Identification et caractérisation de Lrrc54, une protéine hépatique modulée en condition d'obésité

Identification et caractérisation de Lrrc54, une protéine

hépatique modulée en condition d’obésité

Mémoire

Etienne Camiré

Maîtrise en physiologie-endocrinologie

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Etienne Camiré, 2015

iii

Résumé

Par analyse bio-informatique, nous avons construit une liste de gènes candidats en identifiant ceux principalement exprimés par le foie et n’ayant pas de rôles connus dans le développement de la stéatose hépatique. L’expression hépatique des candidats potentiels a été validée par qPCR.

Cette méthode a permis l’identification d’une nouvelle protéine plasmatique : Lrrc54. Nous avons découvert que l’expression hépatique de Lrrc54 augmente dans trois modèles d’obésité murins, dans un modèle de stéatose hépatique murin ainsi que chez des patients obèses ayant des degrés différents de stéatose. In vitro et in vivo, nous avons établi que le stress du réticulum endoplasmique induit ces hauts niveaux de Lrrc54. En induisant la stéatose hépatique dans un modèle de souris génétiquement invalidé pour Lrrc54, nous avons observé un profil de marqueurs pro-inflammatoires moins élevé que chez les souris sauvages indiquant un rôle pour Lrrc54 dans la promotion de l’inflammation par un mécanisme encore inconnu.

v

Table des matières

Résumé ... iii

Table des matières ... v

Liste des tableaux ... vii

Liste des figures ... ix

Liste des abréviations... xi

Remerciements ... xv

Introduction ... 1

Généralités sur l'obésité ... 1

L'obésité et la stéatose hépatique ... 2

Définitions et prévalence ... 2

Pathophysiologie ... 3

Impacts du stress du RE et de la réponse UPR ... 4

Impacts de l’inflammation ... 6

La fibrose, l’intégration des signaux de stress et d’inflammation ... 8

Modèles murins de stéatose hépatique ... 8

Souris ob/ob déficientes en leptine ... 9

Souris db/db résistantes à la leptine ... 9

Souris exposées à une diète riche en gras ... 9

Souris exposées à une diète déficiente en méthionine et choline ... 9

Souris soumises à une injection de tunicamycine ... 10

Le diagnostic de la stéatose hépatique ... 10

Analyse sanguine, imagerie médicale et biopsie ... 11

Nouvelles approches ... 12

Objectifs de l'étude ... 13

Matériels et méthodes ... 15

Stratégie d'identification ... 15

Animaux ... 15

Modèles murins d'obésité ... 15

Modèle murin de stéatose hépatique... 15

Injection de tunicamycine in vivo ... 16

vi

Culture cellulaire ... 16

Maintien des cellules ... 16

Traitement ... 16

Analyses ... 17

Extractions d'ARN, synthèse de ADNc et analyses géniques ... 17

Analyses protéiques ... 17

Résultats ... 19

Identification et caractérisation de Lrrc54... 19

Lrrc54, une protéine majoritairement hépatique modulée par l’obésité... 22

Lrrc54 dans la stéatose hépatique ... 23

Stéatose hépatique murine ... 23

Stéatose hépatique humaine ... 23

Mécanisme régulant l'expression de Lrrc54 ... 25

Régulation par la réponse UPR ... 25

Régulation par l’accumulation de triglycérides ... 26

Régulation par l'insuline ... 27

Effet de la perte de Lrrc54 in vivo ... 29

Discussion ... 33

Modulation de Lrrc54, une protéine plasmatique modulée dans la stéatose hépatique ... 33

Rôles des SLRP dans les pathologies ... 37

Actions connues de Lrrc54 et hypothèse de mécanisme d’action dans la stéatose ... 40

Littérature sur Lrrc54 ... 40

Hypothèses de mécanisme d’action de Lrrc54 ... 41

Conclusion ... 45

vii

Liste des tableaux

Tableau 1 Candidats potentiels ... 20 Tableau 2 Sentiers de signalisation affectés par les SLRP ... 38

ix

Liste des figures

Figure 1 Le drainage du tissu adipeux cible le foie ... 2

Figure 2 Voies de signalisation de la réponse UPR ... 4

Figure 3 Voies de signalisation de l'inflammation ... 7

Figure 4 Stratégie d'identification de nouveaux gènes dont l’expression est spécifique au foie et modulée en contexte d’obésité. ... 19

Figure 5 Analyse phylogénique et organisation chromosomique des classes de SLRP humains ... 21

Figure 6 Lrrc54, une protéine hépatique surexprimée en contexte d’obésité. ... 22

Figure 7 Hauts niveaux d'expression de Lrrc54 associés à l'accumulation de triglycérides hépatiques ... 24

Figure 8 Mécanisme de régulation de Lrrc54 ... 28

Figure 9 Effet de la perte de Lrrc54 in vivo sur la stéatose hépatique ... 31

Figure 10 Modulation et effet de l'expression de Lrrc54 ... 41

xi

Liste des abréviations

Abréviation Définition

4-PBA 4-phenyl butyric acid

ALT Alanine transférase

AML12 Lignée cellulaire d’hépatocytes murins

ApoE Apolipoprotein E

ATF4 Activating transcription factor 4

ATF6 Activating transcription factor 6

Bgn Biglycan

BiP Binding immunoglobulin protein

BMP Bone morphogenic protein

BSA Bovine serum albumin

CCL4 Tétrachlorométhane

CD68 CD antigen CD68

CHAD Chondroadherin

CHOP C/EBP homologous protein

CK-18 Cytokeratin-18

CRT Calreticulin

DAMPs Damage associated molecular patterns

Db/db Souris n’ayant pas le récepteur à la leptine

Dcn Decorin

DTT Dithiothréitol

E2IG4 E2-induced gene protein 4

EGF Epidermal growth factor

eIF2 Eukaryotic translation initiation factor 2

EIIH Early insulin-induced hepatic gene

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

ERp57 Endoplasmic reticulum resident protein 57

F4/80 Cell surface glycoprotein F4/80

FGF Fibroblast growth factor

Fmod Fibromodulin

GAG Glycosaminoglycane

Grp78 Glucose related protein 78

HDL High density lipoprotein

HSCs Hepatic stellate cells

Hsp90b1 Heat shock protein 90kDa beta member 1

IGF-IR Insulin-like growth factor 1 receptor

IKK Inhibitor of  kinase

IL-12p40 Interleukin-12 subunit p40

IL-6 Interleukin 6

IMC Indice de masse corporelle

Inos Inducible nitric oxide synthase

IRE Inositol-requiring enzyme 1

IRM Imagerie par résonance magnétique

IRS Récepteur de l’insuline

IUCPQ Institut de cardiologie et de pneumologie de Québec

JNK c-Jun N-terminal kinase

LDL Low density lipoprotein

xii

Lrrc54 Leucine-rich repeat containing 54

Lrrc54-KO Souris génétiquement invalidée pour Lrrc54

Lum Lumican

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MCD Diète déficiente en méthionine et choline

Met Hepatocyte growth factor receptor

MPC-1 Macrophage chemotactic protein 1

NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease

NASH Non-alcoholic steatohepatitis

NCEP ATP III National Cholesterol Education Program Adult

Treatment Panel III

Ndst1 GlcNAc n-acetylase/N-sulfotransferase 1

NF-B Nuclear-factor kappa B

Nyx Nyctalopin

Ob/ob Souris déficiente en leptine

OMS Organisation mondiale de la santé

PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor alpha

PERK PKR-like ER kinase

RE Reticulum endoplasmique

RMN-H Résonance magnétique nucléaire du proton

ROS Espèces réactives de l’oxygène

SLRP Small leucine-rich proteoglycan

SREBP-1c Sterol regulatory element-binding protein 1c

SXR Steroid and xenobiotic sensing nuclear receptor

TGF-β1 Transforming growth factor-β1

TGF-βR1 Transforming growth factor-β receptor 1

TLR Toll-like receptors

Tsku ou Tsk Tsukushin ou Tsukushi

UPR Unfolded protein response

VLDL Very low density lipoprotein

WT Souris sauvage

Xbp-1 X-box binding protein 1

xiii

xv

Remerciements

Les remerciements, une section qui est courte, mais tout autant essentielle et cruciale. Tant de bons moments sont passés que les instants plus difficiles semblent mineurs et presque anecdotiques grâce aux personnes qui m'ont entouré. La liste est tellement longue qu'il m'est difficile de tous les nommer ici sans les faire paraitre moins importants qu'ils ont été pour moi.

Sans vouloir tomber dans le cliché, le premier remerciement va à mon directeur de recherche Mathieu. Pour moi, tu es beaucoup plus qu'un simple mentor. Je t'ai rencontré à un moment où je ne savais plus dans quelle direction je devais poursuivre et tu as su être là pour m'écouter tout en m'appuyant dans mes choix. Merci de la confiance que tu as su avoir en moi, cela a nettement contribué à mon développement personnel. Le projet qui m'a été confié était plutôt ambitieux, surtout pour un étudiant à la maîtrise. Ce fut un projet de tous les défis où des moments furent difficiles, où rien ne semblait fonctionner. Mais, la satisfaction était autant plus grande lorsque tous les efforts mis apportaient de nouveaux résultats. Sache que je n'aurais pas autant aimé ma maîtrise si je n'avais eu de tels défis à relever. Tu as été un directeur exemplaire toujours présent pour ses étudiants même quand ils sont à la dernière minute. Ne change surtout pas.

Une maîtrise, ce n'est pas le travail d'une seule personne. Il s'agit plutôt de celui d'une équipe entière apportant du support autant technique que moral pour mes expériences. Je partage entièrement mes succès avec vous tous. Vos conseils, vos blagues déplacées, vos sautes d’humeurs et vos critiques parfois sévères m’ont rendu plus fort et m’ont permis de rester les deux pieds sur terre. Ce n’est pas que des collègues que j’ai côtoyés et découverts pendant les deux années de ma maîtrise. Il s’agit d’amis que je n’oublierai jamais. L’ambiance du ‘lab’ va me manquer avec tous ces cris et ces joies. Les « AH! Putain fais chi*r » quotidiens vont me manquer particulièrement.

1

Introduction

Généralités sur l'obésité

Le surpoids et l’obésité sont définis comme une accumulation excessive de tissus adipeux pouvant entrainer divers types de maladies. Leur prévalence n’a pas cessé d’augmenter au cours des dernières décennies. Selon l’Organisation mondiale de la Santé (OMS), le nombre de cas d’obésité a doublé depuis 1980. En 2014, l’OMS estimait le nombre d’adultes en surpoids (IMC > 25) à 1,9 milliard, dont 600 millions d’obèses (IMC > 30) ce qui démontre l’importance du problème à l’échelle mondiale [1]. De nombreuses comorbidités y sont associées dont le diabète de type 2, la résistance à l’insuline, les dyslipidémies, la stéatose hépatique, les maladies cardiovasculaires ainsi que certains types de cancers, ce qui représente des coûts de santé importants pour la société [2]. Seulement pour le diabète, les coûts associés (médicaux et perte de productivité) étaient estimés à 245 milliards aux États-Unis en 2012 [3]. Au fil des années, de nombreuses approches, comme les modifications des habitudes de vie, les traitements pharmacologiques et la chirurgie bariatrique ont été utilisées afin de combattre cette maladie qu’est l’obésité. Les modifications des habitudes de vie se sont montrées peu efficaces pour améliorer l’obésité à long terme [4]. Actuellement, il n’existe pas de traitements pharmacologiques permettant de réduire l’obésité de façon sécuritaire. Quant à la chirurgie bariatrique, les résultats sont très bons, notamment pour le traitement du diabète de type 2 [5]. Malgré ces succès, cette approche ne peut pas être offerte à tous étant donné le coût de l’opération et les conséquences pour l’individu. Ainsi, il y a un important besoin de mieux comprendre les comorbidités de ces individus obèses afin de développer de nouvelles approches pour améliorer leur état de santé.

Il est bien connu que le surplus d’énergie consommé est accumulé dans le tissu adipeux sous forme de graisses ce qui est exacerbé dans le contexte de l’obésité. Il existe différents types de localisation pour ce tissu. Il peut être dit ‘sous-cutané’ pour une localisation sous la peau ou ‘viscéral’ pour une localisation dans la cavité abdominale. Cette localisation du dépôt a un impact important sur les comorbidités dont les individus obèses vont souffrir [6]. Le tissu adipeux viscéral est plus néfaste qu’un dépôt sous-cutané ce qui est un concept clé du syndrome métabolique permettant d’identifier les patients ayant un risque accru de complications métaboliques. Le National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III) définit ce syndrome par la présence de trois des cinq critères suivants : hypertriglycéridémie, de bas niveaux de HDL cholestérol, une hyperglycémie, hypertension et une augmentation du tour de taille (marqueur du tissu adipeux viscéral) [6]. L’accumulation du surplus d’énergie dans leur tissu adipeux sous-cutané sensible à l’insuline est considérée comme étant protecteur. En cas de dysfonction de ce tissu, une accumulation de graisses ectopiques peut avoir lieu au niveau du tissu adipeux viscéral, du foie, du muscle et du cœur [7].

2

Au fur et à mesure que le tissu adipeux viscéral prend de l’expansion, plusieurs altérations y ont lieu notamment à cause de la toxicité des lipides, ce qui peut entrainer de la mort cellulaire, l’infiltration de macrophages, une lipolyse accrue et une résistance à l’insuline [8]. La physiologie de ce tissu adipeux est altérée entrainant une altération du métabolisme des acides gras, une altération de la sécrétion des adipokines et une production de cytokines pro-inflammatoires. Ce tissu adipeux pathologique est drainé par la veine porte ce qui favorise le transport de nombreuses cytokines inflammatoires et d’acides gras dans l’organisme, ce qui contribue au développement de la résistance à l’insuline dans les tissus en périphérie. Par sa localisation, le foie est fortement affecté par le drainage du tissu adipeux viscéral et il va développer des complications métaboliques.

Figure 1 Le drainage du tissu adipeux cible le foie

Dans cette condition, le foie va fréquemment accumuler une quantité importante de lipides sous forme de triglycérides (stéatose hépatique). Cette accumulation de triglycérides est associée à une toxicité due au flux d’acides gras dans le foie et la présence de cytokines pro-inflammatoires. Cela entraine divers stress cellulaires, l’établissement d’une inflammation chronique et l’apoptose de cellules contribuant au développement de la résistance à l’insuline par l’accumulation de métabolites toxiques au niveau du foie et d’autres tissus périphériques [9, 10].

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La présente étude s’est intéressée au foie étant donné l’ascension de maladies hépatiques liées à l’épidémie d’obésité actuelle. Ces maladies hépatiques sont complexes par la grande variabilité de facteurs pouvant induire et les nombreux stades de celle-ci. La stéatose hépatique ou le non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) est caractérisée par plusieurs stades de développement. Le stade le plus bénin est la stéatose simple, qui est

3 principalement caractérisée par une accumulation de triglycérides sans inflammation significative. Ce stade peut correspondre à 70 à 90% des patients atteints de stéatose hépatique [11]. Certains patients vont progresser à un stade plus avancé où il y a de l’inflammation, de la fibrose et des lésions hépatiques en plus de l’accumulation de triglycérides, ce qui peut culminer en cirrhose et en insuffisance hépatique. Ce stade se nomme stéatohépatite non-alcoolique ou le non-alcoholic steatohepatitis (NASH) [11]. Également, les niveaux de triglycérides peuvent diminuer à ce stade au fur et à mesure que la fibrose progresse. Il est estimé que 70% des patients ayant une obésité viscérale vont développer une de ces formes. La prévalence exacte de stéatose hépatique dans la population est difficile à estimer puisque de nombreux patients n’en reçoivent jamais le diagnostic. Selon certaines estimations, jusqu’à 30% de la population serait atteinte de l’un des différents stades de stéatose hépatique [11].

Pathophysiologie

De nombreux facteurs caractérisent la stéatose hépatique et son développement. De façon un peu simpliste, cette pathologie est fréquemment décrite par une suite d’évènements se succédant pour causer les différents stades de la maladie. On y décrit en premier une accumulation de lipides sous forme de triglycérides entrainant de la toxicité et de la mort cellulaire. Cette mort cellulaire entraine un recrutement de cellules immunitaires qui causent ultimement une cicatrisation et une fibrose du foie. Dans cette vision, l’accumulation de triglycérides hépatiques sensibilise le foie, le rendant susceptible aux injures subséquentes expliquant la progression d’une stéatose simple au NASH [12]. La réalité est toutefois bien plus complexe. Seulement 10 à 30% des patients atteints de stéatose hépatique développent un stade plus progressif comme le NASH [11]. Ainsi, cette hypothèse évolue vers une vision où il y a une multitude de facteurs et d’injures parallèles résultant des altérations métaboliques de l’obésité. Parmi ces facteurs, il y a l’augmentation du flux d’acides gras libres, l’altération de la production d’adipokines, les signaux pro-inflammatoires du microbiote intestinal, le type de nutriments provenant de la diète, les signaux inflammatoires hépatiques ainsi que l’activation de certains stress et de l’apoptose dans le foie [12]. Toutefois, les mécanismes expliquant la transition entre la stéatose simple et le NASH restent méconnus.

Une caractéristique importante dans le développement d’une stéatose hépatique est l’accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, ce qui est fréquemment associée à tort à la progression de la pathologie. En fait, il pourrait plutôt s’agir d’un mécanisme de protection visant à réduire la lipotoxicité de l’excès d’acides gras libres. Cet excès d’acides gras libres est principalement dû à trois facteurs : la lipolyse excessive du tissu adipeux résistant à l’insuline, l’apport en gras de la diète et la lipogenèse par le foie [12]. Cette présence accrue de lipides et de lipotoxicité est associée à la modulation de certaines voies de signalisations importantes dans le développement de la stéatose comme le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’inflammation qui sont liées entre elles, affectant le pronostic de la pathologie.

4

Impacts du stress du RE et de la réponse UPR

Le RE contrôle de nombreuses fonctions importantes pour le maintien de l’homéostasie de la cellule. Parmi ces fonctions, il y a la synthèse des protéines; la synthèse des macromolécules lipidiques comme les triglycérides, le cholestérol et les phospholipides ainsi que le stockage du calcium intracellulaire [13]. Plusieurs perturbations de ces fonctions sont possibles notamment en y accumulant des protéines mal repliées et des lipides ou en altérant l’homéostasie calcique. Ces altérations créent un stress dans cette organelle, le stress du RE. Pour résoudre cette situation problématique et rétablir l’homéostasie, la réponse aux protéines mal repliées ou l’unfolded protein response (UPR) est induite. Il a été démontré que ce stress est présent dans de nombreuses pathologies comme l’obésité et le NAFLD où il est notamment induit dans le foie et le tissu adipeux [14]. La voie UPR comporte trois voies de signalisation qui ont pour objectifs de réduire la transcription et l’augmentation de la traduction générale de protéines ciblées par la réponse UPR permettant le rétablissement de l’homéostasie et le métabolisme des lipides. Parmi ces gènes cibles, on retrouve des protéines chaperons permettant d’augmenter la capacité de repliement des protéines [15]. Ces trois voies de signalisation sont toutes induites par l’une de ces trois protéines transmembranaires du RE : PERK (PKR-like ER kinase), IRE1 (inositol-requiring enzyme 1) et ATF6 (activating transcription factor 6) (Figure 2) [13, 15].

Figure 2 Voies de signalisation de la réponse UPR Tiré de Malhi and Kaufman [15]

5 En présence de stress du RE, la protéine chaperon Grp78 (glucose related protein 78), illustrée par BiP (binding immunoglobulin protein) dans la figure ci-dessus, se dissocie de PERK, d’IRE1 et d’ATF6 pour replier les protéines mal repliées qui s’accumulent dans le RE. Cette dissociation entraine l’activation des trois voies de signalisation. Dans le cas de PERK et d’IRE1, cela entraine la formation d’homodimères qui s’autophosphorylent. La phosphorylation d’IRE1 permet la dégradation d’ARNm et l’épissage l’alternatif de l’ARNm de XBP-1 (X-box binding protein-1) pour produire la protéine mature qui active la transcription de gènes de l’homéostasie du réticulum endoplasmique. La phosphorylation de PERK phosphoryle eIF2 (eukaryotic translation-initiation factor 2 alpha) ce qui amène à une diminution de la traduction et l’activation de la transcription de certains gènes cibles de la réponse UPR comme ATF4 (activating transcription factor 4). Dans le cas d’ATF6, la dissociation de Grp78 entraine son transit dans l’appareil de golgi où il est clivé. ATF6 clivé va activer la transcription de plusieurs gènes de la réponse UPR comme XBP-1, CHOP (C/EBP homologous protein) ainsi que plusieurs protéines chaperons [13, 15].

Dans le contexte de l’obésité, le stress du RE et la réponse UPR peuvent être induits par plusieurs facteurs. Un facteur important est l’excès d’acides gras libres provenant à 56% de la lipolyse excessive du tissu adipeux résistant à l’insuline, à 15% de l’apport en gras de la diète et à 26% de la lipogenèse par le foie [16]. La réponse est différente en fonction de la structure de l’acide gras. Les effets néfastes sont principalement associés aux acides gras saturés et les acides gras à longue chaîne de carbone comme le palmitate alors que des acides gras insaturés comme l’oléate peuvent avoir un effet plutôt protecteur [9]. Cette différence s’explique par une moins grande efficacité de l’estérification des acides gras saturés ce qui cause leur incorporation dans les phospholipides ainsi que la génération d’intermédiaires lipidiques toxiques plutôt que leur transformation en triglycérides et lipides neutres [9].

Les acides gras saturés peuvent induire le stress du RE en s’intégrant dans les phospholipides du RE ce qui perturbe sa morphologie et ses fonctions. Ils peuvent également l’induire indirectement. La surcharge d’acides gras submergeant les cellules cause la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) puisque les cellules ne sont pas en mesure de stocker et de métaboliser tous ces acides gras. Ces ROS causent du stress du RE en affectant le repliement des protéines [9]. Il a également été démontré que les hauts niveaux d’insuline peuvent induire la réponse UPR, probablement en augmentant la synthèse protéique. Cette production accrue de protéines pourrait conduire à une augmentation et une accumulation de protéines mal repliées ce qui cause du stress du RE [17, 18]. Il est également intéressant de noter que le stress du RE peut également être responsable d’une accumulation de lipides dans le foie en induisant l’expression de SREBP-1c (Sterol regulatory element-binding protein 1c) pouvant indiquer une accentuation du désordre lipidique présent dans le foie [19].

6

En fonction de l’intensité et de la durée du stress du RE, la réponse UPR ne sera pas la même. Au niveau basal, la cellule maintient à un certain niveau la réponse UPR pour subvenir aux besoins physiologiques. Lorsque la physiologie normale du RE est perturbée et qu’il y a une accumulation de protéines, la réponse UPR est induite pour rétablir l’équilibre. Dans le cas où l’homéostasie peut être rétablie, les cellules se sont adaptées et maintiennent une capacité supérieure de repliement de protéines dans le RE. Dans le cas contraire où l’homéostasie ne peut être rétablie, la réponse UPR induit les voies terminales causant de la résistance à l’insuline, de l’inflammation et l’apoptose des cellules [20].

La réponse UPR peut directement induire la résistance à l’insuline. La voie d’IRE1 active les kinases de stress JNK (c-Jun N-terminal kinase) et IKK (inhibitor of K kinase) ce qui affecte la signalisation de l’insuline en phosphorylant les substrats du récepteur de l’insuline 1 et 2 (IRS1 et IRS2) au niveau de certains acides aminés [13, 21]. Cette phosphorylation favorise la dégradation des IRS et bloque l’efficacité du signal de l’insuline. La sensibilité à l’insuline peut être rétablie par des traitements pharmacologiques réduisant le stress du RE. En administrant le chaperon chimique 4-PBA (4-phenyl butyric acid) à des souris ob/ob, il a été possible de rétablir leur sensibilité à l’insuline et leur glycémie ce qui est caractérisé par une diminution de la réponse UPR [22]. La réponse UPR peut également induire directement l’inflammation et l’apoptose des cellules. La voie PERK peut augmenter l’inflammation causant l’activation de NF-B (nuclear-factor kappa B). La voie d’IRE1 active JNK et mène également à l’activation de NF-B ce qui augmente l’inflammation [9]. Cette voie peut également activer l’apoptose en induisant plusieurs voies comme CHOP, caspase et JNK. Cette mort cellulaire induira une réponse immunitaire notamment en activant la voie JNK ainsi qu’en libérant à l’extérieur des cellules différents facteurs pouvant stimuler une réponse immunitaire comme les calreticulin (CRT), Hsp90b1 (heat shock protein 90 kDa beta member 1) et ERp57 [23].

Impacts de l’inflammation

Plusieurs facteurs peuvent induire l’inflammation dans la stéatose hépatique. Comme mentionné précédemment, le stress du RE peut activer l’inflammation en induisant NF-B et JNK. D’autres mécanismes peuvent également les induire. Comme pour le stress du RE, les acides gras saturés ont un rôle important. Il a été démontré que ces acides gras peuvent interagir avec TLR2 et TLR4 (toll-like receptors) [9, 24]. Cette interaction entraine l’activation de JNK, d’IB kinase (IKK) et de NF-B (Figure 3) [24]. L’activation de ces voies de signalisation entraine la transcription de plusieurs cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines, dont MCP-1 (macrophage chemotactic protein MCP-1). D’ailleurs, il a été démontré que l’activation de TLR4 contribue au développement de la stéatose hépatique, de l’inflammation dans le foie et de la résistance à l’insuline [25]. Ainsi, la production de souris TLR4-KO spécifique aux hépatocytes protège contre les effets néfastes d’une diète riche en gras. Cela est explicable par une diminution de la signalisation de l’inflammation pouvant activer les cellules

7 immunitaires. Il a été démontré que la perte de MCP-1, dont l’expression est activée par TLR4, inhibe l’expression de plusieurs cytokines pro-inflammatoires lors d’injures causées au foie par l’éthanol. En plus, il a été démontré que la perte de MCP-1 prévient l’accumulation de triglycérides au foie. Cela indique un rôle pour le recrutement de macrophages dans le développement de la pathologie [26].

Figure 3 Voies de signalisation de l'inflammation Tiré de Farrell, van Rooyen [24]

Un facteur important pouvant également entrainer de l’inflammation dans le foie est la libération de cytokines pro-inflammatoires par le tissu adipeux viscéral. Dans l’obésité, le tissu adipeux libère des quantités importantes de cytokines pro-inflammatoires [24]. Le drainage du tissu adipeux viscéral par la veine porte dirige ces cytokines vers le foie où elles vont pouvoir activer les cellules de Kupffer et les cellules immunitaires résidentes dans le foie. Le rôle de ces facteurs pro-inflammatoires est notamment mis en évidence en observant que l’infiltration du tissu adipeux par des cellules immunitaires précède le développement de l’inflammation dans le foie [24]. Un dernier facteur pouvant entrainer de l’inflammation dans le foie, qui sera traité ici, est la production de signaux de dangers par les cellules endommagées ou les cellules en nécrose. Comme mentionné précédemment, le stress du RE peut causer la libération de certains facteurs pouvant stimuler la réponse immunitaire en absence de pathogènes [12]. Ces DAMPs (damage associated molecular patterns) agissent de façon similaire aux

8

signaux produits par les pathogènes. Ils vont tous les deux être reconnus par les TLRs ce qui induit la réponse immunitaire en régulant des cytokines et des chimiokines [12]. Cette réponse a pour principal but de recruter des macrophages afin de résorber la lésion et d’éliminer les cellules fautives. Toutefois, l’installation d’une inflammation chronique amène une situation différente où la fibrose va s’installer et former des cicatrices au niveau du foie.

La fibrose, l’intégration des signaux de stress et d’inflammation

Ainsi, le foie est la cible de nombreux facteurs amenant le développement de la stéatose hépatique causée par l’obésité. Plusieurs de ces facteurs induisent la formation de la fibrose, un évènement arrivant dans les stades plus terminaux de la maladie [11]. Dans le contexte de la stéatose hépatique, les signaux de stress et l’inflammation présents activent les HSCs (hepatic stellate cells) qui vont produire une quantité accrue de matrice extracellulaire causant l’accumulation de collagène et la formation de sites de fibrose.

Le stress RE et l’accumulation de lipides dans les hépatocytes causent de la mort cellulaire et la libération de divers facteurs induisant l’inflammation ainsi que la fibrogénèse dans les HSCs. En traitant des HSCs avec du milieu conditionné provenant d’hépatocytes stéatosés, ces cellules acquièrent un profil plus fibrogène, leur prolifération est augmentée et elles ont une résistance à l’apoptose [27].

De l’autre côté, les macrophages activés par l’inflammation produisent des cytokines pro-inflammatoires et du TGF-β1 (transforming growth factor-β1) se liant respectivement aux TLR4 et aux TGF-βR1 des HSCs [28] ce qui les active et induit leur différentiation en myofibroblastes. Ces myofibroblastes migrent au site de lésion et ils y expriment plusieurs marqueurs comme -SMA (-smooth muscle actin), collagène de type I et fibronectine pour produire la matrice extracellulaire et induire la fibrose [29].

Modèles murins de stéatose hépatique

Afin de répondre à plusieurs questions sur la mécanistique du développement de la stéatose hépatique, il est essentiel d’utiliser des modèles animaux pour refléter les changements au sein du foie qui impliquent plusieurs types cellulaires. Plusieurs des modèles fréquemment utilisés sont également des modèles d’obésité étant donné la prévalence de la stéatose hépatique dans la population obèse. D’autres modèles ciblent plus directement le foie à l’aide de certaines diètes ou d’agents pharmacologiques,

Plusieurs modèles sont utilisés dans le cadre de ce projet de recherche et ils seront traités dans de plus amples détails dans cette section. Il s’agit des modèles génétiques d’obésité ob/ob et db/db, du modèle d’obésité par une diète riche en gras, du modèle de stéatose hépatique induite par une diète déficiente en méthionine et choline (MCD) et d’un modèle d’injure pharmacologique par la tunicamycine.

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Souris ob/ob déficientes en leptine

Les souris ob/ob sont des souris dont l’obésité massive est causée par une mutation spontanée dans le gène de la leptine. Cette mutation amène la perte du signal de la satiété ce qui les rend hyperphagiques. Ces souris sont massivement obèses. Elles ont une hyperglycémie, une hyperlipidémie caractérisée par une élévation des HDL (high density lipoprotein), une résistance à l’insuline et un diabète de type 2 dès un jeune âge [30]. Ces souris développent spontanément une stéatose hépatique, mais elle ne progresse pas en NASH spontanément. Pour développer certaines caractéristiques d’un NASH, ces souris ont besoin d’une injure supplémentaire comme une diète MCD, une diète riche en gras ou une faible dose de lipopolysaccharide (LPS), un consitutuant de la membrane externe des bactéries Gram négative couramment utilisé pour induire de l’inflammation. Les souris soumises à ce type de traitements vont développer une inflammation hépatique caractéristique d’un NASH sans développer de fibrose. Les souris ob/ob sont résistantes à la fibrose hépatique [31].

Souris db/db résistantes à la leptine

Les db/db sont très similaires aux souris ob/ob. La principale différence est que la mutation des souris db/db a lieu dans le récepteur de la leptine. Ainsi, elles sont résistantes à la leptine malgré des niveaux très élevés de l’hormone [30]. Comme les souris ob/ob, les souris db/db développent spontanément une stéatose hépatique, mais elles ont également besoin d’injures supplémentaires pour développer un NASH. Contrairement aux souris ob/ob, elles peuvent développer de la fibrose hépatique si elles sont stimulées [31].

Souris exposées à une diète riche en gras

En soumettant des souris à une diète riche en gras, il est possible d’observer le développement de l’obésité. Dans ce modèle, on va notamment observer une hyperglycémie, une hyperinsulinémie, une hyperlipidémie et de hauts niveaux de leptine [32]. Dans ce modèle, il y a un développement progressif de stéatose hépatique menant à un NASH moyen développant de la fibrose hépatique [31].

Souris exposées à une diète déficiente en méthionine et choline

Il est possible d’induire une stéatose hépatique en soumettant des souris à une diète MCD. Cette diète est composée à 40% de sucrose et 10% de gras. La déficience en choline entraine un blocage de la sécrétion des triglycérides sous forme de VLDL. La méthionine est essentielle à de nombreux processus cellulaires dont la synthèse de protéines et du glutathion [33]. La déficience entraine une augmentation du stress oxydatif, de l’inflammation et de la fibrose.

Contrairement aux modèles de stéatose hépatique liés à l’obésité, les souris sous cette diète perdent du poids au lieu d’en prendre. La perte de poids peut dépasser les 20% après seulement 3 semaines de diètes. Ces

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souris ont également une glycémie plus faible que les souris sur la diète contenant de la méthionine et de la choline.

En l’espace de deux à trois semaines, les souris vont développer une stéatose hépatique importante caractérisée par une infiltration de macrophages et un début de fibrose. La fibrose s’installe principalement à partir de la dixième semaine de diète [34]. Après trois semaines de diètes, il y a un NASH léger.

Souris soumises à une injection de tunicamycine

De nombreux agents pharmacologiques sont connus pour causer des injures au niveau du foie. Un groupe a voulu vérifier si une injection de tunicamycine, un agent causant du stress du RE en inhibant les N-glycosylations, pouvait causer des effets similaires à la stéatose hépatique et au NASH. En réponse à la tunicamycine, il a été démontré que les souris montrent une accumulation de triglycérides hépatiques et une augmentation de cytokines inflammatoires, indiquant la présence de certains critères du NASH. Ce modèle peut se rétablir rapidement de cette injure ce qui peut être intéressant pour étudier les processus impliqués dans la réparation du foie [35].

Le diagnostic de la stéatose hépatique

La stéatose peut être catégorisée en grade allant de 0 à 3. Un grade de 0 correspond à un patient sain non-stéatosé, où moins de 5% des hépatocytes sont atteints. Les grades 1 à 3 sont déterminés en fonction du pourcentage de stéatose, du degré de fibrose et d’inflammation [11].

Actuellement, le diagnostic est difficile et nécessite l’évaluation de plusieurs critères pour déterminer les facteurs de risques pour son développement. De nombreux facteurs doivent être pris en considération dans l’évaluation des patients. Les risques varient avec l’âge, le sexe, l’ethnicité, la sévérité du syndrome métabolique et la diète. Les hommes sont plus à risque que les femmes ce qui semble être dû à leurs différences dans l’accumulation de graisses. Les hommes vont plus souvent accumuler des graisses au niveau viscéral alors que les femmes ont généralement une obésité dite gynoïde où les dépôts de graisses ont lieu au niveau sous-cutané ce qui entraine moins de complications métaboliques. Certaines populations comme les hispaniques sont également plus à risque de développer un NAFLD. Le type de diète est également un facteur de risque important. Plus une diète contient un apport élevé en cholestérol, en acides gras saturés et en fructose, plus le foie se trouve à risque d’accumuler des lipides. Un facteur de risque facilement évaluable en clinique est la présence du syndrome métabolique. Le tiers des patients atteints de stéatose hépatique correspondent aux critères de ce syndrome et 90% des patients ont au moins un critère. Tous ces facteurs sont utiles, mais ils ne permettent seulement de déterminer les patients devant recevoir une attention particulière de la part de leur médecin et non

11 de poser un diagnostic. Pour cela, de nombreux facteurs peuvent être évalués en clinique pour établir le diagnostic et identifier le grade de stéatose du patient.

Analyse sanguine, imagerie médicale et biopsie

En clinique, le patient se présentant avec une stéatose hépatique sera généralement asymptomatique. Dans quelques cas, le diagnostic est le résultat de la découverte de niveaux altérés d’enzymes hépatiques. Mais, 80% des patients atteints de stéatose hépatique ont des niveaux normaux d’alanine transférase (ALT) [11]. Les niveaux détectés ne permettent pas d’établir une corrélation avec la sévérité de la pathologie [36, 37]. Pour pallier à ce problème, plusieurs solutions ont été envisagées. Parmi celles-ci, il y a le NAFLD Liver Fat Score où certains facteurs de risques et mesures cliniques sont ajoutés pour réaliser une prédiction sur la présence de stéatose hépatique chez le patient [38]. En prenant en compte la présence du syndrome métabolique, de diabète de type 2, les niveaux à jeun d’insuline et d’enzymes hépatiques, ces chercheurs ont pu prédire la présence de NAFLD à une sensibilité de 86% et une spécificité de 71%. Une telle approche est très intéressante, mais elle a seulement permis de distinguer les patients atteints de ceux qui sont en santé. Cette approche a l’importance faiblesse de ne pas être en mesure de distinguer les différents stades de stéatose hépatique. Ainsi, il est important d’investiguer plus en profondeur ces patients grâce à d’autres techniques comme l’imagerie. Plusieurs techniques d’imagerie médicale ont été testées afin de diagnostiquer la stéatose hépatique. Certaines sont prometteuses alors que d’autres montrent de sérieuses limitatons. Parmi les techniques évaluées, il y a l’utilisation de l’échographie du foie par ultrason, la tomodensitométrie (CT-scan), l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la résonance magnétique nucléaire du proton (RMN-H) et des techniques d’imageries combinées à l’élastographie [39]. Toutes ces méthodes sont capables de détecter la stéatose hépatique, mais elles comportent toutes certaines limites par rapport au seuil de détection et la distinction des différents grades. L’imagerie par échographie est facile d’accès et peu coûteuse, mais comporte une limite importante pour le seuil de détections de la stéatose. L’efficacité de cette technique diminue considérablement pour les patients ayant un pourcentage de stéatose inférieur à 30% [40]. Les techniques d’imagerie par résonance magnétique sont reconnues pour être les plus sensibles de ces techniques, mais elles comportent d’importantes limites par rapport au coût de leur utilisation et de leur accessibilité, qui n’est pas répandue dans tous les centres hospitaliers. Ainsi, l’IRM et la RMN-H sont très peu utilisées pour le diagnostic de la stéatose hépatique en clinique [39]. Au-delà du seuil de 30% de stéatose, ces différentes techniques ont toutes une bonne détection de la stéatose, mais aucune n’est capable de distinguer efficacement la stéatose simple de la stéatohépatite non-alcoolique notamment à cause de leur incapacité à détecter la fibrose et sa progression [39]. Pour combler cette lacune, certaines de ces techniques ont été évaluées en combinaison avec l’élastographie. L’élastographie consiste à produire des vibrations qui créent une onde qui sera transmise au foie. La vélocité de l’onde corrèle avec la rigidité du foie qui est déterminé par le degré de fibrose. Des applications de cette technique existent en

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échographie et en RMN-H [39]. L’une des plus étudiées est le Fibroscan. Cette technique utilisée avec l’échographie permet une bonne distinction des différents grades de fibrose ce qui permet de distinguer la stéatose simple du NASH [41]. Toutefois, cette technique a certaines limites à son application dans le cas de patients obèses. Chez les individus obèses et obèses morbides, l’évaluation de la rigidité du foie est beaucoup diminuée avec la sonde normale. Pour pallier à ce problème, une sonde extra-large a été développée, mais qui ne règle que partiellement le problème [42, 43]. Bien que ces techniques d’imagerie répondent à plusieurs questions dans le diagnostic de la stéatose hépatique, cela n’élimine pas le besoin de pratiquer des biopsies du foie pour obtenir l’ensemble des critères essentiels à la gradation de la stéatose (accumulation de lipides, fibrose, cellules en apoptose et infiltration de macrophages) [39].

Actuellement, la méthode de diagnostic la plus reconnue pour établir les différents grades de NAFLD est la biopsie du foie. L’analyse de cette biopsie par un pathologiste d’expérience permet d’établir avec précision le degré d’accumulation de lipides, d’inflammation, de fibrose et de dégénérescence des hépatocytes pour la zone prélevée [44]. Malgré cela, cette méthode comporte de nombreuses lacunes. La biopsie du foie est une technique invasive et coûteuse nécessitant du personnel qualifié et elle comporte plusieurs sources de variations affectant les résultats. Les résultats sont dépendants du site d’échantillonnage qui peut ne pas refléter le statut complet du foie en plus d’être sujet à la variabilité d’interprétation entre les pathologistes [44]. Également, cette technique ne permet pas ou facilement le suivi dans le temps du patient et il n’est pas envisageable de l’utiliser à large échelle étant donné la forte prévalence de cette pathologie dans la population.

Nouvelles approches

Afin d’améliorer la prise en charge des patients stéatosés, plusieurs nouvelles approches sont envisagées notamment par le dosage de nouveaux marqueurs sanguins. Ces marqueurs sont associés à des altérations du foie au niveau cellulaire. Par exemple, le NASH est associé à une augmentation de l’apoptose. Ainsi, le dosage de marqueurs plasmatiques de l’apoptose pourrait distinguer le NASH de la stéatose hépatique. Cela a été évalué pour la cytokeratin-18 (CK-18), une protéine structurale dans les hépatocytes. Lors de l’apoptose, cette protéine est clivée et se retrouve dans la circulation sanguine [11]. Son dosage par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) s’est révélé prometteur dans le diagnostic du NASH, mais il serait moins efficace dans la détermination du degré de fibrose [39]. Il est possible d’appliquer ce concept à d’autres altérations ayant lieu dans ce contexte comme l’accumulation de lipides, le stress du RE et l’infiltration de cellules immunitaires. Le dosage de plusieurs agents moléculaires libérés ou sécrétés peut augmenter la sensibilité du diagnostic puisque plusieurs facteurs impliqués dans la stéatose hépatique peuvent être considérés. Toutefois, cette approche comporte certaines lacunes notamment la spécificité du diagnostic face aux agents utilisés. La stéatose hépatique a souvent lieu simultanément à des altérations au niveau d’autres tissus ayant des mécanismes en commun. C’est notamment le cas du stress du RE qui va également être induit dans le tissu adipeux [45]. Ainsi,

13 les niveaux produits par le tissu adipeux pourraient faire croire à une stéatose hépatique alors que ce n’est pas nécessairement le cas. Pour faire face à cela, une attention plus particulière devrait être portée aux protéines dont l’expression est majoritairement limitée au foie.

Objectifs de l'étude

Les objectifs de ce projet comportent deux volets afin de répondre à certaines problématiques entourant la santé hépatique principalement dans un contexte d’obésité. La stéatose hépatique ou le non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) montre une haute prévalence chez les individus obèses, ce qui est associé à un risque accru de plusieurs comorbidités. Cette pathologie est complexe étant donné les différents stades de son développement. Son diagnostic est difficile et invasif ce qui affecte grandement son traitement efficace. Notre projet de recherche compte répondre à cela en identifiant de nouvelles protéines hépatiques modulées dans ce contexte pathologique d’obésité et en identifiant de nouvelles protéines hépatiques pouvant refléter la santé hépatique.

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Matériels et méthodes

Stratégie d'identification

Afin d’identifier des gènes candidats dont l’expression est enrichie dans le foie, nous avons utilisé une approche bio-informatique utilisant le logiciel en ligne BioGPS accessible à http://biogps.org. Dans ce logiciel, nous avons identifié les gènes enrichis dans le foie en établissant une corrélation avec l’expression de l’albumine murine, un gène spécifique au foie.

Animaux

À l’exception des souris femelles soumises à une diète riche en gras, toutes les souris utilisées sont des mâles provenant de Jackson Laboratory ou de notre colonie. Elles sont toutes de souche C57BL/6J. Elles ont toutes été reçues ou déplacées dans les salles d’expérimentation au moins une semaine avant l’expérimentation. Toutes les souris ont été maintenues dans des cages individuelles dans les installations animalières du centre de recherche de l’Institut de cardiologie et de pneumologie de Québec.

Les souris ont été mises à jeun pour une période de 6 heures avant la prise de la glycémie ou le sacrifice. Elles ont été sacrifiées par une injection létale de kétamine-xylazine suivie d’une ponction cardiaque et d’une dislocation cervicale.

Modèles murins d'obésité

Nous avons prélevé les tissus de souris ob/ob et de souris db/db âgées de 12 semaines.

Des souris femelles âgées de 12 semaines ont été soumises à une diète riche en gras pendant 25 semaines avant de prélever leurs tissus.

Modèle murin de stéatose hépatique

Souris sur une diète déficiente en méthionine et choline

Les souris âgées de 12 semaines ont été soumises pendant une semaine à la diète contrôle supplémentée en méthionine et choline avant de poursuivre pour une période de trois semaines sur une diète MCD commerciale ou à la diète contrôle. Le suivi de leur poids a été fait aux deux jours. Leur glycémie a été prise une fois par semaine.

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Injection de tunicamycine in vivo

Les souris âgées de 12 semaines ont été soumises à une injection intrapéritonéale de tunicamycine (2mg/kg pour un volume maximal de 200µL) ou du véhicule (200µL de solution saline). Elles ont été sacrifiées 8 heures post-injection.

Souris Lrrc54 KO

Le modèle de souris knock-out complet pour Lrrc54 a été acquis auprès de la Mutant Mouse Regional Resource Centers où une librairie de souris transgéniques a été déposée [46]. Les souris utilisées dans nos expérimentations ont été produites dans notre colonie et elles étaient à 75% de souche C57BL/6J et à 25% de souche SV129.

Culture cellulaire

Maintien des cellules

La lignée cellulaire d’hépatocytes murins AML12 a été maintenue dans du milieu DMEM/F12 contenant 10% de sérum de fœtus de bœuf et supplémenté en insuline, transferrine et sélénium comme décrit dans la littérature [47].

Traitement

Pour les traitements avec la tunicamycine, le DTT (dithiothréitol) et la brefeldine A, les cellules ont été étalées la veille du traitement pour atteindre une confluence de 80%. Ces agents pharmacologiques ont été ajoutés lors du changement de milieu lors de la journée de l’expérimentation.

Pour le traitement à l’insuline, les cellules ont été étalées deux jours avant le traitement pour atteindre une confluence de 80%. Le jour suivant, les cellules ont été mises à jeun en changeant le milieu pour du milieu sans sérum. Le jour du traitement, l’insuline fut ajoutée dans le milieu de culture pour le temps et les doses indiqués. Pour le traitement à l’oléate, les cellules ont été étalées deux jours avant le début du traitement pour atteindre une confluence de 80%. Le jour suivant, le milieu de culture a été remplacé pour un milieu sans sérum supplémenté avec 1% de BSA (bovine serum albumin) ne contenant pas d’acide gras et la supplémentation d’insuline, transferrine et sélénium habituelle. Le jour du traitement l’oléate-BSA a été ajouté dans le milieu à la concentration et la durée indiquées.

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Analyses

Extractions d'ARN, synthèse de ADNc et analyses géniques

Les extractions d’ARN ont été réalisées à l’aide de trousses commerciales en colonnes selon les recommandations du fabricant. Une digestion à la DNase I a été faite pour éviter la contamination d’ADN génomique.

L’ADNc a été synthétisé en utilisant la trousse de Bio-Rad iScript™ cDNA Synthesis Kit pour 1µg d’ARN selon les recommandations du fabricant. L’ADNc a été dilué 15 fois dans de l’eau ultra pure.

Les gènes ont été analysés par PCR quantitatif en utilisant la trousse de Bio-Rad SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix selon les recommandations du fabricant.

Analyses protéiques

Les cellules et les tissus ont été homogénéisés dans un tampon de lyse comme décrit dans la littérature [48, 49]. Les échantillons ont été dosés pour leur contenu en protéine totale par la technique de Bradford, dilués dans le tampon de lyse puis chauffés à 95°C pendant 10 minutes. Les échantillons ont ensuite été révélés par immunobubardage.

Digestion du plasma à la PNGase F

En utilisant la trousse de PNGase F provenant de New England BioLabs, 1µL de plasma fut digéré selon les recommandations du fabricant. La réaction a ensuite été révéléé par immunobuvardage pour vérifier la présence de N-glycosylations en utilisant un anticorps spécifique pour Lrrc54 (Santa Cruz, sc-79976).

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Afin d'identifier de nouvelles protéines hépatiques modulées en contexte d'obésité, nous avons développé une stratégie basée sur le logiciel en ligne BioGPS. Cet outil, comme son nom l'indique, a comme fonction principale de localiser les tissus/lignées cellulaires ayant de hauts niveaux d'expression pour un gène d'intérêt. Le site met à la disposition de l'utilisateur plusieurs jeux de données. Les jeux de données par défaut contiennent des distributions cellulaires, mais il est également possible d'analyser d'autres jeux de données rendus publics et ayant été mis à la disposition de l'utilisateur. Ce logiciel intègre également une fonction permettant d'établir des corrélations entre un gène d'intérêt et les autres contenus dans le jeu de données. Cette fonction est à la base de notre stratégie. En établissant une corrélation avec l'albumine, un gène spécifique au foie, il est possible d'identifier des gènes ayant un profil d'expression enrichi dans le foie. Pour qu’un gène soit inclus, la corrélation avec le profil d’expression de l’albumine devait être minimalement de 0,7. Cette liste fut réduite à un total de 28 gènes candidats en se basant sur ce qui est connu ou inconnu à propos de ces candidats dans la littérature, la pertinence ou le potentiel dans le contexte de l’obésité ainsi que la présence d’un peptide signal indiquant une protéine potentiellement sécrétée. (Tableau 1) Ces critères ont reçu une note entre 0 et 2 pour chacun des gènes présents dans la liste afin d’obtenir une note maximale de 6. Une plus grande importance a été portée aux gènes possédant un peptide signal dont aucun rôle n’est connu dans le foie et l’obésité afin d’identifier de nouvelles protéines sécrétées pouvant se retrouver dans la circulation sanguine afin d’agir sur d’autres organes. Ces candidats potentiels furent validés en mesurant leur expression dans le foie de souris obèses (ob/ob) développant une stéatose hépatique importante.

Figure 4 Stratégie d'identification de nouveaux gènes dont l’expression est spécifique au foie et modulée en contexte d’obésité.

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Tableau 1 Candidats potentiels Symbol Correlation Score

BC025446 0,8864 6 Cml2 0,935 5 Leap2 0,8489 6 Lect2 0,9329 6 Mia2 0,8783 6 Mup10 0,9367 6 Notum 0,8779 6 Pla2g12b 0,7206 6 Prr16 0,9128 6 Lrrc54 0,8067 6 1300017J02Rik 0,9382 5 Cfhr1 0,9266 5 Cfhr2 0,9225 5 Cpn1 0,842 5 Gdf2 0,8541 5 Hamp 0,9459 5 Hpx 0,9623 4 Il1rap 0,9347 5 Inhbe 0,8212 5 Lifr 0,9151 4 Lrg1 0,7531 5 Orm1 0,8766 4 Orm2 0,9215 4 Pbld1 0,7301 5 Pbld2 0,9042 5 Proz 0,931 5 Vsig4 0,9155 5 Fetuin A 0,9469 4

Fetuin A est une protéine hépatique sécrétée déjà connue pour être régulée dans l’obésité dans la littérature [50-52]

Notre étude a porté une attention particulière à Lrrc54 (Leucine-rich repeat containing 54), une protéine peu connue de la littérature. Leucine-rich repeat containing 54 est une protéine possédant un peptide signal, onze domaines riches en leucine (LRR), dont un situé en N-terminal ainsi que des sites potentiels de glycolysations (Figure 6 B). Cette protéine est connue sous plusieurs noms dans la littérature. Le plus fréquemment utilisé est Tsukushin ou Tsukushi (Tsku ou Tsk [abréviation pouvant porter à confusion]), E2-induced gene 4 protein (E2IG4) et Early insulin-induced hepatic gene (EIIH). Dans le cadre de ce mémoire, le nom Lrrc54 sera utilisé.

21 Lrrc54 appartient à la famille des Small leucine-rich proteoglycan (SLRP), une famille de protéines principalement extracellulaires modulant certaines voies de signalisation. Cette famille est actuellement constituée de 18 membres séparés en cinq classes1 _{selon les homologies de séquences et selon la présence} caractéristique de regroupements riches en cystéine en N-terminal (Figure 5) [54]. Les trois premières classes sont des classes correspondant bien au modèle de la famille alors que les classes IV et V y correspondent moins bien. Lrrc54 appartient à la classe IV incluant également Chondroadherin (CHAD) et Nyctalopin (Nyx). Les fonctions des trois membres de cette classe sont peu connues d’après la littérature existante. La plupart des membres de cette famille forme des regroupements sur les chromosomes à l’exception de certains membres, dont Lrrc54 (Figure 5). Cette organisation particulière pourrait indiquer une duplication de chromosomes au cours de l’évolution et ainsi une redondance de certaines fonctions [54].

Figure 5 Analyse phylogénique et organisation chromosomique des classes de SLRP humains Tiré de Schaefer and Iozzo [54]

Les fonctions de Lrrc54 sont peu connues de la littérature. Les publications à son sujet l’ont principalement identifié comme un modulateur extracellulaire de plusieurs voies de signalisation dans le développement embryonnaire. Pour le moment, son rôle dans les pathologies n’a pas été identifié. Nous croyons que ses fonctions de modulateur extracellulaire sont applicables dans certains contextes pathologiques. Dans le contexte hépatique, son impact sur le Tgf-β [55] et l’inflammation [56] représente un intérêt important dans le développement de la stéatose hépatique.

1 _{ECMX de la classe I est manquant sur la Figure 5}

53. Nastase, M.V., R.V. Iozzo, and L. Schaefer, Key roles for the small leucine-rich proteoglycans in renal and pulmonary pathophysiology. Biochim Biophys Acta, 2014. 1840(8): p. 2460-70.

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Les analyses bio-informatiques, découlant de l'outil en ligne BioGPS, prédisent une expression principalement hépatique de Lrrc54 (Figure 6 A). Ces données furent validées par qPCR sur une distribution de tissus provenant de souris minces sur une diète contrôle (Figure 6 C). Dans ce cas, les plus hauts niveaux de Lrrc54 se retrouvent également dans le foie. Cette analyse révèle également de hauts niveaux d’expression dans le petit intestin. Ces hauts niveaux d’expression majoritairement au foie doivent refléter des fonctions importantes pour ce gène au sein de ce tissu. Ainsi, il est particulièrement intéressant d’analyser les niveaux dans certaines conditions pathologiques comme l’obésité. L’expression hépatique de Lrrc54 a été analysée dans trois modèles murins d’obésité : les souris db/db, les souris ob/ob et des souris soumises à une diète riche en gras (Figure 6 D-E-F). Pour chaque modèle, une forte augmentation de l’ARNm fut observée indiquant une fonction dans cette condition.

Figure 6 Lrrc54, une protéine hépatique surexprimée en contexte d’obésité. (A) Profil d’expression de Lrrc54 dans le logiciel BioGPS.

(B) Structures de Lrrc54 selon les bases de données bio-informatiques.

(C) Profil d’expression de Lrrc54 dans des tissus de souris C57BL/6J. Normalisation sur 36B4. (n=4)

(D-E-F) Expression hépatique de Lrrc54 chez des souris db/db (n=5 vs 6) (D), ob/ob (n=5 vs 4) (E) et sur une diète riche en gras (n= 6 vs 7) (F) par rapport à leur contrôle respectif. Normalisation sur 36B4.

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Lrrc54 dans la stéatose hépatique

Stéatose hépatique murine

Associations entre les hauts niveaux de triglycérides hépatiques et l’expression de Lrrc54 dans des modèles d’obésité

Les trois modèles murins d’obésité étudiés sont bien connus dans la littérature pour développer différents degrés de stéatose hépatique. Ainsi, il est intéressant de vérifier s’il existe un lien entre les hauts niveaux d’expression de Lrrc54 et certains paramètres modifiés au cours de cette maladie. Nous avons porté une attention particulière au niveau de triglycérides hépatiques. Dans les trois modèles, nous avons observé une forte corrélation entre l’accumulation de triglycérides hépatiques et l’expression de Lrrc54. Le coefficient de corrélation r2 _{et le p-value} étaient respectivement de 0.77 et de 0.0004 chez les souris db/db, de 0.94 et inférieur à 0.0001 chez les souris ob/ob et de 0.24 et de 0.04 chez les souris sous la diète riche en gras (Figure 7 A-B-C). Cette forte corrélation dans plusieurs modèles supporte un lien possible entre ces deux paramètres dans le développement de la pathologie. La plus faible corrélation du dernier groupe peut être associée à une plus grande hétérogénéité de la stéatose hépatique résultant de cette diète et un stade variable de stéatose hépatique. Les souris soumises à cette diète peuvent développer un NASH et de la fibrose hépatique alors que les souris db/db ou ob/ob n’en développent pas spontanément.

Stéatose hépatique sans obésité

Afin d’établir si la hausse de l’expression hépatique de Lrrc54 est associée à la stéatose hépatique et non à d’autres paramètres induits dans un contexte d’obésité, nous avons soumis des souris WT (sauvages) à une diète déficiente en méthionine et en choline (MCD), un modèle où les souris développent une stéatose sévère en absence d’obésité (Figure 7 D-E). Chez ces souris, trois semaines de diète suffisent pour induire une importante accumulation de triglycérides hépatiques (Figure 7 F) ainsi qu’une augmentation de trois fois de l’expression hépatique de Lrrc54 par rapport aux souris sur la diète contrôle (Figure 7 G). Également dans ce modèle, nous avons observé que cette accumulation de triglycérides au foie corrèle fortement avec l’expression hépatique de Lrrc54 à un r2 _{de 0.608 et un p-value de 0.001 (Figure 7 H). Ainsi, Lrrc54 semble être régulé} similairement au développement de la stéatose hépatique indépendamment de l’obésité.

Stéatose hépatique humaine

Pour évaluer si LRRC54 est régulé de la même façon chez l’humain, une cohorte a été bâtie à partir de patients ayant subi une chirurgie bariatrique à l’IUCPQ. Lors de l’intervention, des tissus ont été prélevés afin d’inclure les patients à la banque de tissus de l’IUCPQ. Tous les patients sélectionnés ont eu un diagnostic de stéatose hépatique allant de 0 à 15% à la suite de leur intervention. Il s’agit d’hommes âgés de moins de 50 ans ayant un IMC allant de 34 à 70. L’expression hépatique de LRRC54 a été mesurée par qPCR. La cohorte a été séparée en deux groupes : les patients ayant une stéatose hépatique inférieure ou égale à 5% ce qui correspond au

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seuil de détection clinique de cette pathologie et les patients ayant un diagnostic de stéatose hépatique de 10 à 15%. Les triglycérides hépatiques ont été mesurés afin de confirmer le diagnostic établi précédemment. Les niveaux de ces triglycérides sont plus élevés dans le groupe de patients stéatosés (Figure 7 I) ce qui confirme le diagnostic qu’ils ont reçu. Entre ces deux groupes, nous avons observé une augmentation de l’expression hépatique de LRRC54 de 1.6 fois dans le groupe stéatosé par rapport au groupe non-stéatosé (Figure 7 J). Les triglycérides mesurés dans ces foies corrèlent fortement avec l’expression de LRRC54 à un r2 _{de 0.2847 et un}

p-value de 0.0017 (Figure 7 K). Ces résultats mettent en évidence une régulation de LRRC54 dans le développement de la stéatose hépatique humaine.

Figure 7 Hauts niveaux d'expression de Lrrc54 associés à l'accumulation de triglycérides hépatiques

(A-B-C) L’accumulation de triglycérides hépatiques chez les souris (A) db/db (n=5 vs 6), (B) ob/ob (n=5 vs 4) et (C) sur une diète riche en gras corrèle (n=6 vs 7) avec l’expression hépatique de Lrrc54. Normalisé sur 36B4. (D) Variation de poids chez les souris sur la diète MCD ou contrôle pendant 3 semaines. (n= 7 vs 7)

(E) Glycémie prise une fois semaine après 6 heures de jeûne pour les souris sur la diète MCD ou contrôle. (F) Accumulation de triglycérides hépatiques chez les souris sur la diète MCD.

(G) Augmentation de l’expression hépatique de Lrrc54 chez les souris sur la diète MCD. Normalisé sur RN18S. (H) Corrélation entre l’accumulation de triglycérides hépatiques et l’expression hépatique de Lrrc54.

(IJK) L’accumulation de triglycérides hépatiques est associée à l’augmentation d’expression hépatique de LRRC54 chez l’homme. N=28; patient contrôle ayant une très faible stéatose : diagnostic égal ou inférieur à 5% de stéatose (n=14) ; patients stéatosés : diagnostic de stéatose entre 10 et 15% (n=14). Normalisé sur RPL27.

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Mécanisme régulant l'expression de Lrrc54

D’un point de vue thérapeutique, il est très intéressant de déterminer les mécanismes régulant l’expression de Lrrc54 afin d’évaluer son potentiel thérapeutique ou son potentiel comme biomarqueur de la santé hépatique. Nous nous sommes intéressés particulièrement à des mécanismes permettant de comprendre le lien entre les niveaux de triglycérides hépatiques et l’expression de Lrrc54. Trois mécanismes de régulation ont été testés. Nous avons testé s’il y a une régulation par la réponse UPR, puisqu’il est bien connu dans la littérature qu’il y a un lien direct entre l’accumulation de triglycérides hépatiques, le stress du RE et l’obésité [9]. Ensuite, nous avons testé si une accumulation in vitro de triglycérides a un effet sur l’expression de Lrrc54 étant donné le lien observé avec l’accumulation de triglycérides dans le foie. Pour finir, nous avons testé si l’insuline avait un impact sur son expression étant donné les niveaux élevés d’insuline dans l’obésité et qu’une publication a déjà démontré un effet de l’insuline sur l’expression de Lrrc54 dans des hépatocytes de rats [57].

Régulation par la réponse UPR

Pour vérifier l’effet de la réponse UPR sur l’expression de Lrrc54, plusieurs approches ont été utilisées. Nous avons vérifié la présence de stress du RE dans les modèles de souris utilisés ainsi qu’au sein de la cohorte de patients de l’IUCPQ. Par la suite, nous avons validé les relations observées par des traitements induisant le stress du RE dans des cellules en culture et chez des souris.

Stress du RE dans l’obésité et la stéatose hépatique

Chez les trois modèles murins d’obésité étudiés, une augmentation significative de l’expression hépatique de Grp78 est observée dans chacun des modèles (Figure 8 A-B-C). Tel que mentionné précédemment, Grp78 est un marqueur classique de la réponse UPR [58]. Chez les souris db/db et les souris ob/ob, l’augmentation est de deux fois dans les deux cas. Cette augmentation corrèle fortement avec l’expression de Lrrc54. Cette corrélation a un r2 _{de 0.78 et un p-value de 0.0002 chez les souris db/db (Figure 8 A). Chez les souris ob/ob, elle a un r}2 _de 0.80 et un p-value de 0.0015 (Figure 8 B). Dans le cas des souris sur la diète riche en gras, on note une augmentation de 1,5 fois de l’expression de Grp78 (Figure 8 C), mais on y observe seulement une tendance de corrélation entre l’expression de ces 2 gènes (r2_{= 0.18; p= 0.0716). En contexte de stéatose hépatique causée} par la diète MCD, une augmentation de 7 à 8 fois des niveaux protéiques de Grp78 fut observée en protéine (Figure 8 D). Cette augmentation ne fut pas observée sur son expression génique ce qui peut indiquer une stabilisation de la protéine. Chez ce modèle, une forte corrélation (r2_{= 0.5864; p= 0.0011) fut observée entre} l’expression de Lrrc54 et les niveaux protéiques de Grp78. Au sein de la cohorte de patients, une augmentation de 1.5 fois de l’expression de Grp78 fut également notée (Figure 8 E). Ainsi, il y a une forte relation entre l’expression de Lrrc54 et la présence de stress du RE tel qu’identifié par les niveaux de Grp78.