Les cellules de Paneth

Les cellules de Paneth furent décrites il y a plus d’un siècle par Gustav Schwalbe et Josef Paneth. Situées au fond des cryptes intestinales (ou cryptes de Lieberkühn), ce sont des cellules pyramidales pourvues d’un réticulum endoplasmique abondant et présentant de nombreuses granules de sécrétion regroupées au pôle apical (figure 39). Elles sont spécialisées dans la sécrétion des peptides à activité antimicrobienne tels que les - défensines, le lysozyme C, ou la phospholipase A2. Ces peptides s’attaquent aux bactéries commensales aussi bien qu’aux pathogènes extérieurs en déstabilisant leurs membranes. Ainsi, les cellules de Paneth participent à l’immunité innée, empêchent la colonisation bactérienne des cryptes et contribuent à la composition du microbiote intestinal (Bevins and

Salzman, 2011). Les peptides antimicrobiens sont synthétisés et maturés dans le RE puis maturés à nouveau dans le golgi avant d’être concentrés dans des granules de sécrétion. L’exocytose de ces granules de sécrétion est en partie déclenchée en réponse à différents stimuli tels que les agonistes cholinergiques (Satoh et al., 1995), les bactéries ou les fragments bactériens (Ayabe et al., 2000) ou d’autres agonistes des TLR (Toll Like Receptor) (Rumio et al., 2012). Les peptides sécrétés diffusent ensuite dans le mucus qui recouvre la muqueuse intestinale et participent ainsi à la barrière anti-microbienne (Meyer-Hoffert et al., 2008).

Figure 39 : Représentation schématique de l’épithélium intestinal

La crypte de Lieberkühn et la villosité intestinale sont représentées. Les principaux types cellulaires de l’épithélium intestinal sont indiqués. Une image d’une crypte de Lieberkhühn obtenue par microscopie photonique permet de visualiser les cellules de Paneth et les granules de sécrétion qu’elles contiennent.

La production et la maturation de nombreuses protéines produites par les cellules de Paneth représentent un défi de taille pour le réticulum endoplasmique. Comme bon nombre de cellules exocrines séreuses, les cellules de Paneth présentent une sensibilité accrue au

stress du RE qui s’illustre dans plusieurs études clé. Cette sensibilité est particulièrement visible dans les souris présentant une délétion d’XBP1 spécifiquement dans l’épithélium intestinal. Alors que l’absence d’XBP1 n’affecte pas les entérocytes, elle provoque l’absence totale de cellules de Paneth et la diminution du nombre de cellules caliciformes à mucus (Kaser et al., 2008). De même, le stress induit par l’ischémie et la reperfusion de l’intestin génère une réponse UPR soutenue et conduit à l’apoptose des cellules de Paneth (Grootjans et al., 2011).

La sensibilité des cellules de Paneth au stress du RE favorise le développement de pathologies inflammatoires du tube digestif (ou IBD pour Inflammatory Bowel Disease) telles que la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse. La maladie de Crohn se caractérise par une inflammation qui est favorisée par une réponse immune inadaptée face aux bactéries intestinales. Les cellules de Paneth, de par leur activité antimicrobienne, protègent de la maladie de Crohn. D’autre part, plusieurs gènes prédisposant à la maladie de Crohn impliquent directement la cellule de Paneth (Wehkamp and Stange, 2010). La colite ulcérative, quant à elle, est caractérisée par une inflammation du colon dont la cause demeure toujours inconnue.

Les voies de la réponse au stress du RE semblent exercer un rôle majoritairement protecteur vis-à-vis des pathologies inflammatoires du tube digestif. La perte d’XBP1 chez la souris augmente leur sensibilité à la colite induite par le dextran sodium sulfate, un agent pro-inflammatoire. De plus, un variant d’XBP1 identifié chez l’homme a été associé avec un risque de développer la maladie de Crohn (Kaser et al., 2008).

D’autre part, AGR2 (Anterior Gradient 2), une protéine appartenant à la famille des protéines disulfide isomérases (PDI), est fortement exprimée dans les cellules de Paneth. La délétion d’AGR2 chez la souris provoque une altération de la morphologie des cellules de Paneth, une augmentation des marqueurs du stress du RE (BIP et XBP1s) et une colite semblable à celle observée chez les patients atteints de la maladie de Crohn (Zhao et al., 2010).

La phosphorylation d’eIF2 qui peut être activée en aval de la kinase PERK joue également un rôle important dans le fonctionnement des cellules de Paneth. Les souris exprimant une forme d’eIF2 non phosphorylable (eIF2S51A) spécifiquement dans les

cellules intestinales, présentent une altération des cellules de Paneth à la fois dans leur structure et dans leur fonctionnement. Elles présentent notamment une fragmentation du RE, une réduction du nombre de granules de sécrétion et une diminution de la production de protéines antimicrobiennes. Ces souris sont caractérisées par une sensibilité accrue à l’infection et à la colite induite par le dextran sodium sulfate (Cao et al., 2014).

En revanche, le facteur de transcription CHOP qui est activé lors d’une colite induite dans les souris xbp1-/-, Atf6-/- ou p58ipk-/- semble contribuer à la pathologie intestinale. C’est ce que suggère une étude qui montre que les souris KO pour le facteur de transcription CHOP, sont protégées de la colite induite par le dextran sodium sulfate (Namba et al., 2009). L’ensemble de ces données montre bien l’importance des protéines impliquées dans la réponse UPR pour la survie des cellules de Paneth.

INTRODUCTION

CONTEXTE ET OBJECTIFS

Le contrôle de la traduction est un des mécanismes clés de la régulation de l’expression génique. Il intervient principalement au niveau de l’initiation de la traduction et implique la régulation des facteurs d’initiation de la traduction (eIF). Parmi ces facteurs, eIF4E, qui reconnaît la coiffe des ARNm, est une des protéines essentielles à l’initiation de la traduction cap-dépendante. Sa fonction traductionnelle peut être inhibée par son interaction avec les protéines 4E-BP (désignant indifféremment 4E-BP1 et 4E-BP2). Cependant, l’activité inhibitrice des 4E-BP n’est pas constitutive et est soumise à une régulation post traductionnelle principalement effectuée en aval de la voie PI3K/Akt/mTOR. Lorsqu’elles sont phosphorylées par la kinase mTOR, leur affinité pour eIF4E diminue drastiquement et elles ne peuvent plus exercer leur activité de répresseur traductionnel. Les 4E-BP apparaissent donc comme des régulateurs majeurs de la synthèse protéique.

Même si les 4E-BP sont exprimées de manière ubiquitaire, elles présentent des profils d’expression singuliers. De manière intéressante, le pancréas est l’organe qui exprime le plus 4E-BP1 (ARNm et protéine) alors que 4E-BP2 n’est que très faiblement exprimé dans cet organe. Cependant, le fort taux d’expression de 4E-BP1 au niveau pancréatique reste inexpliqué.

Mon premier objectif a donc été de caractériser le profil d’expression général de 4E-BP1 au sein de l’organisme et de rechercher les mécanismes moléculaires à l’origine de sa forte expression spécifiquement dans le pancréas.

Dans le pancréas, 4E-BP1 est soupçonnée de contrôler le taux de synthèse des enzymes digestives. Cette hypothèse se base sur des résultats obtenus in vivo ou à partir d’acini isolés qui montrent que les formes inhibitrices de 4E-BP1 (hypophosphorylées) sont

converties en formes non-inhibitrices (hyperphosphorylées) lors de traitements avec des sécrétagogues tels que la CCK ou consécutivement à la prise alimentaire. Cependant, ces données restent corrélatives et aucun lien de cause à effet entre la régulation de 4E-BP1 et la synthèse des enzymes digestives n’a été démontré. De plus, 4E-BP1 ne régule pas seulement la traduction d’ARNm codant pour des enzymes digestives mais possède une fonction générale sur la traduction des protéines. Elle est notamment impliquée dans la réponse au stress et le contrôle de la prolifération. Cependant, son rôle précis dans le pancréas n’est pas complètement élucidé.

Mon second objectif a donc été d’étudier la fonction de 4E-BP1 (et de son homologue 4E-BP2) dans la physiologie pancréatique.

METHODOLOGIE

L’analyse du profil d’expression de 4E-BP1 a été effectuée par western blot et marquages immunohistochimiques à partir de prélèvements issus de nombreux organes murins. Des souris invalidées pour les facteurs de transcription suspectés de réguler 4E-BP1, ainsi que deux lignées cellulaires acineuses pancréatiques, AR4-2J et 266-6, ont été utilisées pour l’analyse moléculaire de l’expression de 4E-BP1.

La fonction des 4E-BP dans la physiologie pancréatique a été explorée in vivo et ex vivo à l’aide d’un modèle murin présentant une délétion homozygote des gènes codant pour 4E-BP1 et son homologue fonctionnel 4E-BP2 (souris DKO).

ARTICLE : Translational homeostasis through endoplasmic-reticulum-

mediated massive expression of 4E-BP1 in serous exocrine tissues

Charline Lasfargues1,2, Yvan Martineau1,2, David Müller1,2, David A. Hess3, Daniel DiRenzo3, Arkady Khoutorsky4, Romain Baer1,2, Julie Guillermet-Guibert1,2, Nahum Sonenberg4, Stephen F. Konieczny3, Corinne Bousquet1,2 and Stéphane Pyronnet1,2,5

1

INSERM UMR-1037, Cancer Research Center of Toulouse (CRCT), Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer and Laboratoire d’Excellence Toulouse Cancer (LabEx TOUCAN), and 2

Université de Toulouse, 31403 France 3

Department of Biological Sciences and the Purdue Center for Cancer Research, Purdue University, West Lafayette, IN 47907

4

Department of Biochemisry & Rosalind and Morris Goodman Cancer Research Center, McGill University, Montreal, QC, H3A 1A3, Canada

5

Introductory paragraph

Serous exocrine cells synthesize large amounts of secreted proteins which transit through the endoplasmic reticulum (ER). How such massive protein synthesis can be physiologically regulated and how these secreting cells cope with heavy ER load remains incompletely understood. We show that serous exocrine cells, including pancreatic and salivary acinar cells and duodenal Paneth cells, highly express the regulator of protein synthesis 4E-BP1, but not the related 4E-BP2. Observations made in genetically modified mice, primary cell culture and established acinar cell lines indicate that 4E-BP1 gene transcription is maintained at high levels due to chronic activation of ER-dependent pathways and the consequential induction of the transcription factor ATF4 independently of exogenous stress. In turn, 4E-BP1 provides a critical regulatory point by controlling the massive production of secreted proteins and creating a protective feedback loop that limits the translation of CHOP mRNA, a transcription factor which otherwise induces cell death when overexpressed. We propose that permanent induction of 4E-BP1 through an ER- dependent pathway in serous exocrine cells provides a physiological means of controlling massive ER protein synthesis and ensuring cell survival.

Keywords: Pancreas, Salivary gland, Paneth cell, acinar cell, ER stress, UPR, 4E-BP1, ATF4, CHOP, apoptosis, pancreatitis

Figure 1. Correlation between 4E-BP1 and protein synthesis levels in serous exocrine cells.

(a) 4E-BP1 is highly expressed in pancreatic and salivary glands. Whole protein extracts from different mouse organs were processed for Western-blotting using the indicated antibodies. (b) 4E-BP1 is highly expressed in pancreatic, salivary and duodenal serous exocrine cells. Serial sections of paraffin-embedded pancreas, salivary gland or duodenum were processed for IHC using anti-4E-BP1 or 4E-BP2 antibodies. Nucleus are counterstained with hematoxylin. ac: acinar cells, d: ducts, i: islet of Langerhans, m: mucinous cells. White arrowheads: secretory-granule-containing and 4E-BP1-positive cells, black arrowheads: 4E- BP2-positive cells. (c) Pancreatic, salivary and duodenal acinar cells exhibit the highest rates of protein synthesis in vivo. The rates of protein synthesis were evaluated by IHC using an anti-puromycin antibody

(SUnSET method5) on sections of paraffin-embedded pancreas, salivary gland or duodenum from mice

which were injected with either puromycin or vehicle. Nucleus are counterstained with hematoxylin. ac: acinar cells, d: ducts, i: islet of Langerhans. White arrows: secretory-granule-containing and 4E-BP1- positive cells, black arrows: 4E-BP2-positive cells. (d) 4E-BP1 regulates pancreatic amylase production. The activity of secreted amylase was determined after treatment of acinar cells isolated from WT or Eif4ebp1 and Eif4ebp2 double knock-out (DKO) mice with 10µM acetylcholine (Ach) for 10 or 20 minutes. Data

Main text

The translation of mRNAs into proteins is a complex molecular process regulated by extra- and intracellular stimuli. Among the eukaryotic translation initiation factors (eIFs) whose activity is regulated by signaling pathways, the cap-binding protein eIF4E plays a central role1. The molecular function of eIF4E is to recognize the mRNA 5’ cap structure and to dock the ribosome at the mRNA 5’ end through its interaction with other eIFs. The activity of eIF4E can be reversibly inhibited by different sequestering proteins, including the eIF4E- binding proteins 4E-BP1 and 4E-BP2, where their relative affinity for eIF4E is drastically reduced when they are hyperphosphorylated following induction of the protein kinase mTOR2.

4E-BP1 and 4E-BP2 proteins appear ubiquitously expressed although their respective amounts vary significantly among different tissues3. Since they are powerful regulators of protein synthesis, we hypothesized that their uneven patterns of expression could reflect organ-specific needs in translational control. To test this hypothesis, we compared 4E-BP1 and 4E-BP2 expression levels to protein synthesis rates in different organs. Western-blotting (WB) analyses of whole tissue extracts revealed that although both proteins were expressed in a wide range of tissues, significantly higher levels of 4E-BP1 were detected in the pancreas and in the salivary gland (Fig. 1a and Supplementary Fig. S1a). These two organs are composed mainly of exocrine cells (also called acinar cells) that are specialized in synthesizing large amounts of digestive enzymes destined for secretion. However, these organs also contain endocrine cells grouped in islets (pancreas), mucinous cells (salivary gland) and duct cells (both organs). Therefore, to distinguish which cell lineage highly expressed 4E-BP1, we performed immunohistochemistry (IHC) experiments using either 4E- BP1 or 4E-BP2 antibodies in pancreatic and salivary gland sections from wild type (WT) or double knock-out (DKO) mice carrying homozygous deletions of both Eif4ebp1 and Eif4ebp2 genes4. 4E-BP1 was highly and specifically expressed in pancreatic and salivary acinar cells but poorly expressed in endocrine, mucinous or duct cells. In contrast, 4E-BP2 was detected at low levels in all cell lineages (Fig. 1b). Other exocrine cells resembling those found in the pancreas and salivary glands are Paneth cells located at the bottom of intestinal crypts. Their function is also to synthesize large amounts of enzymes (such as lysozyme) or anti-microbial

peptides (such as defensin) which transit through the ER and are stored in secretory granules before secretion. The examination of 4E-BP1 and 4E-BP2 expression by IHC revealed two distinct subpopulations of cells confined at the bottom of duodenal crypts expressing high levels of 4E-BP1 or 4E-BP2 (Fig. 1b). 4E-BP1 positive cells contained secretory granules suggesting they corresponded to Paneth cells, while 4E-BP2 positive cells lacked secretory granules (Fig. 1b). Co-immunofluorescence (IF) experiments performed on duodenal sections using 4E-BP1 antibodies and antibodies recognizing specific markers of either Paneth (lysozyme) or stem (PCNA) cells confirmed that 4E-BP1 expression was restricted to Paneth cells as the cells also labeled with antibodies specific to lysozyme. In contrast, 4E-BP2 positive cells represented the PCNA positive stem cell population (Supplementary Fig. S1b). The signals detected in these three organs by WB or IHC using 4E-BP1 or 4E-BP2 antibodies were specific as no band or staining could be visualized when both antibodies were tested on organs obtained from DKO mice (Supplementary Fig. S2).

We next verified which cell lineage within these three organs exhibited the highest rate of protein synthesis in vivo by adapting the new SUnSET method5,6. This method is based on the incorporation of puromycin into nascent polypeptides and its subsequent detection by IHC using a specific puromycin monoclonal antibody. A short 30 min pulse with puromycin (intra-peritoneal injection) showed that pancreatic and salivary acinar cells and duodenal Paneth cells exhibited rates of protein synthesis much higher than those visualized in other cell lineages (Fig. 1c). Thus, a high level of 4E-BP1 expression, but not 4E-BP2, correlates with a high rate in protein synthesis and suggests that 4E-BP1 is the major regulator of translational control in serous exocrine cells of the pancreas, salivary gland and duodenum.

In pancreatic acinar cells, 4E-BP1 has been suspected of controlling the degree of biosynthesis of digestive enzymes. This assumption was supported by data we obtained in established pancreatic acinar cells or by data obtained in vivo showing that the translation inhibitory form of 4E-BP1 (i.e. hypophosphorylated) was converted into its non-inhibitory form (i.e. hyperphosphorylated) upon treatment of cells with the natural secretagogue gastrin7 or after food intake8. In these reports however, no causal link between increased 4E- BP1 phosphorylation and increase in the production of digestive enzymes has been demonstrated. Therefore, to verify whether 4E-BP1 actually controls the production of

digestive enzymes, we monitored the rates of amylase production by pancreatic acini isolated from WT versus DKO mice. The rate of amylase production was significantly higher in acini isolated from DKO mice compared to those isolated from WT mice (Fig. 1d). These data demonstrate that 4E-BP1 is upregulated specifically in acinar cells where it controls the production of digestive enzymes.

We next searched for the molecular mechanism accounting for specific upregulation of 4E-BP1 in serous exocrine cells. Expression of 4E-BP1 mRNA visualized by Northern- blotting in different organs revealed earlier that the large amount of 4E-BP1 protein in the pancreas was similarly accompanied by an elevated level of 4E-BP1 transcript3 suggesting a transcriptional mechanism. A few transcription factors regulating 4E-BP1 gene expression in mammalian cells have been identified2. However, these factors are expressed in numerous organs and under circumstances which cannot intuitively explain the specificity of 4E-BP1 expression in pancreatic, salivary and duodenal serous exocrine cells9-11. We therefore searched for alternative transcription factors.

One candidate is Mist1, which is the only known transcription factor expressed exclusively in serous exocrine cell types and is necessary for the acquisition and maintenance of the acinar cell phenotype found in different secretory organs, including pancreatic and salivary glands and intestinal Paneth cells 12,13. Unfortunately, neither 4E-BP1 protein levels nor Eif4ebp1 promoter activity was altered following transfection of acinar 266-6 cells with a wild type (Mist1) or an inactive mutant (Mist1mb) Mist1 cDNA (Supplementary Fig. S3a). To ensure that Mist1 is not indirectly involved in 4E-BP1 expression in vivo, we then used mice carrying an inducible Mist1 transgene (Mist1CreER/CreER/LSL-Mist1myc)14. These mice do not express endogenous Mist1 as their two Mist1 alleles have been replaced by an inducible Cre recombinase (CreER). However, they carry a transgene encoding a myc-tagged Mist1 protein rendered inducible by CreER due to the presence of an upstream Lox-STOP-Lox (LSL) cassette. When left untreated, these mice do not express Mist1 (Mist1 KO). But, upon tamoxifen treatment, the activated Cre recombinase excises the stop cassette, thereby rescuing Mist1 expression (Mist1 KO rescue). In support of the negative data obtained in established acinar cells, no difference in Eif4ebp1 mRNA level could be detected upon

Figure 2. ATF4, but not XBP1 or ATF6, contributes to 4E-BP1 expression in acinar cells.

(a) Induction of 4E-BP1 protein and mRNA in ER-stressed acinar cells. Western-blotting using the indicated antibodies (top) and RT-qPCR using 4E-BP1 specific primers (bottom) were performed on protein or RNA extracts from pancreatic acinar cell lines AR4-2J and 266-6 treated with 8µg/mL tunicamycin (Tm) or vehicle (DMSO) for 4 or 8 hours. RT-qPCR data were obtained from three independent experiments performed in duplicates. *: p<0.05. (b) Induction of 4E-BP1 protein in ER-stressed human pancreatic acini. Western-blotting using the indicated antibodies was performed on protein extracts from human primary pancreatic acinar cells treated with either 8µg/mL tunicamycin (Tm) or DMSO for 8 hours. (c) Induction of 4E-BP1 mRNA upon XBP1 inactivation in the pancreas. 4E-BP1 and ATF4 mRNA levels were assessed by RT-qPCR in the pancreas from Mist1CreER/CreER Xbp1fl/fl mice treated or not with tamoxifen (Tam) 2, 3 and 4 weeks post-Tam. Data obtained from 3 or more mice per time point. *: p<0.05. (d) Down-regulation of 4E- BP1 in the pancreas of Atf4-null mice. Western-blotting using the indicated antibodies was performed on

pancreatic protein extracts from ATF4+/+, ATF4+/- or ATF4-/- mice. (e) ATF4 knock-down alters both basal

and ER-stress-induced 4E-BP1 expression in acinar cells. Western-blotting using the indicated antibodies was performed on protein extracts from 266-6 acinar cells which were treated for 8 hours with 8µg/mL tunicamycin (Tm) or DMSO following expression of a non-targeting (shSCR) or ATF4-targeting (shATF4) shRNA. (f,g) The ATF4-binding element (ATF4-RE) located in Eif4ebp1 intron 1 contributes to both basal ER-stress-induced 4E-BP1 expressions. (f) Luciferase (luc) in pGL2p plasmid was flanked by either the upstream Eif4ebp1 promoter (bp1p, containing the putative ATF6-RE) or the downstream ATF4-RE (ATF4) or both. (g) Luciferase activity was measured in extracts from 266-6 acinar cells which were treated for 6 hours with 8µg/mL tunicamycin (Tm) or DMSO 24 hours after transfection. Data obtained from three