Développement de matrices composites à base de collagène et de chitosane pour la régénération de cartilage

Texte intégral

(1)Développement de matrices composites à base de collagène et de chitosane pour la régénération de cartilage. Thèse. Nabila Mighri. Doctorat en génie chimique Philosophiae Doctor (Ph.D.). Québec, Canada © Nabila Mighri, 2016.

(2) Développement de matrices composites à base de collagène et de chitosane pour la régénération de cartilage. Thèse. Nabila Mighri. Sous la direction de :. Pr Mahmoud Rouabhia, directeur de recherche Pr Frej Mighri, codirecteur de recherche Pr Abdellah Ajji, codirecteur de recherche.

(3) RÉSUMÉ. Après une perte importante d’un tissu cartilagineux, plusieurs possibilités s’offrent aux chirurgiens pour remplacer cette perte tissulaire. Parmi, cela nous trouvons,. les greffes. autologues ou allogéniques et l’utilisation de polymères biocompatibles. Sans oublier que jusqu’aujourd’hui, les propriétés et la structure du cartilage natif n’ont pas été entièrement imitées par l’ingénierie tissulaire. Étant donné les limitations des méthodes actuelles, telles que : la pénurie des donneurs, l’immunogénicité des greffons allogéniques, et le manque d’intégration des polymères l’ingénierie tissulaire du cartilage pourrait constituer une excellente alternative aux méthodes actuelles. Nos objectifs pour cette thèse sont (i) de produire une matrice composite constituée de polymères naturels; (ii) d’évaluer les propriétés physicochimiques de ces matrices composites, et (iii) d’évaluer les propriétés biologiques de ces matrices pour la production de tissu cartilagineux. Nous avons réalisé qu’une combinaison des deux biopolymères, le collagène et le chitosane, nous a permis d’obtenir une matrice avec des propriétés mécaniques et biologiques renforcées en comparaison à une matrice de collagène seul. La caractérisation physicochimique de nos matrices nous a permis de mieux comprendre les types de réactions chimiques produites entre les deux polymères et les différents autres constituants de la matrice utilisés pour des fins mécaniques, tel que le glutaraldéhyde, et pour des fins biologique,s tels que l’acide glutamique et la glycine. En second lieu, nos résultats portant sur la caractérisation biologique nous ont permis de confirmer que nos matrices composites produites, ensemencées de chondrocytes, favorisent l’adhésion et la prolifération de ces cellules.. iii.

(4) Nos résultats démontrent de façon tangible l’efficacité d’une combinaison entre le collagène et le chitosane pour la régénération in vitro de tissus cartilagineux. Ces résultats devront être confirmés in vivo en utilisant un modèle animal afin de confirmer la pertinence des membranes composite à base de collagène et de chitosane pour des applications biomédicales, dont le remplacement du cartilage endommagé.. iv.

(5) ABSTRACT. Given the large number of patients suffering from cartilage damage, with different degrees of severity affecting all ages, a wide range of approaches has been designed. These include autologous or allogeneic grafts, the implementation of polymers, etc. However, each of these cartilage replacement do have significant limitations, such as the scarcity of donors, the risk of infection and disease transmission, the immunogenicity of the polymer implants and their reduced integration with native tissue. To overcome these limitations, tissue engineering cartilage could be an excellent alternative. The objectives of our studies are (i) to produce a natural composite matrix containing collagen and chitosan, (ii) evaluate the physicochemical properties of these composite matrices, and (iii) investigate the biological properties of these matrices for the production of cartilage tissue. Our structural and ultrastructural analyses demonstrated that collagen porous membrane can be coated with chitosan at different concentration leading to the formation of a natural composite matrix. The physicochemical characterization confirmed the chitosan interaction with collagen leading to a mechanically stable matrix that can easily be handled. It is also important to mention that the use of cross-linker such as glutaraldehyde improved the mechanical properties of the composite matrix. These designed composite matrixes were biocompatible allowing cell adhesion and growth. These biological activities were improved when composite matrix was pretreated with glutamic acid and glycine. Such matrix offered appropriate condition allowing the adhesion and growth of chondrocytes. Overall, we were able to design a composite matrix by combining collagen membrane and chitosan solutions. Although very interesting, our in vitro data should be confirmed by in vivo studies using an animal model, prior to clinical applications.. v.

(6) TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ……. ......................................................................................................................................................... III ABSTRACT. ............................................................................................................................................................. V TABLE DES MATIÈRES ............................................................................................................................................ VI LISTES DES TABLEAUX .........................................................................................................................................VIII LISTES DES FIGURES .............................................................................................................................................. IX LISTE DES ABREVIATIONS ...................................................................................................................................... XI DÉDICACES ..........................................................................................................................................................XIV REMERCIEMENTS .................................................................................................................................................XV 1. CHAPITRE I: ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE............................................................................................................ 3 1.1. LE CARTILAGE ...................................................................................................................................................3. 1.1.1. Généralités ...............................................................................................................................................3. 1.1.2. Organisation du cartilage ........................................................................................................................5. 1.1.3. Constitution du cartilage ..........................................................................................................................6. 1.2. LES CAUSES ET CONSÉQUENCES DES PERTES CARTILAGINEUSES SUR LA SANTÉ DES PATIENTS ...............................................13. 1.2.1 1.3. L’INGÉNIERIE TISSULAIRE ......................................................................................................................................18. 1.3.1. L’ingénierie tissulaire au service la peau ................................................................................................20. 1.3.2. L’ingénierie tissulaire au service du foie .................................................................................................21. 1.3.3. L’ingénierie tissulaire au service de l’os .................................................................................................21. 1.4. L’INGÉNIERIE TISSULAIRE DU CARTILAGE ..................................................................................................................22. 1.4.1. 2. Les moyens actuels pour le traitement des pertes de cartilage .............................................................14. Les biomatériaux utilisés pour la régénération cartilagineuse...............................................................23. 1.5. CONTEXTE ET HYPOTHÈSES ...................................................................................................................................44. 1.6. OBJECTIFS .........................................................................................................................................................46. CHAPITRE II : MATÉRIELS ET MÉTHODES ....................................................................................................... 47 2.1. MATÉRIELS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES .................................................................................................................47. 2.2. MÉTHODES .......................................................................................................................................................47. 2.2.1. Protocole de production des matrices composites .................................................................................47. 2.2.2. Techniques de caractérisation ................................................................................................................48. 2.2.3. Protocole de traitement des matrices composites à l’acide glutamique ...............................................59. 2.2.4. Protocole de traitement des matrices composites à la glycine ..............................................................59. 2.2.5. Effet de l’acide glutamique et de la glycine sur l’adhésion et sur la croissance/prolifération des. chondrocytes .......................................................................................................................................................60 3. CHAPITRE III : RÉSULTATS .............................................................................................................................. 62. vi.

(7) 4. 3.1. PRODUCTION DES MEMBRANES COMPOSITES À BASE DE COLLAGÈNE ET DE CHITOSANE .....................................................62. 3.2. TECHNIQUES DE CARACTÉRISATION ........................................................................................................................63. 3.2.1. Caractérisation chimique des membranes .............................................................................................63. 3.2.2. Caractérisation biologique des membranes ...........................................................................................70. 3.2.3. Caractérisation chimique des membranes après traitement à l’acide glutamique ...............................73. 3.2.4. Caractérisation chimique des membranes après traitement à la glycine ..............................................81. 3.2.5. Caractérisation biologique des membranes après traitement à la glycine ............................................88. CHAPITRE IV : DISCUSSIONS .......................................................................................................................... 91 4.1. SYNTHÈSE .........................................................................................................................................................91. 4.2. CARACTÉRISATION CHIMIQUE DES MEMBRANES DÉVELOPPÉES .....................................................................................92. 4.2.1. Caractérisation par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) .....................................92. 4.2.2. Caractérisation par spectrométrie photoélectronique X (XPS) ...............................................................94. 4.2.3. Caractérisation par microscopie électronique à balayage (MEB) ..........................................................95. 4.2.4. Caractérisation des propriétés mécaniques ...........................................................................................96. 4.3. CARACTÉRISATION BIOLOGIQUE DES MEMBRANES DÉVELOPPÉES ..................................................................................98. 4.3.1. Étude de l’adhésion cellulaire sur les membranes .................................................................................98. 4.3.2. Évaluation de la prolifération des chondrocytes après culture sur les différentes membranes .............99. 4.3.3. Dosage de l’interleukine IL-6 ..................................................................................................................99. 4.4. CARACTÉRISATION CHIMIQUE DES MEMBRANES APRÈS TRAITEMENT À L’ACIDE GLUTAMIQUE ...........................................100. 4.4.1. Caractérisation par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ...................................100. 4.4.2. Caractérisation par spectrométrie photoélectronique X (XPS) .............................................................101. 4.4.3. Caractérisation par microscopie à balayage (MEB) .............................................................................102. 4.5. CARACTÉRISATION BIOLOGIQUE APRÈS TRAITEMENT À L’ACIDE GLUTAMIQUE ................................................................103. 4.6. CARACTÉRISATION CHIMIQUE DES MEMBRANES APRÈS TRAITEMENT À LA GLYCINE .........................................................103. 4.6.1. Caractérisation par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ...................................103. 4.6.2. Caractérisation par spectrométrie photoélectronique X (XPS) .............................................................105. 4.6.3. Caractérisation par microscopie à balayage (MEB) .............................................................................106. 4.7. CARACTÉRISATION BIOLOGIQUE DES MEMBRANES APRÈS TRAITEMENT À LA GLYCINE.......................................................106. 5. CONCLUSION ............................................................................................................................................... 108. 6. PERSPECTIVES ............................................................................................................................................. 111. 7. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................................ 112. 8. ANNEXES ..................................................................................................................................................... 124. vii.

(8) LISTES DES TABLEAUX TABLEAU 1-1 : PRINCIPALES MOLÉCULES DE COLLAGÈNE (SHOULDERS AND RAINES 2009) .............................................................32. viii.

(9) LISTES DES FIGURES. FIGURE 1-1 PHOTO DE CARTILAGE ARTICULAIRE SAIN D'UN GENOU HUMAIN ADULTE (FOX, BEDI ET AL. 2009) .....................................4 FIGURE 1-2 SCHÉMA D’UNE COUPE DE CARTILAGE ARTICULAIRE SAIN; A : L'ORGANISATION CELLULAIRE DANS LES ZONES DU CARTILAGE ARTICULAIRE; B : L'ARCHITECTURE DES FIBRES DE COLLAGÈNE (FOX, BEDI ET AL. 2009) ........................................................... 5. FIGURE 1-3 MICROPHOTOGRAPHIE FLUORESCENTE D'UNE SECTION TANGENTIELLE DU CARTILAGE ARTICULAIRE...................................8 FIGURE 1-4 MICROPHOTOGRAPHIE ÉLECTRONIQUE DE DEUX CHONDROCYTES, SIMILAIRE À CELLE REPRÉSENTÉE SUR LA FIGURE 1-3. LES DEUX CHONDROCYTES SITUÉS DANS UN CHONDRON SONT ENTOURÉS PAR DES FIBRES FINEMENT TISSÉES DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE (CHI, RATTNER ET AL. 2004) ............................................................................................................... 8. FIGURE 1-5 PHOTOGRAPHIE MONTRANT UN CHONDROCYTE ET SA MATRICE EXTRACELLULAIRE, AINSI QUE LE.....................................10 FIGURE 1-6 LES DIFFÉRENTS CONSTITUANTS DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE DU CARTILAGE ARTICULAIRE (CHEN, ROUSCHE ET AL. 2006) ............................................................................................................................................................................12 FIGURE 1-7 DIAGRAMME MONTRANT LES DIFFÉRENTES ÉTAPES DU PROCESSUS DE L’IMPLANTATION DES CELLULES ..............................17 FIGURE 1-8 DIAGRAMME MONTRANT LE CONCEPT DE L’INGÉNIERIE TISSULAIRE (DVIR, TIMKO ET AL. 2011) ....................................19 FIGURE 1-9 (A) STRUCTURE CHIMIQUE DU CHITOSANE, (B) STRUCTURE CHIMIQUE DE LA CHITINE ..................................................26 FIGURE 1-10 SCHÉMA ILLUSTRANT LA VERSATILITÉ DU CHITOSANE ................................................................................................. FIGURE 1-11 IMAGE D’UN SEGMENT DE TRIPLE HÉLICE DE COLLAGÈNE, METTANT EN ÉVIDENCE LES LIAISONS......................................33 FIGURE 1-12 SYNTHÈSE DU POLY(GLYCOLIDE), PGA (SUGIURA, YUNOKI ET AL. 2009) ..................................................................38 FIGURE 1-13 SYNTHÈSE DU POLY (LACTIDE), PLA (MIDDLETON AND TIPTON 2000).....................................................................39 FIGURE 1-14 SYNTHÈSE DU POLY(Ε-CAPROLACTONE), PCL (MIDDLETON AND TIPTON 2000)........................................................40 FIGURE 1-15 STRUCTURE CHIMIQUE DE L'ACIDE GLUTAMIQUE (A) ET DE LA GLYCINE (B) ................................................................43 Figure 2-1 : Illustration d’une configuration expérimentale typique de la spectroscopie dephotoélectrons X (XPS)50 FIGURE 2-2 (A) SCHÉMA DE PRINCIPE DE L’APPAREILLAGE DE LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE À TRANSFORMÉE DE FOURIER ................52 FIGURE 2-3 SCHÉMA DE RÉDUCTION DU MTT EN FOZMAZAN (KRONEK, PAULOVIČOVÁ ET AL. 2013) ..............................................57 FIGURE 2-4 PRINCIPE DE L’ELISA .......................................................................................................................................59 FIGURE 3-1 MEMBRANES DE COLLAGÈNE SEUL (A), MEMBRANES DE COLLAGÈNE RECOUVERTES DE CHITOSANE ..................................62 FIGURE 3-2 SPECTRES FTIR DES MEMBRANES PRODUITES ............................................................................................................ FIGURE 3-3 SPECTRES XPS DE C1S, N1S ET O1S DES MEMBRANES DE COLLAGÈNE SEUL, DE COLLAGÈNE ............................................... FIGURE 3-4 MICROGRAPHIES À BALAYAGE ÉLECTRONIQUE DE LA SURFACE ET DE LA COUPE TRANSVERSALE DES ...................................67 FIGURE 3-5 COURBE DE CONTRAINTE-DÉFORMATION DES MEMBRANES PRODUITES NON RÉTICULÉES ................................................... FIGURE 3-6 PHOTOGRAPHIES DE MICROSCOPIE À FLUORESCENCE MONTRANT L’ADHÉSION ET LA .......................................................... FIGURE 3-7 ÉVALUATION DE LA CROISSANCE DES CHONDROCYTES APRÈS CULTURE SUR LES DIFFÉRENTES ...........................................71 FIGURE 3-8 TAUX DE SÉCRÉTION DE L'INTERLEUKINE (IL-6) PAR LES CHONDROCYTES ENSEMENCÉS SUR LES........................................72. ix.

(10) FIGURE 3-9 SPECTRES FTIR DE MEMBRANES DE COLLAGÈNE RÉTICULÉES AU GLUTARALDÉHYDE ET TRAITÉES OU NON À L'ACIDE GLUTAMIQUE .......................................................................................................................................................... 73. FIGURE 3-10 SPECTRES FTIR DE MEMBRANES DE COLLAGÈNE REVÊTUES DE CHITOSANE À 0.1%, RÉTICULÉES AU ................................74 FIGURE 3-11 SPECTRES FTIR DE MEMBRANES DE COLLAGÈNE REVÊTUES DE CHITOSANE À 1%, RÉTICULÉES AU ...................................75 FIGURE 3-12 SPECTRES XPS DES MEMBRANES PRODUITES TRAITÉES À L'ACIDE GLUTAMIQUE ..........................................................76 FIGURE 3-13 MICROGRAPHIE À BALAYAGE ÉLECTRONIQUE DES MEMBRANES TRAITÉES À L'ACIDE GLUTAMIQUE ..................................78 FIGURE 3-14 PHOTOGRAPHIES DE MICROSCOPIE À FLUORESCENCE MONTRANT LA LOCALISATION DES CHONDROCYTES.........................79 FIGURE 3-15 TESTS DE MTT APRÈS 48 ET 96 HEURES DE CULTURE MONTRANT LE TAUX DE PROLIFÉRATION DES ................................80 FIGURE 3-16 SPECTRES FTIR DE MEMBRANES DE COLLAGÈNE REVÊTUES DE CHITOSANE À 0.1%, RÉTICULÉES AU ................................81 FIGURE 3-17 SPECTRES FTIR DE MEMBRANES DE COLLAGÈNE REVÊTUES DE CHITOSANE À 0.1%, RÉTICULÉES AU ...............................82 FIGURE 3-18 SPECTRES FTIR DE MEMBRANES DE COLLAGÈNE REVÊTUES DE CHITOSANE À 0.1%, RÉTICULÉES AU ................................83 FIGURE 3-19 SPECTRES XPS DES MEMBRANES PRODUITES TRAITÉES À LA GLYCINE ........................................................................85 FIGURE 3-20 PHOTOGRAPHIES DE MICROSCOPIE À FLUORESCENCE MONTRANT LA LOCALISATION DES CHONDROCYTES.........................87 FIGURE 3-21 PHOTOGRAPHIES DE MICROSCOPIE À FLUORESCENCE MONTRANT LA LOCALISATION DES CHONDROCYTES.........................88 FIGURE 3-22 TESTS DE MTT MONTRANT LE TAUX DE PROLIFÉRATION DES CHONDROCYTES SUR LES MEMBRANES ................................89. x.

(11) LISTE DES ABREVIATIONS. °C. Degré Celsius. 3D. Tridimensionnel. Å. Angström. ACI. Implantation des cellules autologues. ADN. Acide désoxyribonucléique. ADSCs. Cellules souches du tissu adipeux. ARN. Acide ribonucléique. ARNm. Acide ribonucléique messager. Ch. Chitosane. CI50. Concentration inhibitrice médiane. cm. Centimètre. CO2. Dioxyde de carbone. Coll. Collagène. DD. Degré de désacétylation. DMA. Analyseur dynamique mécanique. DMEF. Milieu Eagle modifié de Dulbecco - F12. EB. Énergie de liaison. Ecin. Énergie cinétique. ECM. Matrice extracellulaire dense. EDTA. Acide éthylène diamine tétraacétique. EGF. Facteur de croissance épidermique humain. xi.

(12) ELISA. Méthode immuno-enzymatique. ESCs. Cellules souches embryonnaires. eV. Électronvolt. FDA. Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux. FTIR. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. GA. Acide glutamique. GAG. Glycosaminoglycanes. Gly. Glycine. GTA. Glutaraldéhyde. HA. Acide Hyaluronique. Hyp. (2S, 4R) -4-hydroxyproline. IL-6. Interleukine-6. KDa. Kilodalton. Kg. Kilogramme. kV. kilovolt. L0. Longueur initiale. MEB. Microscopie électronique à balayage. mg. Milligramme. min. Minute. mL. Millilitre. MM. Masse moléculaire. mm. Millimètre. MMP. Métalloprotéinases de matrice. MPa. Mégapascal. MSCs. Cellules souches mésenchymateuses. xii.

(13) MTT. Marquage au bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium. N. Newton. NADPH. Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate. nm. Nanomètre. Pa. Pascal. PBS. Tampon phosphate salin. PCL. Poly (caprolactone). pg. Picogramme. PGA. Poly(glycolide). PLA. Poly (lactide). Pro. (2S) proline. TC. Tropocollagène. TNF. Facteur de nécrose tumorale. tr. Tour. XPS. Spectroscopie de photoélectrons X. μm. Micromètre. . xiii.

(14) DÉDICACES. Je voudrais dédier cette thèse à mon père, que j’aime tant, qui a toujours été là durant toute ma vie, qui m’a toujours enveloppé de son amour inconditionnel sans faille, mon meilleur ami qui a su partager mes peines et mes joies, un rocher duquel je puise ma force et sur qui je me pose.. À ma mère, je ne pourrais jamais trouver une maman plus adorable, si proche de mon cœur même quand la distance nous sépare.. À tous ceux qui me sont chers.. xiv.

(15) REMERCIEMENTS. Les recherches qui font l’objet de cette thèse ont été menées au sein de deux laboratoires de l’Université Laval : i) au Groupe de recherche en écologie buccale à la Faculté de médecine dentaire et ii) au laboratoire de matériaux polymères du département de génie chimique à la Faculté des sciences et de génie. Que Monsieur Mahmoud Rouabhia, Professeur à la Faculté de Médecine dentaire à l’Université Laval, trouve ici toute l’expression de ma reconnaissance pour avoir dirigé ma thèse, pour sa rigueur et pour l’attention et la disponibilité et ses conseils si précieux qu’il m’a prodigués tout le long de ces trois années. Mes remerciements vont également à Monsieur Frej Mighri, Professeur en génie chimique à la Faculté des sciences et de génie de l’Université Laval, codirecteur de ma thèse, pour son encouragement, son aide et ses conseils qui ont grandement contribué à la réalisation et à l’aboutissement de ces travaux. Je suis très sincèrement reconnaissante à Monsieur Abdellah Ajji, Professeur en génie chimique à l’École polytechnique de Montréal, co-directeur de ma thèse, pour les discussions enrichissantes que nous avons pu avoir tout au long de ces travaux. Mes vifs remerciements s’adressent à Monsieur Alain Garnier, Professeur en génie chimique de l’Université Laval, qui m’a fait l’honneur de présider le jury de ma thèse. Je tiens à exprimer ma gratitude à Monsieur Said Elkoun, Professeur en génie mécanique à l’Université de Sherbrooke, Madame Muriel Subirade, Professeure en sciences des aliments et de nutrition à l’Université Laval, et Monsieur Ze Zhang, professeur au département de chirurgie de l'Université Laval, pour l’intérêt qu’ils ont bien voulu accorder à mon travail, en acceptant d’être membres du jury de ma thèse. Je voudrais remercier tout particulièrement Hyunjin Park, pour son aide et sa bonne humeur, Yann Giroux et Jeff Mao, pour leurs aides techniques.. xv.

(16) INTRODUCTION. L’ingénierie tissulaire a évolué à partir de la nécessité de réparer les organes et les tissus endommagés suite à une maladie ou une blessure. Alors que la meilleure solution pour la régénération et la guérison a été l'autogreffe, cette approche est intrinsèquement limitée par la quantité de tissu disponible du site donneur. Ce second site entraîne un traumatisme supplémentaire pour le patient et les risques associés tels que la douleur, l'infection, et la morbidité du site donneur. Le concept d'ingénierie tissulaire incarne la création d'une structure d'échafaudage ayant une structure appropriée, les propriétés mécaniques nécessaires pour permettre la pénétration des cellules du tissu à régénérer et la formation de tissu par la suite (Karp, Dalton et al. 2003). L'objectif de l’ingénierie tissulaire est que le nouveau tissu produit in vitro s’intègre avec le tissu hôte après son implantation. Idéalement, l'échafaudage temporaire fournit une voie pour la régénération et se dégrade pendant ou après la cicatrisation, en évitant ainsi la nécessité d'éliminer le matériau ainsi que les effets secondaires possibles associés aux matériaux laissés dans le corps. Une attention particulière doit être accordée aux produits de dégradation et à leur non-toxicité pour le patient. Bien qu'il existe de nombreuses méthodes pour la création de matrices, la plupart d'entre elles ont une efficacité limitée, surtout lorsqu’on s’intéresse au cartilage. Les lésions du cartilage articulaire sont très fréquentes, plus de 6 millions de personnes sont touchées par des problèmes au niveau du genou, du poignet et de la cheville, chaque année aux États-Unis (Zhang, Hu et al. 2009). Une usure progressive du cartilage articulaire peut conduire à une perte complète du cartilage, exposant l’os et le laissant sans protection. Il a été rapporté que l'arthrose affecte 33,6% (12,4 millions) des adultes de 65 ans et plus aux États-Unis. L’Académie Américaine des chirurgiens orthopédiques (AAOS) rapporte que l'arthrose représente 67% des séjours de courte durée et des hospitalisations non mortelles en 2004 (Judelsohn and Marshall 2012). Compte tenu de l'augmentation de la population et de l’espérance de vie, les occurrences de blessures au niveau du cartilage et de l'arthrose augmenteront, sans aucun doute, dans le monde entier (Zhang, Hu et al. 2009) . Contrairement à d'autres tissus, le cartilage a une faible capacité de régénération. Par conséquent, une fois blessé, le cartilage est beaucoup plus difficile à s'autoguérir. Il est composé d'un petit pourcentage de chondrocytes, mais aussi d’une matrice extracellulaire dense (ECM) empêchant la. 1.

(17) mobilité des chondrocytes. En outre, le cartilage articulaire est avasculaire, dépourvu de nerfs, et de réseaux lymphatiques, ainsi que diverses cellules progénitrices locales (Vasita and Katti 2006). Pour ces différentes raisons, il est actuellement difficile de restaurer la fonction complète d’un cartilage articulaire endommagé ou malade (Zhang, Hu et al. 2009). Par conséquent, il est souhaitable de développer une matrice pour le remplacement du cartilage endommagé, et il se trouve que l'ingénierie tissulaire pourrait fournir des solutions de rechange pour la réparation du cartilage articulaire. Pour cela, le matériau d'échafaudage doit être soigneusement choisi et l'architecture de l'échafaudage doit être correctement conçue pour assurer la biocompatibilité avec les cellules ensemencées. On a choisi d’utiliser une combinaison de deux biopolymères biocompatibles et biodégradables qui sont le chitosane et le collagène, le premier possédant des propriétés biologiques extraordinaires et le second étant un composé principal du cartilage natif. Dans le chapitre I nous présenterons une revue bibliographique relative au cartilage, sa composition, les dommages qu’il peut subir et les traitements actuels en cas de perte. Nous aborderons aussi les biomatériaux utilisés pour la régénération cartilagineuse, les polymères naturels et synthétiques, en s’intéressant plus particulièrement au chitosane et au collagène. Nous évoquerons aussi les cellules utilisées pour la régénération cartilagineuse. Dans le chapitre II, nous expliquerons comment nous avons procédé pour mettre au point de nouvelles matrices composites à base de collagène et de chitosane, renforcée par la réticulation à la glutaraldéhyde et traitée soit à l’acide glutamique ou à la glycine pour l’amélioration de la biocompatibilité. Dans le chapitre III, nous présenterons nos résultats relatifs aux caractérisations chimiques et biologiques de nos différentes matrices. Dans le chapitre IV, nous discuterons nos travaux et nous ferons la mise au point des différentes réactions chimiques ayant lieu entre les différents composés de nos matrices. Nous terminerons par une conclusion et par quelques perspectives d’avenir destinées à optimiser notre procédé́ pour d’éventuelles applications cliniques.. 2.

(18) 1. CHAPITRE I: ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE 1.1 1.1.1. LE CARTILAGE Généralités. Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif, composé d’un réseau dense de fibres de collagène agrégées sous forme d’une substance gélatineuse ayant une surface lisse lubrifiée (Fox, Bedi et al. 2009). Cependant, il est soumis à un environnement biomécanique dur. Avec une épaisseur de 2 à 3 mm dans la plupart des articulations, il résiste à une pression variant entre 1 à 4 MPa, et ceci avec une moyenne de 2 millions de fois par an. Sa structure unique permet de fournir une surface lisse lubrifiée pour l'articulation et de procurer au tissu la capacité d’absorber les chocs, de supporter en partie le poids du corps et de résister à l'usure des articulations tout en conservant une grande flexibilité (Williams, Peterson et al. 2007).. Le cartilage est composé d'une matrice extracellulaire dense (ECM) avec une distribution très éparse de cellules spécialisées appelées chondrocytes qui reçoivent la nutrition par diffusion à travers le gel. L'ECM est principalement composée d'eau, de collagène et de protéoglycanes, avec d'autres protéines et glycoprotéines non collagéniques présentes en plus petites quantités. Ces composants permettent de retenir l'eau dans l’ECM, ce qui est essentiel pour maintenir ses propriétés mécaniques uniques (Fox, Bedi et al. 2009).. Les chondrocytes sont disposées sur des sites dispersés à travers le cartilage. Elles maintiennent le tissu cartilagineux en renouvellement continu et ceci par la synthèse et la dégradation constantes des différents composants de la matrice. Tout déséquilibre dans ce processus pourrait conduire à la dégradation et la destruction du cartilage chez les patients (Bitton 2009; Altman 2010). Surtout que le cartilage articulaire (dépourvu de nerfs, de vaisseaux sanguins et lymphatiques) a une capacité limitée pour la guérison et la réparation intrinsèque. À cet égard, la préservation de la santé du cartilage articulaire est primordiale pour la santé du système musculo-articulaire (Fox, Bedi et al. 2009).. 3.

(19) Trois principaux types de cartilage peuvent être distingués :. - Le cartilage hyalin, étant le plus répandu, est le type qui fait le squelette embryonnaire. Il persiste à l’âge adulte à l'extrémité des os au niveau des articulations. Très résistant et il est d'un bleu blanc brillant, est situé aux extrémités des côtes, du nez, du larynx, de la trachée et des bronches. - Le fibrocartilage est le plus dur des cartilages, il se trouve principalement dans les disques intervertébraux et au niveau des insertions des ligaments et des tendons. Il est semblable au tissu fibreux, mais contient uniquement de la substance fondamentale et des chondrocytes. - Le cartilage élastique, qui est d’apparence jaune, est plus souple que les deux autres formes, car il contient des fibres élastiques en plus du collagène. Chez l'homme, il constitue l'oreille externe, le tube auditif de l'oreille moyenne et l'épiglotte (Rogers 2010).. Figure 1-1 Photo de cartilage articulaire sain d'un genou humain adulte (Fox, Bedi et al. 2009). 4.

(20) 2UJDQLVDWLRQGXFDUWLODJH /H FDUWLODJH DUWLFXODLUH HVW RUJDQLVp HQ TXDWUH ]RQHV ELHQ GLVWLQFWHV XQH ]RQH VXSHUILFLHOOH XQH ]RQHPpGLDQHXQH]RQHSURIRQGHHWXQH]RQHFDOFLILpH . )LJXUH6FKpPDG¶XQHFRXSHGHFDUWLODJHDUWLFXODLUHVDLQ$O RUJDQLVDWLRQFHOOXODLUHGDQVOHV ]RQHVGXFDUWLODJHDUWLFXODLUH%O DUFKLWHFWXUHGHVILEUHVGHFROODJqQH )R[%HGLHWDO

(21) . /D]RQHVXSHUILFLHOOHHVWDVVH]PLQFHSURWpJHDQWOHVFRXFKHVOHVSOXVSURIRQGHVGXFDUWLODJHGHV FRQWUDLQWHV GH SUHVVLRQ (OOH FRQVWLWXH HQYLURQ j GH O pSDLVVHXU WRWDOH GX FDUWLODJH DUWLFXODLUH /HV FKRQGURF\WHV SUpVHQWHV GDQV FHWWH FRXFKH VRQW DSODWLHV HQ IRUPH GH GLVTXH HW HQ QRPEUH UHODWLYHPHQW IDLEOH )R[ %HGL HW DO

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(26) Dans cette couche, les chondrocytes sont de forme arrondie ou sphérique. La teneur en protéoglycanes y augmente et les fibres de collagène s’entrecroisent pour former un réseau de transition oblique intermédiaire entre la zone superficielle et la couche profonde (Eyre 2002; Fox, Bedi et al. 2009). - La zone profonde est chargée de fournir la plus grande résistance aux forces de compression, étant donné que les fibrilles de collagène sont disposées perpendiculairement à la surface articulaire. Elle représente environ 30% de l’épaisseur totale du cartilage articulaire et contient des fibrilles de collagène plus épaisses avec une disposition radiale. La teneur en protéoglycanes y est plus élevée et la concentration en eau est plus basse. Les chondrocytes y sont généralement disposées en colonnes, parallèles aux fibres de collagène. - Finalement, une fine ligne irrégulière distingue la zone profonde du cartilage calcifié. La zone profonde fournit la plus grande quantité de résistance aux forces de compression, étant donné la teneur élevée en protéoglycanes. La couche calcifiée joue un rôle essentiel dans la sécurisation du cartilage à l'os, en ancrant les fibrilles de collagène de la zone profonde à l’os sous- chondral (Eyre 2002; Redman, Oldfield et al. 2005; Fox, Bedi et al. 2009).. 1.1.3 Constitution du cartilage Le cartilage articulaire normal est composé de chondrocytes et d’une matrice extracellulaire formée principalement de collagène et de protéoglycanes. Les chondrocytes représentent environ 10% du poids humide du cartilage articulaire et sont spécialisées dans le métabolisme du cartilage. Ce sont des cellules actives qui sont responsables du développement du cartilage et du maintien de la matrice extracellulaire. L'eau et les électrolytes dissous constituent 60 à 85% du poids humide du cartilage. Le collagène quant à lui y constitue 10 à 30%, tandis que la teneur en protéoglycanes varie entre 3 et 10%. La matrice extracellulaire contient également des glycoprotéines en quantité très faible et des lipides. Lors de l’exploration des propriétés mécaniques et de la fonction du cartilage, deux phases doivent être considérées: une phase poreuse perméable renforcée par des fibres et une autre fluide coulant librement (Redman, Oldfield et al. 2005).. 6.

(27) 1.1.3.1. Les chondrocytes. Les chondrocytes sont généralement de forme discoïde ou sphérique et sont entourés par une matrice extracellulaire riche en fibres de collagène et de protéoglycanes (Chi, Rattner et al. 2004). Le concept du chondron a été introduit par Benninghoff en 1925, (Sun, Chou et al. 2009) cependant, son concept d’un chondron rempli de fluide représentant une unité anatomique, mécanique et histogénétique de cartilage n’a pas réussi à attirer la reconnaissance qu'il méritait. 40 ans plus tard, en 1969, l'application de nouveaux concepts histochimiques par Szirmai (Orth, Peters et al. 2002) a conduit à une réévaluation de la notion du chondron et selon laquelle les chondrons ont pu être identifiés dans le sédiment du cartilage nasal de cheval, produit par homogénéisation à haute vitesse. Néanmoins, le concept de Szirmai n'a pas été largement adopté, et ceci jusqu’au travail de Poole dans les années 80, qui a montré que les chondrons intacts pourraient être libérés du cartilage tibial avec une faible vitesse d’homogénéisation. Il a été établi de façon concluante que le chondron était une unité fonctionnelle de base du cartilage articulaire adulte (Eyre 2002).. Le chondron se compose d'un chondrocyte lié à sa surface à un transparent glycocalyx péricellulaire appelé matrice péricellulaire et clos par une capsule fibrillaire péricellulaire. Dans le cartilage articulaire canin, le chondron peut contenir une, deux ou plusieurs chondrocytes sous forme de colonne et présenter un certain degré de polarité à l'intérieur de la matrice extracellulaire (Matsiko, Levingstone et al. 2013). En double colonne, les queues des chondrons forment des interconnexions entre les segments adjacents et des continuités linéaires entre les chondrocytes avoisinants (Eyre 2002). Les chondrocytes et la matrice extracellulaire fonctionnent d’une manière complémentaire pour fournir un mécanisme hydroélastique capable d'absorber, de redistribuer et de transmettre les forces de compression à l'os sous-chondral (Eyre 2002).. 7.

(28) Figure 1-3 Microphotographie fluorescente d'une section tangentielle du cartilage articulaire fémorale d'un lapin (Chi, Rattner et al. 2004). Figure 1-4 Microphotographie électronique de deux chondrocytes, similaire à celle représentée sur la Figure 1-3. Les deux chondrocytes situés dans un chondron sont entourés par des fibres finement tissées de la matrice extracellulaire (Chi, Rattner et al. 2004). 8.

(29) 1.1.3.2. La matrice extracellulaire. La matrice extracellulaire du cartilage articulaire est constituée d’un réseau dense de collagène de type II mélangé aux protéoglycanes. L’élément qui constitue 65 à 80% du poids humide du cartilage articulaire est l'eau. La teneur en collagène, essentiellement de type II, atteint 60% du poids sec de cartilage articulaire. D'autres types de molécules, y compris les lipides, les phospholipides, les sels inorganiques et les glycoprotéines ne constituent qu'une petite fraction de l'ECM (Williams, Peterson et al. 2007). 1.1.3.2.1 Le collagène Le collagène est un biomatériau ubiquitaire trouvé dans de nombreux tissus, y compris dans le cartilage articulaire, les vaisseaux sanguins, les os, les muscles, les tendons et les ligaments. Toutes les molécules de collagène sont constituées de trois chaînes α de polypeptides formant une triple hélice (Eyre 2002). La glycine et la proline sont les acides aminés formant la majeure partie de la fibre de collagène, cependant l’hydroxyproline lui fournit la stabilité de par les liaisons hydrogène (Williams, Peterson et al. 2007). Le collagène prédominant dans le cartilage articulaire est de type II. Il y représente environ 90 95%. Les types VI, IX, X et XI y sont également présents, mais avec des teneurs relativement faibles (Redman, Oldfield et al. 2005). Les collagènes de type XI, IX et VI, se trouvent être des copolymères hétéro-typiques, ils forment avec les collagènes de type II et XI la composante fibrillaire avec un arrangement antiparallèle de collagène de type IX, à la surface (Orth, Peters et al. 2002; Sun, Chou et al. 2009). Le collagène de type IX est connu comme régulateur de diamètre du collagène de type II (Matsiko, Levingstone et al. 2013) et il a été localisé dans le chondron où le collagène de type II possède le plus petit diamètre pour pouvoir former le tissage serré de la capsule péricellulaire (Mithoefer, McAdams et al. 2009). Le collagène de type VI est apparu comme une clé moléculaire marqueuse de la microanatomie du chondron. Des études sur les chondrons isolés démontrent que le collagène de type VI localisé dans le micro-environnement péricellulaire a la capacité d’interagir directement avec la surface de la cellule. Bien qu’il existe avec des concentrations faibles, le collagène de type VI a une double fonction. Il est capable d’orchestrer l'architecture péricellulaire et de jouer le rôle de médiateur dans la signalisation entre les chondrocytes et leur micro-environnement (Orth, Peters et al. 2002).. 9.

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(32) . . .

(33) Les glycoaminoglycanes existants dans le cartilage articulaire incluent l’acide hyaluronique, le sulfate de chondroitine, le sulfate de kératane et le sulfate de dermatane. Leurs concentrations varient selon la zone du cartilage, l’âge du patient et le type de maladie (Redman, Oldfield et al. 2005). Parmi les protéoglycanes essentiels au fonctionnement normal du cartilage articulaire nous trouvons l'aggrécane, la décorine, le biglycane et la fibromoduline (Fox, Bedi et al. 2009). Les protéoglycanes les plus abondants trouvés dans le cartilage sont les aggrécanes, qui possèdent plus de 100 sulfates de chondroitine et de sulfate de kératane. Ils sont connus pour leurs capacités à interagir avec l'acide hyaluronique (HA) pour former d’importants agrégats de protéoglycanes avec un poids moléculaire excédant 2 x105 KDa et constituant 90 % de la totalité des protéoglycanes du cartilage. Ils occupent ainsi l'espace interfibrillaire de la matrice extracellulaire et fournissent au cartilage ses propriétés osmotiques essentielles pour sa résistance aux forces de compression. Les protéoglycanes non agrégés sont caractérisés par leur capacité à interagir avec le collagène. Bien que la décorine, le biglycane et la fibromoduline sont beaucoup plus petits que l'aggrécane, ils peuvent être présents en quantités molaires similaires. Cependant, ils diffèrent dans la composition et la fonction des glycosaminoglycanes. La décorine et le biglycane possèdent une et deux chaînes de sulfate de dermatane, respectivement, alors que la fibromoduline possède plusieurs sulfates de kératane. La décorine et la fibromoduline interagissent avec le collagène de type II. de la matrice. extracellulaire, tandis que le biglycane interagit avec le collagène VI, en raison de sa proximité immédiate avec les chondrocytes (Fox, Bedi et al. 2009).. 11.

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(36) 1.2. Les causes et conséquences des pertes cartilagineuses sur la santé des patients. Le cartilage articulaire possède plusieurs rôles importants: il lubrifie les articulations et répartit les forces de compression afin de minimiser le stress sur l’os sous-chondral. L'impact répétitif et aigu, ainsi que les torsions articulaires peuvent endommager le cartilage et les surfaces de l'articulation du genou. Une blessure au niveau du cartilage articulaire peut entraîner des douleurs, des gonflements, des dysfonctionnements de l'articulation, et le cas échéant la dégénérescence progressive des articulations (PYLAWKA, KANG et al.).. Les lésions cartilagineuses affectent environ 900.000 Américains chaque année, conduisant à plus de 200.000 interventions chirurgicales traitant les lésions de haute importance (grade III ou IV). Sur 31 516 arthroscopies, 63% des patients ont été diagnostiqués comme ayant des lésions cartilagineuses, dont 41% étaient de grade III et 19% étaient de grade IV. 5% de ces arthroscopies sont comptés parmi des patients de moins de quarante ans pour des lésions de grade IV. 74% des patients ont des lésions cartilagineuses simples (4% des arthroscopies) (PYLAWKA, KANG et al. ; Curl, Krome et al. 1997). Des évaluations de 1000 arthroscopies du genou ont montré que 61% des patients ont été diagnostiqués avec des lésions cartilagineuses ou ostéochondrales parmi lesquelles 55% classées comme grade III et 5% de stade IV (Hjelle, Solheim et al. 2002). Ces lésions peuvent varier en taille et peuvent se produire d’une façon isolée ou comme de multiples lésions sur un seul joint. La plupart de ces lésions du cartilage articulaire se produisent du condyle fémoral (58% de toutes les lésions du cartilage adviennent au niveau du genou) (PYLAWKA, KANG et al.). Dans de nombreux cas, la dégénérescence du cartilage articulaire peut causer la perte de structure et de fonction articulaire provoquant la douleur et la perte de mouvement surtout chez les gens du troisième âge. Cela se produit avec l'arthrose primaire, mais il peut aussi résulter d'un traumatisme articulaire ou des troubles inflammatoires qui détruisent la surface articulaire, ce qui provoque l'arthrose secondaire. La possibilité de la restauration d'une articulation dépend d’une évaluation du comportement biologique et de la réactivité du cartilage articulaire à des lésions ou à des maladies. Des observations ont été rapportées depuis des siècles et ont été confirmées au cours des cinquante dernières années, que le cartilage articulaire n’a pas la capacité de réparer les dommages structurels qui l’atteignent (Buckwalter and Mankin 1997; Migliore and Procopio 2015).. 13.

(37) -. L'arthrose :. C’est la forme la plus courante d'arthrite. Elle atteint 6% des adultes américains âgés de 30 ans et plus, au niveau du genou, et touche environ 3% au niveau de la hanche. Étant donné que l'arthrose est une maladie dont la prévalence augmente avec l'âge ainsi que la preuve récente de changements importants liés à l'âge dans le fonctionnement des chondrocytes, tout ceci suggère que les changements liés à l'âge qui se produisent au niveau du cartilage articulaire peuvent contribuer au développement et à la progression de l'arthrose. Bien que les mécanismes responsables de l'arthrose restent mal compris, l’utilisation modérée des articulations qui dure toute une vie ne semble pas augmenter le risque (Buckwalter and Mankin 1997; Felson, Lawrence et al. 2000). Cette maladie est accompagnée fréquemment d’une invalidité au niveau du genou ou de la hanche; elle est la cause la plus commune pour le remplacement complet de l’articulation de la hanche ou du genou. Des études épidémiologiques sur l'arthrose ont montré des modèles de prévalence : le risque d’avoir cette maladie augmente avec l'âge et selon le sexe. Dans une enquête à base communautaire, l'incidence et la prévalence de la maladie augmentent de 2 à 10 fois pour les 30 à 65 ans et augmentent encore plus par la suite. Avant 50 ans, la prévalence de l'arthrose est plus élevée chez les hommes que chez les femmes. Après l'âge de 50 ans, les femmes sont plus souvent atteintes au niveau de la main, du pied et du genou que les hommes. Ces derniers sont touchés plus au niveau de la hanche (Oliveria, Felson et al. 1995; Felson, Lawrence et al. 2000). L’arthrose est une maladie complexe dont l'étiologie balance entre la biomécanique et la biochimie. La preuve en est l’accroissement du rôle des facteurs systémiques (tels que la génétique, l'apport alimentaire, l'oestrogène et la densité osseuse) et des facteurs biomécaniques (tels que la faiblesse musculaire, l'obésité et la laxité articulaire). Ces facteurs de risque sont importants dans les articulations qui sont soumises au poids du patient (Felson, Lawrence et al. 2000). 1.2.1 Les moyens actuels pour le traitement des pertes de cartilage 1.2.1.1 Les traitements non chirurgicaux Les traitements non chirurgicaux comprennent des médicaments oraux, des dispositions physiques telles que la perte de poids, des attelles du genou, des orthèses orthopédiques du genou et des injections (les corticostéroïdes et l'acide hyaluronique).. 14.

(38) Ces traitements sont souvent inefficaces chez les patients symptomatiques ou très actifs et ne pourraient être considérés comme satisfaisants que chez les patients pas très atteints ou ceux qui souhaitent éviter ou retarder la chirurgie ou les patients atteints de dégénérescence avancée à cause de l'arthrose, ce qui est considéré comme une contre-indication pour les procédures de restauration du cartilage articulaire (Redman, Oldfield et al. 2005; Sun, Chou et al. 2009). Traditionnellement, le traitement des lésions du cartilage articulaire inclut une combinaison d'antiinflammatoires non stéroïdiens, une modification de l'activité physique, du poids et des chondroprotecteurs telle que la glucosamine ou le sulfate de chondroïtine (Sun, Chou et al. 2009). La glucosamine stimule l’activité des chondrocytes, tandis que la chondroïtine inhibe les enzymes qui dégradent le cartilage et empêche la formation d'un thrombus dans le tissu périarticulaire. Ces substances diminuent la douleur, améliorent l'amplitude des mouvements et la vitesse de la marche chez les patients. Cependant, aucune donnée ne montre que ces substances affectent les propriétés mécaniques ou biochimiques du cartilage articulaire (Orth, Peters et al. 2002). 1.2.1.2 Les traitements chirurgicaux 1.2.1.2.1 La microfracture Cette technique est adoptée comme une option de traitement secondaire pour les lésions cartilagineuses de moins de 2-3 cm de diamètre. Cependant, cette stratégie de réparation est généralement réservée aux patients ayant des exigences modérées. La microfracture implique le forage de trous d’environ 0,5 à 1 mm de diamètre à travers le tissu cartilagineux et dans la moelle osseuse pour permettre à cette dernière d’avoir un accès au site lésé permettant le recrutement de cellules progénitrices et promouvoir ultérieurement la réparation de ces blessures. Un repos postopératoire ainsi qu’une démarche lente sont nécessaires pour permettre aux patients d’avoir une bonne guérison.. Des études sur le moyen et le long terme ont révélé que la formation de tissu cartilagineux est limitée par rapport à d'autres techniques, au fil du temps, le cartilage hyalin, devient plus fibreux et se détériore en raison de ses faibles propriétés biomécaniques et élastiques. Cette technique de réparation est vouée à l'échec, donc cette option de traitement ne sert qu'à retarder l'obligation éventuelle pour le remplacement d'articulations (Mithoefer, McAdams et al. 2009; Matsiko, Levingstone et al. 2013).. 15.

(39) 1.2.1.2.2 Les greffes Les greffes ostéochondrales ou allogreffes sont indiquées pour le traitement des lésions avec l'exposition de l'os sous-chondral. Elles sont proposées pour les articulations gravement détruites, et ceci au niveau du genou et de la cheville. Les greffes autologues ont l'avantage d'utiliser le même tissu biologique ayant les mêmes propriétés immunologiques que le tissu endommagé. Elles sont réservées pour les petites et moyennes lésions (jusqu'à 3 cm de diamètre) et aussi pour les patients d'un âge plus avancé. De plus grandes lésions seraient traitées avec d'autres procédures telles que les allogreffes ou la mosaïcoplastie qui nécessite quant à elle un certain nombre de fragments de tissus cartilagineux pris à partir d'une région de l'articulation où il n’y a pas de forces de compression (Matsiko, Levingstone et al. 2013). Les lésions du cartilage pouvant être traitées avec un seul greffon ont un meilleur pronostic à long terme par rapport aux lésions qui nécessitent la transplantation de plusieurs greffons. Cependant, les greffes ostéochondrales peuvent subir une nécrose et il peut y avoir une apparition d’un kyste sous-chondral conduisant à une instabilité mécanique et finalement à un rejet de la greffe. En outre, l’allogreffe peut déclencher une forte réponse inflammatoire, accompagnée d’une libération massive de cytokines pro-inflammatoires, ce qui peut mener à de graves répercussions sur le cartilage. Des efforts sont faits pour identifier des substances pharmacologiques (facteurs de croissance, médicaments) ou des méthodes physiques (champs électromagnétiques, ultrasons) pour améliorer la stabilité du greffon et le contrôle de l’inflammation (Benazzo, Cadossi et al. 2008). 1.2.1.2.3. L’implantation des cellules autologues. La technique de l’implantation des cellules autologues ou ACI (Autologous Chondrocyte Implantation), connue aussi comme la procédure Carticel®, a été largement utilisée. Elle est recommandée pour les patients ayant des lésions du cartilage entre 1 et 12 cm2, et pour ceux sur qui la technique de microfracture n’a pas fonctionné. La technique ACI est réalisée en deux étapes : pour la première opération, un petit fragment de cartilage sain est retiré d’une zone où de faibles forces de compression y sont appliquées, et ceci à partir du genou du patient. Par la suite, les chondrocytes sont extraites du tissu cartilagineux et mises en culture pendant 3 à 5 semaines afin d’obtenir un nombre suffisant pour la réimplantation (environ 12 × 106 cellules). La deuxième opération sera réalisée, en injectant ces cellules au niveau de la lésion, et un fragment du périoste de l'os du tibia du patient est suturé comme protection pour sécuriser les chondrocytes (Zhang, Hu et al. 2009).. 16.

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(44) 1.2.1.2.4. Remplacement des articulations. La chirurgie de remplacement des articulations est l'un des plus grands progrès de la médecine au cours des 50 dernières années. Les lésions articulaires graves, les arthroses avancées, engendrent une destruction massive du cartilage articulaire. Et par conséquent, le remplacement des articulations devient nécessaire pour aider les patients à restaurer le fonctionnement normal du cartilage. Le tissu ostéochondral endommagé est partiellement ou totalement enlevé puis remplacé par un joint artificiel. Ce dernier, constitué d'une coquille métallique (tel que le titane, l'acier inoxydable), d’une pièce en polymère (tel que le polyéthylène), ainsi que d’une tige métallique, est implanté afin de remplacer le cartilage endommagé (Siopack and Jergesen 1995; Zhang, Hu et al. 2009). Comme l'âge moyen de la population augmente, il y a une forte demande pour les arthroplasties du genou et de la hanche. Dans plus de 90% des cas, cette opération chez un patient relativement âgé dépasse les 15-20 ans. Cependant, il faudrait prendre en considération qu'un patient âgé effectue 500 000 à 1 million de cycles de marche par an, ceux-ci peuvent atteindre quatre à cinq fois plus chez une jeune personne active, alors les chirurgies de révision deviennent souvent une nécessité. Sans compter aussi les différents types de complications, y compris les infections, le descellement ou l’usure de l’implant et l’ostéolyse (Goodman, Konttinen et al. 2014).. 1.3. L’ingénierie tissulaire. Les trois dernières décennies ont vu l'émergence d'un nouveau domaine, qui est l'ingénierie tissulaire dans laquelle des spécialistes de différents domaines (scientifiques, ingénieurs, médecins) se sont investis, y appliquant des outils et des connaissances de leurs domaines respectifs. L’objectif est d’essayer de produire des substituts biologiques pouvant mimer les tissus d’origine pour des fins de recherche et remplacer (ou aider à régénérer) les tissus malades ou lésés. Une des premières définitions de l’ingénierie tissulaire a été introduite en 1993 par Langer et Vacanti, qui la définissent comme « un champ interdisciplinaire appliquant les principes d'ingénierie et ceux de la science de la vie pour le développement de substituts biologiques qui restaurent, maintiennent ou améliorent les fonctions de tissus ou d'organes » (Langer 1993).. 18.

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(48) . . .

(49) La perte d’un tissu ou le non-fonctionnement d'un organe suite à une blessure ou à une maladie est un problème majeur de santé aux États-Unis, surtout que la transplantation des tissus et d'organes est sévèrement limitée par la non-disponibilité de donneurs compatibles. Les alternatives actuellement utilisées, telles que les prothèses artificielles, ne réparent pas la fonction de tissu ou d'organe et ne sont pas destinées à intégrer le tissu hôte. De plus, ces dispositifs mécaniques peuvent s’user sur le long terme, et peuvent induire une réponse inflammatoire chez le patient (Chapekar 2000).. L'ingénierie tissulaire constitue réellement une alternative à la transplantation de tissus ou d'organes. Avec cette technologie, un tissu lésé ou un organe en dysfonctionnement peut être traité soit par l'implantation d'un substitut d'ingénierie biologique ou bien avec des systèmes de perfusion. Les produits de l'ingénierie tissulaire peuvent être pleinement fonctionnels au moment du traitement (par exemple, les dispositifs d'assistance du foie, les îlots encapsulés), ou avoir un potentiel d'intégrer et de former le tissu fonctionnel nécessaire après l'implantation (par exemple, les chondrocytes incorporés dans une matrice de support). Dans certains cas, les biomatériaux sont modifiés pour améliorer la migration et la fixation des cellules spécifiques au tissu recommandé, afin de réparer ou remplacer les tissus endommagés (Chapekar 2000; Berthiaume, Maguire et al. 2011). L’ingénierie tissulaire a atteint divers stades de développement, allant du relativement mature (la peau), au concept en cours (le cartilage), jusqu’au stade précoce (le foie).. 1.3.1 L’ingénierie tissulaire au service la peau Lorsque l'intégrité de la peau est compromise en raison de blessures comme des brûlures, elle doit être restaurée pour faciliter la réparation et la régénération, surtout lorsque la perte de la peau est importante, notamment dans le cas de brûlures de deuxième ou de troisième degré. Les plaies de la peau qui se prolongent en profondeur dans le derme, nécessitent un traitement spécialisé, vu que la muqueuse épithéliale, présente sur la superficie de la peau, ne se régénère pas d’elle-même, pouvant conduire à des cicatrices et même à des limitations de la mobilité, si elles sont localisées au niveau d’une articulation, et à des difformités cosmétiques graves.. 20.

(50) La limitation existante pour les autogreffes de peau réside dans le fait que le tissu est extrait à partir de zones indemnes du corps, et bien qu'il soit possible d'étendre la couverture par engrènement de la peau (une technique dans laquelle la greffe de peau est uniformément perforée et étirée pour couvrir de plus grandes zones de la plaie), le manque de derme dans la greffe de peau donne un aspect de peau de crocodile prononcé sur la cicatrice. Pour répondre à ces limitations, les substituts de peau ont été développés. L'ajout d'une matrice dermique pour les tissus épithéliaux ajoute l'avantage théorique d'une greffe plus épaisse et plus durable (Fukumoto, Sperling et al. 2003; Charles Huang, Reuben et al. 2004; Lee and Mooney 2012). Différents types de substituts de peau avec des caractéristiques différentes sont disponibles dans le commerce ; ils contiennent les deux composants épidermiques et dermiques (Varkey, Ding et al. 2015).. 1.3.2 L’ingénierie tissulaire au service du foie Le besoin clinique pour l'ingénierie tissulaire du foie est devenu évident du fait qu’il y a 30 000 décès chaque année aux États-Unis seulement touchant les patients atteints d'insuffisance hépatique aiguë et chronique. La transplantation hépatique, lorsque le foie malade est enlevé et un foie de donneur est mis à sa place, est actuellement la seule option viable pour ces patients, mais la rareté des donneurs permet seulement 6000-7000 greffes de foie par an. En outre, la plupart des patients souffrant d'insuffisance hépatique ne sont pas admissibles pour la transplantation, parce qu'ils sont trop malades pour tolérer la chirurgie assez complexe et invasive. Deux approches d'ingénierie tissulaire sont en cours de développement en tant qu’alternatives à la transplantation hépatique: (a) un support de foie bio-artificiel qui est un dispositif extracorporel à travers lequel le plasma est mis en circulation et les hépatocytes fonctionnellement actifs sont emballés dans un bioréacteur en vue d'aider le foie malade jusqu'à ce qu'il se régénère ou jusqu'à ce qu'une greffe de foie appropriée pour la transplantation soit disponible. (b) un foie bioartificiel transplanté basé sur une matrice de foie décellularisée ensemencée par des cellules autologues ou allogéniques (Berthiaume, Maguire et al. 2011; Kumar, Tripathi et al. 2011).. 1.3.3 L’ingénierie tissulaire au service de l’os L'incidence mondiale des maladies et des accidents osseux est fortement en hausse et devrait doubler d'ici 2020, surtout dans les populations où le vieillissement est associé à une augmentation de l'obésité et une diminution de l'activité physique (Amini, Laurencin et al. 2012).. 21.