Endothélialisation d’un modèle 3D de muqueuse
vaginale humaine reconstruite par génie tissulaire
Modélisation in vitro et implantation animale
Mémoire
Weronika Jakubowska
Maîtrise en Médecine Expérimentale
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Weronika Jakubowska, 2017
Résumé
La reconstruction vaginale a pour but d’améliorer la qualité de vie des femmes atteintes d’anomalies congénitales ou de cancers urogénitaux. Le manque de tissus disponibles pour ces chirurgies peut être pallié par la reconstruction de substituts autologues de muqueuse vaginale humaine (MVH) par génie tissulaire. La vascularisation représente un élément critique pour le succès des greffons, ainsi des cellules endothéliales dérivées de la veine ombilicale (HUVEC) ont été incorporées au modèle de de MVH reconstruite par auto-assemblage. Différentes techniques de culture cellulaire soit l’auto-assemblage classique SA, le réensemencement RS et une technique hybride SA/RS ont été testées afin de déterminer celle qui est la plus adaptée pour l’endothélialisation du modèle et pour l’implantation animale. Les cellules endothéliales forment un réseau pseudo-capillaire in vitro et expriment des marqueurs spécifiques comme le CD31/PECAM et le facteur Von Willebrand. De plus, la présence du marqueur d’antigène neuroglial 2 (NG2) dans les substituts produits par les conditions SA/RS et RS suggère la présence de péricytes. L’approche SA/RS permet de générer des MVH endothélialisées démontrant une maturité capillaire supérieure, tout en conservant des propriétés mécaniques qui répondent aux critères requis pour l’implantation. Des HUVEC transduites avec des particules lentivirales qui permettent l’expression de GFP et de la luciférase ont été utilisées afin d’observer la cinétique de la formation du réseau pseudo-capillaire in vitro et de confirmer la présence des cellules endothéliales in vivo. Ces tissus reconstruits ont été implantés chez des souris immunodéprimées afin de confirmer la fonctionnalité et la stabilité du réseau pseudo-capillaire reconstruit in vivo. La présence de globules rouges murins à l’intérieur des vaisseaux humains exprimant la GFP démontre le potentiel de fonctionnalité du réseau capillaire reconstruit. En conclusion, les MVH reconstruites représentent un premier modèle 3D endothélialisé qui offre des applications innovatrices pour la recherche et la chirurgie.
Abstract
Tissue engineering of autologous human vaginal mucosa (HVM) introduces novel surgical applications to the field of vaginal reconstruction for paediatric patients with congenital urogenital abnormalities such as the Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser syndrome (MRKH) or neoplastic diseases. Vascularization of tissue-engineered constructs represents a major challenge seeing that graft survival and success rate highly depend on it. This study aims at reconstructing a pseudo-capillary network within a tissue-engineered HVM using the self-assembly technique free of exogenous materials. Vaginal stromal cells were co-seeded with endothelial cells derived from a human umbilical cord vein (HUVEC). Different cell culture techniques were tested, the classical self-assembly (SA) by sheet stacking, re-seeding (RS) and a new hybrid SA/RS method in order to determine the approach that is the most adapted for pre-vascularization of the HVM, while maintaining biomechanical properties that are suitable for surgery. The presence of a pseudo-capillary network in vitro was assessed with specific markers such as PECAM-1/CD31 and Von Willebrand factor. Additionally, neuroglial antigen 2 was detected at the periphery of capillaries and reveals the presence of pericytes within constructs produced with the RS and SA/RS methods. Our results show that the use of a combined SA/RS technique seems to be most adapted for the pre-vascularization of the HVM as it generates constructs with higher microvascular maturity and mechanical properties compatible with surgical handling. Transduced HUVEC with a vector that allows the expression of GFP and luciferase were used to observe the formation of a capillary network in vitro and to monitor endothelial cells in vivo. To assess the functionality of the reconstructed capillary-like network, endothelialized HVM constructs were implanted in immunocompromized mice. The finding of mouse red blood cells within GFP positive capillaries confirms the functionality of the reconstructed capillary-like network in vivo. Finally, this first tissue-engineered endothelialized HVM model can be used for numerous clinical and research applications.
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... viii
Liste des abréviations ... ix
Remerciements ... x
Chapitre 1 : Introduction ... 1
1.1 Anatomie du système reproducteur féminin ... 2
1.2 Embryologie urogénitale ... 2
1.3 Histologie de la muqueuse vaginale ... 4
1.3.1 Épithélium vaginal ... 4
1.3.2 Stroma de la muqueuse vaginale ... 7
1.4 Neurovascularisation ... 9
1.5 Régulation hormonale ... 10
1.6 Biomécanique du vagin ... 10
1.7 Anomalies de la muqueuse vaginale ... 11
1.7.1 Anomalies congénitales : syndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser ... 11
1.7.2 Néoplasies vaginales ... 12
1.8 Thérapies et chirurgies de reconstruction ... 13
1.9 Génie tissulaire ... 15
1.9.1 Stratégies de génie tissulaire ... 16
1.9.2 Méthode d’auto-assemblage ... 17
1.9.3 Applications du génie tissulaire dans la reconstruction vaginale ... 17
1.10 Vascularisation ... 21
1.10.1 Angiogénèse et vasculogénèse ... 21
1.10.2 Vascularisation des greffons ... 21
1.10.3 Stratégies de prévascularisation ... 22
1.10.4 Cellules endothéliales ... 23
1.10.5 Péricytes ... 26
1.10.6 Facteurs angiogéniques ... 27
Chapitre 2 : Problématique et objectifs ... 30
Chapitre 3 : Matériels et méthodes ... 33
3.1 Devis de recherche ... 34
3.2 Populations cellulaires, critères de sélection et taille de l’échantillon ... 34
3.3 Extraction cellulaire de fibroblastes et cellules épithéliales de vagin ... 35
3.4 Reconstruction des substituts de MVH par auto-‐assemblage ... 36
3.6 Cellules endothéliales transduites HUVEC exprimant la GFP et luciférase ... 40
3.7 Comité d’éthique ... 41
3.8 Reconstruction de tissus dédiés pour l’implantation animale ... 41
3.9 Préparation de stent ... 41
3.10 Chirurgie animale ... 41
3.11 Imagerie in vivo par microscopie à bioluminescence ... 43
3.12 Analyses histochimiques ... 44
3.13 Analyse des données ... 45
Chapitre 4 : Résultats ... 46
4.1 Endothélialisation de MVH reconstruite par les approches SA, RS et SA/RS ... 47
4.2 Propriétés mécaniques des MVH reconstruites par SA, RS et SA/RS ... 52
4.3 Étapes de la formation d’un réseau pseudo-‐capillaire in vitro ... 55
4.4 Stabilité des cellules endothéliales in vivo ... 59
4.5 Apparence macroscopique des greffons de MVH reconstruite ... 61
4.6 Histologie des greffons de MVH ... 63
4.7 Perfusion du réseau pseudo-‐capillaire reconstruit des greffons de MVH par des globules rouges murins ... 64
Chapitre 5 : Discussion ... 67
5. 1 Optimisation in vitro ... 68
5.1.1 L’endothélialisation des substituts de MVH par les techniques SA, RS et SA/RS ... 68
5.1.2 Propriétés mécaniques des substituts de MVH par les techniques SA, RS et SA/RS ... 70
5.2 Formation du réseau pseudo-‐capillaire in vitro ... 72
5.3 Implantation animale ... 75
5.4 Comparaison avec d’autres modèles ... 78
5.5 Limitations & perspectives ... 81
5.6 Retombées scientifiques & applications ... 82
Chapitre 6 : Conclusion ... 84
Liste des tableaux
Tableau 1: Résumé des approches de reconstruction vaginale pour les patientes MRKH ... 14
Tableau 2: Populations cellulaires ... 36
Tableau 3: Anticorps utilisés pour les analyses immunohistochimiques ... 45
Liste des figures
Figure 1: Différenciation des canaux de Müller ... 3
Figure 2: Coupe histologique de la muqueuse vaginale humaine native ... 5
Figure 3: Distribution des jonctions intercellulaires au niveau de l'épithélium vaginal ... 6
Figure 4: Principe du génie tissulaire pour la reconstruction de tissus humains ... 16
Figure 5: Coloration histologique du modèle de MVH reconstruite par auto-assemblage ... 19
Figure 6: Caractérisation immunohistochimique du modèle de MVH reconstruite au LOEX ... 20
Figure 7: Inosulation d'un greffon prévascularisé ... 23
Figure 8: Étapes de la formation d'un réseau microcapillaire in vitro ... 24
Figure 9: Rôles des péricytes lors de l'angiogenèse ... 27
Figure 10: Reconstruction de MVH endothélialisée via différentes techniques SA, RS et SA/RS ... 38
Figure 11: Essais mécaniques de tension uniaxiale sur des substituts de MVH reconstruite ... 39
Figure 12: Transduction des HUVEC avec des particules lentivirales qui permettent l'expression de GFP et de la luciférase ... 40
Figure 13: Préparation de greffons pour l'implantation animale ... 42
Figure 14: Implantation animale des greffons de MVH reconstruite ... 43
Figure 15: Aspect macroscopique des substituts de MVH reconstruite ... 47
Figure 16: Comparaison histologique des substituts endothélialisés de MVH reconstruite par les techniques de SA, RS et SA/RS ... 48
Figure 17: Comparaison immunohistochimique de la morphologie du réseau pseudo-capillaire reconstruit par les techniques SA, RS et SA/RS. ... 49
Figure 18: Architecture du réseau pseudo-capillaire de MVH reconstruite par SA/RS ... 50
Figure 19: Détection de péricytes au pourtour des pseudo-capillaires dans les substituts de MVH reconstruite par les techniques RS et SA/RS. ... 51
Figure 20: Comparaison des propriétés d’élasticité et de force maximale des substituts de MVH reconstruites par les différentes techniques. ... 54
Figure 21: Stabilité de l'expression de la GFP par les HUVEC transduites ... 55
Figure 22 : Cinétique de la formation du réseau pseudo-capillaire in vitro ... 56
Figure 23 : Processus de tubulogenèse dans les pseudo-capillaires reconstruits ... 57
Figure 24: Présence d'un réseau microcapillaire dans les substituts de MVH endothélialisée avant l'implantation animale ... 58
Liste des abréviations
AMH Hormone anti-mülérienne Ang-1 Angiopoïétine-1
BGS Sérum bovin (Bovine growth serum) BSA Albumine de sérum bovin
CD31/PECAM-1 Molécule d’adhésion des plaquettes aux cellules endothéliales (Platelet endothelial cell adhesion molecule)
DH Milieu DMEM/HAM (Dulbecco’s modified Eagle Medium : Hams’F-12) DME Milieu d’Eagle modifié par Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle Medium) EGF Facteur de croissance épidermique (Epidermal growth factor)
EGM2-MV Milieu de croissance pour cellules endothéliales (Endothelial Cell Growth Media) ERα Récepteur œstrogène alpha
ERβ Récepteur œstrogène bêta
ERE Séquence cis-régulatrice spécifique (Estrogen response element)
FGF-β Facteur de croissance basique des fibroblastes (Basic fibroblast growth factor) FSFI Index de fonction sexuelle féminine (Female Sexual Function Index)
Fva Fibroblaste de vagin GAG Glycosaminoglycannes
H&E Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine
HUVEC Cellules endothéliales de veine de cordon ombilical (Human umbilical vein endothelial cell) KSFM Milieu de culture spécialisé pour les kératinocytes (Keratinocyte Serum Free Medium) LOEX Laboratoire d’organogenèse expérimentale
MEC Matrice extracellulaire
MMP Métalloprotéinase matricielle (Matrix metalloproteinases )
MRKH Syndrome de Mayer-Rokitansky-Küster Hauser MVH Muqueuse vaginale humaine
NG2 Antigène neural/glial 2 (Neural/glial antigen 2) NO Oxyde nitrique
NPY Neuropeptide Y
OCT « Optimum cutting temperature »
PAI-1 Inhibiteur de l’activateur du plasminogène de type 1 (Plasminogenactivator inhibitor type 1) PAS Coloration d’acide périodique de Schiff
PBS Tampon phosphate salin ( Phosphate buffered saline)
PDGF-B Facteur de croissane dérivé des plaquettes (Platelet-derived-growth factor B) PDGFR Récepteur du PDGF
PGA Polymère d’acide polyglycolique
POP Prolapsus génital ( Pelvic organ prolapse) RS Réensemencement
SA Technique d’auto-assemblage classique par empilement de feuillets (Self assembly) SA/RS Technique hybride de réensemencement et d’empilement de feuillets
SVF Sérum de veau fœtal
S3T3 Couche nourricière de fibroblastes murins irradiés
TGF-B Facteur de croissance transformant B ( Transforming growth factor B)
VEGF Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (Vascular endothelial growth factor) VEGFR-1 (Flt-1) Récepteur 1 du VEGF
VEGFR-2( Flk-1) Récepteur 2 du VEGF
VIP Peptide vasointestinal (Vasointestinal peptide) VonW Facteur de Von Willebrand
Remerciements
J’aimerais remercier tous ceux qui ont marqué mon passage au LOEX. Tout d’abord, mon directeur de recherche Dr. Bolduc pour m’avoir accueilli dans son équipe et avoir conçu un projet qui répondait à mes intérêts. Dr. Bolduc est un bel exemple de clinicien chercheur impliqué à l’échelle international, son expertise chirurgicale et sa vision de translation clinique ont été des atouts majeurs dans la réalisation de ce projet.
Je tiens à remercier chaleureusement Dr. Chabaud, notre chargé de projets, pour les longues discussions, ses disponibilités et son encadrement tout au long de ma maîtrise. Aussi, je tiens à remercier l’ensemble de l’équipe Cassandra, Geneviève et Ingrid de m’avoir accompagnée dans mon parcours. Merci à tous ceux ayant contribués à ce projet : Sergio Cortez-Gio pour les analyses des données, Todd Galbraith pour ses conseils pour l’endothélialisation, Marc-Antoine Plourde Campagna pour la réalisation des tests mécaniques, Julie Rivard pour son aide à l’animalerie, Amélie Lavoie pour son aide au microscope et les Drs. Auger et Berthod pour le don de cellules transduites.
Je tiens aussi à dire un grand merci à tous mes collègues du LOEX, mes voisins de bureau et les étudiants qui donnent vie au LOEX.
De plus, je remercie l’ensemble des chercheurs du LOEX et ses fondateurs Drs Auger et Dre. Germain pour la création de ce centre de recherche innovateur. Finalement, je remercie la Faculté de médecine de l’Université Laval de m’avoir permis de réaliser une maîtrise conjointement à mes études de médecine.
Au cours de la vie, une femme est sujette à plusieurs changements physiologiques aux différentes étapes critiques du développement sexuel soit la puberté, la grossesse et la ménopause. Le système reproducteur féminin s’adapte en fonction des changements hormonaux et module via différents mécanismes l’anatomie pelvienne, la fonction sexuelle et les mécanismes de défense immunitaire. Il est essentiel de comprendre l’anatomie, l’histologie et la physiologie des organes reproducteurs féminins afin d’être en mesure de reconstruire des organes qui reproduisissent fidèlement leur complexité biologique et fonctionnelle.
1.1 Anatomie du système reproducteur féminin
Au cœur de l’anatomie du système reproducteur se trouve l’utérus qui est le site de l’implantation de l’embryon lors d’une grossesse. Il s’agit d’un organe hautement vascularisé qui permet de supporter la croissance de l’embryon. L’utérus est composé de trois couches, essentiellement : l’endomètre, le myomètre et la séreuse. Situées à la partie supérieure de l’utérus, les cornes utérines bilatérales relient l’utérus aux trompes utérines qui s’ouvrent dans la cavité péritonéale. Les ovaires sont les gonades sexuelles féminines qui produisent les ovocytes et les hormones sexuelles. Aux extrémités des trompes utérines se trouvent des franges qui captent l’ovule lors de son expulsion de l’ovaire. L’ovule migre à travers la trompe utérine, qui est d’ailleurs le site de fécondation, pour ensuite atteindre la cavité utérine pour l’implantation du zygote (Moore, Dalley et al. 2006). À l’extrémité inférieure de l’utérus se trouve le col utérin qui protège la cavité utérine face à l’entrée de microorganismes. Le vagin est un canal musculaire qui s’étend du col jusqu’à la vulve. Le vagin possède une profondeur de 7 à 15 cm et possède plusieurs replis muqueux qui contribuent aux propriétés élastiques (Hacker, Gambone et al. 2010). Le vagin assure plusieurs fonctions dont l’érogénéité par un mécanisme de lubrification et sert de voie lors de l’accouchement. Les organes externes sont composés essentiellement de la vulve qui comporte les grandes lèvres, les petites lèvres, le clitoris, le méat urinaire et l’entrée du vagin. Près de l’entrée du vagin se trouvent les glandes de Bartholin qui sécrètent du mucus et humidifient le vagin (Smith and Netter 2008).
1.2 Embryologie urogénitale
La complexité du système reproducteur parmi les organismes vivants corrèle avec l’évolution biologique. La conjugaison via un pilus est une méthode de reproduction sexuée employée par les bactéries afin de transférer de l’information génétique (Alberts 2004). Les levures se reproduisent essentiellement par multiplication asexuée, toutefois la reproduction sexuée est possible. Les plantes sont des organismes pluricellulaires qui possèdent un mécanisme de reproduction beaucoup plus complexe ayant des organes reproducteurs spécifiques. Le pistil est l’organe sexuel femelle des plantes à fleurs, alors que les étamines sont les organes mâles (Jordan 1993). Dans le règne animal,
les reptiles, les amphibiens, les oiseaux et certains mammifères possèdent un organe nommé cloaque qui sert de voie commune au système digestif, urinaire et reproducteur. Chez la majorité des mammifères, le cloaque est une structure primitive transitoire qui fait partie du développement embryologique du système urogénital et digestif (Moore, Persaud et al. 2013). Chez l’homme, le cloaque existe à partir de la quatrième semaine de gestation et subit une séparation à la sixième semaine en sinus urogénital et boyau arrière (Warne, Hiorns et al. 2011). Le sinus urogénital donne place au système urinaire entier et aux deux tiers inférieurs du vagin (Moore and Dalley 1999). L’interaction entre les compartiments du mésenchyme et de l’épithélium régule la différenciation et la compartimentation du cloaque (Runck, Method et al. 2014). À partir de la 12ème semaine de gestation,
le canal anal, le vagin et l’ouverture urétrale sont établis.
Figure 1: Différenciation des canaux de Müller
À cinq semaines de gestation, les gonades sont identiques dans les deux sexes. Lors du stade sexuel indifférencié les embryons possèdent des canaux mésonéphriques (canaux de Wolff) et para-mésonéphriques (canaux de Müller). Les canaux de Müller, représentés en bleu, se développent pour donner place à l’utérus, les trompes utérines et au tiers supérieur du vagin. Le vagin possède deux origines embryologiques distinctes soit le mésoderme et l’endoderme. Les ovaires et la partie supérieure du vagin sont dérivés du mésoderme, alors que le sinus urogénital, représenté en jaune, provient de l’endoderme. Certaines anomalies du développement des canaux de Müller peuvent causer l’absence d’utérus, des trompes utérines, la présence d’un vagin borgne, tout en conservant des ovaires intacts. Adapté de UptoDate 2017.
Le développement sexuel féminin débute à partir de la troisième semaine de gestation et repose sur une régulation hormonale qui induit l’apoptose des cellules des canaux de Wolff et le développement des canaux de Müller (Langman, Sadler et al. 2015). En l’absence de testostérone et de l’hormone antimüllérienne (AMH) sécrétées par le testicule, le développement féminin se produit naturellement (Jameson 2010). Les canaux de Müller s’allongent caudalement et fusionnent à la 12ème semaine pour
former le canal utéro-vaginal. Ainsi, le tiers supérieur du vagin est formé par la canalisation des canaux de Müller, alors que les deux tiers inférieurs sont dérivés du sinus urogénital (Gupta, Bischoff et al. 2014). La fusion du canal vaginal est complétée à partir de la 20ème semaine. Par conséquent, le vagin possède deux origines embryologiques distinctes soit les canaux de Müller et le sinus urogénital (Moore, Persaud et al. 2013).
1.3 Histologie de la muqueuse vaginale
Le vagin est composé de trois couches soit: la muqueuse vaginale, une musculeuse intermédiaire et l’adventice qui sert de support structurel à l’organe (Hoffman, Schorge et al. 2016). La muqueuse vaginale présente des caractéristiques histologiques particulières décrites ci-après qui sont essentielles à la fonction adéquate du tissu.
1.3.1 Épithélium vaginal
La muqueuse vaginale est constituée d’un épithélium pavimenteux pluristratifié non kératinisé qui tapisse la cavité interne et recouvre une superficie moyenne de 87 cm2 (Pendergrass, Belovicz et al.
2003). L’épithélium vaginal possède une épaisseur moyenne de 150-200 µm chez une femme pré ménopausée (Squier, Mantz et al. 2008). Celui-ci est composé d’une couche basale, suprabasale, de plusieurs couches intermédiaires de cellules riches en glycogène et d’une couche apicale (Thompson, van der Bijl et al. 2001).
L’épithélium vaginal varie au cours de la vie d’une femme, car il est sujet aux fluctuations hormonales et environnementales. Avant la puberté, l’épithélium vaginal est mince, car celui-ci est composé uniquement des couches basale et suprabasale. Lorsque les femmes sont en âge de reproduction, l’épithélium vaginal s’épaissit et contient en moyenne 28 couches de cellules épithéliales (Patton, Thwin et al. 2000). Après la ménopause, le déclin en œstrogène induit une atrophie de l’épithélium vaginal, un épuisement des réserves en glycogène et un phénomène de kératinisation à la surface de l’épithélium vaginal similaire à l’épiderme (Nilsson, Risberg et al. 1995).
Figure 2: Coupe histologique de la muqueuse vaginale humaine native
Coloration trichrome de Masson d’une coupe de muqueuse vaginale humaine. Les différentes couches de l’épithélium vaginal sont indiquées: (a) couche basale, (b) couche suprabasale, (c) couches intermédiaires remplies de glycogène, (d) couche apicale. Le stroma vaginal est composé de fibroblastes, fibres de collagène de type I et III, d’élastine et d’autres protéines matricielles. Le stroma vaginal est riche en vaisseaux sanguins tel qu’indiqué avec des flèches jaunes. Photo prise au microscope avec un objectif X25. Image fournie par le Dr. Eric Philippe, Département de chirurgie de la Faculté de médecine, Université Laval. Barre d’échelle = 100 µm
L’épithélium vaginal représente une interface entre l’environnement externe et le stroma vaginal qui sert de barrière à l’entrée de pathogènes. La fonction de barrière de l’épithélium vaginal repose sur la stabilité des jonctions intercellulaires entre les cellules épithéliales (Marchiando, Graham et al. 2010). Les différents types de jonctions reparties au niveau de l’épithélium vaginal assurent une cohésion intercellulaire ainsi qu’une polarité apico-basale. Les jonctions intercellulaires ont une apparence semblable à une toile d’araignée qui reflète un réseau complexe de protéines transmembranaires, adaptatrices et structurelles. Les types de jonctions cellulaires présentes au niveau de l’épithélium vaginal sont principalement des jonctions d’adhérence, des jonctions serrées et des desmosomes (Blaskewicz, Pudney et al. 2011).
Figure 3: Distribution des jonctions
intercellulaires au niveau de l'épithélium vaginal
Distribution des jonctions intercellulaires en fonction de la polarité apico-basale de l’épithélium vaginal. Forte densité de protéines d’adhérence de type TJ, AJ et D au niveau des couches basale et suprabasale. Il y a une perte d’expression des protéines de jonctions dans les couches superficielles. Légende: AJ: jonctions d’adhérence, TJ: jonctions serrées, D: desmosomes
Adapté de Blaskewicz, Pudney et al. 2011.
Les jonctions serrées scellent l’espace intercellulaire par occlusion empêchant ainsi la diffusion passive entre les cellules. Elles sont constituées de protéines transmembranaires dont les claudines et l’occludine, et sont reliées au cytosquelette par des protéines adaptatrices zonula occludens (ZO) (Meng and Takeichi 2009). En plus de leur rôle dans la perméabilité tissulaire, elles agissent comme des plateformes de signalisation intracellulaire (Blaskewicz, Pudney et al. 2011, Oh, Lee et al. 2016). Dans l’épithélium vaginal, les molécules de jonctions serrées sont détectées essentiellement dans les couches inférieures. Les jonctions d’adhérence et les desmosomes assurent une résistance à la tension mécanique (Green and Simpson 2007). Les cellules épithéliales des couches basale et suprabasale contiennent des jonctions d’adhésion intercellulaire robustes, alors que les couches apicales démontrent une perte de ces jonctions d’adhésion (Langbein, Grund et al. 2002). La distribution apico-basale des jonctions cellulaires au sein de l’épithélium vaginal démontre une perte progressive des jonctions d’adhérences des cellules épithéliales lors de leur migration apicale (Blaskewicz, Pudney et al. 2011). Lorsque les cellules apicales desquament, les cellules de la couche basale assurent la régénération de l’épithélium vaginal et elles ont un haut taux d’activité mitotique. De plus, l’épithélium de la muqueuse vaginale joue un rôle de première ligne dans la défense contre certains pathogènes transmis sexuellement (Quayle 2002, Hickey, Patel et al. 2011). Les cellules
épithéliales du vagin sécrètent de nombreux facteurs antimicrobiens dont la lactoferrine et plusieurs défensines (Cole and Cole 2008, Patel, Fahey et al. 2013). Aussi, elles contiennent des mucines et produisent un glycocalyx riche en cellules immunitaire à la surface de l’épithélium (Gipson, Spurr-Michaud et al. 1995, Gipson, Ho et al. 1997, DeSouza, Lagow et al. 1998).
Les cellules apicales perdent leurs noyaux lorsqu’elles s’accumulant à la surface de l’épithélium vaginal (Asscher, De Boer et al. 1956). Ces cellules apicales essentiellement mortes sont remplies de glycogène et froment le stratum corneum. La cornification de l’épithélium vaginal sert de plateforme aux mécanismes immunitaires (Anderson, Marathe et al. 2014). Les cellules du stratum corneum sont relativement perméables, favorisent la croissance de la flore endogène et la production d’un biofilm (Anderson, Marathe et al. 2014). Au fur et à mesure que les cellules épithéliales se différencient et migrent en apical, leur contenu en glycogène augmente. Ainsi, uniquement les couches suprabasales et apicales contiennent du glycogène. Les cellules épithéliales des couches intermédiaires ajustent leur contenu en glycogène en fonction du taux d’œstrogène (Gregoire, Kandil et al. 1971, Ayehunie, Islam et al. 2015). Après la puberté, l’augmentation du taux d’œstrogène corrèle avec une augmentation du dépôt de glycogène au niveau des cellules épithéliales et l’établissement de la flore (Paavonen 1983). Le glycogène des cellules épithéliales est transformé en glucose, celui-ci est par la suite métabolisé par les lactobacilles en acide lactique. La production d’acide lactique par les lactobacilles crée microenvironnement vaginal acide (Boskey, Telsch et al. 1999). Malgré la diversité de la communauté bactérienne vaginale, les lactobacilles dominent la flore vaginale et jouent un rôle très important dans l’immunité contre certains pathogènes. Conséquemment, un déséquilibre de la flore vaginale prédispose au développement d’infections tel qu’une vaginose bactérienne (Morris, Nicoll et al. 2001). Le microenvironnement caractéristique de la muqueuse vaginale soutient l’établissement du microbiote vaginal qui à son tour maintient l’homéostasie du tissu (Nelson, Rockwell et al. 2016). Ainsi, l’intégrité de l’épithélium vaginal est essentiel aux nombreuses fonctions de celui-ci: barrière mécanique, régulation de la perméabilité, réponse hormonale, mécanismes de défense immunitaire et siège de la flore vaginale endogène. Sous l’épithélium se trouve la lame basale qui est une couche de matrice extracellulaire (MEC) sécrétée par les cellules épithéliales. Celle-ci sépare l’épithélium du reste du tissu conjonctif sous-jacent.
1.3.2 Stroma de la muqueuse vaginale
Le stroma vaginal est un tissu conjonctif constitué de fibroblastes qui sécrètent des éléments de la MEC composée de fibres de collagène de type I, III et V, d’élastine, de glycosaminoglycanes (GAG), protéoglycanes et glycoprotéines (Abramowitch, Feola et al. 2009). La famille des collagènes représente un élément majeur de la MEC, particulièrement le collagène de type I et III. Le collagène de type I est initialement sécrété sous forme de tropocollagène constitué de trois chaînes alpha
enroulées en hélice. Celui-ci subit de nombreuses modifications post-traductionnelles au niveau du réticulum endoplasmique rugueux (Alberts 2004, Frantz, Stewart et al. 2010). Une des modifications les plus importante est l’hydroxylation des résidus de lysine et proline en hydroxylysine et hydroxyproline. L’acide ascorbique est un cofacteur essentiel au déroulement de ces réactions d’hydroxylation (Hata and Senoo 1989). L’hydroxyproline stabilise le tropocollagène, alors que l’hydroxylysine assure la polymérisation des fibres de tropocollagène adjacentes par liaisons covalentes. L’enzyme lysyl-oxydase catalyse l’assemblage des fibres de collagène et d’élastine (Lucero and Kagan 2006). La réticulation des fibres de collagène dans la MEC procure une résistance mécanique. Les GAG présents au niveau de la MEC sont principalement l’acide hyaluronique, le sulfate d’héparine et le sulfate de chondroïtine (Montoya, Maldonado et al. 2015). Les protéoglycannes et les glycoprotéines interagissent avec les composantes de la MEC et contribuent à l’intégrité structurelle du stroma. Les intégrines sont des récepteurs d’adhésion cellulaire qui assurent les interactions entre les fibroblastes et les composantes de la MEC (Frantz, Stewart et al. 2010). Les fibroblastes assurent le maintien de l’intégrité de la MEC vaginale et sécrètent des enzymes cataboliques nommées métalloprotéases matricielles (MMP). Le remodelage matriciel repose sur un équilibre entre la synthèse et la dégradation matricielle assurée par les MMP (Mott and Werb 2004). L’action des MMP est contrecarrée par des inhibiteurs des MMP (TIMP) afin d’assurer une homéostasie tissulaire. Les MMP sont sécrétées sous forme de proenzymes et requièrent un clivage protéolytique afin d’être activées. Les sous types MMP-2 et MMP-9 dégradent les fibres de collagène I, III et V et l ‘élastine qui sont les composantes majeures des tissus conjonctifs du plancher pelvien (Jackson, Avery et al. 1996). L’œstrogène module l’expression des MMP au niveau de la peau et des organes du système reproducteur féminin. Un déclin d’œstrogène secondaire à la ménopause est associé avec une dégradation accrue de la MEC et une altération du contenu en collagène qui à leur tour prédisposent au prolapsus génital (POP) (Moalli, Shand et al. 2005). Le POP est caractérisé par une faiblesse du plancher pelvien et résulte en une protrusion des organes pelviens: la vessie, l’utérus ou le rectum dans le canal vaginal. Le POP affecte près de la moitié des femmes post ménopausées et cause des douleurs pelviennes chroniques, l’incontinence urinaire et la dysfonction sexuelle (Jelovsek, Maher et al. 2007). Des différences dans l’orientation des fibres de collagène, une rigidité accrue de la MEC vaginale, une augmentation de l’activité enzymatique, des altérations du contenu en collagène et en élastine, une atteinte de la réticulation des fibres de collagènes et une perte de la contractilité des fibroblastes ont été observées chez des femmes post ménopausées avec POP (Jackson, Avery et al. 1996, Kerkhof, Hendriks et al. 2009, Dviri, Leron et al. 2011, Ruiz-Zapata, Kerkhof et al. 2013, Ruiz-Zapata, Kerkhof et al. 2016). Ainsi, le comportement cellulaire des fibroblastes et le remodelage matriciel sont sujets à une régulation hormonale et influencent les propriétés biomécaniques du tissu vaginal.
1.4 Neurovascularisation
L’apport vasculaire de la muqueuse vaginale provient de l’artère vaginale, la branche vaginale de l’artère utérine, l’artère pudendale interne et des branches de l’artère rectale moyenne (Smith and Netter 2008). Le réseau vasculaire est composé d’artérioles, venules et microcapillaires. Des vaisseaux artériels et veineux se trouvent en périphérie, cependant la vascularisation de la muqueuse est essentiellement composée de microcapillaires ayant un diamètre inférieur à 100 µm (Bereza, Tomaszewski et al. 2012). L’architecture du réseau microvasculaire de la muqueuse vaginale consiste en fines boucles capillaires en forme d’épingle distribuées de façon homogène, similairement à la muqueuse gingivale et au lit d’ongle (Weber, Milstein et al. 2015).
Ces fins vaisseaux capillaires permettent la diffusion de l’oxygène et des nutriments à travers le tissu, ainsi que la lubrification de la muqueuse vaginale. La muqueuse vaginale est hautement vascularisée ayant une densité microcapillaire de 32 capillaires/mm2 chez la femme pré ménopausée en bonne santé (Weber, Milstein et al. 2015). La paroi vaginal antérieure est hautement innervée au niveau de la lamina propria, ce qui évoque une zone fortement érogène (Li, Liao et al. 2014, Ostrzenski, Krajewski et al. 2014). Dans le vagin, les capillaires sont innervés par un riche plexus de fibres nerveuses qui relarguent divers neuropeptides tels que le peptide intestinal vasoactif (VIP), le neuropeptide Y (NPY), la substance P et l’oxyde nitrique (NO) (Hoyle, Stones et al. 1996). Les nerfs contenant le VIP sont abondants et ont des propriétés vasodilatatrices. À l’opposé, le NPY cause la vasoconstriction (Blank, Gu et al. 1986). Ainsi, ces nombreuses fibres nerveuses sont essentielles pour la fonction sexuelle, car elles sont impliquées dans les fonctions sensorimotrices et hémodynamiques. Certaines fibres nerveuses pénètrent les couches de l’adventia, la media et l’intima des vaisseaux sanguins de plus grand calibre jusqu’à l’endothélium. L’innervation des vaisseaux de grands calibres en profondeur régule la perfusion sanguine, alors que l’innervation des microcapillaires en surface module avant tout la perméabilité capillaire (Hoyle, Stones et al. 1996). Contrairement à l’endomètre, l’épithélium vaginal est dépourvu de glandes, ainsi la lubrification du vagin dépend surtout de la vascularisation. Lors d’un stimulus sexuel, des neuropeptides sont libérés et altèrent la perméabilité capillaire (Munarriz, Kim et al. 2002). Un transsudat se forme et celui-ci migre à travers les cellules épithéliales en utilisant soit un transport transcellulaire via des canaux de type aquaporines localisés sur les cellules épithéliales ou un transport paracellulaire qui repose sur les jonctions serrées (Park, Han et al. 2008). La densité capillaire est significativement supérieure au niveau du tiers distal de la paroi vaginal antérieure comparativement au tiers proximal (Song, Hwang et al. 2009). Les disparités de la densité vasculaire et nerveuse dans les différentes zones de la paroi vaginale peuvent être attribuées à leurs différentes origines embryologiques.
1.5 Régulation hormonale
La muqueuse vaginale est un tissu dont la structure, la biomécanique et la vascularisation sont étroitement régulées par les hormones sexuelles. Les trois oestrogènes naturels sont l’17β-estradiol, l’estrone et l’estriol (DeCherney, Nathan et al. 2013). Le 17β-estradiol est l’œstrogène endogène le plus puissant, celui-ci est deux fois plus puissant que l’estrone et correspond à une concentration sérique jusqu’à quatre fois supérieure à celle de l’estrone (Gruber, Gruber et al. 2004). Le 17β-estradiol est produit essentiellement au niveau des ovaires par l’aromatisation de la testostérone. Le 17β-estradiol atteint un pic d’environ 275 pg/mL à mi-cycle qui déclenche l’ovulation (le Nestour, Marraoui et al. 1993). L’œstrogène se lie à un sous-type du récepteur d’œstrogène (ER) soit le ERα ou le ERβ qui appartiennent à la superfamille des ER (Cavallini, Dinaro et al. 2008). Ceux-ci sont des récepteurs nucléaires qui agissent comme des facteurs de transcription (Murdoch and Gorski 1991). Ainsi, l’œstrogène module l’expression génique, la synthèse protéique et les réponses cellulaires. L’effet de l’œstrogène sur les organes reproducteurs féminins repose sur une interaction entre le stroma et l’épithélium vaginal (Buchanan, Kurita et al. 1998). En réponse à l’œstrogène, les fibroblastes sécrètent des facteurs de croissance paracrines qui favorisent la prolifération des cellules épithéliales (Miyagawa and Iguchi 2015). La présence des récepteurs ERα au niveau de l’épithélium vaginal est nécessaire pour l’intégration des signaux sécrétés par le stroma et la différenciation épithéliale. Le récepteur ERα est exprimé dans les couches basale et suprabasale de l’épithélium vaginal, alors que le récepteur ERβ est présent dans les autres couches. Contrairement à l’ERβ, le récepteur ERα est aussi exprimé par les fibroblastes de vagin (Buchanan, Kurita et al. 1998).
Parmi la pléthore des changements qui accompagnent le déclin d’œstrogène associé à la ménopause, une atrophie des vaisseaux et une diminution de la perfusion sanguine vaginale contribuent aux symptômes de sécheresse vaginale (Robinson, Rainer et al. 1996). Ces symptômes peuvent être renversés avec un traitement local d’œstrogène (Simon, Nachtigall et al. 2008). Ainsi, la régulation hormonale influence l’hémodynamie de la muqueuse vaginale (Gorodeski 2007).
1.6 Biomécanique du vagin
Le vagin a un rôle de soutien aux organes pelviens adjacents tel que la vessie en antérieur et le rectum en postérieur. Le vagin est supporté par du tissu conjonctif et des muscles striés: les muscles élévateurs de l’anus, pubococcygien, iléococcygien et coccygien (Smith and Netter 2008). Ces muscles du plancher pelvien, qui ont pour fonction dans plusieurs espèces animales à soutenir la queue, se sont adaptés avec l’évolution biologique de l’homme d’une espèce quadripode à bipode
afin de soutenir les organes pelviens au gré de la force de gravité. Le tissu vaginal possède des propriétés biomécaniques particulières, car il s’agit d’un tissu avec un grand potentiel de déformabilité lorsque soumis à un stress de tension (Rubod, Boukerrou et al. 2008). Les variations importantes des valeurs de force maximales observées avec l’âge au niveau du tissu vaginal en comparaison avec le rectum et la vessie suggèrent que le tissu vaginal subit des changements considérables avec l’âge qui sont d’origine plutôt traumatique que naturelle (Chantereau, Brieu et al. 2014). Les fibroblastes de vagin sont réceptifs aux forces mécaniques et s’alignent perpendiculairement aux forces de tension (Ruiz-Zapata, Kerkhof et al. 2013). Conséquemment, des traumas induisent une réorganisation de la MEC et peuvent causer par un effet de Mullins une augmentation de la rigidité du tissu vaginal, ce qui expliquerait que les femmes ayant eu plusieurs accouchements sont à plus grand risque de POP (Rahn, Ruff et al. 2008). De plus, la biomécanique du vagin est influencée par les taux d’œstrogène (Pessina, Hoyt et al. 2006). L’ovariectomie dans un modèle animal altère considérablement l’intégrité biomécanique du vagin et des tissus de support, cependant un supplément d’œstrogène renverse cette instabilité structurelle et préserve l’homéostasie de la MEC (Moalli, Debes et al. 2008, Liang, Knight et al. 2016). Ainsi, les paramètres biomécaniques du vagin sont particulièrement sujets à changement au cours de la vie et corrèlent avec l’âge, le statut hormonal et les stress induits.
1.7 Anomalies de la muqueuse vaginale
Plusieurs atteintes ou anomalies de la muqueuse vaginale nécessitent des interventions chirurgicales: anomalies congénitales, néoplasies vaginales, traumas, fistules vésico-vaginales obstétricales ou iatrogéniques (Leissner, Black et al. 2000, Haferkamp, Wagener et al. 2005, Liu, Shen et al. 2005, Hadzi-Djokic, Pejcic et al. 2009).
1.7.1 Anomalies congénitales : syndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser
Plusieurs anomalies congénitales du développement urogénital peuvent nécessiter des chirurgies de reconstruction telles que les malformations du cloaque et l’agénésie vaginale. Les malformations du cloaque sont considérées comme des anomalies congénitales très sévères qui résultent d’une non-séparation des structures dérivées du cloaque, c’est à dire l’orifice urétral, le vagin et le canal anal (Levitt and Pena 2010).
Le syndrome Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) est une dysgénésie des canaux de Müller qui représente 3% des anomalies müllériennes (Breech and Laufer 2009). La prévalence du syndrome MRKH est de 1/4000 à 1/5000 nouveau-nés de sexe féminin et il est considéré comme la deuxième cause d’aménorrhée primaire (Evans, Poland et al. 1981). La moitié des patientes MRKH présentent également des anomalies du système urinaire. Les patientes MRKH ont un sous-développement des
canaux de Müller qui résulte en une absence d’utérus, de trompes et du tiers supérieur du vagin (Hoffman, Schorge et al. 2016). La cause du syndrome MRKH reste encore discutée, cependant une explication plausible est l’activation anormale de l’hormone AMH, qui inhibe le développement des structures müllériennes (Pizzo, Lagana et al. 2013, Nodale, Ceccarelli et al. 2014). Ces patientes possèdent, toutefois, une fonction ovarienne normale et un vagin borgne (2/3 inférieur) qui origine du sinus uro-génital. Elles ont un développement sexuel normal et consultent à l’adolescence pour un problème d’aménorrhée et des difficultés lors des relations sexuelles (Hoffman, Schorge et al. 2016). Le diagnostic de MRKH chez de jeunes femmes peut représenter une importante source de détresse psychologique. Le traitement de première ligne pour les patientes MRKH reste à ce jour un traitement conservateur de dilatation du canal vaginal (Care 2002). La méthode de Frank fut introduite en 1938 et reposait alors sur l’usage de dilatateurs faits en verre (Frank 1938). En 1981, la méthode d’Ingram utilisait un bicycle stationnaire doté d’un dilatateur vaginal afin d’augmenter la pression à l’aide du poids de la patiente (Ingram 1981). Afin d’assurer un haut taux de succès, les thérapies de dilatation requiert des patientes impliquées et matures sexuellement. Ces thérapies génèrent de l’inconfort, exigent un investissement de temps et peuvent causer des complications locales (Bellati, Calcagno et al. 2009). De plus, il s’agit d’un traitement à long terme dont les résultats dépendent de la sévérité de l’agénésie. Pour ces raisons, les patientes MRKH désirent souvent bénéficier d’une chirurgie de reconstruction connue sous le terme de vaginoplastie (Roberts, Haber et al. 2001).
1.7.2 Néoplasies vaginales
Malgré la faible prévalence des néoplasies primaires du vagin, représentant moins de 2% de tous les cancers du système reproducteur féminin, le vagin peut être un site de néoplasie secondaire soit par métastase ou extension locale d’une néoplasie adjacente (Hoffman, Schorge et al. 2016). Les métastases vaginales par extension directe proviennent du col utérin, de l’endomètre ou de la vulve, alors que les métastases par voie hématogène ou lymphatique proviennent de néoplasies à distance comme le cancer du sein, du rein ou de l’ovaire. En ordre de fréquence, la majorité des néoplasies vaginales sont des carcinomes épidermoïdes, suivi des mélanomes, sarcomes et adénocarcinomes. L’adénocarcinome est un cancer primaire qui affecte les jeunes femmes de moins de 20 ans, alors que le rabdomyosacrome embryonnaire est une tumeur vaginale très maligne qui se présente dans l’enfance (DeCherney, Nathan et al. 2013).
Dans un contexte de stade oncologique avancé, l’exentération pelvienne vise à réséquer les organes reproducteurs et dans certains cas la vessie ou le rectum. Dans certains cas, la reconstruction vaginale peut même être vitale pour restaurer l’anatomie pelvienne et combler un vide anatomique créé par une résection extensive (Mirhashemi, Averette et al. 2002, Hockel 2003). La reconstruction
vaginale dans un contexte oncologique a pour objectif d’accélérer le processus de guérison et restaurer l’anatomie du plancher pelvien (Pusic and Mehrara 2006, Hockel and Dornhofer 2008). L’augmentation des mesures de dépistage et, conséquemment, des taux de survie des patientes font apparaître à long terme des morbidités secondaires aux traitements oncologiques qui nuisent considérablement à la qualité de vie des patientes (Panici and Angioli 2003). Suite à des traitements oncologiques, les patientes peuvent avoir des séquelles dont une dysfonction sexuelle. La radiothérapie pelvienne induit une sténose et fibrose vaginale à long terme, et compromet la fonction et la vascularisation de l’organe (Kirchheiner, Nout et al. 2016). De plus, des changements au niveau de la microvascularisation vaginale induisent une atrophie de la muqueuse vaginale. Une perte des structures microcapillaires entrave la perfusion adéquate du tissu et une dilatation pathologique des capillaires cause des télangiectasies qui sont prônes aux saignements. Une détérioration du tissu vaginal peut causer des ulcérations, des fistules ou une nécrose qui contribuent à la fragilité du tissu et aux symptômes associés (Kirchheiner, Fidarova et al. 2012). Ainsi, la reconstruction vaginale chez des patientes ayant des antécédents de chirurgies ou de traitements de radiothérapie pelvienne est un défi considérable étant donné l’état du tissu vaginal qui peut nuire considérablement à la prise de greffon et la guérison de plaie (Pusic and Mehrara 2006).
1.8 Thérapies et chirurgies de reconstruction
Les chirurgies de reconstruction visent à restaurer autant la structure que la fonction de l’organe. La reconstruction vaginale a pour but de rétablir l’anatomie, la fonction sexuelle, l’image corporelle et avant tout améliorer la qualité de vie des femmes (Panici, Ruscito et al. 2011). Cette intervention cible principalement deux types de patients soit la population pédiatrique avec des anomalies congénitales ou des femmes ayant des cancers urogénitaux.
Historiquement, les premières reconstructions de néovagin ont été décrites en 460-377 avant Jésus-Christ par Hippocrate (Goldwyn 1977). En 1898, la vaginoplastie de Abbè fut introduite, celle-ci consiste d’une autogreffe de peau prélevée au niveau de la cuisse antérieure (Abbe 1898). Toutefois, ce n’est qu’à partir de 1938 que l’usage des autogreffes de peau pour la reconstruction vaginale devient popularisé avec la méthode de McIndoe qui consiste en l’enroulement d’un greffon de peau autour d’un stent en plastique (McIndoe and Banister 1938, Mc 1950). À partir des années 1970, le choix des greffons est orienté selon les territoires de vascularisation comme les lambeaux musculocutanés à partir du muscle gracilis ou du muscle grand droit de l’abdomen (Pusic and Mehrara 2006). Dans le contexte oncologique, différentes approches chirurgicales ont été proposées selon l’atteinte vaginale. Par exemple, pour corriger un défaut de la paroi vaginale postérieur, le choix
d’un lambeau à partir du muscle grand droit de l’abdomen permet de remplir davantage l’espace mort (Pusic and Mehrara 2006).
La vaginoplastie intestinale a été décrite pour la première fois en 1904 par Baldwin (Baldwin 1904). Cette intervention chirurgicale ne nécessite pas l’usage de dilatateurs, ce qui en fait une procédure favorisée dans un contexte pédiatrique. Malgré la divergence des opinions sur la place de la vaginoplastie sigmoïdienne dans la littérature, cette approche semble donner des résultats satisfaisants, cependant comporte un risque de complications digestives (Thomas and Brock 2007).
Tableau 1: Résumé des approches de reconstruction vaginale pour les patientes MRKH
Inspiré de Thomas and Brock 2007, Torres-de la Roche, Devassy et al. 2016.
Thérapies Description Avantages Inconvénients
Méthode de Frank, Ingram Frank : Dilatation manuelle Ingram : Bicycle stationnaire doté d’un dilatateur • Traitement conservateur • Préserve tissu vaginal • Résultats satisfaisants
• Inconfort
• Maturité Sexuelle • Traitement à long terme • Temps
• Résultats limités selon atteinte
Méthode de Vechietti
Dilatation par traction interne; bille acrylique relie le vagin à la paroi abdominale
• Procédure minimalement invasive
• Préserve tissu vaginal
• Inconfort
• Usage de dilatateurs • Contraction à long terme • Risque de prolapse • Lésions urologiques
Méthode d’Abbe
Autogreffe de peau • Reconstruction de
néovagin • • Sécheresse vaginale Poils au niveau de la greffe • Cicatrice au site donneur • Risque de prolapse/ sténose • Sténose
Méthode McIndoe
Autogreffe de peau enroulée autour d’un stent
• Reconstruction de néovagin • Risque de fistule vésico- vaginale
• Prolapse • Dyspaneurie • Sténose du greffon • Cicatrice au site donneur • Risque de carcinome épidermoïde Vaginoplastie intestinale Prélèvement d’intestin ou du colon sigmoïde • Clientèle pédiatrique • Évite l’usage de dilatateur
• Sécrétions excessives de mucus
• Risque d’adénocarcinome • Complications digestives : iléus
D’autres substituts anatomiques ont été décrits pour la reconstruction vaginale: la muqueuse buccale (Grimsby and Baker 2014), la membrane amniotique (Morton and Dewhurst 1986), le péritoine (Davydov and Zhvitiashvili 1974), des matrices de derme accelularisé (Zhu, Zhou et al. 2013) et des matrices de cellulose oxydée (Motoyama, Laoag-Fernandez et al. 2003, Sharma, Gupta et al. 2007). Ainsi, les techniques de chirurgies de reconstruction vaginale utilisent divers substituts anatomiques qui présentent des complications majoritairement d’ordre fonctionnel tel que la sécheresse vaginale, et la dyspareunie (Pusic and Mehrara 2006). Malgré l’introduction des techniques sophistiquées de reconstruction vaginale mentionnées précédemment, il n’y pas à ce jour de consensus sur la meilleure approche chirurgicale, car toutes ces techniques ont leurs avantages et inconvénients et qu’aucune ne permet de restaurer fidèlement l’anatomie et la fonction du tissu natif (McQuillan and Grover 2014, Sadri-Ardekani and Atala 2015). La reconstruction de tissus autologues par génie tissulaire s’avère une alternative thérapeutique qui pallie au manque de substrats adéquats pour ce type d’intervention. 1.9 Génie tissulaire
Dans le but d’offrir de nouvelles solutions pour la reconstruction d’organes et le remplacement de tissus endommagés, le génie tissulaire a pour objectif de reconstruire des tissus biologiques. L’émergence du génie tissulaire à la fin du 20e siècle remédie à la problématique de pénurie d’organes.
La pénurie du don d’organes pour les transplantations représente un fardeau économique important pour le système de santé pouvant s’élever à plus de 400 milliards par années aux États-Unis (Langer and Vacanti 1993). Le génie tissulaire est axé sur le développement de nouvelles stratégies pour restaurer des tissus humains en intégrant plusieurs disciplines dont la biologie moléculaire et le génie biomédical (Viola, Lal et al. 2003). Une application clinique du génie tissulaire est la reconstruction d’autogreffe d’épiderme pour le traitement des grands brûlés (Parenteau, Nolte et al. 1991). Depuis 1979, des épidermes cultivés autologues sont reconstruits pour servir de greffes pour les grands brûlés (Green, Kehinde et al. 1979). Le laboratoire d’organogenèse expérimentale (LOEX) a été fondé en 1985 au Québec. En 1986, la première greffe d’épiderme cultivé au Canada a été transplantée chez un patient grand brûlé. Depuis, le LOEX possède des salles blanches dédiées à la reconstruction d’épidermes pour le traitement des grands brûlés (Auger, Berthod et al. 2004).
Figure 4: Principe du génie tissulaire pour la reconstruction de tissus humains
Les étapes principales du génie tissulaire sont: a) l’extraction de cellules isolées de patient à partir d’une biopsie ou d’un prélèvement, b) l’amplification cellulaire en culture et c) l’ensemencement des cellules sur des substrats biologiques ou synthétiques. d) En présence de plusieurs facteurs de croissance, les cellules prolifèrent et forment des tissus humains in vitro. e) Ceux-ci qui peuvent par la suite servir de substrats pour des chirurgies de reconstruction. Adapté de Harvard Extension School.
1.9.1 Stratégies de génie tissulaire
Le génie tissulaire repose sur l’usage de différents matériaux d’échafaudage tels que des polymères naturels comme le collagène et la gélatine, ou des polymères synthétiques comme le polyéthylène glycol ou un polymère d'acide glycolique (PGA). Les hydrogels sont obtenus par liaison physique, chimique ou encore par rayonnement ultraviolet entre différents polymères (Yi, Ding et al. 2017). Les biomatériaux jouent un rôle structurel et de soutien à la reconstruction tissulaire (Fuchs, Nasseri et al. 2001). Il existe différentes stratégies de génie tissulaire, celles-ci emploient soit l’usage de cellules qui peuvent être injectées directement in vivo, l’usage de molécules comme des facteurs de croissance qui stimulent la prolifération cellulaire ou finalement la reconstruction de tissu in vitro à partir d’une matrice (Vacanti and Langer 1999). Plusieurs types de matrices peuvent servir de matériel d’échafaudage soit une MEC synthétique, biologique ou acellularisée (Sadri-Ardekani and Atala 2015).
1.9.2 Méthode d’auto-assemblage
Tel que décrit en 1972, les fibroblastes dermiques humains, en présence d’acide ascorbique, synthétisent du collagène en culture cellulaire (Switzer and Summer 1972). De plus, les fibroblastes dermiques supplémentés avec de l’acide ascorbique sécrètent assez de collagène in vitro pour former une matrice 3D (Hata and Senoo 1989). La technique d’auto-assemblage du LOEX repose entièrement sur le potentiel intrinsèque des cellules de sécréter leur propre MEC en présence d’acide ascorbique (Auger, Lopez Valle et al. 1995, Auger, Remy-Zolghadri et al. 2002, Berthod, Germain et al. 2006). Au fur et à mesure que les cellules construisent leur microenvironnement via la sécrétion des éléments de la MEC, elles forment des interactions cellule-cellule et cellule-MEC. Ces interactions cellulaires et matricielles ainsi que le remodelage de la MEC reproduisent fidèlement l’architecture de tissu natif (Chabaud, Rousseau et al. 2015). L’auto-assemblage offre d’excellents résultats de différenciation cellulaire et de fonction biologique (Auger 2006). De plus, la technique d’auto-assemblage du LOEX permet de reconstruire des tissus humains sans avoir recours à des biomatériaux qui pourraient avoir des effets toxiques in vivo (Germain, Goulet et al. 2002, Auger, Berthod et al. 2004). Cette technique a été appliquée pour la reconstruction de plusieurs tissus: la peau (Auger, Lopez Valle et al. 1995), la cornée (Proulx, d'Arc Uwamaliya et al. 2010), le tissu adipeux (Vermette, Trottier et al. 2007), la vessie (Bouhout, Perron et al. 2010), l’urètre (Magnan, Levesque et al. 2009), l’os (Galbraith, Clafshenkel et al. 2017), les vaisseaux sanguins (L'Heureux, Paquet et al. 1998, L'Heureux, Germain et al. 1999), les valves cardiaques (Picard-Deland, Ruel et al. 2017) et récemment la muqueuse vaginale (Orabi, Saba et al. 2017). De plus, des essais cliniques sont présentement en cours pour des greffes de peaux reconstruites bilamellaires ainsi que des greffes de cornée (Proulx, Fradette et al. 2011, Larouche, Cantin-Warren et al. 2016). Aussi, les peaux reconstruites ont aussi été testées pour le traitement d’ulcères veineux chroniques (Boa, Cloutier et al. 2013). Ces modèles reconstruits reproduisent fidèlement les tissus natifs, et permettent également de modéliser des pathologies comme la sclérodermie (Corriveau, Boufaied et al. 2009), le psoriasis (Jean, Lapointe et al. 2009), les cicatrices hypertrophiques (Simon, Bergeron et al. 2012), le mélanome (Gibot, Galbraith et al. 2013) et la sclérose latérale amyotrophique (Pare, Touzel-Deschenes et al. 2015). Les divers tissus reconstruits par auto-assemblage sont en constante optimisation afin de reproduire davantage la complexité des tissus vivants.
1.9.3 Applications du génie tissulaire dans la reconstruction vaginale
Quelques études démontrent des résultats prometteurs de l’implantation in vivo de muqueuse vaginale reconstruite par génie tissulaire. Notamment, une étude porte sur la reconstruction de muqueuse vaginale autologue de lapin qui a été implantée en sous-cutané chez la souris immunodéprimée, puis chez des lapines (De Filippo, Yoo et al. 2003, De Filippo, Bishop et al. 2008). Ce modèle est composé
de cellules de muscle lisse et de cellules épithéliales de vagin de lapin qui ont été ensemencées sur un échafaudage tubulaire de PGA. Lors de l’implantation animale, les greffons ont été recouverts d’omentum afin de favoriser la vascularisation du greffon. Les résultats ont démontré la présence d’un épithélium vaginal et de fibres musculaires six mois après la greffe. De plus, des tests de contractilité en réponse à des signaux électriques et pharmaceutiques ont souligné une ressemblance fonctionnelle entre les tissus reconstruits implantés et le vagin natif (De Filippo, Bishop et al. 2008).
En 2007, un néovagin reconstruit par culture cellulaire a été implanté chez une première patiente MRKH de 28 ans (Panici, Bellati et al. 2007). À partir d’une biopsie de muqueuse vaginale de 1 cm2,
une greffe de 314 cm2 a été reconstruite par thérapie cellulaire. Les cellules épithéliales de vagin ont
été mises en culture sur un gel de collagène IV pendant deux semaines. Les gels ont été transférés sur des gazes d’acide hyaluronique afin de former un néovagin de 12 cm de longueur par 2 cm de diamètre. L’opération consistait en une dissection d’un canal vaginal jusqu’au cul de sac de Douglas et d’une vaginoplastie par technique modifiée d’Abbé-McIndoe (Panici, Ruscito et al. 2011). Le même laboratoire a publié quelques années plus tard, une série d’implantation du même modèle chez 23 patientes MRKH âgées entre 17 et 49 ans. Le temps de culture in vitro à partir du moment de la biopsie jusqu’au jour de la chirurgie est en moyenne de 20,4 jours et le temps opératoire de 21,5 minutes. Le taux de prise du greffon est de 83% et un questionnaire de fonction sexuelle FSFI a été utilisé comme outil d’évaluation. En moyenne les patientes ont un score au FSFI de 27,2/ 36 correspondant à un résultat satisfaisant (Benedetti Panici, Maffucci et al. 2015, Rosen, Brown et al. 2000).
Par ailleurs, une autre étude décrit l’implantation de MVH reconstruite autologue à partir d’une biopsie de vulve chez quatre patientes MRKH âgées entre 13 et 18 ans. Similairement aux études d’implantation chez les lapines, des cellules musculaires lisses et cellules épithéliales ont été ensemencées sur l’échafaudage de PGA dont les dimensions ont été personnalisées pour chaque patiente par modélisation informatique. Des segments de muqueuse intestinale décellularisée ont été ensemencés avec des cellules de patientes afin d’ajouter de l’élasticité au greffon. Un suivi jusqu’à huit ans démontre un succès à long terme (Raya-Rivera, Esquiliano et al. 2014).
Récemment, un nouveau modèle in vitro de muqueuse vaginale humaine (MVH) reconstruite par technique d’auto-assemblage a été introduit par l’équipe du Dr. Bolduc au LOEX. Ce modèle est développé à partir de fibroblastes de vagin et de cellules épithéliales de vagin extraits à partir de biopsies de MVH saines (Orabi, Saba et al. 2017). Différents modèles ont été reproduits selon le statut hormonal des patientes soit un modèle prépubertaire à partir d’une biopsie de fille de 3 ans, pré ménopausée d’une femme de 32 ans et post ménopausée d’une femme de 64 ans. Ce modèle de MVH reconstruite par auto-assemblage permet d’obtenir un épithélium pluristratifié bien différencié
(Figure 1.5). Une coloration d’acide périodique de Schiff (PAS) démontre la présence de mucopolysaccharides au niveau de l’épithélium vaginal des tissus reconstruits (Figure 1.5 c-d) (Orabi, Saba et al. 2017). De plus, ces équivalents expriment plusieurs marqueurs de l’épithélium vaginal dont des cytokératines AE1-AE3, l’involucrine, la mucine-1, le récepteur Erβ et la laminine V au niveau de la membrane basale. De plus, des marqueurs du stroma comme le collagène de type I, III et l’élastine sont présents (Figure 1.6) (Orabi, Saba et al. 2017).
Figure 5: Coloration histologique du modèle de MVH reconstruite par auto-assemblage
(a-b) Une coloration trichome de Masson du modèle de MVH reconstruite par auto-assemblage démontre la présence d’un épithélium pluristratifié et pavimenteux similaire au tissu natif. (c-d) Une coloration PAS du tissu vaginal reconstruit met en évidence la présence de mucopolysaccharides au niveau de l’épithélium vaginal des tissus reconstruits. Les cellules épithéliales des couches intermédiaires dans les tissus reconstruits de MVH sont remplies de polysaccharides. (b) Barre d’échelle = 100 µm, tiré des travaux de Weronika Jakubowska, (c-d) Barre d’échelle= 50µm, résultats tirés des travaux d’Ingrid Saba
Ces études soulignent le potentiel du génie tissulaire comme option thérapeutique attrayante pour la reconstruction vaginale. La vaginoplastie par thérapie cellulaire présente de nombreux avantages: celle-ci est autologue, s’avère relativement sécuritaire, nécessite un court temps opératoire, est réalisable dans un contexte minimalement invasif, ne cause pas de morbidités au site donneur et permet de reproduire un tissu dérivé à partir du tissu natif qui restaure mieux la fonction sexuelle (Benedetti Panici, Maffucci et al. 2015). Malgré les cas d’implantation chez des patientes MRKH, ces études demeurent expérimentales et nécessitent davantage d’optimisation avant de devenir une option de reconstruction courante. Avant tout, le développement de stratégies de vascularisation est essentiel pour assurer la prise du greffon et rétablir la fonction du tissu (Auger, Gibot et al. 2013).
Figure 6: Caractérisation immunohistochimique du modèle de MVH reconstruite au LOEX
Comparaison des marqueurs de l’épithélium et du stroma vaginal détectés par immunofluorescence au niveau de la MVH reconstruite vs le tissu natif: cytokératines AE1/AE3, involucrine, mucine-1, ERβ, laminine V, collagène de type I, III et élastine. Adapté de Orabi, Saba et al. 2017.
