HAL Id: dumas-01684804
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Claire Fourcy Lebrun
To cite this version:
Claire Fourcy Lebrun. Étude en période néonatale des substances immunoréactives interférant avec le dosage de digoxine. Sciences pharmaceutiques. 1989. �dumas-01684804�
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Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10
http://www.cfcopies.com/juridique/droit-auteur
ANNEE 1989
U. F. R. de PHARMACIE Domaïne de laMerci
La Tronche
MEMOIRE
DU DIPLOME.D'ETUDES SPECIALISEES DE
BIOLOGIE MEDICALE
Soutenue devant leJury Interrégional le6 janvier1989
Par Clair·e FOURCY épouse LEBRUN
/
N° D'oRDRE
,
l-oo-
/
.
Conformément auxdi~positions de l'Arrêtédu4 octobre1988tient
lieude : '
THE SE
POUR LE DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE
1 •
ETUDE EN PERIODE NEONATALE.DES SUBSTANCES
IMMUNOREACTIVES .INTERFERANT .AVEC ·
M. leProfesseur M. leDocteur MM. les Professeurs M. Me. M. LE DOSAGE DE DIGOXTNE J · J_ • .ROCHAT, P.S. JOUK-M. COMET A. FAVIER B. LACHET N. BENOIST
c
.
GUELfi Président du[Données à caractère personnel]
A mes pa.re:n.ts,
qui n'ont cessé de m'encourager.
A mes gra.:n.ds -pare:n.ts.
A mes be a. u:x::-pa.re:n. t s.
A t o u t e ma f ami J.. J.. e.
Vous m'avez fait l'honneur d'accepter de présider ce mémoire et cette thèse.
Je vous témoigne ici l'expression de mon très grand respect.
Au Docteur P.S. JOUK
Vous m'avez fait l'honneur de diriger ce
travail et de m'apporter constamment votre aide compétente et précieuse.
Votre disponibilité a permis de mener à bien la
réalisation de ces travaux. Je vous en remercie vivement.
Vous avez toujours témoigné une grande
compréhension à l'égard de nos recherches.
Je vous remercie pour l'accueil chaleureux que j'ai toujours trouvé dans votre Laboratoire.
A Monsieur B. LACHET
Je vous suis très reconnaissante pour l'aide hautement technique que vous m'avez apportée pour l'exploitation statistique des résultats.
Vous m'avez fait l'honneur de bien vouloir juger mon travail.
Soyez assuré de ma sincère reconnaissance.
A Monsieur C. GUELFI
Tu as toujours volontiers apporté ton aide,
tes conseils et tes encouragements aux
internes.
Je te témoigne ici toute ma reconnaissance.
A Madame N. BENOIST
Vous n'avez pas hésité à
région malgré de lourdes
professionnelles. Soyez-en remerciée.
venir d'une autre responsabilités
J'ai toujours trouvé
accueil chaleureux et
disponibilité.
auprès de vous un
une très grande
Vous avez su .m'apprendre, me conseiller,
m'encourager tout au long de mes études.
Veuillez trouver ici l'expression de ma
Madame BARBE,
pour son aide précieuse et son extrême compétence dans le domaine des dosages de digitaliques.
Tout le personnel du service de Médecine Néonatale et Réanimation Infantile du Professeur RAMBAUD,
pour leur aide dans la réalisation des
prélèvements chez les nouveau-nés.
Madame I. LE CARDINAL,
pour sa diligence dans la dactylographie de mon mémoire.
INTRODUCTION
His torique : La digitale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
PREMIERE PARTIE I. REVUE CRITIQUE CONCERNANT L'APPARITION DU CONCEPT DE DIGITATIQUES ENDOGENES . . . . . . . . . . . . 3
A. LES TECHNIQUES DE DOSAGE ... 4
1. Les méthodes immunologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2. :Les méthodes dites physiologiques ... 5
B. PROBLE!VlES !VlETHODOLOGIQUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1. Mise en évidence de la DLIS et de son caractère endogène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2. Conditions d'étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
La cinétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
. L'absence d'interférence ... 7
C. SYNTHESE, ACTIVITE, REGULATION, STRUCTURE ... 8
1. Siège de la synthèse ... 9
2. Y a-t-il une analogie fonctionnelle ... 9
3. Caractères physico-chimiques ...•... 10
4. Stimuli de la synthèse ...•... 10
D. IMPLICATIONS BIOLOGIQUES ET CLINIQUES ACTUELLES .... 11
1. Implications biologiques ... 11
2. Implications médicales ... 12
DEUXIEME PARTIE MATERIEL ET METHODES
I. MATERIEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
A. ENVIRONNEMENT DE L'ETUDE ... 15
B. DESCRIPTION DU MATERIEL ... 16
II. METHODES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
A. REALISATION DES PRELEVEMENTS SANGUINS ... 20
B. FICHE DE RENSEIGNEMENTS ... 20
C. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS DE SANG ... 22
D. LE DOSAGE DIGITALIQUE ... 22
1. Principe des méthodes de dosage ... 22
a. Dosage par polarisation de fluorescence ... 22
-principes physiques ... 23
. La fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
La polarisation de fluorescence . . . . . . . . 23
- application biologique le dosage immune-logique par polarisation de fluorescence ... 24
. Le système TDX Abbot t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
b. Dosage par radioimmunologie 28 2. Choix des kits réactifs ... . 29
a. Dosage par polarisation de fluorescence ... . 29
2. Statistiques inférentielles ... 31
a. Test statistique de corrélation ...•... 32
b. Test statistique de comparaison de tendances centrales . . . . . . . . . . . . . 32
TROISIEME PARTIE RESULTATS . . . . . . . . . . . . 33
QUATRIEME PARTIE : ANALYSE DES RESULTATS - DISCUSSION I. SELECTION DE DEUX KITS DE DOSAGE DE LA DIGOXINE Mise en évidence de "Digoxine Like Immunoreactive Substance" dans le sérum des nouveau-nés ... 39
A. ANALYSE DES RESULTATS ... 39
B. ETUDE STATISTIQUE DE COMPARAISON ET CORRELATION DES TAUX SERIQUES DE DLIS . . . . . . . 44
1. Test des rangs algébriques de Wilcoxon .... ···44
2. Test de Spearman ... 45
C. DISCUSSION . . . . . . . . . . 46
II. ETUDE CINETIQUE DE LA DLIS 47 A. ETUDE CINETIQUE TRANSVERSALE DE LA DLIS ... 47
B. ETUDE CINETIQUE LONGITUDINALE DE LA DLIS ... 49
1 . Rés u 1 ta t s . . . . . . . 50
A. CHOIX DE TESTS STATISTIQUES ... 55 B. RESULTATS ... 56
1. Corrélation du taux de DLIS (Tx2 ou Tx3) - Age
gestationel ... 56 2. Corrélation du taux de DLIS (Tx2 ou Tx3) et du
poids de naissance ... 57 3. Corrélation du taux de DLIS (Tx2 ou Tx3) et
l'aspect clinique du nouveau-né (hypotrophie,
détresse respiratoire, infection) ... 57 4. Corrélation du taux DLIS (Tx2 ou Tx3) et aspect
clinique de la mère (infection, hypertension) ... 58
CINQUIEME PARTIE PERSPECTIVES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
CONCLUSION ... 60 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 62
Le papyrus d'EBERS (ouvrage de référence qui dresse la listede p ~ d'un million de prescriptions utilisées en
Egypte sous lerègne du pharaon Amen hotep, au XVIè siècle
avant J.-C.) semble démontrer que les Egyptiens
connaissaient déjà la Digitale et l'utilisaientpour ses vertus curatives.
Le terme de Foxglove (dérivé de fairies'glove =gant de fée) se rencontre dans les textes anglais du Xè au XIIIè siècle. Il y désigne une plante, non décrite, qui sert à des applications cutanées, vraisemblablement laDigitale, très employée en onguent à cette époque.
La première description apparaît en 1543. Elle est raison de laressemblance de Selon lacouleur de lafleur, jaune sont distinguées.
fondamentale de laDigitale alors dénommée Digitalis en lafleur avec un déàcoudre. lesdeux variétés pourprée et Mais, l'évènement décisif qui va promouvoir laDigitale pourprée comme un grand médicament du coeur se situe en 1775. A cette date, William Withering, médecin anglais né dans le Shropshire, est avisé qu'une vieille femme guérissait, dans la campagne de cette région, les cas d'hydropisie rebelle par une médication secrète. Elle. lui présente la vingtaine de plantes qui lui servent à confectionner ses décoctions et infusions. De part sa formation de botaniste, Withering reconnaît, entre autre, des feuilles de Digitale pourprée qu'il identified'emblée comme étant l'élément actif du mélange.
Après de longs tâtonnements, Withering parvint à
codifier la prescription de laDigitale en infusion ou en poudre de feuilles déséchées, de telle sorte qu'elle détermine l'action diurétique sans causer ni vomissement, ni diarrhée. Ainsi, en 1785, à partir d'observations personnelles et de cas qui lui auront été adressés, Withering fait lepoint sur l'utilisationthérapeutique de laDigitale pourprée dans son livre :
''Account on the foxglove and sorne of itsmedical uses." Ilprécise dans son ouvrage qu'en plus de son activité diurétique, laplante est douée d'une puissante action toni -cardiaque et décrit également les effets secondaires, conséquence d'une posologie excessive ; ilsouligne enfin
la nécessité de déterminer la dose correcte pour chaque malade et d'éviter la toxicité.
Toutefois, au début du siècle dernier, l'importance de la découverte de Withering ne fut pas comprise de tous les
médecins. L'action bénéfique des digitaliques va être
sévèrement occultée par le mauvais usage qui en est fait :
prescription de doses excessives à l'origine d'une toxicité
fréquente, indications inadéquates.
C'est à partir de 1835 que les
extraire le principe actif de la
Médecine salue officiellement la
Nativelle qui finit par isoler cristallisée pure.
chimistes s'emploient à
Digitale. L'académie de grande découverte de en 1868 la Digitaline
Puis, peu à peu, jusqu'au milieu du 20è siècle, médecins
et physiologistes reconnaissent et démontrent les différen-tes actions de la Digitale sur le coeur dont l'effet inotrope positif.
Au cours de ces trente dernières années, les digitali-ques ont fait l'objet de très nombreux travaux. C'est ainsi
que trois découvertes capitales méritent de figurer
également dans l'historique des progrès qui ont contribué à
la connaissance des glucosides cardiotoniques :
- d'abord, la mise en évidence par Skou en 1965 de
l'ATPase Na+ K+ au niveau de la membrane cellulaire qui
permet d'éclairer le mécanisme intime de l'action inotrope positive, longtemps demeuré mystérieux ;
- ensuite, la mise au point dans les années 1965-1970 de techniques de plus en plus fines de dosages des taux plasmatiques des digitaliques qui rendent possible les études pharmacocinétiques ;
-enfin, l'utilisation par Smith, Haber et Butler à partir
de 1976 d'anticorps antidigoxine d'origine ovine, les
fragments Fab, révolutionnant enfin le traitement de
l'intoxication digitalique en permettant de guérir de façon
spectaculaire des cas d'absorption massive jusqu'alors
PREMIERE PARTIE
I.REVUE CRITIQUE CONCERNANT L'APPARITION DU CONCEPT
DE DIGITALIQUES ENDOGENES
C'est en 1785, ily a deux cents ans, que Sir Withering publie le premier article sur les propriétés thérapeutiques de la digitale. Illuiavait fallu dix ans pour isolerle principe actif d'une potion utilisée dans le traitement de l'hydropisiepar une vieille femme du Stropshire {1).
Les digitaliques ou glucosides- cardio-toniques utilisés en clinique proviennent encore actuellement de l'extractionà partir de trois espèces végétales principales, la Digitale, le Strophantus et laScille. Toutes ces plantes contiennent des hétérosides qui constituent les principes actifs et qui sont formés d'un sucre et d'une genine stéroïdienne {partie non sucrée). Tous ces hétérosides ont une grande analogie structurale mais différent entre eux par le nombre de groupement hydroxyle, qui varie de façon parallèle à l'hydrophilie {2,
31 4) •
La connaissance de certaines o ~ s d'origine
végétale utilisées en thérapeutique a permis de mettre en évidence l'existence de molécules endogènes mimant leurs effets. Ceci a déjà été lecas historiquement pour deux types de molécules les opiacés et les benzodiazépines. Ces découvertes font suite à la caractérisation du récepteur cellulaire de chacune des familles de molécules citées. Sur le récepteur, sont identifiés les sites de liaisons communs aux molécules d'origine exogène et
endogène (5).
Actuellement, cette démarche est engagée pour les molécules digitaliques dont le récepteur, laNa-K-ATPase membranaire (6,7), semble reconnaître des molécules endogènes. C'est l'ensemble de cette démarche que nous voudrions expliciter point par point, en envisageant successivement les outils, c'est à dire les techniques de dosage, les problèmes méthodologiques de mise en évidence du composé endogène, les caractéristiques structurales et métaboliques, et enfin, les implications biologiques et cliniques actuelles.
A. LES TECHNIQUES DE DOSAGES (8}
Tout commence par la mise à disposition depuis 1969
d'anticorps polyclonaux antidigitaliques dont l'intérêt est double : primo, d'avoir permis de mettre au point un dosage
immunologique du médicament (9} secondo, de permettre
après l'isolement des fragments Fab de ces anticorps, le traitement des intoxications digitaliques graves (10, 11).
Quelles sont
cardio-toniques ?
Il existe en fait immunologiques et étudierons d'abord les secondes, leur
les techniques de dosage des glycosides deux types de méthode : les méthodes
les méthodes physiologiques. Nous
les premières qui après avoir détrôné redonnent un regain d'intérêt.
1. LES METHODES IMMUNOLOGIQUES
Elles utilisent des antisérums "fabriqués''
contenant des anticorps reconnaissant des épitopes
(épitope : déterminant antigénique reconnu par le site de
combinaison des molécules anticorps} spécifiques à la
surface de la molécule digitalique.
- Les différents pools d'anticorps mis à notre
disposition par l'industrie sont des anticorps polyclonaux obtenus après injection chez le lapin ou la souris de la molécule digitalique rendue immunogène par absorption sur une protéine.
- Cependant, pour une même molécule, la
spécificité des anticorps fabriqués contre divers épitopes varie en fonction de la technique de fabrication utilisée ; et malheureusement, c'est un des problèmes actuels, la
localisation moléculaire de chaque épitope n'est pas
connue.
Le principe de la détection est de comparer l'intensité de la réaction antigène-anticorps obtenue pour
le sérum du patient étudié à une courbe d'étalonnage
réalisée à partir de solution contenant des digitaliques en
concentration connue.
se faire : soit par un marqueur radio-actif (8, 12) ; soit par un marqueur enzymatique (13) ; soit par polarisation de
fluorescence (14) mais cette révélation ne joue pas sur
le coeur même de la réaction immunologique. Les différen -ces, souvent minimes, observées entre les différents modes de révélation tiennent au fait que les différents kits
commercialisés utilisent des préparations d'anticorps
différents (15, 16, 17, 18}.
2. LES METHODES DITES PHYSIOLOGIQUES
Historiquement les premières utilisées, elles
reçoivent actuellement un regain d'intérêt.
Elles visent à comparer l'activité physiologique
du sérum étudié au niveau du site effectueur des
digitaliques par rapport à des sérums étalons contenant des
digitaliques en concentration connue.
- Au niveau moléculaire, les
exogènes (7, 19) agissent en bloquant la
membranaire de l'organisme.
digitaliques Na-K-ATPase - Ce site d'action est aussi le site de fixation de la molécule, ce qui permet de dire que cette ATPase membranaire est le ''récepteur digitalique" (6}.
Il va donc falloir pouvoir mesurer soit les concentrations des ions Na+ et K+ dans les différents compartiments intra et extra-cellulaires, soit la concentra-tion de molécules exogènes dont la réparticoncentra-tion intra-cellu-laire est dépendante de la même ATPase.
- Ainsi, la première méthode utilisée a été celle de la captation du rubidium 86 par des suspensions de globules rouges qui présentent une Na-K-ATPase membranaire
identique à celle existant à la surface du myocarde et du
muscle lisse (8}.
Plus récemment, d'autres méthodes physiologiques ont été proposées, dont la mesure de consommation d'ATP et la diminution de concentration en ATP au niveau d'une préparation de membranes cellulaires rénales (20).
B. PROBLEMES METHODOLOGIQUES
1. MISE EN EVIDENCE_DE LA DLIS ET DE SON CARACTERE ENDOGENE
La faible marge de manoeuvre existant entre les taux thérapeutiques et toxiques ne pouvait que grandement favoriser le succès de ces méthodes de dosage ; c'est ce qui a été observé (13, 21, 22, 23, 24).
D'emblée, elles ont mis en évidence une grande variabilité individuelle des taux observés aux doses
théra-peutiques usuelles cette variabilité était surtout
manifeste chez le nouveau-né, puisque 52 % se retrouvaient en zone toxique (25).
- Accusées les premières (26), les altérations de la fonction hépatique et rénale n'ont été impliquées que dans un faible nombre de cas.
- La deuxième hypothèse était d'envisager un problème de spécificité du dosage pour chaque tranche d'âge
( 27} •
Effectivement, le dosage immunologique chez des
sujets ne recevant pas de digitalique exogène a montré,
chez le nouveau-né à terme et prématuré, chez la femme
enceinte, et au cours de certaines affections de l'adulte,
l'existence d'un composé dosable interférant avec les
digitaliques exogènes. Cette substance a alors reçu le nom de "DLIS : Digoxine Like Immunoreactive Substance".
Son taux sérique dosable est habituellement faible
(0,1 à 0,4 ng/ml) mais peut atteindre des taux dits
thérapeutiques, supérieurs à 1 ng/ml (18).
2. CONDITIONS D'ETUDE
Avant de pouvoir envisager une origine endogène à cette DLIS, plusieurs conditions doivent être réunies, en
particulier chez le nouveau-né d'une part que la
cinétique des taux détectés soit compatible avec une
synthèse endogène d'autre part que toute interférence
La cinétique
Les études longitudinales de la cinétique sont peu nombreuses pour des raisons évidentes de difficulté de prélèvement chez le nouveau-né.
Certaines études dont les résultats ont été publiés (15, 18, 27, 28, 29, 30) montrent une ascension progressive jusqu'à un pic de détection qui se situe entre le premier et le huitième jour après la naissance, suivie d'une décroissance habituellement rapide.
Avant de être tout-à-fait faites :
conclure à une synthèse endogène, et pour rigoureux, deux objections doivent être - primo, les séries publiées sont limitées et demandent à être confirmées par de plus grandes séries,
- secondo, la cinétique croissante peut recevoir d'autres explications que la synthèse endogène, en particulier un
éventuel déplacement de l'équilibre de liaison aux
protéines ; et Valdes (28), en particulier, a dosé de façon séquentielle la DLIS, d'abord par dosage immunologique simple dans les conditions standard habituelles, puis après dénaturation thermique des protéines par ébullition du sérum pendant cinq minutes ; il montre ainsi qu'il existe de très larges var1ations de taux de DLIS mesurés en conditions basales, alors que la quantité totale dosée après dénaturation thermique est, elle, remarquablement stable.
L'interprétation de Valdes est que le dosage après dénaturation thermique permet de doser l'ensemble du DLIS : la forme libre, habituellement dosée dans les conditions basales, et la forme liée aux protéines. Il en déduit que l'augmentation des taux de DLIS décelée dans les conditions basales ne dépend que du déplacement de l'équilibre de la forme liée aux protéines vers la forme libre sous divers stimuli.
L'absence d'interférence
La deuxième condition était d'éliminer une
interférence avec un métabolite physiologique sécrété en quantité abondante chez la femme enceinte, le prématuré, le nouveau-né.
Les premières substances soupçonnées pour cette interférence sont bien naturellement les hormones stéroïdiennes, qui présentent une analogie de structure évidente avec les hétérosides cardio-toniques et qui ont un profil de sécrétion particulier au cours de la grossesse et chez le nouveau-né (13, 29, 31).
Cette interférence a été particulièrement étudiée par Jocelyn M. Hicks (32). Ses conclusions sont que chaque hormone stéroïdienne prise isolément à un taux physiologi-que n'entraîne pas d'interférence significative. Par contre, des sérums reconstitués à partir de pools de ces différentes hormones corticosurrénaliennes induiraient des interférences significatives pouvant atteindre des taux de digoxinémie dits thérapeutiques. Néanmoins, les caractéristiques de ces pools reconstitués sont très loin des répartitions physiologiques chez le nouveau-né et seule nous semble persister une éventuelle ambiguïté en ce qui concerne le sang prélevé au niveau du cordon.
C. SYNTHESE, ACTIVITE, REGULATION, STRUCTURE
Le principe de la nature endogène de la DLIS dosé par les méthodes immunologiques étant acquis, plusieurs questions se posent immédiatement.
1°) Quelle cellule ou organe est candidat pour la synthèse de ce digitalique endogène ?
2°) Outre une analogie de reconnaissance immunologique évoquant une analogie structurale, existe-t-il une analogie fonctionnelle ? Quelle est l'efficacité relative sur le récepteur de chacune de ces deux molécules endo et exogène ?
3°) Quels sont les caractères physico-chimiques de ce digitalique endogène ?
4°) Quels sont les stimuli actuellement reconnus actifs sur la synthèse des digitaliques endogènes ?
Essayons de répondre successivement à ces questions.
1. SIEGE DE LA SYNTHESE
Nous allons essayer de circonscrire très progres-sivement le problème ; en débutant chronologiquement, c'est-à-dire chez la femme enceinte et le foetus :
- les taux sériques maternels de digoxine endogène
augmentent régulièrement au cours de la grossesse
indétectables au premier trimestre, détectables à des taux très faibles dans 20% des cas au deuxième trimestre et
détectables à des taux moyens de 0,32 +/- 0,15 ng/ml dans
90 % des cas au troisième trimestre (33) - les taux
évoque une (33}
au niveau du cordon sont plus élevés ce qui origine foeto-placentaire plutôt que maternelle - enfin, l'égalité
l'artère ombilicale placentaire (33).
des taux au niveau de la veine et de évoque une origine foetale plutôt que Poursuivons. La synthèse est foetale, néonatale, nous l'avons vu précédemment, mais au niveau de quel
organe ? Notre connaisance est encore bien réduite et ne
repose que sur des dosages réalisés sur des broyats de différents organes. Les taux les plus élevés sont retrouvés au niveau de la surrénale foetale, qui fait figure de
premier candidat actuel à la synthèse.
2. Y-A-T-IL UNE ANALOGIE FONCTIONNELLE ?
L'activité fonctionnelle de ce digitalique
endogène a justement été recherchée sur de telles
préparations de broyat de surrénales de lapin (34). Ces études
fonctionnelle évaluée
rubidum 86, corrélée
digitalique endogène.
ont montré l'existence d'une activité sur l'inhibition de la captation du avec le dosage immunologique du
Cette étude est la seule à notre connaissance sur
3. CARACTERES PHYSICO-CHIMIQUES
On ne sait que peu de choses sur les caractéristi-ques physico-chimicaractéristi-ques de ce digitalique endogène. Les seuls renseignements dont nous disposons sont ceux obtenus
à partir des essais d'élimination de l'interférence dans le
dosage.
Il est hydrosoluble, thermostable, non digestible par des enzymes protéolytiques et sa masse moléculaire est
inférieure à mille daltons (28).
4. STIMULI DE LA SYNTHESE
Reprenons maintenant les différents stimuli ayant été invoqués dans la synthèse endogène des digitaliques. - chez la femme enceinte, les données restent contradictoi-res. Pour certains, l'hypertension artérielle gravidique est corrélée avec une augmentation des taux de digoxine
endogène sériques maternels (28) mais ceci n'est pas
retrouvé par d'autres auteurs lorsque les taux sont
rapportés à l'âge gestationnel (33).
- chez le nouveau-né, nous ne disposons pas d'études ayant tenté de corréler le taux de digoxine endogène avec les données hémodynamiques néonatales.
-chez l'adulte, dont nous n'avons pas parlé encore, la
digoxine endogène n'est retrouvée que dans certaines
situations pathologiques très particulières chez les
sujets insuffisants rénaux (26) dans 60% des cas ; chez les sujets acromégales présentant une surcharge volémique (20).
Le seul fil conducteur semblant exister actuelle-ment entre toutes ces situations est donc l'existence d'une
hypervolémie circulante. Quoique non encore démontré,
certains auteurs (20, 35) font jouer aux digitaliques endogènes le rôle de premier candidat en tant que facteur effecteur sur le tubule rénal de l'hormone natriurétique auriculaire.
D. IMPLICATIONS BIOLOGIQUES ET CLINIQUES ACTUELLES
1. LES IMPLICATIONS BIOLOGIQUES
Alors que la DLIS n'était interprétée que comme un défaut de spécificité des réactions immunologiques (36), de nombreux efforts ont été faits pour l'éliminer ou le diminuer (37, 38). Plusieurs techniques ont été essayées, toutes cherchant à mettre en évidence une différence de réactivité entre les digitaliques exogènes et le DLIS.
- La plus fondamentale a été de comparer le niveau d'interférence obtenu avec différents kits de dosage dont les épitopes de reconnaissance de l'hétéroside étaient partiellement connus (39). Le niveau d'interférence le plus faible est obtenu avec des kits (Abbott, Beckton Dickinson) (40} dont les anticorps sont dirigés préférentiellement contre le groupement hydroxyle en position trois du noyau stéroïdien il faut noter que ces kits permettent une reconnaissance équivalente de la digoxine et la digitoxine.
Par contre, les autres kits les plus couramment utilisés dont l'anticorps est tourné préféren-tiellement vers les cycles C et D du noyau stéroïdien ont une interférence beaucoup plus marquée.
- La deuxième méthode utilisée était basée sur une hypothèse de sensibilité différente à la dénaturation thermique. En fait, les résultats ne sont guère modifiés. Ces résultats ont par ailleurs permis d'établir le caractère thermostable de la molécule endogène (28).
- Le troisième groupe de méthodes repose sur l'étude d'une modification des liaisons anticorps-digoxine, anticorps-DLIS au cours de la réaction en fonction du temps et de la température d'incubation (41).
La rapidité d'association de l'anticorps avec la digoxine et le DLIS semble identique pour les deux molécules ; l'association est obtenue après quelques minutes. Cependant, l'obtention de l'équilibre d'affinité, lui, fait intervenir la force de liaison plus grande pour la digoxine qui va progressivement prendre la place du DLIS au niveau de l'anticorps, l'équilibre étant atteint en quelques heures, plus lentement à basse température, plus rapidement à haute température. Et effectivement, l'augmentation de la durée d'incubation diminue le niveau d'interférence avec le DLIS, que ce soit dans les méthodes dites "sandwich" classiques ou les méthodes "sandwich" séquentiellles (42).
Il n'est peut-être pas étonnant d'ailleurs que le DLIS soit apparu avec force ces dernieres années, étant donné la tendance générale au raccourcissement des durées d'incubation des réactions pour permettre de donner des résultats rapidement (43, 44, 45).
Maintenant que le DLIS a pris son caractère de digitalique endogène à part entière, l'intérêt pratique de
ces essais de différenciation au cours des réactions
immunologiques diminue un peu, puisqu'il n'est pas possible de faire abstraction de cette digoxine endogène au cours
d'un traitement par digoxine. Par contre, l'étude
différentielle des composés exogènes et endogènes reste tout-à-fait fondamentale pour permettre des expériences
visant à évaluer l'activité fonctionnelle respective de
chacun des deux composés.
2. LES IMPLICATIONS MEDICALES
Elles découlent logiquement de tout ce qui a été
dit précédemment et se résument à la nécessité d'un dosage
de la digoxine avant toute mise en route d'un traitement,
en particulier chez des personnes à risques femmes
enceintes, prématurés, nouveau-nés, insuffisants rénaux.
Lorsqu'un composé endogène analogue à la digoxine
est mis en évidence, il gêne considérablement la surveillan-ce thérapeutique (46}. Et aucun des résultats rapportés précédemment ne permet de dire actuellement quel poids respectif donner aux digitaliques endogènes et exogènes. La surveillance d'un traitement repose alors sur les signes cliniques et électriques habituels, en connaissant leur valeur tardive.
La balance entre les avantages et les inconvé nients des digitaliques dans les populations concernées nous font néanmoinns arrêter ces traitements avant tout signe clinique et électrique de toxicité, lorsque les taux sanguins de digoxine atteignent la zone de toxicité, qui est de 2,2 ng/ml dans notre laboratoire.
E. CONCLUSION
Nous venons d'avancer tous les nous disposons actuellement ayant amené digitalique endogène.
arguments dont au concept de L'imagination en ce qui concerne la nomination et la paternité n'a pas manqué. Les termes proposés pour ce digitalique endogène étant endocardine ou endocardiotonine ou endigène. Celui semblant actuellement le plus prévalent est celui d'endoxine.
Ce dernier problème ne nous semble pas le plus important, et nous espérons que cette revue générale aura permis de souligner tous les problèmes qui restent encore en suspens et qu'elle suscitera la réalisation de nouveaux travaux sur ce sujet.
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DEUXIEME PARTIE MATERIEL ET METHODES
I. MATERIEL
A. ENVIRONNEMENT DE I.'ETUDE
L'étude a été effectuée au sein du CHRU de Grenoble, regroupant l'Hôpital A. Michallon, l'hôpital de La Tronche, et l'hôpital Sud, soit un total de
- 3005 lits théoriques et 2621 lits réels en service en 1987,
- 60 services d'hospitalisation,
- 736 000 journées d'hospitalisation facturées en 1987, - un peu plus de 300 prescripteun (médecins, sage-femmes, et cinq pharmaciens).
Les prélèvements ont été réalisés dans le service de Médecine Néonatale et Réanimation Infantile du Pr RAMBAUD de l'hôpital A. Michallon qui comprend :
-l'unité A réanimation infantile qui compte 6 lits,
- l'unité B avec 19 lits,
- l'unité C 21 lits,
- l'unité stérilisation biberonnerie.
Pour l'ensemble de ces quatre unités, 40 puéricultri-ces et 33 auxilliaires puéricultripuéricultri-ces sont employées.
Un total de 24 incubateurs sont répartis entre l'unité B et C.
B. DESCRIPTION DU MATERIEL Les prélèvements nouveauxnés hospitalisés filles et 19 garçons. de sang ont été réalisés chez 40 dans l'unité B ou C, dont 21 Parmi ces nouveau-nés, nous avons cinq paires de jumeaux, et troistriplés.
Les poids grammes et 3600
(schéma 1).
à la naissance sont compris entre 1200 grammes avec une moyenne de 1932 grammes Les âges gestationnels sont répartis entre 220 et 295 jours de gestation soit, environ 32 semaines et 42 semaines de gestation avec une moyenne de 245,5 jours,soit 35 semaines de gestation (schéma 2).
de prélèvements, variables pour chaque compris entre 7 heures et 720heures de d'un jour àtrente jours de vie environ
de 163 heures de vie, soit 7 jours Les âges
nouveau-né, sont vie, soit moins avec une moyenne
(schéma 3).
5 enfants sont nés de mère présentant une hyperten -sion artérielle pendant lagrossesse.
JI. ~
A. REALISATION DES PRELEVEMENTS SANGUINS
Les prélèvements sont réalisés sur des nouveau-nés ne recevant aucune thérapeutique digitalique, dès leur entrée dans leservice.
40EFFECTIFS - 1-30 1 -1 - 1-20 - 1-10 1-0
REPARTITION DES POIDS
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Schéma 1 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1800-2000 ~ 1600-1800 ~ 1400-1600 ~ 1200-1400 ~ 1000-1200 1000-1200
REPARTITION DES AGES GESTATIONNELS
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Schéma 3Chaque nouveau-né est prélevé quatre fois sur une période de huit jours, soit environ un prélèvement tous les deux jours. Certains nouveau-nés ne sont prélevés que trois fois lorsque leur sortie de l'hôpitalest prévue avant la fin du protocole.
Le prélèvement est le plus souvent capillaire au talon sauf dans les quelques cas où une voie veineuse profonde est placée chez lenouveau-né : dans ce cas, le prélèvement est veineux.
Le sang
anticoagulant} millilitre de microtubes.
est recueilli sur microtube sec (sans
de 600 microlitres. En moyenne 1,2
sang sont prélevés, ce qui représente deux
B. FICHE DE RENSEIGNEMENTS (schéma 4}
Une fiche de renseignements est remplie pour chaque nouveau-né o po ~ nt plusieurs rubriques :
- nom, prénom,
- date et heure de naissance, - âge gestationnel,
- poids de naissance,
état clinique particulier de lamère,
- caractéristiques de chaque échantillon de sang prélevé numéro d'identification,
. date et heure de réalisationdu prélèvement. - état clinique particulier du nouveau-né,
- traitement associé,
-paramètres biologiques, lorsqu'ilssont connus . sodium,
potassium, hématocrite, protéine, bilirubine.
FICHE DE RENSEIGNEMENTS
(concernant lenouveau-né)
- NOM/PRENOM:
- DATE ET HEURE DE ~ ~
- AGE GESTATIONNEL D'APRES LA DATE DES DERNIERES REGLES (DDR):
- POIDS DE NAISSANCE:
- ETAT CLINIQUE PARTICULIER DU NOUVEAU-NE, TRAITEMENT EVENTUEL:
- MERE: PATHOLOGIE PARTICULIERE PENDANT LA GROSSESSE:
- GROSSESSE MULTIPLE ?:
- PRELEVEMENTS:
Numéro Date Heure Paramètres biologiques biliT, biliD, Na, K, prot., Hte a b c d Schéma 4
C. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS DE SANG
Les microtubes sont centrifugés à 3000 tours par minute. Le sérum situé en surface du tube est séparé du culot sanguin grâce à la présence d'un gel séparateur contenu dans le microtube qui vient se placer à l'interface culot-sérum au cours de la centrifugation.
Un gros avantage du gel séparateur est de faciliter, donc d'optimiser le recueil du sérum à la micropipette. Ceci est important, car les manipulations se font sur de faibles volumes de sang. Pour 1,2 millilitre de sang, 0,5 ml de sérum environ sont recueillis.
Le sérum obtenu identifiées pour chaque congélateur à - 4°
c.
est stocké dans
échantillon, et conservé au des acuvettes
Les dosages de digoxine sur ces sérums seront par la suite réalisés par séries de 30.
D. LE DOSAGE DIGITALIQUE
Le dosage de la digoxine sur ces sérums est effectué au laboratoire de Médecine Nucléaire, service du Pr COMET par deux méthodes simultanément :
- méthode de dosage par polarisation de fluorescence, - méthode de dosage par radio-immunologie.
1. PRINCIPE DES METHODES DE DOSAGE
a. Dosage par polarisation de fluorescence (14, 47)
Les principes fondamentaux de la polarisation de fluorescence sont connus depuis 1926 par les travaux de
F. PERRIN.
Trente ans plus tard, WEBER applique la
techni-que à des systèmes biologiques, et c'est en 1961 que son
application à la réaction ag - ac fut décrite par DANDIJIKER
et FEIGEN.
Avec l'introduction de l'informatique dans la technologie médicale, l'élaboration d'un matériel perfor-mant, rapide, simple et fiable, a été réalisable permettant
l'utilisation de la polarisation de fluorescence en
biologie clinique.
- Principes physiques . La fluorescence
La caractéristique d'une molécule fluorescente est
d'absorber une lumière d'une longeur d'onde déterminée.
Cette absorption correspond à une transition électronique,
dite "état excite", dont la durée de vie est de l'ordre de
quelques nanosecondes (10 à 50). Le phénomène de réémission
de lumière accompagne le retour à l'état initial des
électrons excités et correspond à la fluorescence.
Ainsi, la fluorescence absorbe la lumière bleue et émet une
fluorescence verte après une excitation d'environ 4.10-9
secondes. En envoyant un rayon lumineux sur un produit fluorescent et en observant l'intensité de la lumière émise, on mesure l'intensité de fluorescence qui sera
proportionnelle à l'intensité de la source lumineuse, à la
concentration et à l'efficacité du composant fluorescent .
. La polarisation de fluorescence
Les molécules fluorescentes absorbent l'énergie suivant une
direction privilégiée que l'on appelle "moment de
transition d'absorption". Si on excite ces molécules par une lumière polarisée, on peut imaginer qu'il s'opère une
photosélection, c'est à dire, que le phénomène d'absorption
sera maximum pour un certain nombre de molécules orientées dans la même direction que le faisceau incident. Les
molécules perpendiculaires à ce faisceau incident ne seront
Pendant la durée de vie de l'état excité, un certain nombre de phénomènes vont intervenir pour dépolariser la molécule excitée, et si on mesure l'intensité de fluorescence dans
des directions parallèles
(Il}
et perpendiculaires ( ) àla lumière incidente, on définit le taux de polarisation :
I
Il -
Ip
=
I
Il
+ ILes phénomènes de polarisation de fluorescence qui
traduisent, pour ce qui nous intéresse, le mouvement des
molécules pendant la durée de vie de l'état excité
dépendent essentiellement des propriétés hémodynamiques des molécules, de la viscosité du milieu et de la température.
de rotation de la molécule fluorescen-son volume : elle est exprimée par le rotationnelle, défini comme le temps pour tourner d'un angle de 68°5. Ce pour des petites molécules telle la pour les grosses molécules comme les En effet, la vitesse
te est fonction de temps de relaxation que met la molécule temps varie de 1 ns
fluoresceine, à 100 ns
immunoglobulines.
Ainsi, une petite molécule dépolarise la lumière
d'excitation polarisée. Si elle est couplée au cours d'une réaction immunochimique avec une grosse molécule anticorps, le facteur de polarisation augmentera.
Cette relation entre la taille des
polarisation de fluorescence peut être réaction ag - ac : le dosage immunologique de fluorescence est fondé sur ce principe.
molécules et la
appliquée à la
par polarisation
- Application biologique : le dosage lmmunolo-gique par polarisation de fluorescence
Utilisé dans le système TDX de la société Abbott, cette technique qui associe le principe de compétition entre
protéines à la polarisation de fluorescence, permet une
mesure directe d'un médicament ou d'une hormone, sans avoir
recours à une étape de séparation.
Le dosage est basé sur la compétition qui existe entre un
marqué appelé "traceur", les deux entrant en compétition pour occuper un nombre limité de sites de liaison des
anticorps spécifiques correspondant au produit à doser.
Dans le système TDX, le marqueur utilisé est la fluorescei ne : on utilise le principe physique qu'est la polarisation
de fluorescence pour mesurer, grâce à un système de
détection optique, le changement de l'angle de lumière fluorescente polarisée émise par la fluoresceine lors de la
réaction, changement qui reflète la liaison du traceur à
l'anticorps se traduisant par une augmentation de son volume hydrodynamique.
En effet, le traceur non lié s'oriente d'une manière aléatoire entre le moment de l'absorption de l'énergie
lumineuse d'excitation et celui de l'émission de la
fluorescence ; la polarisation de fluorescence est par
conséquent faible. Après la liaison du traceur à
l'anticorps spécifique, sa rotation devient la même que
celle de la molécule anticorps, c'est à dire beaucoup plus
lente que celle du traceur non lié : la polarisatiron de la
lumière d'émission augmente à mesure que le traceur se lie
à l'antisérum. Le médicament non marqué présent dans
l'échantillon à doser entrant en compétition avec le
traceur pour occuper les sites de liaison de l'anticorps, la polarisation de fluorescence observée avec le traceur devient une valeur située entre celles du traceur libre et du traceur lié.
Si l'échantillon contient une forte concentration de
médicament, la valeur de polarisation observée sera plus proche de celle du traceur libre, donc faible.
Si l'échantillon contient une faible dose de médicament, la valeur de polarisation sera plus proche de celle du traceur lié, c'est à dire élevée (schéma 5).
La relation précise existant entre la polarisation et la concentration d'un médicament non marqué est établie en mesurant les valeurs de polarisation des étalons contenant des concentrations connues de médicament.
- Le système TDX ABBOTT Il est composé
d'analyses, de médicaments.
d'un
Dosages immunoZogiques par poZarisation de fZuorescence
PEU DE MEDICAMENT A DOSER
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BEAUCOUP DE MEDICAMENT A DOSER
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POlARISAnON ELEWEPOLARISATION FAIBU
Compétition immunoZogique entre Ze médicament à doser~
et le traceur marqué à la fluorescéine ~
vis-à-vis des sites anticorps spécifiques
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REFLECTEUR
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TUllE... !'!-IOTOMULTIPLICATEURSystème optique de l'analyseur en polarisation àe fluorescence (TDX)
DISTRIBUTEUR TAMPON1 1 1 1.
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LECTEUR DE CODE BAR
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SYSTEME OPTIQUE
L'analyseur est équipé d'un fluorimètre, d'un distributeur diluteur, d'un clavier de commande, d'un afficheur, d'une imprimante et d'un microprocesseur.
Toutes les étapes du microprocesseur et tous logicielde l'analyseur.
dosage sont contrôlées par le lesprotocoles programmés dans le Chaque protocole contient des instructionsdétaillées pour
les volumesàmettre en oeuvre, pour lesmouvements du bras de pipettage et du carrousel, ainsi que laconcentration des étalons utilisés pour chaque courbe d'étalonnage. La température du tampon et des tubes à réaction est également surveillée par lemicroprocesseur (schéma 6).
b. os ~ radioimmunologie (8, 12)
C'est un dosage radioimmunologique par
compétition dans lequel la digoxine non radioactive du sérum et une quantité déterminée de di o~in marquée à l'iode125 réagissent de façon compétitive sur les sites de fixation d'une quantité limitéed'anticorps de ladigoxine déposée sur une phase solide (billes en polystyrène ou surface du tubeàessai).
Ainsi, le pourcentage de digoxine radioactive liéeà laphase solide (anticorps) est inversement propor -tionnelà la concentration de ladigoxine dans le sérum. Après incubation, ladigoxine (radioactive et non radioacti -ve) liée à laphase solide est séparée de ladigoxine non liée. La radioactivité liéeàlaphase solide est ensuite mesurée à l'aide d'un compteur gamma àscintillationà
puits. La concentration exacte de digoxine dans
l'échantillonest déterminée par comparaison avec un groupe d'étalons contenant des quantités connues de digoxine non radioactive.
2. CHOIX DES KITS REACTIFS
a. Dosage par polarisation de fluorescence
Nous avons utilisé le coffret réactif employé en routine dans le service de Médecine Nucléaire du Professeur COMET "kit FPIA TDX ABBOTT".
- rapide
- fiable,
Le dosage est :
15 minutes après l'arrivée du prélèvement au laboratoire, le résultat peut être rendu.
- spécifique les interférences physiologiques sont négligeables jusqu'à des seuils élevés.
- très sensible la sensibilité est de l'ordre de
0,2 ng/ml
- reproductible le coefficient de variation est inférieur
à 3 % en série inter-essais. - économique en sang.
b. Dosage par radioimmunologie (48, 49, 50)
Nous avons utilisé deux kits de dosage
- Le kit diagnostique Laboratoires ABBOTT :
TM
Digoxin RIA BEAD proposé par les
Ce kit de dosage était utilisé en routine par le laboratoire de médecine nucléaire, service du Pr COMET avant l'emploi de la polarisation de fluorescence.
Les anticorps antidigoxine sont déposés sur des billes en polystyrène contenues dans des tubes à essai. La séparation digoxine libre et digoxine liée à l'anticorps pendant la période d'incubation se fait par décantation, élimination du liquide se trouvant dans le tube et égouttage du tube.
Le Laboratoire ABBOTT précise que lekit Digoxine RIA BEAD TM fournit des valeurs de digoxine sérique qui sont
indépendante des protéines sériques. La limite inférieure
0,2 ng/ml. de sensibilité du test est de
- Le coffret radioimmunologique digoxine ~ ~ Il CA-527,547
GAMMA COAT,_ Clinical Assays Laboratoires TRAVENOL
Les anticorps sont fixés sur laparoi interne inférieure du tube Gamma Coat. Après incubation, lecontenu des tubes est aspiré ou décanté et laradioactivité des tubes est comptée.
La sensibilité est de 0,09 ng/ml.
La linéaritédes résultats obtenus par dilution successi -ve d'un échantillon de sérum contenant une concentration connue de digoxine permet de conclureàl'absenced'inter -férence non spécifique avec un constituant du sérum.
Ce coffret réactif a été choisiàlalecture des données de certaines publications (29, 33) : ce kit de dosage en effet, semble posséder un niveau d'interférence avec la digoxine-endogène plus élevé que d'autres kits radio
-immunologiques.
E. EXPLOITATION STATISTIQUE DES RESULTATS (52)
L'exploitation statistique des effectuéeà l'aide du logiciel BMDP Package) de l'Universitéde Californie implanté sur un ordinateur PRIME 9955.
1. LES STATISTIQUES DESCRIPTIVES
résultats a été (Biomedical Dixon (LOS ANGELES - USA)
Histogrammes et grandeurs statistiques
habituelles (moyennes, mode, médiane, variance, écart type, écarts types de la moyenne et de lamédiane, quartiles, coefficients d'aplatissement et d ~ t i etc...) ont
été obtenusàl'aidedu programme 2 D.
Les tendances centrales des variables distribuées de façon log-normale (c'est à dire dont les logarithmes sont gaussiens) ont été estimées par leurs moyennes géométriques (exponentielles des moyennes arithmétiques des logarithmes népériens). Les limitesde confiance qui leur sont associées sont les exponentielles des limites de confiance des logarithmes moyens.
Celles des variables présentant des distributions ni gaussiennes, ni log-normales ont été estimées par les médianes accompagnées de leurs intervalles de confiance respectifs.
La moyenne arithmétique et son intervalle de confiance n'a été utilisée que dans lecas de variables gaussiennes ouàdistribution symétrique.
Rappelons qu'une grandeur statistique gaussienne St a pour limites de confiance au seuil de probabilité
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I':J
S
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[V] est lavaleur critique lue dans latabledu t de Student pour un seuil de probabilité unilatéral ~ et ledegré de libertéV attachéàlagrandeur statistique St dont l'écard type estimé est./)st.2. LES STATISTIQUES INFERENTIELLES
Un grand nombre des variables quantitatives disponibles n'étant pas gaussiennes, des testsstatistiques non paramétriques robustes qui ne nécessitent pas la normalité ont été employés. Ilsse fondent sur les rangs des valeurs numériques ordonnées plutôt que sur les valeurs elles-mêmes.
a. Test statistique de corrélation Le degré d'association entre
quantitatives a été estimé à l'aide du
corrélation de Spearman (52).
deux variables coefficient de
b. Tests statistiques de comparaison de tendances centrales
Lorsqu'il y a appariement des deux
échantillons de population les deux tendances centrales
de valeurs numériques appariées ont été comparées à l'aide
du test des rangs algébriques de Wilcoxon.
Lorsqu'il n'y a pas appariement des deux
échantillons de population la comparaison des tendances
centrales de ces deux échantillons de population non
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b 183 c207 11O0,,42lJ 11<0,2 O,l6 1 1 1 a 87 1 0,62 : 0,4 33 1700 Hypoglycélie b 183 (0,2 1 0,4 10,)6f4j c201 10, 5 1 0, 2 d 255 1 0,54 1 O,H 1 1 1 1 a 87 1 0,8 10,64 JJ 1380 Détresse resp. b 181 <O,ll
0,46 1 0,58 ftj Hood c201 1o,c6
1o,sa
d 255 1 O,t6 1 0,52 1 1 1 1 a 87 1 0,5 1 0,69 33 1515 Hypoglycélie b 183 <0,2 1 0,4 10,4 ~ 4j c 207 10,4 1 0,52 d 255 1 0,4 1 0,44 . 1 1 1 1 alU 1 <0,2 1<0,2 38 1890 Hypoglycêaie b 240 <0,3 j0,26 t<O,lt6j c264 10,4 1<0,2 d 312 10,361<0,2 1 1 t a181l
0,7110,36 b 217 <0,2 1 O,Jt10,28 c301 1 0,281 0,2 . d 349 1 0,410,26 1 1 1 1 l a480 1 0,410,22 b 576 <0,2 1 0,351<0,l c600 1 0,33,0,21 d 648 1 0,281<0,3 1 ' 37 2170 Tétralogie de Falot confirlée à1'échographie 35 1350 Staphylocoque oeil droit Pace-aater IC ~t biologiques T 1 1 1 1 1 1 1 1 l : 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 .,1 1 1 1 c::,...,o,
1 ~ .... 1<rf 1 1 1.f.'l r-f r-t 0 Cl <rf J<rfJlf.lu1 Jflf Ill Ill l2:~ Po1 .... 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 243 1u
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103 b 1l7 c175 d 247 1 0,21 1o,z
1 1 1 0, 42 10, 45 37 960 Hypotrophie <0,2 1O,J61 0,36+6j : 0,27 1<0,2 1<0, 210,lJ 1 1 1 1 10 Ka137 1 0,311<0,2 U~ Hypotrophie 11r
b 185 <0,2 c 257 11 0 0,54,26 <0,2 1<0,2 +5j Placento -f t 1 ( 1 1 culture :t Strepto 8 a 48 0, 31 :0, 610, 34 38 1810 Hypotrophie b 120 O,J 10,310,3 tCj Oedêae e 168 O,l 1<0,2 1<0,2 d 216 <0,2 1 0,2 1<0,2 1 1 1 1 12 F a 117 10,51o.u
31 1200 10, 710,52t6j Hood JO 'Infection 1l Fu
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