histogram off all wild whitefish species microbiota. ... 115 Figure 4. 4 : Principal coordinate analyses (PCoAs) within- and between-lake of wild whitefish species microbiota. ... 116 Figure 4. 5 : Principal coordinate analyses (PCoAs) between the microbiota of the four captive whitefish groups. ... 117 Figure 4. 6 : Metastats results on dwarf, normal and hybrids captive whitefish... 118 Figure S 4. 1 : Network analysis of intestinal microbiota of dwarf and normal wild whitefish and intestinal microbiota of dwarf, normal and hybrids captive whitefish. ... 131
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Liste des abréviations
ANOVA Analysis of variance
PCoA Principal Coordinates Analysis
RNA Ribonucleic acid (Acide ribonucléique) 16s rRNA 16S ribosomal RNA
BDM Bateson-Dobzhansky-Muller
BKD Bacterial kidney disease
BLAST algorithm Basic local alignment search tool CO2 Carbon dioxide (dioxyde de carbone) DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
DNA Deoxyribonucleic acid
Fst Fixation index
GLM Generalized linear model
KO KEGG Orthology
MCMC Markov Chain Monte Carlo MID-tags Multiplex identifiers
MS-222 Tricaine Methanesulfonate
mtDNA Mitochondrial DNA
NLME Mixed effects linear random model NMS Nonmetric Multidimensional Scaling OTU Operational taxonomic unit
PAUS Pea aphid U-type symbiont PCA Principal component analysis
PCR Polymerase chain reaction (réaction en chaîne par polymérase) PERMANOVA Permutational analysis of variance
PICRUSt Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States
QTL Quantitative trait locus RDP Ribosomal Database Project
RFLP Restriction fragment length polymorphism TGGE Temperature gradient gel electrophoresis YBP Years before present (années avant ce jour)
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À ma sœur, Auregan Sevellec pour m’avoir montré ce qu’était le courage À mon grand-père, Pierre Le Douaran pour m’avoir appris à saisir les opportunités de la vie
« The microbial world is a sleeping giant of biology »
xi
Remerciements
Il y a quelques années, je n’aurais jamais songé faire un doctorat. Je ne pensais pas avoir le caractère, ni les compétences intellectuelles et pourtant aujourd’hui, j’écris ces lignes … Et tout cela, c’est grâce à toi Louis. Merci Louis Bernatchez pour m’avoir donné cette liberté de tâtonner, de reculer, de réussir à faire des découvertes surprenantes et inattendues ! Merci de m’avoir soutenu durant tout le temps de ce long doctorat ! Merci de m’avoir fait confiance ! Merci pour la maturité apportée par ce doctorat et qui fait de moi une meilleure personne. Merci de m’avoir donné cette chance.
Je voudrais aussi remercier mon codirecteur, Nicolas Derome. Merci pour ton soutien, tes suggestions et ton enthousiasme pour ce projet malgré mon côté farouche !
J’aimerais aussi remercier les membres de mon comité d’encadrement : Steve Charette, Marie Filteau, Christian Landry et Julie Turgeon. Merci pour votre confiance aux différentes étapes de ce doctorat et pour vos suggestions.
Je souhaiterais remercier spécialement trois personnes, Anne Dalziel, Bérénice Bougas et Julie Grasset. Sans vous, je ne me serais pas lancée dans cette folle aventure et surtout je n’y serais pas restée.
Je voudrais également remercier mes plus proches collaborateurs, sans qui cette thèse n’existerait probablement pas. Scott Pavey, Sébastien Boutin, Éric Normandeau, Martin Laporte, Guillaume Côté et Cécilia Hernandez, merci à vous tous.
Merci aussi à tous les anciens et les nouveaux membres du laboratoire Bernatchez ! Les membres du laboratoire vont et viennent mais l’ambiance, la coopération et le soutien sont toujours les mêmes ! J’aimerais tout particulièrement remercier Anaïs Lacoursière-Roussel, Anne-Laure Ferchaud, Fabien Lamaze, Ben Sutherland, Anne-Marie Dion-Côté, Amanda Xuereb, Clément Rougeux, Alex Bernatchez et Jérémy Gaudin.
Il me reste à remercier également tous les organismes qui m’ont soutenu financièrement : le département de biologie de l’Université Laval, Québec-Océan et l’IBIS.
Je ne serais jamais arrivée à cette étape sans eux… Merci maman, depuis toute petite, tu me soutiens comme personne, tu me pousses toujours plus haut et ça fonctionne. J’ai la chance d’avoir une famille géniale, merci Boris Thomas, Patrick Sevellec, Auregan Sevellec, Elouenn Sevellec, Jacqueline Le Douaran, et Pierre Le Douaran d’avoir toujours été là pour moi. Aucun mot ne suffit à vous exprimer ma gratitude.
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Avant-propos
Cette thèse est organisée en 5 chapitres, incluant l’introduction générale (Chapitre 1) et la conclusion (Chapitre 5). Les chapitres 2, 3 et 4 sont publiés, soumis ou en voie d’être soumis dans des revues scientifiques.
Le chapitre 2 est publié sous la référence : Sevellec M, Pavey S A, Boutin S, Filteau M, Derome N, Bernatchez L. 2014. Microbiome investigation in the ecological speciation context of lake Whitefish (Coregonus clupeaformis) using next generation sequencing. Journal of Evolutionary Biology 27 : 1029–1046.
LB a conçu et a supervisé le projet. SAP a échantillonné. MS a produit les données. MS, SAP, SB et MF ont analysé les données. MS a écrit le manuscrit en collaboration avec SAP, ND et LB.
Le chapitre 3 a été accepté par la revue Microbiome : Sevellec M, Derome N, Bernatchez L. Holobionts and ecological speciation : the intestinal microbiota of Lake Whitefish species pairs.
MS et LB ont conçu le projet. LB a supervisé le projet. MS a échantillonné, a produit les données, a analysé les données. MS a écrit le manuscrit en collaboration avec ND et LB. Le chapitre 4 n’a pas encore été soumis: Sevellec M, Laporte M, Bernatchez A, Derome N, Bernatchez L. Investigation of the intestinal microbiota within a host under speciation in natural and controlled environment: the case of the Lake Whitefish pairs and hybrids. MS et LB ont conçu le projet. LB a supervisé le projet. MS et ML ont échantillonné. MS et AB ont produit les données, MS et ML ont analysé les données. MS a écrit le manuscrit en collaboration avec ML, ND et LB.
En plus de ces trois chapitres, je suis premier et second auteur de deux articles publiés au cours de mes travaux de doctorat :
Sevellec M, Boutin S, Pavey S A, Bernatchez L, Derome N. 2012. A fast, highly sensitive double-nested PCR-based method to screen fish immunobiomes. Molecular Ecology Resources 12: 1027-1039.
Pavey S A, Sevellec M, Adam W, Normandeau E, Lamaze F C, Gagnaire P-A., Filteau M, Herber F O, Maaroufi A, Bernatchez L. 2013. Nonparallelism in MHCIIβ diversity
xiii
clupeaformis) species pairs as revealed by next-generation sequencing. Molecular Ecology 22: 3833–3849
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Chapitre 1 : Introduction
2 1.1 Le surprenant potentiel des bactéries
« La terre est une planète microbienne où les macroorganismes sont un ajout récent » (Mark L. Wheelis (Woese 1998)). En effet, les dernières estimations indiquent que l’apparition des Procaryotes a eu lieu il y a 3.9 milliards d’années et celles des Eucaryotes il y a 1.8 milliards d’années (Parfrey et al. 2011; Wacey et al. 2011).
1.1.1 Chez les animaux et les plantes
À ce jour, il n’existe pas dans la nature des animaux ou des plantes sans microbiote. Le microbiote, dans le cadre de cette thèse, est défini comme l’ensemble de la communauté bactérienne présente sur un organisme hôte. Les autres microorganismes, bien que jouant un rôle tout aussi important que les bactéries au sein d’un hôte ne seront pas abordés ici. Les animaux et les plantes ont donc évolué, évoluent et vont évoluer avec leur microbiote (Rawls et al. 2006). De plus, quelques indices laissent à penser que les Eucaryotes ont évolué à partir des Procaryotes. Les Eucaryotes utilisent les mêmes réactions biochimiques élémentaires que les Procaryotes (Rosenberg & Zilber 2016). Environ 60% des gènes humains sont homologues aux gènes procaryotes (Domazet 2008). En outre, la théorie de l’endosymbiose, bien que controversée, suggère que la cellule eucaryote provient de l’incorporation d’un procaryote dans un autre procaryote (Sagan 1967). L’avènement du séquençage de nouvelle génération a eu un énorme impact sur le monde microbien permettant de révéler le rôle considérable des bactéries. Chez l’Homme, le ratio entre le nombre de cellules humaines et le nombre de cellules bactériennes a récemment été estimé à 1:1. Il y a donc autant de cellules bactériennes que de cellules humaines (Sender et al. 2016). Ces bactéries interviennent au niveau de la régulation du système immunitaire, éliminent les agents pathogènes potentiels, extraient l’énergie de la nourriture, synthétisent des vitamines essentielles et des cofacteurs, améliorent les fonctions intestinales, inhibent certaines toxines et facteurs cancérigènes (Qin et al. 2010; Consortium 2012; Enders & Enders 2015).
1.1.2 Dans les cycles biogéochimiques
Les bactéries interviennent aussi dans l’environnement comme par exemple, dans les cycles biogéochimiques, dans la composition de l’atmosphère. Elles influencent le climat,
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participent au recyclage de certains nutriments et de la décomposition de certains polluants (Huse et al. 2008). Sans cette régulation bactérienne, la vie multicellulaire telle qu’on la connait serait impossible. De plus, il a été récemment démontré que certaines bactéries étaient capables de métaboliser 99% du méthane en dioxyde de carbone (CO2).
Le méthane a un pouvoir de réchauffement de 25 fois plus puissant que le CO2 et des
milliards de mètres cubes sont emprisonnés sous les glaces de l’Arctique et l’Antarctique. La libération de ce méthane suite au réchauffement climatique pourrait significativement amplifier ce phénomène (Michaud et al. 2017). Ainsi, les bactéries peuvent également intervenir dans l’atténuation du réchauffement climatique.
1.1.3 Découverte des bactéries par l’Homme
La première observation des bactéries par l’Homme eu lieu en 1683 par Antonie Van Leeuwenhoek qui observa, à l’aide d’un microscope, des bactéries buccales. Cependant, dès 1546 Girolamo Fracastoro suggère que des microorganismes peuvent être un facteur de maladie (Prescott et al. 2003). Au 19ème siècle deux écoles de microbiologie émergent
(Rosenberg & Zilber 2013) :
• L’école de Robert Koch et de Louis Pasteur se focalisant sur la lutte contre les bactéries pathogènes entrainant des incroyables découvertes comme les vaccins et les antibiotiques.
• L’école de Sergueï Vinogradski et de Martinus W. Beijerinck se focalisant sur les bénéfices que les bactéries peuvent apporter notamment en écologie. De nos jours, même si beaucoup d’études médicales se concentrent sur les bactéries pathogènes, de plus en plus d’études analysent les interactions bénéfiques des bactéries sur leur hôte.
1.2 Les différents types d’interaction hôte-bactéries
Il existe différentes interactions hôte-bactéries qui dépendent du type de la souche bactérienne mais également du type d’hôte. Par exemple, une bactérie pathogène chez un hôte ne sera pas obligatoirement pathogène chez une autre espèce hôte. Seuls les trois types d’interactions hôte-bactéries principales seront développées ici.
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Il y a encore quelques années, les bactéries commensales étaient considérées comme faisant partie d’un processus unidirectionnel où elles tiraient avantage de l’hôte sans que celui-ci soit affecté (Prescott et al. 2003). Cependant, les bactéries commensales protègent l’hôte contre les bactéries pathogènes en échange d’un milieu protégé et de nutriments. En effet, les bactéries commensales occupent les sites de fixation ne permettant pas aux bactéries pathogènes de se fixer sur l’hôte (Rosenberg & Zilber 2013). Bien qu’elle ne soit pas neutre, cette interaction n’est pas coûteuse pour l’hôte ou les bactéries. Une souche bactérienne commensale peut survivre sans son hôte et en absence de cette souche, l’hôte favorisera la fixation d’une autre espèce bactérienne commensale (Alberdi et al. 2016; Macke et al. 2017). De plus, de nombreuses études montrent que les bactéries commensales coopèrent avec le système immunitaire de l’hôte (Arpaia et al. 2013).
La grande différence entre les bactéries commensales et les bactéries symbiotiques est la durée de l’interaction. Il existe une relation durable entre les bactéries symbiotiques et leur hôte. De plus, il arrive que l’hôte et les bactéries symbiotiques dépendent métaboliquement l’un de l’autre. Cette relation est autant bénéfique pour les deux protagonistes (Prescott et al. 2003). Un exemple bien connu est celui du ver tubicole géant (Riftia pachyptila) et de son symbionte composé de Gammaprotéobactéries. Ce ver vit dans les fonds marins, à proximité des cheminées hydrothermales. Ces dernières rejettent du liquide ayant une forte concentration en sulfure d’hydrogène. Le ver absorbe le sulfure d’hydrogène qui est métabolisé par les bactéries symbiotiques en matière organique (le malate et le succinate) qui sont les nutriments du ver (Klose et al. 2016).
Le dernier type d’interaction est la relation hôte pathogène conduisant aux maladies infectieuses. Il existe des agents pathogènes primaires qui causent la maladie chez un hôte sain par interaction directe. Il existe des agents pathogènes opportunistes qui font partie du microbiote normal de l’hôte. Ces derniers deviennent pathogènes dans certaines conditions, notamment si le système immunitaire de l’hôte s’affaiblit (Prescott et al. 2003). Lewis Thomas remarqua que « Le pouvoir pathogène n’est pas la règle. En effet, il est si peu fréquent et n’implique qu’un si petit nombre d’espèces dans l’immense population des bactéries, qu’il a un aspect insolite. La maladie résulte généralement de négociations symbiotiques peu concluantes, un dépassement de la ligne d’un côté ou de l’autre, une mauvaise interprétation biologique des frontières ». Il est généralement admis que la
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relation hôte pathogène se termine soit par l’extermination de l’un des protagonistes soit par une évolution en une interaction commensaliste ou symbiotique (Rosenberg & Zilber 2013).
1.3 Le concept de l’hologénome et l’évolution
Les variations génétiques sont les principaux facteurs permettant l’évolution. Chez les animaux et les plantes, ces variations génétiques sont la conséquence de plusieurs processus comme la reproduction sexuée, les réarrangements chromosomiques, l’épigénétique et la mutation de l’hôte (Thomas et al. 2010). Cependant, les animaux et les plantes sont encore plus complexes et hébergent des milliards de microorganismes. Ces derniers ont aussi des mécanismes permettant des variations génétiques. Ainsi pour avoir une vue holistique de l’évolution des animaux et des plantes, il est nécessaire d’inclure leur microbiote. L’holobionte est le terme employé pour décrire l’hôte ainsi que son microbiote. Et l’hologénome est la somme de l’information génétique de l’holobionte comprenant le génome de l’hôte et le microbiome (somme de l’information génétique du microbiote).
1.3.1 Le concept de l’hologénome
Le postulat du concept de l’hologénome est que l’holobionte (hôte + microbiote) fonctionne comme une seule et même entité biologique face à la sélection naturelle. Le concept de l’hologénome est composé de trois principes (Rosenberg & Zilber 2016) :
• Tous les êtres multicellulaires comprennent un microbiote abondant et diversifié. Souvent, le nombre de microorganismes ou la somme de leur information génétique est supérieur aux nombres de cellules et de gènes de l’hôte.
• L’hologénome est transmis de génération en génération avec une conservation partielle du microbiome permettant le maintien des propriétés de l’holobionte. • Le microbiote et son hôte interagissent de manière à influencer la valeur
sélective de l’holobionte.
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La diversité et l’abondance microbienne au sein de l’holobionte dépendent de la variété des sites de fixation pour les bactéries des différents tissus, de l’activité du système immunitaire et des changements des conditions environnementales, incluant l’état physiologique de l’organisme hôte. Il existe un noyau stable au sein du microbiote qui est composé d’espèces bactériennes communes à tous les individus d’une espèce hôte. La plupart du temps, les bactéries du noyau stable sont présentes en grand nombre. À l’opposé, il existe un non-noyau du microbiote qui inclut les espèces bactériennes qui sont facilement échangeables et qui varient en fonction des conditions environnementales (Rosenberg & Zilber 2013; 2016).
Ce sont cette diversité et cette abondance du microbiote qui permettent à l’holobionte d’acquérir trois autres mécanismes de variations génétiques. Premièrement, l’amplification microbienne est le mode de variation le plus rapide face à des changements tels que la disponibilité des nutriments ou de la température ou l’exposition aux antibiotiques ou un changement environnemental (Rosenberg & Zilber 2013; 2016). L’amplification de certaines bactéries et la diminution d’autres influencent le réservoir de gènes bactériens, qui permet une adaptation rapide aux nouvelles conditions. Par exemple, les enfants ayant une alimentation riche en fibre ont un microbiote intestinal dominé par les genres Prevotella et Xylanibacter permettant l’hydrolyse de la cellulose et du xylane. Ces genres bactériens sont absent dans le microbiote intestinal des enfants ayant une alimentation riche en glucide (De Filippo et al. 2010).
Deuxièmement, la variation génétique provient également des bactéries acquises de l’environnement. Au vu des milliards de bactéries avec lesquelles les hôtes sont en contact, il est raisonnable de considérer qu’une bactérie provenant de l’environnement peut coloniser de manière définitive un hôte. De plus, sous certaines conditions favorables, cette bactérie nouvellement acquise, peut amplifier et affecter le phénotype de l’hôte. Il est cependant difficile de distinguer si une bactérie provient de l’environnement ou est déjà présente de manière mineure chez son hôte.
Finalement, le dernier type de variation est le transfert horizontal de gènes, se définissant par un mouvement de matériel génétique d’un organisme donneur à un autre organisme receveur. L’organisme receveur n’est pas le descendant de l’organisme donneur. Ces transferts de matériels génétiques peuvent se faire de bactérie à bactérie mais aussi de bactérie à son hôte. Chez l’humain, 145 gènes sont attribués au transfert horizontal de gènes dont la plupart ont pour origine des bactéries ou des protistes (Crisp et al. 2015).
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Ce mécanisme est particulièrement puissant pour générer de la variation dans le réservoir de gènes.
Ces trois mécanismes de variations génétiques dus aux bactéries sont rapides et sensibles au changement de l’environnement. Alors que l’évolution des gènes de l’hôte est lente et moins sensible à l’environnement (Alberdi et al. 2016; Macke et al. 2017).
1.3.3 La transmission de génération en génération du microbiote
Durant ces dernières années, il est devenu évident que le microbiome est transmis de façon verticale, notamment par la mise en évidence du noyau du microbiote au sein de nombreuses espèces hôtes. Il existe beaucoup de méthodes de transmission du microbiome de génération en génération. Chez les humains, le microbiome est majoritairement transmis par contact direct pendant et après la naissance entre l’enfant et ses parents (Blaser & Falkow 2009; Gilbert 2014). Chez certains Mammifères comme les éléphants, les koalas ou les hippopotames, la progéniture mange les fèces de leur mère pour l’acquisition de bactéries (Rosenberg & Zilber 2013). Beaucoup d’oiseaux nourrissent leur progéniture par régurgitation permettant la transmission de la nourriture mais aussi des bactéries (Rosenberg & Zilber 2013). Les poissons apposent des composés antimicrobiens sur leurs œufs qui permettent de sélectionner les bactéries. Elles seront les premières à coloniser les poissons après l’éclosion (Hanif et al. 2004; Wilkins et al. 2015). Les bactéries peuvent aussi être recrutées et transmises via l’environnement par l’eau, l’air et la nourriture partagés entre la progéniture et les parents (Rosenberg & Zilber 2016). Même si ce n’est pas le microbiome qui est transmis mais une espèce bactérienne, certaines bactéries sont transmises par les cellules reproductives de l’hôte comme le genre Wolbachia. Wolbachia est un endosymbionte présent dans une large proportion d’insectes et maternellement transmise par les œufs (Brucker & Bordenstein 2012b).
1.3.4 Les propriétés du microbiote sur la valeur sélective
« Ce n’est pas l’espèce la plus forte ou la plus intelligente qui va survivre mais celle qui est la plus réactive aux changements » (Darwin 1909). Cette citation de Charles Darwin correspond parfaitement au potentiel adaptatif des bactéries. L’adaptation rapide aux changements des bactéries peut augmenter la valeur sélective de l’holobionte.
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La contribution la plus générale et la plus importante du microbiote est la protection contre les pathogènes. Les animaux gnotobiotiques, qui ne possèdent pas de microbiote, qui sont nés et ont grandi dans un milieu stérile, sont beaucoup plus sensibles aux infections et meurent de façon systématique s’ils ingèrent des agents pathogènes (Formal et al. 1961; Shanmugam et al. 2005). De plus, certains processus métaboliques, qui ne peuvent pas être effectués par l’hôte, sont réalisés par son microbiote. Par exemple, certains animaux ne pourraient pas puiser l’énergie de leur alimentation sans leur microbiote. Le Termite se nourrit de bois qu’il peut digérer parce qu’il possède un microbiote permettant la fermentation de la lignine et de l’hémicellulose (Brune 2012). Chez l’Humain, le microbiote synthétise et excrète des vitamines en excès pour subvenir au besoin de son hôte. En outre, le microbiote protège aussi l’hôte contre les molécules toxiques provenant de l’environnement comme les métaux lourds, de certains champignons et de plantes toxiques (Monachese et al. 2012).
Le microbiote influence aussi le développement des animaux et leur comportement. En effet, chez les Vertébrés, la comparaison entre des animaux conventionnels et gnotobiotiques a permis de montrer une divergence d’expression de centaines de gènes (Hooper et al. 2001; Rawls & Samuel 2004). Ces gènes induits par le microbiote permettent le développement complet du système immunitaire et du système digestif (Ley et al. 2006; Lee & Mazmanian 2010). Il a aussi été démontré que le microbiote intestinal peut influencer le cerveau par modulation des hormones influant le nerf vague (Heijtz et al. 2011). De plus, ces influences du microbiote sur le cerveau de l’hôte modifient son comportement. Les souris gnotobiotiques sont plus actives, moins anxieuses et prennent plus de risque que les souris conventionnelles. Si un microbiote est inoculé aux souriceaux gnotobiotiques, le comportement redevient celui d’une souris conventionnelle. Cependant ce changement de comportement ne fonctionne pas suite à l’inoculation d’un microbiote sur des souris gnotobiotiques adultes (Foster & Neufeld 2013). Le microbiote influencerait donc aussi le développement du cerveau de l’hôte. En outre, le microbiote est également moduler les molécules odorantes de leur hôte et ainsi jouer un rôle dans le choix du partenaire sexuel (Rosenberg & Zilber 2013).
1.4 Evolution de l’holobionte : cas de la spéciation
La spéciation est un processus évolutif permettant la formation de nouvelles espèces distinctes (Cook 1906). Ainsi, la biodiversité de cette planète est générée par la spéciation.
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Lors de ce processus, des barrières reproductives se mettent progressivement en place permettant l’apparition de lignées évolutives génétiquement divergentes. Il existe plusieurs mécanismes conduisant à l’élévation des barrières reproductives au sein d’une population comme la spéciation dite allopatrique où la séparation est due à un obstacle physique comme un cours d’eau ou un relief. La population d’origine est ainsi divisée en deux populations ne pouvant plus partager leur réservoir de gènes (Thomas et al. 2010). Un autre mécanisme de spéciation peut avoir lieu par la colonisation d’une nouvelle niche où des individus fondateurs se séparent de la population mère pour coloniser une nouvelle niche trophique ou écologique. Cette niche peut être isolée comme, par exemple, une île ou bien adjacente à la niche de la population mère mais soumise à d'autres pressions de sélection. C’est la spéciation péripatrique ou parapatrique (Thomas et al. 2010). Pour ce type de mécanisme, un cas de spéciation dû au microbiote a été rapporté. Une bactérie endosymbiotique facultative nommée ‘pea aphid U-type symbiont’ (PAUS) permet aux pucerons verts du pois (Acyrthosiphon pisum) l’acquisition d’un nouveau phénotype lui permettant de coloniser une nouvelle niche trophique. En effet, les bactéries PAUS confèrent à leur hôte la possibilité de digérer de la luzerne (Medicago sativum). Cette nouvelle colonisation a amené la population de pucerons possédant cette bactérie à diverger de la population d’origine (Tsuchida et al. 2004). Le dernier mécanisme de spéciation est la spéciation sympatrique où une divergence se crée au sein d’une population sans aucune séparation physique (Thomas et al. 2010). Dans ce cas, l’apparition d’un nouveau caractère chez certains individus les isole de la population d’origine alors que le contact physique est toujours possible. Cette divergence provient souvent de préférences dans l'accouplement. En 1989, il a été mis en évidence qu’au sein d’une même population de Drosophila melanogaster, les mouches élevées sur de la mélasse s’accouplaient avec des ‘mouches à mélasse’ et que les mouches élevées sur de l’amidon s’accouplaient avec des ‘mouches à amidon’. Le nombre de génération étant trop court pour venir d’une divergence de l’hôte mouche, les chercheurs ont donné des antibiotiques aux mouches, dans le but de tester l’implication du microbiote. En présence d’antibiotique, les mouches ont arrêté la préférence d’accouplement mélasse-mélasse et amidon-amidon. En effet, le choix du partenaire chez Drosophila melanogaster dépend de la présence ou de l’absence de Lactobacillus plantarum qui modifie les niveaux de phéromones sexuelles de la mouche (Sharon et al. 2011). Le microbiote peut donc influencer la préférence d'accouplement et ainsi peut aussi influencer la spéciation sympatrique.
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Il est maintenant bien établi que les bactéries contribuent à l'odeur des animaux, même celle des poissons. Or les odeurs ont un rôle déterminant dans le choix du partenaire sexuel. Il existe deux mécanismes permettant au microbiote de moduler la préférence d’accouplement. Le microbiote peut produire des molécules chemosensorielles ou, comme vu précédemment, en modulant les molécules odorantes de l’hôte (Brucker & Bordenstein 2012b; Damodaram et al. 2016; Shropshire & Bordenstein 2016). Le microbiote influence donc les barrières pré-zygotiques mais il peut aussi influencer les barrières post-zygotiques. Le modèle de spéciation Bateson-Dobzhansky-Muller (BDM) stipule que si deux populations d’une même espèce évoluent de façon isolée l’une de l’autre, des incompatibilités génétiques apparaissent induisant de la mortalité hybride ou de la stérilité hybride (Dobzhansky, 1937; Muller, 1942). L’introduction du microbiote au sein de ce modèle accélère l’incompatibilité génétique (Brucker & Bordenstein 2012a; b). Brucker et al. (2012) ont croisé deux espèces de guêpe Nasonia (Nasonia vitripennis et Nasonia giraulti) afin de créer des larves d’hybride F2 élevées en présence de leur microbiote (élevage conventionnel) et sans leur microbiote (élevage gnotobiotique). La mortalité des F2 est clairement plus importante avec le microbiote (élevage conventionnel) que sans le microbiote. Aucune mortalité n’a été recensée chez les larves ayant un microbiote et appartenant à Nasonia vitripennis ou Nasonia giraulti. Cette expérience prouve donc l’accélération du modèle BDM par le microbiote, entrainant la mortalité hybride. De plus, il est connu que les hybrides sont plus sensibles aux maladies infectieuses dues à la rupture d’association entre gènes du système immunitaire (Burke & Arnold 2001; Dhanasiri et al. 2011). Des bactéries pathogènes ou opportunistes provenant de l’environnement pourront alors provoquer plus facilement une infection. Cependant, la rupture de l’association des gènes de l’immunité peut aussi entrainer un déséquilibre microbiote-hôte pouvant mener le microbiote de l’hybride à infecter son hôte. Ce phénomène peut contribuer à la réduction de la valeur sélective de l’hybride. L’holobionte étant encore peu étudié dans un contexte évolutif, d’autres processus influençant l’hôte dans un contexte de spéciation restent à découvrir.
1.5 Le Grand corégone
Les Corégonidés appartiennent à la famille des Salmonidés et sont distribués de façon circumpolaire dans l’hémisphère nord. La plupart des Corégonidés vivent dans des
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rivières où dans des habitats lacustres, comme le grand corégone (Coregonus clupeaformis).
Le grand corégone est un poisson distribué en Amérique du nord qui comprend deux espèces sympatriques référées comme l’espèce naine et l’espèce normale résultant d’une récente divergence adaptative. Le grand corégone est ainsi actuellement en voie de spéciation. En effet, les populations de grand corégone ont été isolées géographiquement lors d’une ère glaciaire au cours du Pléistocène qui a recouvert de glace le Canada et une partie des États-Unis. Cet isolement a mené à la divergence génétique de l’espèce en fonction des refuges glaciaires notamment le refuge glaciaire Acadien et Atlantique. Un contact secondaire entre les lignées acadiennes et atlantiques s’est produit, il y a 12 000 ans, dans au moins 6 lacs du bassin de la Rivière Saint-Jean au sud-est du Québec. Les divergences génétiques et l’opportunité de coloniser une niche trophique différente ont permis la divergence adaptative du corégone nain. Il a ainsi divergé en sympatrie de l’espèce ancestrale benthique, représentée par le corégone normal, pour devenir une espèce limnétique typique, appelée corégone nain (Lu & Bernatchez 1999; Bernatchez et al. 2010).
De plus, une évolution parallèle a eu lieu pour le grand corégone. Le phénomène d’évolution parallèle se produit quand deux espèces indépendantes l’une de l’autre développent des phénotypes similaires dans un écosystème similaire. Ainsi les corégones nains et normaux ont respectivement un phénotype similaire et diffère génétiquement, morphologiquement, physiologiquement, métaboliquement, écologiquement mais aussi au niveau du comportement (Bernatchez et al. 2010; Jeukens et al. 2010; Pavey et al. 2013; Dalziel et al. 2015; Laporte et al. 2016). En effet, le grand corégone normal est un poisson benthique se nourrissant de proies diverses comme des mollusques et du zooplancton, présentant une croissance rapide, une maturité tardive et une longue durée de vie (Bodaly 1979; Landry & Bernatchez 2010). À l’opposé, le corégone nain est un poisson limnétique, se nourrissant presque exclusivement de zooplancton, présentant une faible croissance, une maturité rapide et une durée de vie courte par rapport à l’espèce normale (Bodaly 1979; Bernatchez et al. 1999). L’évolution parallèle a aussi été mise en évidence par des études transcriptomiques qui ont également montré une différence d’expression génique importante entre les espèces naine et normale. Le corégone nain montre une surexpression des gènes impliqués dans la fuite face aux prédateurs alors que le
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corégone normal montre une surexpression des gènes impliqués dans la croissance (StCyr et al. 2008; Bernatchez et al. 2010).
Les espèces de corégone nain et normal sont actuellement partiellement isolées au niveau reproductif (Gagnaire et al. 2013) et des croisements contrôlés entre les nains et les normaux sont possibles. Beaucoup d’hybrides F1 résultant de ce croisement connaissent une mortalité embryonnaire élevée (50-70%) ou un développement anormal (10-30%) suggérant l’élévation de barrières post-zygotiques (Renaut et al. 2009; Dion-Cote et al. 2014).
Le grand corégone est un modèle étudié depuis des années. Les différences, à tous les niveaux biologiques, entre les deux espèces de corégone en font un excellent système pour étudier le microbiote dans un contexte de spéciation.
1.6 Objectifs de la thèse
L’objectif général de cette thèse est de tester l’implication du microbiote dans le phénomène de spéciation via un hôte particulièrement étudié, le grand corégone. Pour cela, les bactéries potentiellement impliquées dans le processus de spéciation ont été étudiées en recherchant la présence de bactéries spécifiques à une forme de corégone dans différents microbiotes ou communautés bactériennes. En effet, nous avons étudié trois communautés bactériennes ayant trois niveaux d’interactions avec l’hôte. Dans un premier temps, nous avons analysés la communauté bactérienne du rein, nous permettant de tester la relation hôte-pathogène de l’holobionte grand corégone. Puis, dans un deuxième temps, nous avons étudié le microbiote intestinal adhérent à la paroi intestinale, nous permettant d’analyser une relation de type hôte-symbionte. En effet, ces bactéries qui aident le corégone à la digestion des aliments sur de longues périodes de temps peuvent être considérées comme des symbiontes (Rosenberg & Zilber 2013). Enfin, nous avons étudié le microbiote intestinal non-adhérent à la paroi, nous permettant d’analyser une relation hôte-microbiote plus neutre que la relation hôte-symbionte.
De plus, la description des différentes compositions taxonomiques bactériennes trouvées chez le grand corégone est une étape très importante pour mieux comprendre les relations hôte-microbiotes. Bien que les Poissons soit le groupe le plus diversifié des Vertébrés, il existe encore trop peu d’études sur le microbiote des poissons, en particulier chez les poissons sauvages (Pascoe et al. 2017). Par ailleurs, encore moins d’études se
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sont focalisées sur le microbiote dans un contexte de spéciation chez le poisson alors que la spéciation est le processus évolutif par lequel est générée la biodiversité (Hata et al. 2014; Sevellec et al. 2014; Baldo et al. 2015; Smith et al. 2015; Sullam et al. 2015; Baldo et al. 2017).
Dans le deuxième chapitre, nous avons analysé les communautés bactériennes du rein des deux espèces du grand corégone sauvage par séquençage 454 du gène de la sous-unité 16S de l’ARN ribosomique. Le rein ayant une fonction immunitaire importante chez les Téléostéens, la présence de bactéries, dont les souches pathogènes, peut y être détectée chez les poissons valétudinaires. Notre premier objectif était de tester l’existence d’une différence d’infection entre les espèces au sein des lacs étudiés. Puis nous voulions tester l’existence de parallélisme au niveau du taux d’infection entre les deux espèces du grand corégone. Enfin, nous voulions également référencer les genres bactériens impliqués dans l’infection des espèces de corégone ou présent au sein des lacs. En effet, les espèces sympatriques du grand corégone ayant des niches écologique et trophique différentes, notre hypothèse était que les deux espèces de corégone ne sont pas en contact avec les mêmes pathogènes.
Dans le troisième chapitre, nous avons analysé le microbiote intestinal adhérent des deux espèces de grand corégone sauvage par séquençage Illumina du gène de la sous-unité 16S de l’ARN ribosomique. Ce microbiote stable peut interagir plus étroitement avec l’hôte que les autres bactéries intestinales. En outre, chez les Vertébrés, le microbiote intestinal est le microbiote qui possède la plus grande influence sur son hôte (Alberdi et al. 2016; Macke et al. 2017). Dans la majorité des cas, le changement de régime alimentaire, comme c’est le cas chez le grand corégone, semble être la principale force motrice de l’évolution. Aux vues de ces connaissances, nous voulions, dans un premier temps, savoir s’il existait des microbiotes intestinaux différents entre les espèces et/ou entre les populations de lacs. Puis nous avons testé l’hypothèse de parallélisme entre les microbiotes intestinaux des corégones nains et normaux. Finalement, nous avons référencé les taxons bactériens impliqués. De plus, dans ce chapitre, nous avons également étudié les communautés bactériennes de l’eau à différentes profondeurs pour chaque lacs afin d’analyser les relations entre les bactéries environnementales et celle de l’hôte.
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Dans le quatrième chapitre, nous avons analysé le microbiote intestinal transitoire des deux espèces de grand corégone sauvage ainsi que des espèces normales, naines et hybrides réciproques de grand corégone captif, élevés en conditions contrôlées. Ces microbiotes ont été analysés par séquençage Illumina du gène de la sous-unité 16S de l’ARN ribosomique. Comme pour les chapitres précédents, nous avons cherché pour le grand corégone sauvage (i) une variation entre le microbiote des espèces naines et normales au sein et entre chaque lacs, (ii) des preuves de parallélisme, (iii) l’identification des taxons bactériens. De plus, nous avons testé l’existence de microbiotes intestinaux différents entre les quatre groupes de corégone présents en conditions contrôlées. Nous avons aussi étudié l’effet parental sur le microbiote en identifiant notamment les pleins frères et pleines sœurs à l’aide d’une analyse mitochondriale et de marqueurs microsatellites.
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Chapitre 2 : Microbiome investigation in the ecological speciation
context of Lake Whitefish (Coregonus clupeaformis) using next
generation sequencing
16 2.1 Résumé
Peu d’études ont utilisé le séquençage nouvelle génération pour analyser le microbiome des vertébrés dans leur environnement naturel, notamment celui des poissons d’eau douce. Dans cet article, nous séquençons le gène ribosomal 16s pour (i) tester s’il existe des différences de communautés bactériennes présentes dans les reins des espèces sympatriques naines et normales du grand corégone ; (ii) tester l’hypothèse d’une plus grande diversité bactérienne pour l’espèce normale et (iii) tester s’il existe une occurrence de parallélisme au niveau de la présence et de la composition des communautés bactériennes entre les différentes paires de corégone sympatriques présent dans différents lacs. La communauté bactérienne du rein de 253 corégones (nains et normaux) de cinq lacs a été analysée par combinaison d’une double PCR imbriquée et d’un séquençage 454. Des bactéries ont été détectées dans 52.6% des reins de corégone analysés. Il n’existe pas de différence globale significative entre les lacs et entre les espèces de corégone. Cependant, l’interaction entre les lacs et les espèces de corégone est significative. Nous avons identifié 579 genres bactériens différents et 18 espèces bactériennes connues pour être pathogènes. Ces résultats sont substantiellement plus importants que les descriptions précédentes utilisant des techniques moins sensibles. En outre, les différences dans les compositions bactériennes entre les espèces de corégone ne sont pas parallèles entre les lacs. Les reins des normaux ont une diversité bactérienne systématiquement plus importante, pouvant être le reflet de leur niche trophique plus diversifiée. Cette diversité bactérienne montre un patron parallèle entre les lacs. Ces résultats contribuent à mettre en évidence que la divergence adaptative des corégones nains et normaux a été conduite à la fois par des conditions écologiques parallèles et non parallèles entre les lacs.
17 2.2 Abstract
Few studies have applied NGS methods to investigate the microbiome of vertebrates in their natural environment, and in freshwater fishes in particularly. Here, we used pyrosequencing of the 16S gene rRNA to; i) test for differences in kidney bacterial communities (i.e. microbiota) of dwarf and normal whitefish found as sympatric pairs; ii) test the hypothesis of higher bacterial diversity in normal compared with dwarf whitefish and iii) test for the occurrence of parallelism with the presence and composition of bacterial communities across species pairs inhabiting different lakes. The kidney microbiota of 253 dwarf and normal whitefish from five lakes was analysed combining a double-nested PCR approach with 454 pyrosequencing. Bacteria were detected in 52.6% of the analysed whitefish. There was no overall significant difference among lakes and forms, although the lake × form interaction was found significant. We identified 579 bacterial genera, which is substantially more than previous descriptions using less sensitive techniques of fish bacterial diversity in kidney, pathogenic or not. Ten of these genera contained eighteen pathogenic species. Differences in bacteria composition between whitefish forms were not parallel among lakes. In accordance with the higher diversity of prey types, normal whitefish kidney tissue consistently had a more diverse bacterial community and this pattern was parallel among lakes. These results add to building evidence from previous studies on this system that the adaptive divergence of dwarf and normal whitefish has been driven both by parallel and non-parallel ecological conditions across lakes.
18 2.3 Introduction
Wild vertebrate species host a considerable bacterial diversity, which may influence their development, physiology, immune system and nutrition (Hooper et al., 2002; Bäckhed et al., 2005; Turnbaugh et al., 2007). Four main types of relationships between bacteria and their hosts have been documented. The first two types are commensal bacteria (Cahill, 1990), which may either have beneficial or neutral effects on the host (Prescott, 1995). The second type has a symbiotic obligatory relationship with the host, thus allowing a mutual benefit between symbiotic bacteria and host (Perru, 2006). The third type is opportunistic bacteria, which are facultative pathogenic bacteria that may become actively pathogenic when the host immune system is impaired and unable to fight off infection (Berg et al., 2005). The fourth type of relationship pertains to pathogenic bacteria which are responsible for infectious diseases (Falkow, 1997). Species and populations may differ in their susceptibility to infection due to differences in their immune systems (White et al., 2009), which may have evolved in response to selection from exposure to changing microbial communities (Nakajima et al., 2011).
Methods of measuring bacterial communities are rapidly improving. The earliest and most traditional technique is the culture-dependent method. Because of functional interdependency for most of the bacterial community members (Laplante et al., 2013), many bacterial species cannot be cultured, and others vary greatly in their culture requirements. As a result, culture-based approaches may suffer from inconsistencies, low sensitivity and a biased global overview of the bacterial diversity. In recent decades, microbiologists have developed new culture independent techniques to obtain a better representation of bacterial communities present in host organisms, for example denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) (Muyzer & Smalla, 1998). Despite their usefulness, these methods are also limited by the resolution of band detection with complex bacterial communities and microbes of low abundance may easily be missed (Danilo, 2004).
Advanced culture-independent techniques, such as 16S rRNA massively parallel pyrosequencing, allow a more complete description of complex bacterial communities. The 16S rRNA gene is composed of conserved and “hypervariable” regions (Amann & Ludwig, 2000; Huse et al., 2008). Thus, it is possible to design nearly universal primers in the conserved regions that capture enough sequence diversity to delineate bacterial genera or
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even species. This technique has demonstrated its effectiveness in studies of environmental bacterial communities (Huber et al., 2007; Roesch et al., 2007; Ghiglione & Murray, 2011; Kuffner et al., 2012; Roesch et al., 2012; Collin et al., 2013), and in investigating the microbiome of plant, human and mouse (White et al., 2009; Arumugam et al., 2011; Buffie et al., 2011; Lopez-Velasco et al., 2011; Siqueira Jr et al., 2011; Grice & Segre, 2012; Lebeis et al., 2012). In contrast, there have been very few studies using this approach documenting the microbiome of vertebrate species in their natural environment (Yildirim et al., 2010; Lavery et al., 2012; McKenzie et al., 2012; Larsen et al., 2013; Linnenbrink et al., 2013) and, to our knowledge, no study has yet documented the microbiome of any freshwater wild fish species using 16S rRNA pyrosequencing.
Lake Whitefish (Coregonus clupeaformis) comprises sympatric species pairs referred to as dwarf and normal whitefish that are found in several lakes of the St. John River drainage in the Province of Québec, Canada, and Maine, United States. A recent period of adaptive radiation (postglacial, 12,000 years before present (YBP)) has led to the parallel phenotypic and ecological evolution in different lakes of the dwarf whitefish derived from the ancestral normal whitefish (Bernatchez, 2004). Dwarf and normal whitefish are partially reproductively isolated in each lake (Gagnaire et al., 2013), differ in genetically-based morphological, physiological, behavioral, ecological and life history traits (Fenderson, 1964; Bernatchez et al., 2010), and occupy the limnetic and benthic habitat, respectively. Dwarf and normal whitefish also differ at the immune system level whereby evidence of parallelism of genes relative to immunity was highlighted among whitefish sympatric species forms (St-Cyr et al., 2008; Jeukens et al., 2010).
A recent study also revealed variable patterns of divergence at the MHCIIβ genes between different pairs of dwarf and normal whitefish, although there was no evidence for parallelism in patterns observed among lakes (Pavey et al., 2013). This study also found no parallel patterns in a small subset of genera where pathogenic bacteria have been identified in the literature. In order to further investigate the possible role of bacteria in the parallel ecological speciation of whitefish, this study considers the entire microbiota found in the kidney tissue of dwarf and normal whitefish from different lakes. The kidney of teleost fish, which include whitefish, is known to play several functions, including urinary and a major immune function (Danguy et al., 2011). Furthermore, the presence of bacteria in kidney has been considered evidence of a pathogen infection (Cahill, 1990). Two previous studies performed on the kidney microbial community in salmonids found 10
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genera and 27 genera with DGGE technique and culture-dependent technique respectively (Dionne et al., 2009; Evans & Neff, 2009). Based on previous studies in other groups of organisms, it is expected to detect a greater diversity of genera in using the more sensitive technique of 16S rRNA pyrosequencing on the infected whitefish individuals. In fact, this technique may even be sensitive enough to detect bacterial DNA that is the result of successful immune responses (Pavey et al., 2013). However throughout the manuscript, we will refer to individuals with bacteria amplified from their kidney tissue as “infected”. In this context, our first objective is to test for differences in kidney bacterial communities between dwarf and normal whitefish found in sympatry in the same lake. The dwarf whitefish form feed almost exclusively on small zooplankton whereas normal whitefish feed on a wider diversity of prey types, including zooplankton, but predominantly zoobenthos, molluscs and small fish (Bernatchez et al., 1999; Bernatchez et al., 2010). Because the digestive tract is one of the major infection routes in fish (Ringø & Olsen, 1999), bacteria have the opportunity to colonize kidneys after passing through the intestinal epithelium (Hart et al., 1988; Jutfelt et al., 2006; Knudsen et al., 2008). Thus, these parallel ecological differences in habitat use and diet suggest that dwarf and normal whitefish from a given lake could be exposed to different bacterial communities, whereas whitefish from the same form but from different lakes could be exposed to similar ones. Some of these could be pathogenic and thus potentially imposing differential selection between dwarf and normal whitefish which could have contributed to the parallel divergence of these species pairs. Therefore, our next objectives were to, second, test the hypothesis of higher bacterial taxonomic diversity in normal vs. dwarf, given their broader range of prey types and, third, test for the occurrence of parallelism at the presence and composition of bacterial communities across species pairs inhabiting different lakes.
21 2.4 Material and methods
Biological material
Sympatric dwarf and normal whitefish samples were collected in five different lakes (Cliff, East, Témiscouata, Webster and Indian) from the St John River drainage, Québec, Canada and Maine, United States (Figure 1). The lakes are geographically and hydrographically isolated from one another (Lu & Bernatchez, 1999). A total of 253 apparently healthy whitefish (from external appearance) were sampled with gill nets between June 14th and July 15th 2010 (Table 1). Fish were dissected on the field in sterile conditions; ventral belly surface of fish were rinsed with ethanol, nondisposable tools were rinsed with ethanol and heated over a blow torch between samples, and kidneys were individually stored in a sterile Eppendorf© tube and flash-frozen in liquid nitrogen. The
samples were then transported to the laboratory and kept at -80°C until further processing.
Bacterial detection using double nested PCR
In order to diagnose the presence of bacteria in whitefish kidney, a double-nested PCR was performed. Due to the high concentration of host genomic DNA in kidney tissue relative to potential bacterial DNA, none of our extractions amplify bacterial DNA with repeatability using the standard techniques of DNA amplification (Sevellec et al., 2012). Detailed protocols of the DNA extraction, double nested PCR, library construction and 454 pyrosequencing are provided in Boutin et al. (2012). In brief, DNA from kidney tissue was extracted with a modified QIAamp DNA minikit protocol for tissues in sterile way, the double nested PCR was based on the same principle of the nested PCR described by Yourno (1992), except that three successive amplifications steps were done with three different primer pairs (Table 2). The full 16S rDNA (1380bp) was amplified using primers 1389R and 9F. For the second step, primers 907R and 23F allowed a specific reamplification of the hypervariable region V1-V2-V3-V4-V5 (884bp). Finally, primers 519R and 63F were used to specifically reamplify the rDNA hypervariable region V1-V2-V3 (456bp). For each step of amplification, two negative controls (extraction was replaced with 2 µL of sterile nuclease-free water (DEPC-treated Water Ambion®)) and one positive
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control (extraction was replaced with 2 µL of bacterial cultures in liquid medium) were done. All positive controls were positive and out of 28 negative controls, 3 only showed fainted bands of contamination. A double nested PCR was performed on each sample twice independently. In the case of conflicting results (one positive DNA amplification result and one negative DNA amplification result), a final double nested PCR was done, serving as a “tie-breaker”. This double nested PCR enabled us to significantly increase a very low amount of bacterial DNA while avoiding eukaryotic DNA contamination (Sevellec et al., 2012). The library was done during third-step primers of the double nested PCR summing the A and B adapters required for 454 pyrosequencing and 45 different bar-coded MID-tags (Multiplex identifiers) to the primers 519R and 63F. All the PCR results were purified by AMPure bead calibration method and were sequenced using the GS-20 (Genome Sequencer 20) (Roche, Basel, Switzerland) at the Plateforme d’Analyses Génomiques (Université Laval, Québec, Canada).
Amplicon analysis
First, CLC Genomics Workbench 3.1 (CLC Bio, Aarhus, Denmark CLC work bench BIO®) was used to trim sequences for quality and remove primer sequences and tags (minimum average quality score: 35 for a window of 50, number of differences to the primer sequence = 0, maximum number of differences to the barcode sequence = 0, number of ambiguous base calls = 0, maximum homopolymer length = 8). Second, pre-processing and analysis was done with the microbial ecology community software MOTHUR (version 1.22.2) (Schloss et al., 2009) following the protocol of Costello stool analysis (http://www.mothur.org/wiki/Costello_stool_analysis). This allowed identifying and deleting chimeras, and removing smaller sequences that were either smaller than 300 base pairs or that contained pyrosequencing errors. Among the three analytical options available in MOTHUR, the OTU-based analysis protocol was used. We generated alpha diversity results, defined by the diversity in an individual fish kidney sample, and the richness estimators (Mc Cure et al., 2002). The richness or number of species in an individual sample was measured using two indexes: the Chao index was used as the richness estimator and the Simpson index was used as the diversity index (Magurran, 2003). The Chao index is the simplest richness index based on the number of rare species (Magurran, 2003). The Simpson index measures the probability that two randomly selected individuals
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belong to the same taxa. Consequently, a higher Simpson index value is correlated with a lower diversity (Peet, 1974; Sepkoski, 1988). The OTU-based analysis using MOTHUR was also used for taxonomic identification (using 98% bootstrap score). Taxonomic identification was also performed by using the Ribosomal database Project (using the maximal criterion of 95% bootstrap score available in this method) (Maidak et al., 2001). Unweighted UniFrac tests were performed with the Phylotype-based analysis using MOTHUR. Finally, putative fish pathogen bacterial genera were identified according to Austin & Austin (2007). Furthermore, the species of selected putative pathogen genera were investigated using the BLAST algorithm (Altschul et al., 1997). For each putatively pathogenic genus that we described in the MS, we pooled sequencing from all populations and individuals in the study. We considered the top blast hit to be the bacterial species for that sequence. Then, for the globally most abundant species, we performed a literature search to determine if there are indications of pathogenicity in fishes. We restricted subsequent pathogen analyses to these genera.
Statistical analyses
We constructed a matrix containing the number of bacterial sequences for each bacterial genus in each fish sample from the MOTHUR taxonomy file (stool.final.an.0.02.cons.taxonomy). This matrix was used to perform a principal component analysis per rank (PCA per rank) (Baxter, 1995) using PC-ORD (Mc Cure et al., 2002). Samples were ranked as a function of the number of sequences found for each OTU. Nonmetric Multidimensional Scaling (NMS) analysis was not used in this case because the final stress was above recommended interpretable range (final stress = 25). Therefore, ranked-based PCA was preferred to NMS. Since absolute abundance may be influenced by sequence specific fidelity in the double nested PCR method, we also performed a non-parametric ranking method of abundance using the METASTATS software (White et al., 2009) to detect differentially abundant OTUs between dwarf and normal whitefish. The OTU by sample abundance matrix was also used for this analysis with standard parameters (p value ≤ 0.05 and number of permutations = 1000).
In order to determine if there were statistically significant differences in the proportion of infected fish among lakes and between forms, we used a generalized linear model (GLM) with a binomial family followed by an ANOVA with lakes and forms as factors and also
