Rôle et régulation de 4E-BP1 dans la physiologie pancréatique

Texte intégral

(1)       . .      .          .     .     .   .         .      .

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(3) Ever tried, ever failed, no matter. Try again, fail again, fail better. Samuel Beckett.

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(5) REMERCIEMENTS. Je voudrais tout d’abord remercier chaleureusement tous les membres de mon jury de thèse, Pr Hervé Prats Dr Sophie Vasseur Dr Pierre Fafournoux Dr Théophile Olhman, Dr Stéphane Pyronnet pour avoir pris le temps d’évaluer mon travail et je les prie de croire en ma plus grande admiration et mon profond respect. Je remercie tout particulièrement le Dr Stéphane Pyronnet, mon directeur de thèse pour m’avoir accueilli dans cette formidable équipe 16/6. Merci beaucoup pour ton optimisme, ton temps, ta bonne humeur et surtout ta confiance qui ont fait que, malgré mes résultats souvent décevants, j’ai toujours pu compter sur toi pour me soutenir. Tes qualités scientifiques et pédagogiques ont été une source d’inspiration pendant toute ma thèse. Merci encore d’avoir été ce chef gentil et compréhensif que beaucoup m’enviait. Je souhaite également exprimer ma gratitude aux docteurs Corinne Bousquet et Julie Guillermet-Guibert. Corinne, merci pour m’avoir accueilli dans l’équipe et pour m’avoir offert ton aide à chaque fois que j’en ai eu besoin. Julie, je suis très heureuse que tu m’ais faite découvrir ta vision sans à priori de la science. Merci aussi d’avoir pris le temps de partagé tes expériences avec moi.. Si mes années de thèse ont été, comme pour beaucoup, de rudes années, je suis très heureuse d’avoir pu les passer entourée de personnes formidables qui ont rempli mes journées de rires et de complicité... Bien évidemment, je souhaite remercier TOUS les gens de mon équipe passés et présents pour leur aide, ainsi que les voisins du 4ème et du 3ème qui sont toujours là pour rendre un service, répondre à une question, prêter un anticorps... Un big up aux « Clubeuses » Camille, Carline, Marion et Alix. Merci pour nos discussions dans le couloir, vos encouragements et je vous souhaite plein de bonnes choses pour votre avenir. Merci à Thibaut. Nos petites discussions matinales sur la scéance de volley de la veille vont me manquer. Je souhaite aussi bon courage aux « petits nouveaux » Rémi, Surya, Monica, Julie. Julie, je compte sur toi pour prendre de soin de David et faire perdurer la team traduction. Je souhaite également remercier Bernard, bien évidemment pour ton aide avec la « bête » (confocal) mais aussi pour nos longues discussions pendant mon M2. Je n’oublierai jamais notre véritable rencontre au pot de Christiane!! Merci aussi à Christian chez qui je pouvais descendre pour demander n’importe quel service..

(6) Merci à ma stagiaire, Manon. J’ai vraiment apprécié travailler avec une étudiante aussi curieuse et motivée que toi. Yvan, même si je sais que tu n’aimes pas les compliments, tu t’es trop bien occupé de moi pour y échapper... Un ENORME merci pour avoir fondé la « team traduction », pour avoir passé des heures à discuter de manip, pour m’avoir inclus dans tes projets et au final m’avoir montré que je n’étais pas plus bête qu’une autre au moment où j’en avais le plus besoin. Avec toi, j’ai aimé la science... Même si parfois la tâche était dure et qu’avec Yvan Martineau, la Science n’attend jamais, saches ça a été un immense plaisir que d’apprendre de toi et de travailler avec toi.. Un gros merci à mes mamans d’adoption Katy et Emeline qui, depuis le tout début, ont toujours pris soin de moi. Comment vais-je faire sans mes mousquetaires favorites? J’emporte avec moi tous nos moments de délire, tous vos précieux conseils et un merveilleux goût de Planteur.... Une mention TRES spéciale pour David, Romain et Célia, le trio de choc, qui m’ont supporté pendant toutes ces années de thèse mais aussi ces derniers mois. Nos pauses repas, les cafés et les soirées pub/burger resteront parmi les meilleurs souvenirs de cette thèse. David, je te décerne la palme d’or du co-équipier de thèse!! Ta gentillesse, ton humour corrosif et ta playlist ont été d’une aide INESTIMABLE. Nos discussions métaphysiques de haut vol vont me manquer. Romain, Mr Poulet, ta personnalité haute en couleur (et en volume sonore) a illuminé mes journées. En encore merci pour les rocks endiablés et tes cheese-cakes bien sûr!!! Et enfin, Célia, la petite dernière. Merci à toi pour être si gentille et rigolote à la fois, tu es un petit soleil à toi toute seule. Je te fais entièrement confiance pour bien t’occuper des garçons en mon absence... Une grosse pensée pour les anciens : Nico qui m’a fait rire comme personne et qui m’a guidé vers la voie de l’Agreg, Yannick pour nos repas animés, nos afterwork au London et tes multiples histoires de chat... Merci aussi à Siham pour sa gentillesse et ses mots d’encouragement. Je tiens aussi à remercier les ex-Pyronnet Laure et Théo, parti s’exiler à l’IPBS avec qui les apéros/soirées sont toujours aussi formidables. Un gros bisou à la petite Emilie qui sans le savoir m’a remonté le moral plus d’une fois juste en m’offrant son sourire et ses premiers pas.. Un grand merci à Sandra, AnneSo, Arno, Marina. Le noyau dur, les survivants du M2 !!! Je repense avec nostalgie à nos repas interminables au L4, aux soirées à la colloc et bien sur à notre escapade espagnole... Marina, merci pour ta joie, pour toutes tes histoires et aussi pour avoir écouté les miennes. J’arrive bientôt à Paris pour « brûler la ville avec toi »!! Un gros merci à Arno pour nos discussions interminables, pour ton humour si particulier et pour ton soutien infaillible..

(7) AnneSo, Sandra, mes SUPER COPINES de thèse, quand j’y repense, comment aurai-je pu faire sans vous ? Sandra, qui arrive toujours à la rescousse en me requinquant à coup de mochaccinos et AnneSo qui connait toutes mes histoires de labo à force de les entendre et qui a pris soin de moi comme personne ces trois derniers mois! Je crois que j’aurai tout partagé avec vous : du road trip de M2 jusqu’au jour J de ma thèse en passant par toutes les soirées Margha/Frog mémorables, les missions quiche/chaussures de thèse ou « ce soir, on fait la trame de la thèse de Charline ». Vous avez juste été extraordinaires!!! Votre amitié m’est des plus précieuses. Je vous remercie des millions de fois et je compte sur vous pour débarquer dans mon donjon à Paris dès que vous voulez.. Merci aux relecteurs tant scientifiques que littéraires : Stéphane, Christian, David, Kathy et Martine. Sans vous, ce manuscrit aurait beaucoup perdu. Un petit mot aussi pour la « familly du volley » qui a offert une terre d’asile à mon cerveau surchargé en noms de protéines, planification de manip et autres détails de protocoles.. Enfin, je remercie de tout cœur ma famille... Papa, Maman, vous m’avez ouvert un monde fabuleux et vous êtes toujours là pour me faire garder l’équilibre quand le vent souffle trop fort. Merci pour tout. Jess, ma bouée de sauvetage, comme tu me l’as dit un soir de nuit et d’alcool : tu es mon mur porteur. Merci aussi aux autres membres de ma super famille et particulièrement à ceux qui ont pu faire le déplacement le jour J. Votre présence m’a beaucoup touché..

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(9) RESUME. Chez les eucaryotes, le contrôle de la traduction des ARNm en protéines par le facteur d'initiation de la traduction 4E (eIF4E) est un mécanisme clé régulant l’expression génique. Grâce à son interaction avec la coiffe, eIF4E facilite le recrutement du ribosome à l'extrémité 5' de l'ARNm (traduction dite "cap-dépendante"). Sa fonction traductionnelle peut néanmoins être inhibée par son interaction avec les régulateurs de la synthèse protéique 4E-BP1 et 4E-BP2 dont la liaison à eIF4E est elle-même dépendante de la signalisation mTOR. Le pancréas est l’organe qui exprime le plus 4E-BP1 suggérant une fonction spécifique dans cet organe. Les objectifs de cette thèse étaient de caractériser les mécanismes moléculaires à l’origine d'une si forte expression et de définir la fonction de 4EBP1 dans la physiologie pancréatique. Les résultats obtenus permettent de proposer un modèle selon lequel la forte expression de 4E-BP1 dans les cellules exocrines pancréatiques est liée à l'activation chronique mais physiologique de voies de signalisation normalement impliquées dans la réponse au stress du réticulum endoplasmique (RE). Une cible majeure de ces voies de signalisation est en effet constitutivement surexprimée dans le pancréas. Il s'agit du facteur de transcription ATF4 lequel se lie directement au gène de 4E-BP1 et maintient son taux de transcription élevé alors qu'il n'a aucun effet sur 4E-BP2. Ces observations pourraient s'appliquer à d'autres cellules séreuses exocrines caractérisées par la synthèse massive de protéines transitant par le RE puis sécrétées. Concernant la fonction physiologique de 4EBP1, les données obtenues révèlent une contribution importante dans l’homéostasie des cellules exocrines pancréatiques. 4E-BP1, dont l’activité est régulée par mTOR, leur fournit un moyen de contrôler la synthèse des enzymes digestives en fonction de la prise alimentaire. 4E-BP1 exerce en outre un rôle protecteur des cellules acineuses se traduisant par une meilleure survie lorsqu'elles sont soumises à un stress conduisant à une pancréatite..

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(11) Sommaire. Sommaire Sommaire ................................................................................................................................... 9 Figures ...................................................................................................................................... 13 Tableaux ................................................................................................................................... 15 Avant propos ............................................................................................................................ 17 Introduction bibliographique ................................................................................................... 19 CHAPITRE I : 4E-BP1 ET LE CONTROLE DE L’INITIATION DE LA TRADUCTION .......................... 21 A.. Généralité sur la traduction ......................................................................................... 21. B.. Modification des ARNm et régulation de l’initiation de la traduction ......................... 23 B.1. B.1.1. La formation de la coiffe ................................................................................. 23. B.1.2. Le rôle de la coiffe .......................................................................................... 23. B.2. La queue polyA....................................................................................................... 24. B.2.1. La polyadénylation.......................................................................................... 24. B.2.2. Le rôle de la polyadénylation ......................................................................... 24. B.3. C.. La coiffe .................................................................................................................. 23. Séquences particulières et mécanismes alternatifs d’initiation de la traduction . 25. B.3.1. Traduction IRES-dépendante .......................................................................... 26. B.3.2. uORF ............................................................................................................... 27. La régulation de l’initiation de la traduction cap-dépendante .................................... 28 C.1. La formation du complexe 43S .............................................................................. 29. C.1.1. La formation du complexe ternaire (eIF2-GTP-Met-ARNti) ........................... 29. C.1.1.1 eIF2 ............................................................................................................ 29 C.1.1.2 L’ARNt initiateur (Met-ARNti) ................................................................... 31 C.1.1.3 eIF2B .......................................................................................................... 31 C.1.2 C.2. Le recrutement du complexe ternaire sur la petite sous-unité du ribosome 32. Le complexe eIF4F : médiateur du recrutement du complexe 43S sur l’ARNm .... 32. C.2.1. eIF4E ............................................................................................................... 33. C.2.1.1 Les fonctions d’eIF4E ................................................................................. 34 C.2.1.2 Régulations d’eIF4E ................................................................................... 35 C.2.1.3 eIF4E et cancer .......................................................................................... 37 9.

(12) Sommaire C.2.2. eIF4G ............................................................................................................... 38. C.2.2.1 Les multiples interactions d’eIF4G assurent le recrutement et la stabilisation de la sous-unité 43S sur l’ARNm .......................................................... 38 C.2.2.2 eIF4G favorise la circularisation des ARNm............................................... 39 C.2.2.3 eIF4G stimule la phosphorylation d’eIF4E................................................. 39 C.2.3. D.. eIF4A ............................................................................................................... 40. C.3. Le balayage du 5’-UTR et la reconnaissance du codon initiateur .......................... 40. C.4. Assemblage de la sous-unité 80s ........................................................................... 42. 4E-BP1 un régulateur majeur de l’initiation de la traduction ...................................... 42 D.1. 4E-BP1, membre emblématique de la famille des 4E-BP ...................................... 42. D.1.1. Identifications des 4E-BP ................................................................................ 43. D.1.2. Les 4E-BP : du gène à la protéine ................................................................... 43. D.1.3. Séquences ....................................................................................................... 44. D.1.3.1 Le domaine de liaison à eIF4E ................................................................... 44 D.1.3.2 Phosphorylation par mTOR : rôle clé des domaines TOS et RAIP............. 45 D.1.3.3 Une multitude de sites de phosphorylations ............................................ 46 D.1.4. Conformation.................................................................................................. 46. D.1.5. Profil d’expression et fonctions principales ................................................... 47. D.2. 4E-BP1 .................................................................................................................... 48. D.2.1. Structure du gène de 4E-BP1 .......................................................................... 48. D.2.2. Régulations de 4E-BP1 .................................................................................... 48. D.2.2.1 Régulation transcriptionnelle.................................................................... 48 D.2.2.2 Régulation par miRNA ............................................................................... 52 D.2.2.3 Régulation par phosphorylation ............................................................... 53 D.2.2.4 Régulation de sa stabilité .......................................................................... 57 D.2.3. 4E-BP1 et cancer ............................................................................................. 59. D.2.4. Ciblage thérapeutique du complexe eIF4F ..................................................... 60. D.2.5. Les rôles physiologiques de 4E-BP1................................................................ 63. D.2.5.1 Rôle dans la prolifération et le contrôle du cycle cellulaire ..................... 63 D.2.5.2 Rôle dans la réponse au stress .................................................................. 64 D.2.5.3 4E-BP1 et le contrôle des enzymes digestives .......................................... 67 CHAPITRE II: LE STRESS DU RETICULUM................................................................................... 69. 10.

(13) Sommaire A.. Généralités sur le réticulum endoplasmique ............................................................... 69. B.. Les fonctions du réticulum endoplasmique ................................................................. 70 B.1. La synthèse des lipides et des stéroïdes ................................................................ 70. B.2. L’homéostasie du calcium ...................................................................................... 70. B.3. La synthèse et le repliement des protéines ........................................................... 71. B.3.1. La translocation des protéines dans le réticulum endoplasmique ................ 71. B.3.2. La maturation des protéines .......................................................................... 73. B.3.2.1 La formation des ponts disulfures ............................................................. 73 B.3.2.2 La N-glycosylation et le contrôle qualité du RE......................................... 74 B.3.2.3 Le repliement des protéines, rôle clé des chaperonnes ........................... 75 C.. Le stress du réticulum .................................................................................................. 77 C.1. Activation des voies de l’UPR ................................................................................. 77. C.1.1. La voie IRE1 ..................................................................................................... 80. C.1.1.1 La protéine IRE1 ........................................................................................ 80 C.1.1.2 Le facteur de transcription XBP1s ............................................................. 80 C.1.1.3 L’activité RIDD d’IRE1 ................................................................................ 81 C.1.1.4 La liaison IRE1-TRAF2 : plateforme de signalisation ............................... 82 C.1.2. La voie ATF6 .................................................................................................... 84. C.1.3. La voie PERK .................................................................................................... 86. C.1.3.1 La kinase PERK ........................................................................................... 86 C.1.3.2 La phosphorylation d’eIF2 et l'inhibition transitoire de la traduction ... 88 C.1.3.3 Le facteur de transcription ATF4 ............................................................... 89 C.1.3.4 L’induction de 4E-BP1, vers une inhibition plus durable de la traduction? 91 C.2. La réponse UPR ...................................................................................................... 93. C.2.1. La résolution du stress .................................................................................... 93. C.2.2. Vers la voie de l’apoptose .............................................................................. 95. C.2.2.1 Le rôle pro-apoptotique de CHOP ............................................................. 96 C.2.2.2 Le rôle pro-apoptotique d’IRE1 .............................................................. 98 D.. La notion de stress du réticulum physiologique ........................................................ 100 D.1. Rôle de la réponse UPR dans les cellules à haute activité sécrétoire.................. 101. D.2. Rôle du stress du RE dans le pancréas exocrine .................................................. 103. 11.

(14) Sommaire CHAPITRE III : LE PANCREAS, MODELE PRIVILEGIE D’ETUDE DES CELLULES EXOCRINES SEREUSES ................................................................................................................................ 105 A.. La notion de cellule exocrine séreuse ........................................................................ 105 A.1. B.. Classification des cellules exocrines .................................................................... 105. Le pancréas exocrine .................................................................................................. 107 B.1. Généralités sur le pancréas .................................................................................. 107. B.1.1. Morphologie, histologie ............................................................................... 107. B.1.2. Les facteurs de transcription et différentiation du pancréas ....................... 110. B.1.2.1 Ptf1 et l’induction du phénotype acineux ............................................ 111 B.1.2.2 Mist1 et le maintien du phénotype acineux ........................................... 112 B.2. La production et la sécrétion des enzymes digestives ........................................ 115. B.2.1. Les enzymes produites par le pancréas........................................................ 115. B.2.1.1 La trypsine, rôle clef dans l’activation des pro-enzymes ........................ 116 B.2.1.2 Les protéases ........................................................................................... 116 B.2.1.3 Les lipases ................................................................................................ 117 B.2.1.4 L’amylase ................................................................................................. 117 B.2.2. Le contrôle de la sécrétion des enzymes digestives ..................................... 118. B.2.3. La régulation de la synthèse des enzymes digestives .................................. 122. B.3. C.. Pathologies du pancréas exocrine ....................................................................... 125. B.3.1. Implication du stress du RE dans la pancréatite........................................... 125. B.3.2. L’adénocarcinome pancréatique .................................................................. 128. Autres cellules exocrines séreuses ............................................................................. 130 C.1. Les glandes parotides........................................................................................... 131. C.2. Les cellules de Paneth .......................................................................................... 132. Résultats expérimentaux........................................................................................................ 137 INTRODUCTION ...................................................................................................................... 139 ARTICLE : Translational homeostasis through endoplasmic-reticulum-mediated massive expression of 4E-BP1 in serous exocrine tissues ................................................................... 141 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................................. 171 Discussion générale et conclusion ......................................................................................... 177 Références Bibliographiques .................................................................................................. 185 Annexes .................................................................................................................................. 221. 12.

(15) Figures. Figures Figure 1 : Schéma général de l’initiation de la traduction Figure 2 : Structure et synthèse de la coiffe Figure 3 : Modèle de circularisation des ARNm Figure 4 : La traduction IRES dépendante Figure 5 : La régulation de la traduction d’ATF4 par ses uORF Figure 6 : Régulation de la phosphorylation d’eIF2 Figure 7 : Structures du Met-ARNt initiateurs et du Met-ARNt élongateur Figure 8 : Les facteurs d’initiation eIF4 et eIF3 permettent le recrutement de la sous-unité 40S Figure 9 : Structures crystalographique du complexe eIF4E (murin) /m7GTP/le peptide eIF4G Figure 10 : La phosphorylation d’eIF4E par les MNK est favorisée lorqu’il est dans le complexe eIF4F Figure 11 : Influence de la quantité de complexes eIF4F sur la traduction d’ARNm dits eIF4E sensibles et sur la traduction des ARNm peu sensibles Figure 12 : Structure primaire des trois protéines 4E-BP Figure 13 : Structures des complexes eIF4E/7-methyl-GDP/peptide eIF4G et eIF4E/7-methylGDP/peptide 4E-BP1. Figure 14 : Les facteurs de transcription de 4E-BP1 Figure 15 : Régulation de l’initiation de la traduction par 4E-BP1 Figure 16 : Kinases et phosphatases régulant la phosphorylation de 4E-BP1. Figure 17 : Ciblage thérapeutique du complexe eIF4F Figure 18 : La structure du réticulum endoplasmique Figure 19: La translocation co-traductionnelle des protéines dans le réticulum endoplasmique Figure 20 : La formation des ponts disulfures. 13.

(16) Figures Figure 21 : La N-glycosylation et le contrôle qualité des protéines Figure 22 : Représentation schématique des trois principaux récepteurs-senseurs du stress du réticulum : IRE1, PERK et ATF6 Figure 23 : Schéma simplifié de la réponse UPR globale. Figure 24 : La voie IRE1 Figure 25 : La voie ATF6 Figure 26 : La voie PERK Figure 27 : Structure génomique d’ATF4 Figure 28 : Contribution de l’UPR dans l’activation des voies apoptotiques Figure 29 : Témoignage de l’activité de la protéine IRE1 dans le pancréas sain Figure 30 : Anatomie générale du pancréas Figure 31 : Structure anatomo-histologique du pancréas Figure 32 : L’établissement des différentes lignées pancréatiques et les principaux facteurs de transcription impliqués Figure 33 : Représentation schématique de la synchronisation de la synthèse/sécrétion des enzymes digestives avec la prise alimentaire Figure 34 : Intégration des signaux conduisant à la sécrétion des enzymes digestives par le pancréas Figure 35 : Voie de signalisation impliquée dans l’exocytose des granules de zymogène Figure 36 : Implication de la signalisation PI3K/Akt/mTOR dans la synthèse des enzymes digestives par les cellules acineuses pancréatiques Figure 37 : Les lésions pancréatiques pré-néoplasiques et les principales altérations génétiques associées à l’adénocarcinome pancréatique. Figure 38 : Les glandes salivaires Figure 39 : Représentation schématique de l’épithélium intestinal. 14.

(17) Tableaux. Tableaux Tableau 1: Les 4E-BP, du gène à la protéine Tableau 2 : Phénotypes des souris présentant une alération génétique de protéines impliquées dans la réponse UPR Tableau 3 : Classification des cellules glandulaires exocrines par leurs sécrétions Tableau 4 : Principales enzymes ou pro-enzymes sécrétées par le pancréas et leurs fonctions. 15.

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(19) Avant propos. Avant propos Cette thèse a pour objectif de présenter les résultats expérimentaux obtenus au cours de mes trois années de doctorat. Ces résultats concernent d’une part la régulation de 4E-BP1 par les voies normalement impliquées dans la réponse au stress du réticulum et d’autre part son rôle dans la physiologie du pancréas exocrine.. L’introduction bibliographique comprend donc trois chapitres. Le premier chapitre détaille le rôle de 4E-BP1 dans le contrôle de l’initiation de la traduction. Le deuxième chapitre est consacré aux voies impliquées dans la réponse au stress du réticulum et s’intéresse plus particulièrement à leurs fonctions physiologiques. Enfin le pancréas exocrine et les cellules exocrines séreuses qui constituent notre modèle d’étude privilégié seront présentés dans le dernier chapitre. Dans chaque fin de chapitre, une attention toute particulière est portée sur les liens bibliographiques qui unissent 4E-BP1, les voies du stress du réticulum et les cellules acineuses pancréatiques.. Mes résultats expérimentaux sont ensuite présentés sous la forme d’un article précédé d’une courte introduction et suivi d’une conclusion et de perspectives.. Enfin, une discussion générale et une conclusion viendront clore cet exposé.. 17.

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(21) Introduction bibliographique. 19.

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(23) 4E-BP1 et la traduction. CHAPITRE I : 4E-BP1 ET LE CONTROLE DE L’INITIATION DE LA TRADUCTION. A. GENERALITE SUR LA TRADUCTION. La régulation de l’expression génique s’effectue à de nombreux niveaux. Si la transcription permet un contrôle général de l’état de la cellule, la traduction est nécessaire pour une régulation plus fine et rapide afin de répondre au mieux aux changements environnementaux que subit la cellule. Elle est généralement subdivisée en quatre étapes : l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage des ribosomes et fait intervenir de nombreux facteurs associés à chaque étape. L’initiation correspond au recrutement du complexe pré-initiateur (comprenant la petite sous-unité du ribosome, des facteurs d’initiations et l’ARNt initiateur) en 5’ des ARN messagers (ARNm). Par la suite, la sous-unité 43S balaye le 5’UTR à la recherche du codon initiateur. Une fois la reconnaissance du codon initiateur effectuée, la sous-unité 60S rejoint le complexe pour former le ribosome au complet. L’élongation consiste en l’ajout d’acides aminés pour former la chaîne polypeptidique via la lecture du code génétique par le ribosome. La terminaison est caractérisée par la reconnaissance du codon STOP et la libération du peptide néosynthétisé. Enfin, le recyclage voit la dissociation des deux sousunités ribosomiques et la libération de l’ARNm. (Voir figure 1) La traduction étant l’un des processus les plus consommateurs en énergie, elle fait l’objet d’une fine régulation qui a principalement lieu au niveau de l’initiation.. 21.

(24) 4E-BP1 et la traduction. Figure 1 : Schéma général de l’initiation de la traduction Issue de Hinnebush AG et Lorsch JR, 2012.. 22.

(25) 4E-BP1 et la traduction B. MODIFICATION DES ARNm ET REGULATION DE L’INITIATION DE LA TRADUCTION. Contrairement aux ARNm procaryotes, les ARNm eucaryotes subissent des modifications avant d’être traduits. Parmi elles, deux modifications co-transcriptionnelles : la coiffe et la queue polyA influencent drastiquement leur régulation traductionnelle. B.1 La coiffe B.1.1. La formation de la coiffe. La plupart des ARNm eucaryotes sont pourvus d’une coiffe. Elle consiste en une extrémité 7-methyl-guanoside (m7G[5’]ppp[5‘]N) située en 5’ UTR. Cette modification cotranscriptionnelle a lieu avant même les étapes d’épissage ou de polyadénylation. L’ARNm est tout d’abord synthétisé avec une extrémité 5’ triphosphate. Le phosphate  est par la suite retiré et un groupement guanosyl-mono-phosphate est ajouté par l’action de la guanylyltransferase. Enfin, un groupement methyl est transféré sur la position N 7 de la guanine de la coiffe (figure 2).. Figure 2 : Structure et synthèse de la coiffe a) La structure de la coiffe b) La synthèse de la coiffe B.1.2. Le rôle de la coiffe. Les ARNm non coiffés ne sont pas traduits de manière efficace. La coiffe a trois fonctions principales : (1) préserver les ARNm de la dégradation, (2) faciliter leur export et (3) favoriser leur traduction. D’une part elle constitue un signal empêchant la dégradation de 23.

(26) 4E-BP1 et la traduction l’ARNm par l’action des protéines de décoiffage Dcp1 et Dcp2 (Decapping protein 1/2) et des exonucléases à activité 5’3’ (Walther et al., 1998). D’autre part, du fait de sa liaison avec le Cap Binding Complex (CBC), elle favorise l’export cytoplasmique des ARNm via le pore nucléaire. Enfin, la coiffe est également nécessaire pour la reconnaissance de l’extrémité 5’ de l’ARNm par le complexe eIF4F qui permet le positionnement correct du ribosome (voir chapitre I, section C.2). De plus, le complexe eIF4F, de par sa liaison avec la PABP, a la capacité de se lier à la queue polyA. De ce fait, l’ARNm adopte une conformation circulaire ayant propriété de stimuler la traduction des ARNm (voir chapitre I, section B.2). Ce mécanisme peut contribuer à la traduction efficace des ARNm ayant subi toutes les étapes de maturation, donc peu susceptibles de porter des anomalies. B.2 La queue polyA B.2.1. La polyadénylation. La polyadénylation est une modification cotranscriptionnelle qui consiste en l’ajout d’une série d’adénines (A) à la fin de l’ARNm. Elle nécessite en premier lieu une étape de clivage. Pour cela, le complexe CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) reconnaît le signal de polyadénylation (PAS, séquence consensus : « AAUAAA ») qui se situe généralement de 10 à 30 nucléotides en amont du site de clivage. Le complexe recrute alors de nombreux facteurs (CstF, CF I, CF II, symplekin et la PAP (poly(A) polymerase) qui permettent le clivage situé juste après un dinucléotide CA libérant ainsi une extrémité 3’OH sur laquelle la PAP est recrutée pour ajouter un peu plus d’une dizaine d’adénines. La PABP (Poly-(A) Binding Protein) qui a une affinité toute particulière pour les séquences riches en adénines se fixe alors sur la queue poly-A fraichement synthétisée et stimule la PAP afin qu’elle ajoute des adénines supplémentaires. B.2.2. Le rôle de la polyadénylation. L’ajout d’une queue poly-A est une modification nécessaire pour assurer la traduction efficace d’un ARNm. Ainsi, tout comme la coiffe, la queue poly-A favorise l’export des ARNm vers le cytoplasme. Elle assure également la stabilité des ARNm en empêchant leur dégradation par les exonucléases à activité 3’5’. Ce mécanisme semble être très. 24.

(27) 4E-BP1 et la traduction dépendant de la liaison de la PABP sur queue poly-A puisque des ARNm non polyadénylés liés à la PABP de manière artificielle semblent également être protégés de la dégradation (Coller et al., 1998). Enfin, la queue poly-A stimule la traduction des ARNm en protéines. En effet, la queue poly-A interagit de manière indirecte avec la coiffe des ARNm via la liaison entre la PABP et un des constituants du complexe eIF4F (eIF4G). La PABP interagit également avec le facteur de terminaison eRF3 (Hoshino et al., 1999). Cette interaction, qui stimule l’initiation de la traduction, provoquerait la formation d’une seconde boucle contenant la partie 3’UTR de l’ARNm (Uchida et al., 2002). Cette conformation circulaire de l’ARNm pourrait favoriser la traduction des ARNm notamment en facilitant le recyclage du ribosome du codon stop vers l’extrémité du 5’UTR qui sont spatialement rapprochés (figure 3).. Figure 3 : Modèle de circularisation des ARNm Issue de Sonenberg N et Dever T, 2003. B.3 Séquences particulières et mécanismes alternatifs d’initiation de la traduction Si la majorité des ARNm sont traduits de manière cap-dépendante, il existe d’autres modes d’initiation de la traduction qui sont notamment mis en place en condition de stress. Ainsi certains ARNm sont traduits de manière cap-indépendante via le recrutement direct du ribosome sur des séquences particulières appelées IRES (pour Internal Ribosome Entry Site). D’autre part, environ 10% des ARNm possèdent des uORF (pour upstream Open Reading. 25.

(28) 4E-BP1 et la traduction Frame) qui modulent l’efficacité de leur traduction. Ces deux mécanismes occupent une place importante dans la réponse adaptée des cellules aux conditions de stress. B.3.1. Traduction IRES-dépendante. La traduction IRES est une méthode alternative d’initiation de la traduction indépendante de la coiffe qui peut se substituer à la traduction cap-dépendante lorsque celle-ci est inhibée. Identifiés pour la première fois chez les picornavirus, (Pelletier and Sonenberg, 1988) les IRES sont également retrouvés dans les ARNm cellulaires. Ce sont des structures secondaires de l’ARNm de type tige-boucle qui permettent le recrutement du ribosome de manière directe ou via l’intermédiaire d’ITAFs (IRES Trans-Activating Factors) tel que PTB (polypyrimidine tract binding protein) ou l’autoantigène LA. Ce mode d’initiation fait intervenir la plupart des facteurs initiateurs de la traduction cap-dépendante excepté eIF4E (figure 4) et est particulièrement actif lorsque la traduction cap-dépendante est inhibée comme lors de la mitose, l’apoptose, l’hypoxie ou l’infection virale... Ce mécanisme permet de traduire spécifiquement des ARNm essentiels en absence de traduction globale. Ainsi, en mitose, lors de la rupture de l’enveloppe nucléaire, la traduction cap-dépendante est inhibée. Cette interruption pourrait notamment avoir pour but d’éviter la synthèse de protéines à partir d’ARNm non matures provenant du noyau. Cependant, la traduction de l’ARNm de la CDK1 qui est nécessaire à la poursuite du cycle cellulaire est maintenue grâce à la présence de son IRES. A ce jour, plus de cent IRES cellulaires ont été répertoriés, cependant, les IRES cellulaires ne présentant aucune homologie ni de séquence ni de structure, leur identification reste difficile.. Figure 4 : La traduction IRES dépendante Représentation schématique de l’initiation de la traduction IRES dépendante. Adaptée de Holcik M et Sonenberg N, 2005. 26.

(29) 4E-BP1 et la traduction B.3.2. uORF. Certains ARNm sont pourvus de plusieurs codons d’initiation fonctionnels situés dans leur 5’UTR. Ces ARNm particuliers contiennent donc plus d’un cadre de lecture ou ORF (Open Reading Frame). Un seul de ces ORF donne lieu à la protéine, les autres étant des éléments appelés uORF (pour upstream Open Reading Frame) qui peuvent moduler l’initiation de la traduction du «véritable» ORF. La présence de ces uORF permet à certains ARNm de voir leur « véritable » ORF traduit lorsque la traduction globale est inhibée. C’est particulièrement le cas lorsque la cellule est soumise à un stress cellulaire tel que l’hypoxie ou le stress du réticulum qui conduit à la diminution de la disponibilité en complexe ternaire portant l’ARNt initiateur (voir chapitre I section C.1.1). L’une des régulations par mécanisme d’uORF la plus étudiée est celle de la protéine GCN4 et de son homologue chez les mammifère ATF4 (Activating Transcription Factor 4) dont l’expression est induite par la phosphorylation d’eIF2. Chez l’homme, l’ARNm d’ATF4 compte deux uORF placés en amont du « véritable » ORF. Leur traduction dépend de la disponibilité en complexes ternaires dont la fonction est de délivrer l’ARNt initiateur à la petite sous-unité ribosomique. Lorsque la disponibilité en complexe ternaire est forte, le ribosome traduit le premier uORF puis par un mécanisme de ré-initiation, traduit ensuite le deuxième uORF avant de se détacher de l’ARNm. En revanche, lorsque la disponibilité en complexe ternaire est faible, le ribosome traduit le premier uORF, puis, du fait du manque en complexes ternaires, ne parviendra à ré-initier la traduction qu’au niveau du « véritable » ORF donnant ainsi naissance à la protéine ATF4 (Harding et al., 2000; Vattem and Wek, 2004) (figure 5). Les mécanismes impliqués dans le contrôle des uORF ne sont pas tous identiques à celui d’ATF4 et peuvent faire intervenir des phénomènes de balayage de fuite ou l’intervention de protéines se liant à l’ARNm. Tout comme les séquences IRES, la présence d’uORF assure aux gènes qui les portent d’être régulés de manière spécifique et rapide.. 27.

(30) 4E-BP1 et la traduction. Figure 5 : La régulation de la traduction d’ ATF4 par ses uORF En condition « normale », les complexes ternaires sont abondants et la traduction protéique est initiée au niveau de ses deux uORF ; la protéine ATF4 n’est pas produite. Lorsque les complexes ternaires sont plus rares, la traduction est initiée au premier uORF puis à l’ORF d’ATF4 donnant naissance à la protéine ATF4. Adaptée de Pavitt G et Ron D, 2012.. C. LA REGULATION DE L’INITIATION DE LA TRADUCTION CAP-DEPENDANTE. L’initiation de la traduction est caractérisée par la rencontre de trois types d’ARN : l’ARN ribosomique (ARNr) porté par le ribosome, l’ARN de transfert (ARNt) porté par le complexe ternaire et l’ARN messager (ARNm). Cette association est favorisée par de nombreux facteurs d’initiation (eIF) qui interviennent successivement jusqu’à l’assemblage du ribosome entier sur l’ARNm. La première étape consiste en l’association entre la petite sous-unité ribosomale 40S avec le complexe ternaire porteur de l’ARNt initiateur pour former le complexe 43S. Ensuite, ce complexe est recruté à l’extrémité 5’ de l’ARNm notamment grâce à eIF4F puis parcourt l’ARNm vers l’extrémité 3’ à la recherche du codon initiateur. Une fois la reconnaissance du codon initiateur effectuée, la sous-unité 60S est recrutée à son tour pour former le ribosome entier et commencer la phase d’élongation. 28.

(31) 4E-BP1 et la traduction Chaque étape nécessite l’action de nombreux facteurs d’initiation qui sont la cible de régulations permanentes. C.1 La formation du complexe 43S C.1.1. La formation du complexe ternaire (eIF2-GTP-Met-ARNti). Le complexe ternaire : eIF2-GTP-Met-ARNti est constitué du facteur d’initiation eIF2 (eucaryotic Initiation Factor 2) associé au GTP et à l’ARNt initiateur (Met-ARNti). La fonction du complexe ternaire est de délivrer l’ARNt initiateur porteur de la méthionine au niveau du site P du ribosome. C.1.1.1 eIF2 eIF2 est un hétérotrimère constitué de trois sous-unités appelées ,  et . La sous unité lie à la fois le GTP et le Met-ARNti. Sous sa forme liée au GDP elle est inactive. Elle est activée par échange du GDP en GTP via l’action d’eIF2B, ce qui lui permet de recruter MetARNti. eIF2 favorise quant à elle l’échange GDP/GTP. eIF2 est la sous-unité régulatrice : sa phosphorylation sur sa sérine 51 inhibe l’activité GEF (Guanine Exchange Factor) d’eIF2B empêchant la formation de nouveaux complexes ternaires (figure 6). Cette phosphorylation est souvent synonyme d’un stress cellulaire dont la résolution nécessite un arrêt transitoire de la traduction. Il existe quatre kinases capables de phosphoryler eIF2 : PERK (PKR-like ER Kinase), PKR (Protein Kinase double-stranded RNA-dependent), GCN2 (General Control Nonderepressible-2) et HRI (Heme-Regulated Inhibitor) qui sont activées en réponse à différents stress. PERK est une protéine transmembranaire du réticulum endoplasmique (RE) senseur du stress du réticulum. La dimérisation de PERK, nécessaire à son activation, est stimulée par l’accumulation de protéines mal repliées dans le RE (Harding et al., 1999), PKR qui est notamment activée par les d’ARN double brin, est un des principaux médiateurs de la réponse à l’infection virale (Levin et al., 1980). Concernant GCN2, sa structure comporte un domaine de liaison aux ARNt non chargés. Elle est donc activée dans des conditions de carence en acides aminés (Wek et al., 1995a; Zhang et al., 2002a) mais elle peut également être activée en réponse à d’autres stress tels que les radiations UV et l’infection virale. 29.

(32) 4E-BP1 et la traduction (Berlanga et al., 2006; Grallert and Boye, 2007). Enfin HRI, principalement exprimée dans les érythrocytes, est activée par une déficience en hème (Chen, 2007). Elle a deux rôles majeurs : coupler l’activation des gènes de la globine au taux d’hème de la cellule et assurer la survie des cellules quand le niveau en fer est bas. La déphosphorylation d’eIF2 est nécessaire pour restaurer un taux de synthèse protéique normal après un stress. Ce retour est rendu possible par l’action de deux phosphatases. Elles sont composées d’une même sous-unité catalytique PP1 (Protein Phosphatase 1) et d’une des deux sous unités régulatrices suivantes : GADD34 (Growth Arrest and DNA Damage-inducible protein 34) ou CReP (Constitutive Repressor of eIF2Phosphorylation) (Jousse et al., 2003; Novoa et al., 2001). Contrairement à CReP qui est exprimée de manière constitutive, l’expression de GADD34 est uniquement induite en réponse au stress comme effecteur du rétrocontrôle négatif.. Figure 6 : Régulation de la phosphorylation d’eIF2 La phosphorylation d’eIF2 sur sa sous-unité  entraine l’inhibition de l’activité GEF d’eIF2B empêchant la formation du complexe ternaire (eIF2-GTP-Met-ARNti) qui est nécessaire à l’initiation de la traduction. Les quatre kinases impliquées dans la phosphorylation d’eIF2 (GCN2, PKR, HRI, PERK) sont réprésentées. Adaptée de Holcik M et Sonenberg N, 2005. 30.

(33) 4E-BP1 et la traduction C.1.1.2 L’ARNt initiateur (Met-ARNti) Le Met-ARNt initiateur (Met-ARNti) est différent des ARNt chargés de la methionine prenant part à l’élongation. Contrairement aux ARNt de l’élongation, le Met-ARNti ne doit pas se lier au facteur d’élongation eEF1A mais au facteur d’initiation eIF2 afin de se loger directement au site P du ribosome et non sur le site A. Il joue également un rôle important dans la reconnaissance du codon initiateur. Son alignement correct avec l’AUG permet l’hydrolyse du GTP en GDP par eIF5 et déclenche ainsi l’élongation. Afin d’être différencié du Met-ARNt « élongateur » et d’assurer toutes ces fonctions, le Met-ARNti présente une séquence nucléotidique différente et des modifications qui le rendent unique (figure 7). Des travaux suggèrent que la structure particulière du Met-ARNt initiateur serait impliquée dans la transmission du signal indiquant que la reconnaissance du codon initiateur a bien eu lieu (Barraud et al., 2008). Lors de l’incorporation du Met-ARNti dans la chaîne polypeptidique, le GTP contenu dans le complexe ternaire est hydrolysé en GDP libérant ainsi le complexe eIF2GDP. Afin d’initier un nouveau cycle de traduction, il est nécessaire de recycler le GDP en GTP. Cette réaction est catalysée par le facteur d’initiation eIF2B.. Figure 7 : Structures du Met-ARNt initiateurs et du Met-ARNt élongateur humain Issue de Farruggio D et al, 1996.. C.1.1.3 eIF2B eIF2B est la GEF permettant l’échange GDPGTP pour eIF2. eIF2B est un double pentamère composé d’un double lot de sous-unités : à (Wortham et al., 2014). Les sous-. 31.

(34) 4E-BP1 et la traduction unités α, β et δ forment le complexe régulateur tandis que les sous-unités  et portent l'activité catalytique. eIF2Best responsable de l’échange nucléotidique. L’activité d’eIF2B est soumise à deux types de régulations. La première est indirecte et est dépendante de l’état de phosphorylation d’eIF2. En effet, la liaison du complexe régulateur à la forme phosphorylée d’eIF2a pour effet d’inhiber l’activité du complexe catalytique. D’autre part, l’activité du complexe peut être inhibée de manière directe lorsqu’eIF2B est phosphorylée par la kinase GSK-3 (Glycogen Synthase Kinase-3) (Welsh et al., 1998). Xuemin Wang et ses collaborateurs ont également décrit un autre site phosphorylation inhibiteur d’eIF2B sensible à la disponibilité en acide aminé dont la kinase demeure toujours inconnue (Wang and Proud, 2008). C.1.2. Le recrutement du complexe ternaire sur la petite sous-unité du. ribosome Après sa formation, le complexe ternaire se lie à la sous-unité 40S du ribosome grâce à l’intervention d’autres facteurs d’initiation formant ainsi le complexe 43S. Chez les eucaryotes, le modèle standard propose que les protéines eIF1, eIF5, eIF3 et eIF1A qui sont préalablement associées à la sous-unité 40S, stabilisent la liaison du complexe ternaire avec la petite sous-unité ribosomique. eIF1A et eIF1, en plus de lier eIF2, maintiennent la sousunité 40S en conformation « ouverte » favorisant la liaison du complexe ternaire (Feoktistova et al., 2013; Passmore et al., 2007). C.2 Le complexe eIF4F : médiateur du recrutement du complexe 43S sur l’ARNm Que ce soit chez les eucaryotes ou chez les bactéries, le contrôle de l’initiation fait principalement intervenir la reconnaissance du codon initiateur. Chez les bactéries, les ARNm sont polycistroniques. Ils présentent donc de nombreux sites d’initiation de la traduction le long d’un même ARNm. La séquence Shine-Dalgarno (SD) située en amont de chaque codon initiateur assure le recrutement de la sous-unité 30S via l’appariement de la séquence anti-SD complémentaire présente sur l’ARN 16S. La régulation de la traduction des ARNm procaryotes se fait donc principalement via la modulation de l’accès du ribosome à la séquence Shine-Dalgarno. Chez les eucaryotes, en revanche, les ARNm sont presque toujours monocistroniques et leur codon initiateur est souvent le premier AUG situé en 5’ de. 32.

(35) 4E-BP1 et la traduction l’ARNm. Le positionnement du ribosome à l’extrémité 5’ de l’ARNm permet le balayage intégral du 5’UTR qui est propice à l’identification du codon initiateur. Des expériences réalisées avec des ARNm synthétiques possédant très peu de structures secondaires ont montré que le complexe 43S avait la capacité de se lier directement à l’ARNm (Pestova and Kolupaeva, 2002). Cependant, les 5’UTR des ARNm cellulaires étant structurés, leur traduction nécessite l’intervention de facteurs d’initiation (Svitkin et al., 2001). Le complexe eIF4F est nécessaire au positionnement correct du ribosome au niveau du 5’UTR des ARNm. Il est composé de trois protéines : eIF4G, une protéine d’échafaudage sur laquelle viennent se fixer eIF4E et eIF4A. eIF4E possède un site de reconnaissance pour la coiffe des ARNm et eIF4A est une ARN hélicase qui intervient dans la dénaturation des structures secondaires de l’ARNm au niveau du 5’UTR. Ensemble, la sous-unité 43S et le complexe eIF4F forment la sous-unité 48S, aussi appelé complexe de préinitiation (PIC). (Voir figure 8). Figure 8 : Les facteurs d’initiation eIF4 et eIF3 permettent le recrutement de la sous-unité 40S. C.2.1. eIF4E. Il existe trois isoformes d’eIF4E : eIF4E-I, eIF4E-II (également appelé 4EHP ou 4E-LP) et eIF4E-III. Cependant, elles ne partagent pas les mêmes partenaires protéiques. Par exemple, contrairement à eIF4E-I, eIF4E-II n’interagit pas avec eIF4G et eIF4E-III n’est pas reconnue par les 4E-BPs (eIF4E Binding Protein). Par ailleurs, seul eIF4E-I (de souris) est capable de sauver le phénotype létal de la délétion du gène unique eIF4E chez la levure 33.

(36) 4E-BP1 et la traduction (Joshi et al., 2004). Il semble donc que les trois protéines aient des fonctions distinctes qui restent à élucider. Pour la suite, eIF4E fera référence à la plus étudiées des trois isoformes : eIF4E-I. C.2.1.1 Les fonctions d’eIF4E eIF4E a été identifiée comme une protéine ayant la capacité à lier la coiffe des ARNm par Nahum Sonenberg en 1978 (Sonenberg et al., 1978). La résolution de la structure tridimentionnelle chez la levure S. Cerevisiae, chez la souris puis chez l’homme montre qu’eIF4E a une forme dite « en gant de baseball ». La coiffe des ARNm se loge dans sa surface concave et y est maintenue par deux résidus Tryptophane (W56 et W102 chez l’Homme et la souris) (figure 9). Via sa liaison avec eIF4G, il permet le recrutement du ribosome à l’extrémité 5’ des ARNm assurant ainsi un balayage intégral du 5’UTR par la sousunité 43S. eIF4E est également impliqué dans le transport nucléocytoplasmique de certains ARNm (Strudwick and Borden, 2002). Il a récemment été montré par une équipe californienne qu’eIF4E était également capable de stimuler l’activité ARN hélicase d’eIF4A et cela indépendamment de sa fonction de liaison à la coiffe (Feoktistova et al., 2013). eIF4E étant le facteur clé de l’initiation cap-dépendante, il est soumis à une régulation permanente.. Figure 9 : Structure crystalographique du complexe eIF4E (murin) /m7GTP/le peptide eIF4G Issue de Volpon L, 2006.. 34.

(37) 4E-BP1 et la traduction C.2.1.2 Régulations d’eIF4E. Régulation par sa phosphorylation. eIF4E est phosphorylé sur un site unique, la serine 209, par les kinases Mnk1 et Mnk2 (Mitogen activated kinases (MAPK)-interacting protein kinases) (Scheper et al., 2001; Waskiewicz, 1997). Les Mnk possèdent un site de liaison sur eIF4G facilitant la phosphorylation d’eIF4E lorsqu’il est engagé dans le complexe eIF4F (Pyronnet et al., 1999) (figure 10). En ce qui concerne ses phosphatases, la phosphorylation d’eIF4E a récemment été décrite comme étant la cible directe de la protéine phosphatase 2A : PP2A (Li et al., 2010b). L’impact de la phosphorylation d’eIF4E reste sujet à débat. Si certains ont montré que la phosphorylation d’eIF4E augmente son affinité pour la coiffe (Minich et al., 1994), d’autres ont obtenu un résultat inverse (Scheper et al., 2002). Chez les souris KO pour les kinases Mnk1 et Mnk2, la synthèse globale n’est pas affectée et les souris ne présentent pas de retard développemental ni de phénotype notable indiquant que la phosphorylation d’eIF4E n’est pas nécessaire pour la croissance normale des animaux (Ueda et al., 2004). Cependant, la phosphorylation d’eIF4E a été associée à son potentiel oncogénique (voir chapitre I, section C.2.1.3).. Figure 10 : La phosphorylation d’eIF4E par les MNK est favorisée lorqu’il est dans le complexe eIF4F Les Mnk phosphorylent eIF4E sur sa sérine 209 (séquence humaine). Leur fixation à eIF4G assure la proximité de leur substrat.. 35.

(38) 4E-BP1 et la traduction Régulation de son expression. Si la phosphorylation d’eIF4E a été très étudiée, sa régulation transcriptionnelle demeure peu documentée. Robin Jones et ses collaborateurs ont identifié c-myc comme facteur de transcription simulant l’expression d’eIF4E (Jones et al., 1996). Deux membres de la famille des PCBP (PolyC-binding protein), hnRNPK et PCBP1 ont également été décrits comme facteurs de transcription activateurs du promoteur d’eIF4E (Lynch et al., 2005; Meng et al., 2007). Inversement, p53 en se liant avec c-myc jouerait plutôt un rôle de répresseur de l’expression d’eIF4E (Zhu et al., 2005). La stabilité de l’ARNm d’eIF4E est aussi la cible d’une régulation. En effet, HuR stabilise l’ARNm d’eIF4E en empêchant la liaison déstabilisatrice d’AUF1 à son 3’UTR (Topisirovic et al., 2009). La séquence peptidique d’eIF4E contient de nombreuses lysines pouvant être la cible d’une polyubiquitinylation entrainant sa dégradation par le protéasome. La forme polyubiquitinylée d’eIF4E ne perd pas sa capacité à lier la coiffe cependant elle voit sa liaison avec eIF4G et sa phosphorylation diminuée. Par ailleurs, la surexpression des 4E-BPs semble inhiber l’ubiquitinylation et la dégradation d’eIF4E (Murata and Shimotohno, 2006). Si chez l’homme,Takayuki Murata et ses collaborateurs ne font que suggérer l’implication de l’E3 ubiquitine ligase Chip (Carboxyl terminus of heat shock cognate protein 70-interacting protein), chez la drosophile, l’E3 ubiquitine ligase Diap1 (Diaphanous homolog 1) a été identifiée comme responsable de la polyubiquitinylation d’eIF4E (Lee et al., 2007).. Régulation par les 4E-BPs. La disponibilité d'eIF4E pour former le complexe eIF4F est majoritairement régulée par des protéines 4E-IP (eIF4E-Interacting Protein) qui entrent en compétition avec eIF4G pour la fixation sur eIF4E. Il existe de nombreuses 4E-IP capables d’inhiber l’activité traductionnelle d’eIF4E par des mécanismes différents. Parmi ces mécanismes, le plus étudié est la séquestration d’eIF4E par les protéines 4E-BP (pour eIF4E Binding Proteins qui désigne indifféremment 4E-BP1, 4E-BP2 ou 4E-BP3) et notamment 4E-BP1. L’interaction entre eIF4E et 4E-BP1 est dépendante de nombreux stimuli et est régulée par un jeu de phosphorylations/déphosphorylations détaillé plus bas (voir chapitre I section D.2.2.3).. 36.

(39) 4E-BP1 et la traduction C.2.1.3 eIF4E et cancer Pour se dupliquer, la cellule a besoin de doubler sa quantité protéique pour la répartir équitablement entre les deux cellules filles. La traduction est donc intimement liée au processus de prolifération. De plus, la traduction spécifique de certains ARNm dits oncogéniques est augmentée lors du processus de cancérisation. eIF4E est considéré comme un proto-oncogène. Sa simple surexpression induit la transformation cellulaire (Avdulov et al., 2004; Lazaris-Karatzas et al., 1990) et favorise le développement de tumeurs chez la souris (Ruggero et al., 2004). Il est également capable de coopérer avec des oncogènes de type Ras, c-myc ou E1A pour induire la transformation cellulaire dans différents modèles (Lazaris-Karatzas et al., 1992) et promouvoir la survie cellulaire (Wendel et al., 2004). Sa forme phosphorylée semble également augmenter son activité oncogénique in vivo. En effet, l’expression d’une forme non phosphorylable d’eIF4E dans un modèle murin de cancer de la prostate diminue de façon drastique l’incidence et la sévérité des lésions cancéreuses. De même l’ablation des kinases Mnk1/2 responsables de la phosphorylation d’eIF4E inhibe la progression tumorale de lymphomes induits par la perte du suppresseur de tumeur PTEN (Phosphatase and TENsin homolog) (Furic et al., 2010; Ueda et al., 2010) . D’autre part, eIF4E est retrouvé surexprimé dans de nombreux cancers tels que le cancer du colon, du sein, de la vessie, du poumon… (De Benedetti and Graff, 2004; Mamane et al., 2004) et sa surexpression est souvent associée à un mauvais pronostic (Graff et al., 2008). Son potentiel oncogénique est principalement expliqué par sa capacité à stimuler la traduction d’ARNm dits « sensibles à eIF4E» qui codent fréquemment pour des protéines impliquées dans des processus oncogéniques tels que la prolifération (c-myc, cycline D1), la survie (Mcl-1, survivine) ou encore la dissémination métastatique (VEGF, FGF2) (Mamane et al., 2004, 2007). Ces ARNm ont la particularité de posséder des 5’UTR longs et structurés qui rendent leur traduction très dépendante de l’activité ARN hélicase apportée par le complexe eIF4F. (Voir figure 11) Un autre mécanisme à travers lequel eIF4E favorise la transformation oncogénique fait intervenir sa fonction dans l’export des ARNm. En effet, la surexpression d’eIF4E stimule l’export de certains ARNm oncogéniques tel que celui de la cycline D1 (Culjkovic et al., 2005).. 37.

(40) 4E-BP1 et la traduction Récemment, une équipe canadienne a montré que la surexpression d’eIF4E conduit au remodelage du pore nucléaire de manière à favoriser l’export des ARNm dépendants d’eIF4E (Culjkovic-Kraljacic et al., 2012).. Figure 11 : Influence de la quantité de complexes eIF4F sur la traduction d’ARNm dits eIF4E sensibles et sur la traduction des ARNm peu sensibles Les ARNm contenant des 5’UTR longs et structurés codent généralement pour des protéines impliquées dans la prolifération, la survie et la croissance tumorale (haut). Leur traduction est très dépendante de l’activité de l’hélicase eIF4A dont le positionnement à l’extrémité coiffée de l’ARNm est très dépendante de l’assemblage du complexe eIF4F. A l’inverse, les ARNm codant pour des protéines “de ménage” (actine, GAPDH…) présentent souvent des 5’UTR courts et peu structurés. Leur traduction n’est quasiment pas affectée par les variations d’assemblage du complexe eIF4F. Adaptée de Roux P et Topisirovic I, 2012. C.2.2. eIF4G. C.2.2.1 Les multiples interactions d’eIF4G assurent le recrutement et la stabilisation de la sous-unité 43S sur l’ARNm eIF4G est une protéine d'échafaudage qui permet le recrutement de nombreuses protéines nécessaires à l'initiation de la traduction (figure 8). eIF4G permet le recrutement de la sous-unité 43S via deux mécanismes : l’un indirect et l’autre direct. D’une part, eIF4G possède un site de liaison à eIF4A, qui, via son activité ARN hélicase déroule les structures secondaires de l’ARNm afin de présenter un ARN simple brin favorable au recrutement de la. 38.

(41) 4E-BP1 et la traduction sous-unité 43S. D’autre part, eIF4G favorise le recrutement de la 43S via son interaction physique avec eIF3, un des facteurs d’initiation de la sous unité 43S. C’est la liaison entre eIF4G et la protéine de reconnaissance de la coiffe eIF4E qui permet le positionnement de la sous-unité 43S en 5’ de l’ARNm assurant ainsi un balayage efficace du 5’UTR à la recherche du codon initiateur. De plus, la liaison eIF4G-eIF4A maintient eIF4A dans une conformation active (Hilbert et al., 2011; Özeş et al., 2011). eIF4G présente également deux sites de liaison à l’ARN qui permettent d’augmenter l’interaction eIF4E-coiffe (Haghighat and Sonenberg, 1997; Prévôt et al., 2003; Yanagiya et al., 2009). C.2.2.2 eIF4G favorise la circularisation des ARNm L’interaction directe entre la protéine de liaison à la queue polyA (PABP) et eIF4G confère à l’ARNm une conformation circulaire dans laquelle le 5’UTR est spatialement rapproché du 3’UTR (figure 3). Cette structure dite « closed-loop » est soupçonnée de faciliter le recyclage des ribosomes vers l’extrémité 5’UTR et de favoriser la traduction d’ARNm matures possédant à la fois une coiffe et une queue poly(A). Cependant, les conséquences de cette conformation particulière sur la traduction sont discutées et semblent varier en fonction des types cellulaires. Alors que l’ablation de l’interaction eIF4GPABP n’a que peu d’incidence sur l’efficacité de traduction dans un système de réticulocytes de lapin (Hinton et al., 2007), elle provoque dans certaines cellules une diminution sensible de l’efficacité de traduction en altérant notamment la liaison d’eIF4E avec la coiffe et la formation du complexe 80S (Kahvejian et al., 2005). C.2.2.3 eIF4G stimule la phosphorylation d’eIF4E eIF4G possède également un site de liaison aux kinases d’eIF4E : Mnk1 et Mnk2, facilitant la phosphorylation d’eIF4E lorsqu’il est engagé dans le complexe eIF4F (Fukunaga and Hunter, 1997; Pyronnet et al., 1999). L’interaction eIF4G-Mnk étant permissive à la phosphorylation d’eIF4E, elle est soumise à régulation. Ainsi la phosphorylation de Mnk1 par la kinase Pak2 déstabilise la liaison des deux protéines (Orton et al., 2004). A l’inverse, la phosphorylation d’eIF4G par PKC favorise son association avec Mnk1 (Dobrikov et al., 2011). Enfin, la séquestration d’eIF4E par les 4E-BPs inhibe la phosphorylation d’eIF4E. Les 4E-BPs en se liant à eIF4E provoquent la dissociation du complexe eIF4E-eIF4G-Mnk1/2.. 39.

(42) 4E-BP1 et la traduction eIF4E n’étant plus à proximité de ses kinases, il est phosphorylé moins efficacement (Müller et al., 2013). C.2.3. eIF4A. eIF4A est une DEAD-box ARN hélicase spécialisée dans la dénaturation des structures secondaires des ARNm. Elle est recrutée par eIF4G et via son activité ARN hélicase, elle permet la progression de la petite sous-unité ribosomique le long de l'ARNm jusqu'au codon initiateur. Elle est particulièrement requise pour la traduction des ARNm possédant un 5' UTR structuré (Svitkin et al., 2001). Chez les mammifères, il existe trois isoformes : eIF4A-I, eIF4A-II, eIF4A-III. Avec plus de 90% d’identité de séquence, eIF4A-I et eIF4A-II sont très similaires. Elles sont toutes deux cytoplasmiques et partagent la même fonction ARN hélicase. In vitro, les deux isoformes se comportent de la même manière au sein du complexe eIF4F (Yoder-Hill et al., 1993). Cependant, elles diffèrent de par leur profil d’expression : si eIF4A-I est exprimée de manière ubiquitaire, eIF4A-II est préférentiellement exprimée dans les tissus peu prolifératifs. eIF4AIII en revanche a une localisation nucléaire. Elle ne présente que 60% d'homologie avec les autres membres et n'est pas capable de recruter la sous-unité 40S (Li et al., 1999) mais semble jouer un rôle majeur au sein du complexe EJC (Exon Junction Complex) ainsi que dans l'épissage et la dégradation des ARNm (Saulière et al., 2012). C.3 Le balayage du 5’-UTR et la reconnaissance du codon initiateur Une fois que la sous-unité 43S a été recrutée au niveau de l’extrémité 5’ de l’ARNm, elle procède au balayage (ou scanning) du 5’UTR à la recherche du codon initiateur. L’initiation à un codon AUG est plus efficace lorsqu’il se situe dans un environnement nucléotidique particulier défini par la séquence consensus 5’-GCCRCCAUGG-3’ (R : base purique) (Kozak, 1986). Cependant beaucoup d’ARNm échappent à cette règle et la traduction peut également démarrer au niveau de codons non-canoniques (CUG, ACG, GUG) s’ils sont situés dans un environnement nucléotidique favorable (Peri and Pandey, 2001). Afin de reconnaitre le codon initiateur, la sous-unité 43S utilise le principe de complémentarité de base entre le codon AUG et l’anti codon présent sur le Met-ARNti.. 40.