Impact génétique des pHs suboptimaux

Texte intégral

(1)

(2) Université de Sherbrooke. Impact génétique des pHs suboptimaux. Par Julien Massonneau Programme de biochimie. Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en biochimie. Sherbrooke, Québec, Canada Juin, 2019. Membres du jury d’évaluation Pr. Guylain Boissonneault, département de biochimie, FMSS, Université de Sherbrooke Pr. Pierre Lavigne, département de biochimie, FMSS, Université de Sherbrooke Pr. Guylain Boulay, département de pharmacologie-physiologie, FMSS, Université de Sherbrooke Pr. Hugo Wurtele, département de médecine, Université de Montréal © Julien Massonneau, 2019.

(3) « Au milieu de la difficulté se trouve l’opportunité » Albert Einstein. « Je suis de ceux qui pensent que la science est d’une grande beauté. Un scientifique dans son laboratoire est non seulement un technicien : il est aussi un enfant placé devant des phénomènes naturels qui l’impressionnent comme des contes de fées » Marie Curie.

(4) iv. RÉSUMÉ Impact génétique des pHs suboptimaux Par. Julien Massonneau Programmes de biochimie Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4. Les cassures bicaténaires sont les dommages les plus dangereux pour une cellule puisque ceux-ci peuvent conduire à la perte de matériel génétique, à la perte de phénotype et à la mort cellulaire. Ces lésions à l’ADN peuvent être la conséquence de l’action néfaste de produits de mécanismes biologiques naturels, comme les espèces réactives de l’oxygène par exemple. L’exposition à certains facteurs exogènes peuvent également être responsable de la formation de cassures bicaténaires, comme l’irradiation ionisante ou le rayonnement ultraviolet. La variation physiologique locale du pH extracellulaire peut être considéré comme un facteur exogène lorsqu’elle résulte d’un stress conduisant à une fluctuation des ions hydrogènes dans le microenvironnement cellulaire. Afin de caractériser l’effet de variations locales du pH extracellulaire (pHe) sur la l’intégrité génétique, nous avons débuté par étudier leurs effets sur la réponse aux dommages à l’ADN et sa réparation. À l’aide de la bléomycine, un agent radiomimétique, des cassures bicaténaires ont été induites dans une culture primaire de fibroblastes en culture. La récupération a été effectuée pendant 24 heures et 48 heures à différents pHe physiologiques, appelés pHe suboptimaux, soit de 7.2 à 6.9. L’apparition et le suivi des cassures bicaténaires induites ont été observés à l’aide d’immunofluorescences et d’immunobuvardages contre la phosphorylation de l’histone H2AFX, un marqueur de remodelage de la chromatine, et contre la protéine 53BP1, un régulateur de la réponse cellulaire lors de cassures bicaténaires. Accompagné de tests de proliférations cellulaires, nous avons déterminé que l’incubation à pHe suboptimal induisait une baisse d’efficacité de la réparation des cassures bicaténaires de l’ADN. L’utilisation de puces PCR nous a également permis de mettre en évidence des baisses d’expressions de différents gènes impliqués dans la phase présynaptique et synaptique de la recombinaison homologue. Nous avons également déterminé que cette baisse d’efficacité pouvait induire des aberrations chromosomiques par la détection de micronoyaux. Cette instabilité chromosomique induite par les pHe suboptimaux a été d’avantage caractérisée à l’aide d’une culture cellulaire immortalisée lymphoblastoïde humaine, les cellules TK6. Suite à trois semaines d’incubation à pHe 7.2 et 6.9, une perte d’hétérozygotie pour le gène TK1 a été détectée par séquençage d’amplicons et des défauts d’épissage ont été observés par ASPCR. Enfin, par séquençage à haut débit des ARNm, nous avons pu déterminer que l’acidification modérée du pHe induisait des modifications du transcriptome. L’ensemble de ces résultats ont permis de démontrer pour la première fois que la variation physiologique localisé du pHe peut induire de l’instabilité génétique avec un potentiel mutagène chez des cellules saines. Mots clés: pHe, cassure bicaténaire, réparation de l’ADN, instabilité génétique, mutagénèse..

(5) v. SUMMARY Genetic impact of suboptimal pHs By. Julien Massonneau Biochemistry Program Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences for the obtention of Doctor degree diploma philosophiae doctor (Ph.D.) in biochemistry, Faculty of medicine and health sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4. Double-strand breaks are the most dangerous type of damage for a cell because they can lead to loss of genetic material and cell death. These DNA lesions can be the result of damaging agents from natural biological mechanisms such as reactive oxygen species. Exposure to exogenous factors, like ionizing irradiation or ultraviolet radiation, can also be responsible for the formation of double-strand breaks. A physiological variation in extracellular pH (pHe) in a cell’s microenvironment can also be considered as an exogenous factor when it results in stress leading to the fluctuation of hydrogen ions in that environment. The genotoxic impact of small pHe variations has never been investigated. In order to characterize the effects of local variations in extracellular pH on genetic integrity, we first investigated its impact on both DNA damage response and DNA repair. Using bleomycin, a radiomimetic agent, double-strand breaks were induced in a primary culture of fibroblasts. The recovery was done for 24 hour and 48 hour periods in different physiological pHe, termed suboptimal pHe, from 7.2 to 6.9. The appearance and progress of the induced double-strand breaks were observed by immunofluorescence and immunoblots with antibodies against the phosphorylation of the H2AFX histone, a marker of chromatin remodeling, and against the 53BP1 protein, a regulator of the cellular response to doublestrand breaks. In addition to the cellular proliferation tests, we established that the incubation in suboptimal pHe induced a decrease in the DNA double-stand breaks repair efficiency. The use of PCR chips also allowed us to highlight decreases in the expression of different genes involved in the pre-synaptic and synaptic phase of homologous recombination. Based on micronuclei detection, we showed that the decreased efficiency of DNA repair resulted in chromosomal aberrations. This chromosomal instability induced by suboptimal pHe was further characterized by using a cell culture of immortalized human lymphoblastoids, TK6 cells. Following three weeks of incubation at 7.2 and 6.9 pHe, a loss of heterozygosity for the TK1 gene was detected by amplicon sequencing and splicing defects were observed by ASPCR. Finally, mRNA sequencing by next-generation sequencing was used to determine that moderate acidosis of the pHe induces transcriptome modifications. Together these results allowed us to demonstrate for the first time that the physiological local variations of pHe can induce genetic instability with a mutagenic potential in healthy cells. Keywords: pHe, double strand break DNA, DNA repair, genetic instability, mutagenesis..

(6) vi. TABLE DES MATIÈRES. Résumé .......................................................................................................................................... iv Summary ........................................................................................................................................ v Table des matières ..................................................................................................................... vi Liste des figures ....................................................................................................................... viii Liste des abréviations ................................................................................................................ x Remerciements ......................................................................................................................... xii Introduction .................................................................................................................................. 1 1. La stabilité du génome .............................................................................................................. 1 1.1. Généralités ................................................................................................................................ 1. 1.2. Les cassures bicaténaires .................................................................................................... 2. 1.3. La réparation des cassures bicaténaires ........................................................................ 4. 1.3.1 La réponse aux dommages à l’ADN ................................................................................... 4 1.3.2 La réparation par recombinaison homologue .............................................................. 6 1.3.3 La réparation par jonction non homologue des extrémités .................................... 8 1.4. L’apoptose ............................................................................................................................... 10. 1.5. La sénescence ........................................................................................................................ 12. 2.. L’expression des gènes ............................................................................................................ 14. 2.1. Généralités .............................................................................................................................. 14. 2.2. Le pré-ARN messager .......................................................................................................... 14. 2.3. L’épissage du transcrit ........................................................................................................ 15. 3.. Le pH .............................................................................................................................................. 18. 3.1. Généralités .............................................................................................................................. 18. 3.2. Le pH intracellulaire ............................................................................................................ 20. 3.3. Les variations du pH extracellulaire et les microenvironnements ..................... 23. 3.4. L’acidification et les transformations cellulaires ...................................................... 24. Problématique .......................................................................................................................... 27 Préface ......................................................................................................................................... 28 Résultats ...................................................................................................................................... 34 Chapitre 1 : Modification de la réponse aux dommages à l’ADN par les pHs suboptimaux. ........................................................................................................................................ 34.

(7) vii. Avant-propos ....................................................................................................................................... 35 Article ..................................................................................................................................................... 36 Chapitre 2: Altérations du transcriptome induites par les pHe suboptimaux. ............. 58 Avant-propos ....................................................................................................................................... 58 Matériel et méthodes ........................................................................................................................ 59 Résultats ................................................................................................................................................ 61 Discussion ............................................................................................................................................. 80 Chapitre 3: Les pHe suboptimaux induisent des variations dans le gène TK1. ............. 83 Avant-propos ....................................................................................................................................... 84 Article ..................................................................................................................................................... 86. Discussion ................................................................................................................................. 102 Conclusion ................................................................................................................................ 110 Bibliographie ........................................................................................................................... 113 Annexes ..................................................................................................................................... 127.

(8) viii. LISTE DES FIGURES Figure 1. Les sources des cassures bicaténaires. .................................................................... 3 Figure 2. Schématisation de la réponse cellulaire en présence de dommage à l’ADN telle que la cassure bicaténaire. ..................................................................................................... 5 Figure 3. Schéma simplifié de la réparation par recombinaison homologue.......................... 7 Figure 4. Schématisation simplifiée de la réparation par NHEJ. ............................................ 9 Figure 5. Représentation des différents patrons d'épissages alternatifs communs. .............. 16 Figure 6. L'homéostasie du pH chez l'humain. ..................................................................... 19 Figure 7. Les échangeurs membranaires responsables de la régulation du pHi chez la cellule. ...................................................................................................................................... 22 Figure 8. Méthode initiale de la préparation des milieux de culture à différents pHe.......... 29 Figure 9. Remodelage chromatinien induit à pHe suboptimal dans les cellules U2OS. ...... 30 Figure 10. Persistance de foyers gH2AFX après récupération à différent pHe suboptimaux dans les cellules U2OS. ................................................................................................ 31 Figure 11. Diminution du niveau d'acétylation de H4K16 à pHe suboptimal dans les cellules U2OS. ........................................................................................................................... 32 Figure 12 (A-1). DSBs formation at suboptimal pHe........................................................... 43 Figure 13 (A-2). Persistence of repair foci at suboptimal pHe. ............................................ 45 Figure 14 (A-3). Reduced H4K16ac level at suboptimal pHe. ............................................. 47 Figure 15 (A-4). Chromosome instability associated to suboptimal pH. ............................. 48 Figure 16 (A-5). Escape from protective pathways at suboptimal pHe................................ 50 Figure 17 (A-6). Intracellular pH determination upon fibroblasts exposure to suboptimal pHe values. ........................................................................................................................... 51 Figure 18 (A-7) Persistence of repair foci at suboptimal pHe. ............................................. 57 Figure 19. Remodelage chromatinien induit à pHe suboptimal. .......................................... 62 Figure 20. Représentation par Volcano plot de l'expression génique en fonction du pHe. .. 64 Figure 21. Étude d'ontologie génique des gènes sous exprimés à pHe suboptimal 7.0. ....... 67 Figure 22. Étude d'ontologie génique des gènes sous exprimés à pHe suboptimal 6.9. ....... 70.

(9) ix Figure 23. Étude d'ontologie génique des gènes surexprimés à pHe suboptimal 7.0. .......... 73 Figure 24. Étude d'ontologie génique des gènes surexprimés à pHe suboptimal 6.9. .......... 76 Figure 25. Représentation par Scatter plot de l'expression des gènes de la réponse aux dommages à l'ADN à pHe suboptimal 7.0.................................................................... 78 Figure 26. Analyse de l'expression génique de EXO1 et XRCC2 lors d’incubation à pHe 7.0 par RT-qPCR. ............................................................................................................... 79 Figure 27 (C-1). Experimental designs and demonstration of DNA damage response at suboptimal pHe in TK6 cells. ....................................................................................... 91 Figure 28 (C-2). Loss of heterozygosity associated with suboptimal pHe. Schematic representation of insertional mutations observed by amplicon sequencing in chromosome 17. ............................................................................................................ 92 Figure 29 (C-3). Alternative splicing induced by suboptimal pHe....................................... 93 Figure 30 (C-4). Generation of truncated transcript at suboptimal pHe. .............................. 94 Figure 31 (C-5). Suboptimal pHe leads to intron retention. ................................................. 95 Figure 32. Résumé des impacts génétiques des pHs suboptimaux. .................................... 111.

(10) x. LISTE DES ABRÉVIATIONS. ADN. Acide déoxyribonucléique. ARN. Acide ribonucléique. ARNm. Acide ribonucléique messager. ARNsn. Acide ribonucléique plus petit que 200 nucléotides. ASPCR. Analyse de l’épissage altéernatif par RT-PCR en point final. ATM. Ataxia telangiectasia mutated. ATP. Adénosine triphosphate. ATR. Ataxia telangiectasia rad3 related. BIR. break-induced replication. DISC. Complexe de signalisation de l’induction de la mort. GO. Gène Ontologie. HDAC. Histone désacétylase. HMT. Histone methyltransférase. HnRNP. Particules ribonucléoprotéiques hétérogènes nucléaires. HR. Recombinaison homologue. NHEJ. Jonction non homologue des extrémités. PCR. Réaction en chaine par polymérase. PFGE. Électrophorèse en champs pulsé. pH. Potentiel hydrogène. pHe. pH extracellulaire. pHi. pH intracellulaire. protéine SR. Protéine sérine arginine. RNPsn. Ribonucléoprotéides nucléaires. ROS. Espèces réactives de l’oxygène. RQR. Réseau québécois en reproduction. RT-qPCR. Reverse transcription quantitative PCR. SCDA. Synthesis-dependent strand annealing. SEM. Erreur standard par rapport à la moyenne.

(11) xi TFT. Trifluorothymidine. TK. Thymidine kinase. TPM. Transcript par million. UV. Ultraviolet. VIH. Virus de l’immunodéficience humaine.

(12) xii. REMERCIEMENTS. Je voudrais tout d’abord remercier mon directeur de recherche, le Pr Guylain Boissonneault, de m’avoir laissé m’épanouir dans son laboratoire de recherche pendant presque 9 ans. Guylain a été un mentor exceptionnel, tant au niveau académique que personnel. Tes conseils et tes enseignements m’ont permis de grandir en tant que scientifique, mais aussi en tant que personne. Merci d’avoir cru en moi dès mon arrivée au Québec et de m’avoir pris sous ton aile au cours de toutes mes études graduées. Tu as été, pendant toutes ces années, mon modèle à suivre, et ta confiance sans faille m’a permis d’aller aussi loin. Je voudrais également remercier plus particulièrement Frédéric Leduc, Jessica Leroux, Oliver Simard, Geneviève Acteau, Marie Chantal Grégoire, Marc-André Brazeau ainsi que Mélina Arguin, mon assistante de recherche préférée, qui m’ont appris toutes les fondamentaux en recherche dès mon arrivée au laboratoire. Merci beaucoup pour votre temps et votre patience, vous m’avez permis de m’acclimater rapidement tant au laboratoire qu’à la vie au Québec. Vous étiez ma nouvelle famille au Québec ! Un grand merci à tous les membres du laboratoire qui se sont ajoutés au fils des années, tels que Anne, Tiphanie, Chloë, Rebecka, Gabi, Houda et Cyrielle pour vos contributions et votre confiance. Un remerciement également pour Kathleen, notre agente d’administration, sans qui le département ne pourrait pas fonctionner. Tu m’as accueilli à bras ouvert lors de mes premiers jours dans le département et tu m’as accompagné tout au long de mes études graduées. Merci à toi ! Je voudrais finalement remercier ma femme Chloë qui m’a soutenu même dans les moments difficiles me permettant de mener à bien mon doctorat dans les meilleures conditions. Merci de m’avoir fait grandir et j’ai très hâte à notre prochaine aventure !.

(13) 1. INTRODUCTION. 1. La stabilité du génome. 1.1 Généralités La structure de l’ADN en double hélice fut décrite pour la première fois le 25 avril 1953 par Francis Crick et James Watson (J. D. Watson et F. H. C. Crick, 1953). Impliquée dans des mécanismes biologiques essentiels, tels que la réplication et la transcription, sa stabilité est d’une importance primordiale pour la survie et le bon fonctionnement de tout organisme. Chez les cellules somatiques eucaryotes humaines, l’ADN mesurant environ 1.8 mètres de long est maintenu dans un noyau d’environ 6 micromètres de diamètre (Annunziato, 2008). Cet empaquetage est rendu possible grâce au surenroulement du matériel génétique autour de nucléosomes. Ils sont composés de deux fois les histones H2a, H2b, H3, H4, soit un octamère, permettant la compaction du génome. L’histone H1 permet de maintenir l’ADN enroulé autour du nucléosome (Hyland et al., 2005). Chaque cellule humaine subirait en moyenne plus de 70,000 lésions dans leur génome à chaque jour (Tubbs et Nussenzweig, 2017). Des facteurs exogènes peuvent être à l’origine de ces lésions, comme l’exposition aux rayons UV, les rayonnements ionisants ou encore certains agents chimiques. Certains produits de mécanismes biologiques endogènes peuvent également induire des lésions à l’ADN, comme les espèces réactives de l’oxygène, ou encore la peroxydation des lipides. Les lésions produites par ces différentes sources sont de natures variées, telles que les lésions de bases ou encore les ponts intercaténaires dans l’ADN (Marnett et Plastaras, 2001). Les dommages les plus répandus sont les cassures monocaténaires (Caldecott, 2008). Celles-ci sont le produit de dommages oxydatifs du métabolisme ou de l’hydrolyse de bases. Si ces cassures ne sont pas réparées ou non.

(14) 2 convenablement réparées, elles peuvent conduire à l’apparition de cassures bicaténaires dans le génome (Masnyk et Minton, 1991).. 1.2 Les cassures bicaténaires La cassure bicaténaire de l’ADN est le dommage le plus cytotoxique. Elle apparait lors d’une rupture du squelette pentose-phosphate sur les deux brins de l’ADN à des sites suffisamment rapprochés (Schipler et Iliakis, 2013). Malgré l’interaction entre les bases azotées et la structure de la chromatine, la proximité de ces deux lésions empêche la juxtaposition normale des deux brins d’ADN complémentaires. De nombreux processus biologiques peuvent être à l’origine de la formation de cassures bicaténaires (van Gent et al., 2001). La réplication de l’ADN est le processus endogène en créant le plus. En effet, un dommage à l’ADN, comme une cassure monocaténaire, un dimère de thymidine, une base oxydée, un site abasique ou encore un pont intercaténaire, peut induire un blocage de la machinerie réplicative à la fourche de réplication (Arnaudeau et al., 2001). Un clivage peut donc devenir nécessaire afin de réparer le dommage, formant ainsi une cassure bicaténaire. D’autres mécanismes biologiques peuvent également générer une source significative de ces cassures, mais de façon indirecte. La réparation par excision de base est l’un de ces mécanismes (Nikolova, Ensminger, Löbrich, et Kaina, 2010). Des bases oxydées, des bases manquantes et des cassures monocaténaires formées par des espèces réactives de l’oxygène sont réparées par ce système. Le retrait de la base modifiée par l’ADN glycosylase ou par endonucléase a pour conséquence de générer d’avantages de cassures monocaténaires. La génération de ces cassures monocaténaires à des sites rapprochés peut créer spontanément des cassures bicaténaires avant que la réparation par excision de base ne soit complétée. Les rayonnements ionisants et certains agents chimiques sont des sources exogènes de cassures bicaténaires bien connues (McMillan et al., 2001). Certains traitements anticancéreux utilisent la propriété cytotoxique des cassures bicaténaires afin d’affecter la viabilité cellulaire, comme la bléomycine, un composé radiomimétique. Cet agent découvert.

(15) 3 en 1962 par le docteur Umezawa et extrait de Streptomyces verticillus, induit la formation de radicaux libres proche de l’ADN lorsqu’il se lie à des ions métalliques et à de l’oxygène. Les espèces réactives de l’oxygène générées induisent la formation de cassures monocaténaires et des cassures bicaténaires dans l’ADN. Ces cassures bicaténaires seront par la suite réparées par NHEJ et par la HR (Sidik et Smerdon, 1990; Woods et Turchi, 2013). Bien qu’il s’agisse du dommage le plus délétère pour une cellule, certains mécanismes biologiques nécessitent la présence de cassures bicaténaires, ainsi que de leur réparation. Lors de la recombinaison des exons V(D)J par exemple, les protéines RAG (recombinaison activating gene) induisent des cassures bicaténaires afin de créer de la diversité combinatoire chez les immunoglobulines (Weaver, 1995). La recombinaison méiotique nécessite également l’induction programmée de cassures bicaténaires, afin de générer des échanges réciproques (crossing over) entre les chromosomes homologues (Andersen et Sekelsky, 2011). Au laboratoire, nous avons déterminé ces dernières années la présence de cassures bicaténaires transitoires lors d’étapes spécifiques de la spermiogénèse murine. Ces cassures bicaténaires semblent nécessaires afin d’éliminer les surenroulements de l’ADN permettant le retrait des histones (Grégoire et al., 2016; Leduc et al., 2012). Les origines de ces cassures bicaténaires sont résumés dans la figure 1 ci-dessous. Chaque rectangle gris représente les principales sources des cassures bicaténaires.. Figure 1. Les sources des cassures bicaténaires. Les cassures bicaténaires peuvent être induites par des mécanismes exogènes ou endogène. Il existe également des mécanismes biologiques normaux où les cassures bicaténaires sont nécessaires aux bons déroulements de ceux-ci..

(16) 4. 1.3 La réparation des cassures bicaténaires Une réparation fidèle et efficace des cassures bicaténaires est primordiale afin de conserver l’intégrité du matériel génétique qui est transmis de génération en génération. L’efficacité de mécanismes essentiels, comme la transcription et la réplication, est grandement affecté en présence de lésions à l’ADN. De nombreux groupes de recherches ont démontré que des cassures bicaténaires non réparées ou mal réparées pouvaient induire la mort cellulaire, mais aussi conduire à des aberrations chromosomiques et à de la mutagenèse (Jeggo et al., 2016; Michel, et al., 1997; Roos et Kaina, 2006). La cellule possède différents systèmes de réparation de l’ADN en fonction des dommages subis. Ici, nous nous intéresserons aux principaux systèmes de réparation des cassures bicaténaires.. 1.3.1 La réponse aux dommages à l’ADN En présence de cassures bicaténaires, la cellule utilise de nombreux systèmes dans le but de les détecter, de signaler leur présence et de promouvoir leur réparation. Bien que cette réponse cellulaire diffère en fonction du dommage rencontré, une voie commune est souvent observée. En présence d’un signal, ici un dommage à l’ADN, une cascade d’évènements se met en place. Pour commencer, ce signal est détecté par des « senseurs » qui déclenchent des « transducteurs », soit une cascade de protéine kinase qui vont ensuite amplifier et diversifier le signal en ciblant une série « d’effecteurs » de la réponse aux dommages à l’ADN. Ces systèmes doivent être sensibles et efficaces afin de réparer le plus rapidement possible le dommage survenu dans le matériel génétique (Maréchal et Zou, 2013; Alberts et al., 2011)..

(17) 5. Figure 2. Schématisation de la réponse cellulaire en présence de dommage à l’ADN telle que la cassure bicaténaire. En présence de cassures bicaténaires, des senseurs les détectent et activent une cascade de kinases transductrices. Enfin, des effecteurs sont activés en fonction de la voie de signalisation choisie.. Le complexe MRN, composé des protéines MRE11, RAD51 et NBS1, est l’un des senseurs en réponse à la présence d’une cassure bicaténaire. Ce complexe est recruté rapidement au site de la cassure permettant l’activation des protéines kinases transductrices (Lamarche et al., 2010). Chez les cellules mammifères, ATM, ATR et les ADN-PKcs sont les kinases les plus en amont de la cascade des kinases (Awasthi et al., 2015). Contrairement à ATR qui est principalement activé en réponse à la détection d’ADN monocaténaire dans le génome, ATM est principalement recruté et activé par le complexe MRN au site d’une cassure bicaténaire. Son activation conduit par la suite à la phosphorylation de nombreux substrats, tels que p53, des kinases de points de contrôles (checkpoint) du cycle cellulaire, comme CHK2, BRCA1 et NBS, ainsi que l’histone H2AFX (Hyun et Jang, 2015; Podhorecka et al., 2010). Ces effecteurs activés permettent d’emprunter différentes voies de signalisation en réponse à la cassure bicaténaire détectée initialement. En fonction de nombreux facteurs, la réponse cellulaire peut principalement conduire à la réparation de la cassure ou arrêter le cycle.

(18) 6 cellulaire et induire l’apoptose ou la sénescence (Ambrosio et al., 2016; Roos et Kaina, 2006; White et Vijg, 2016).. 1.3.2 La réparation par recombinaison homologue La recombinaison homologue (HR) est un échange génétique entre deux séquences homologues de l’ADN. La réparation par cette recombinaison est l’une des deux voies principales de la réparation des cassures bicaténaires (van Gent et al., 2001; Wright et al., 2018). En utilisant le brin d’ADN homologue de la chromatide sœur non endommagée comme modèle, cette voie permet de générer une réparation fidèle du matériel génétique. Cependant, un échange entre deux séquences homologues, mais non identiques, peut mener à de l’évolution, de la diversification, ou encore au brassage d’allèles lors de la méiose. Brièvement, la réparation des cassures bicaténaires de l’ADN est divisée en 3 grandes étapes. Pour commencer, la phase présynaptique permet de générer des extrémités simples brins 3’OH au site de la cassure. Cette résection de l’ADN est générée par des endonucléases telles que EXO1 ou TOP3. Les extrémités 3’OH générées sont stabilisées par la protéine RPA. Pour continuer, la phase synaptique est caractérisée par l’invasion des extrémités 3’OH vers la séquence homologue de la chromatide sœur. Cette étape d’appariement est catalysée par la recombinase RAD51 et ses paralogues. Au point d’embranchement, une jonction peut être créée, soit une jonction Holliday. La polymérisation peut donc avoir lieu par l’ADN polymérase 1 et la migration de la jonction d’Holliday est observée. Cette étape représente le début de la phase postsynaptique. Trois voies principales sont proposées à partir de la génération des points d’embranchement (Li et Heyer, 2008). Lors de la SCDA (synthesisdependent strand annealing), le nouveau brin synthétisé se dissocie du point d’embranchement et se lie à l’autre extrémité de la cassure, ne produisant pas d’échange d’information génétique de type « crossing over ». Pour la BIR (break-induced replication), une copie de la partie distale de la chromatide sœur au-delà de la région d’homologie a lieu, ayant pour conséquence la perte d’hétérozygotie. Enfin, lorsque les deux extrémités de la cassure bicaténaire sont réparées en même temps, deux jonctions d’Holliday sont créées. Ces.

(19) 7 jonctions d’Holliday pouvant être résolues par différentes orientations, un échange d’information génétique peut donc avoir lieu. L’ADN ligase1 est responsable de la ligation de chaque brin réparé.. Figure 3. Schéma simplifié de la réparation par recombinaison homologue. La première étape, la phase présynaptique consiste à la résection de l’ADN par Rad52 afin de générer deux extrémités 3’OH au site de la cassure bicaténaire. Ensuite, lors de la phase synaptique, il y a invasion de l’extrémité 3’OH vers la séquence homologue de la chromatide sœur. Enfin, la phase postsynaptique débute lors de la synthèse de l’ADN manquant par l’ADN polymérase 1. Les extrémités sont liguées par la ligase 1 et les jonctions d’Holliday sont résolues. La cassure bicaténaire présente initialement est donc réparée..

(20) 8 Comme énoncé ci-dessus, la proximité de la chromatide favorise la réparation d’une cassure bicaténaire par recombinaison homologue. Ce mécanisme de réparation est donc privilégié lors de la phase S et G2 du cycle cellulaire, où l’ADN est sous forme répliqué. Une. recombinaison. homologue. incontrôlée. peut. générer. des. réarrangements. chromosomiques et mener à l’inactivation de gènes conduisant à diverses pathologies (da Cunha Colombo Bonadio et al., 2018; Katsuki et Takata, 2016). La perte d’hétérozygotie, une marque génétique de nombreux cancers, peut également se produire lors de défauts dans la HR (Moynahan et Jasin, 2002; Ozaslan et Aytekin, 2009). Ce réarrangement génétique est fortement associé à la perte d’allèles non mutées chez des individus présentant une prédisposition génétique pour certains cancers ou syndromes. Pour le gène RB1 par exemple, une perte d’hétérozygotie peut conduire à la mutation des deux allèles du gène provoquant ainsi l’apparition du rétinoblastome (Ryland et al., 2015).. 1.3.3 La réparation par jonction non homologue des extrémités La réparation par jonction non homologue des extrémités (NHEJ) est la seconde principale voie de réparation des cassures bicaténaires de l’ADN utilisée par la cellule. Elle consiste à la juxtaposition des extrémités libres de la cassure et à leur ligation. Il s’agit d’un mécanisme de réparation sujet à l’erreur (Rodgers et McVey, 2016). En effet, une digestion des extrémités non franches pouvant être nécessaire pour leurs jonctions, l’ADN réparé pourra donc présenter une délétion d’un ou plusieurs nucléotides. Une cellule somatique d’un homme âgé de 70 ans aurait plus de 2000 mutations de ce type réparties sur l’ensemble de son génome représentant l’endroit où le matériel génétique aurait été réparé par le NHEJ (Voet et Voet, 2016). De plus, ce système de réparation peut être responsable de réarrangements chromosomiques majeurs par la délétion ou l’insertion de matériel génétique sur l’ensemble du génome (Seluanov et al., 2004). En fonction de l’état de la cassure bicaténaire et de la phase du cycle cellulaire, la lésion peut être reconnue par les hétérodimères Ku70 et Ku80 qui se lient au site du dommage et ainsi.

(21) 9 recrutent les DNA-PKcs. Le complexe RAD50-MRE11-NBS1 responsable de l’activité exonucléase, endonucléase et hélicase, peut jouer un rôle dans le NHEJ lorsque que les extrémités de la cassure ont besoin d’être modifiées avant la ligation. L’activité exonucléase de la protéine Artémis peut aussi être sollicité dans ce processus. XRCC4 et la ligase 4 recrutés par les hétérodimères Ku au site de la cassure, sont responsables de la ligation des deux extrémités. Contrairement à la HR, le NHEJ ne nécessite pas la présence de chromatides sœurs et peut donc être utilisé à différentes phases du cycle cellulaire.. Figure 4. Schématisation simplifiée de la réparation par NHEJ. La réparation par NHEJ débute par le recrutement de l’hétérodimère Ku70/ku80 et les DNAPKcs au site de la cassure. Si nécessaire, le complexe MRN composé de RAD50-MRE11NBS1 peut modifier les extrémités des brins d’ADN, par le retrait de quelques nucléotides par exemple, afin de rendre la cassure franche. Finalement, la jonction des deux extrémités peut être effectuée par la ligase 4 ou XRCC4..

(22) 10. 1.4 L’apoptose L’apoptose, un processus de mort cellulaire programmée, intervient principalement lors du développement, de la morphogenèse et de l’homéostasie tissulaire (Alberts et al., 2011). Contrairement à la nécrose où un stress aiguë induit accidentellement le gonflement et l’éclatement des cellules répandant leur contenu dans le compartiment extracellulaire et provoquant une réaction inflammatoire, l’apoptose est d’abord un processus programmé et induit, permettant principalement le contrôle de la prolifération cellulaire. Chez l’homme, des milliards de cellules sont détruites dans la moelle osseuse et dans les intestins à chaque heure (Susan, 2007). Dans le système immunitaire, l’apoptose permet le contrôle des lymphocytes activés et également la régulation étroite de la réponse inflammatoire (Osborne, 1996). Lors du développement du système nerveux des vertébrés, de nombreuses cellules nerveuses sont éliminées afin de limiter leur nombre (Nijhawan et al., 2000). Les dommages à l’ADN induits par les rayonnements UV ou les rayonnements ionisants par exemple, ou encore les erreurs de recombinaison, peuvent provoquer ce suicide cellulaire afin de limiter la transmission de mutations à la descendance. En effet, la stabilisation de dommages, telle que la persistance de cassures bicaténaires non réparées, vont induire, entre autres, l’activation et la stabilisation de p53 dans le noyau et le cytoplasme. Ce suppresseur de tumeur régule de nombreux gènes responsables de l’activation des deux principales voies de l’apoptose : la voie extrinsèque et la voie intrinsèque. Lors de la transcription, certains agents chimiques peuvent induire de l’apoptose en bloquant ce mécanisme, créant ainsi de nombreuses cassures bicaténaires dans l’ADN (Atkinson et McGlynn, 2009). Brièvement, en présence d’ATM au site de la cassure, des protéines kinases de point de contrôle CHK1 et CHK2, ainsi que p53, vont être recrutées et activées permettant l’activation de la transcription de facteurs pro-apoptotiques par p53, comme Fas, Puma et Bax. L’expression de p21 est également augmentée lors de l’activation de p53 bloquant ainsi le cycle cellulaire à la phase G1. Les récepteurs de mort, tels que Fas, sont des protéines transmembranaires situées à la surface de la cellule et qui permettent l’activation de la voie.

(23) 11 extrinsèque de l’apoptose lorsqu’elles entrent en contact avec le ligand approprié. Le complexe de signalisation de l’induction de la mort (DISC) est par la suite formé à l’aide de protéines adaptatrices, comme FADD, et des procaspases initiatrices, telles que la procaspase 8 ou 10. Ce complexe induit l’activation de ces procaspases, permettant le clivage des procaspases exécutrices et ainsi l’apoptose. Des récepteurs de mort peuvent aussi activer d’autres voies, comme les récepteurs TNF qui peuvent favoriser la vie de la cellule et activer des gènes de la réponse à l’inflammation en favorisant la voie des NFkB (Hayden et Ghosh, 2014).. L’apoptose peut également être activée par la voie intrinsèque, soit à partir de l’intérieur de la cellule. L’hypoxie, les dommages à l’ADN et le manque de nutriment par exemple, peuvent induire cette voie (Sendoel et Hengartner, 2014). En présence de cassures bicaténaires, p53 phosphorylée peut également activer des gènes Bcl2 pro-apoptotiques de la voie intrinsèque de l’apoptose, tels que Bax et Puma. Les protéines hautement conservées Bcl2 sont les protéines qui régulent finement cette voie en contrôlant la libération du cytochrome C mitochondrial dans le cytoplasme de la cellule. Certaines sont dites proapoptotiques favorisant la libération du cytochrome C, alors que d’autres sont dites antiapoptotiques inhibant cette libération. Lorsque l’équilibre entre l’activité des protéines Bcl2 pro- et anti-apoptotiques est perdu, l’apoptose peut être induite par la voie intrinsèque. Brièvement, Apaf1 est activé lorsque le cytochrome C mitochondrial est libéré dans le cytoplasme. La liaison entre le cytochrome C et Apaf1 induit l’hydrolyse du dATP (désoxyadénosine triphosphate) lié en dADP (désoxyadénosine diphosphate) ayant pour conséquence la liaison de plusieurs complexes cytochrome C – Apaf1, formant ainsi l’apoptosome. Cette macromolécule heptamérique permet le recrutement et l’activation de la procaspase 9 en caspase 9. Celle-ci clive et active les procaspases exécutrices conduisant à l’apoptose. La régulation de l’apoptose est primordiale afin de conserver l’homéostasie tissulaire (Favaloro et al., 2012). Une apoptose incontrôlée peut entrainer l’apparition de pathologies..

(24) 12 Un excès d’apoptose par exemple peut endommager des tissus, alors qu’une apoptose insuffisante peut induire l’apparition de maladies auto-immunes et de cancers. Afin de poursuivre son processus de transformation, une cellule tumorale doit, entre autres, acquérir une résistance à l’apoptose (Hanahan et al., 2000). Il a été rapporté que la protéine p53 est mutée dans 50% des cancers chez l’homme permettant aux cellules cancéreuses de survivre et de proliférer même en présence de dommages à l’ADN (Muller et Vousden, 2013).. 1.5 La sénescence La sénescence est un processus biologique permettant l’arrêt de la prolifération cellulaire suite à un stress. Contrairement à la quiescence qui induit un arrêt réversible du cycle cellulaire, la sénescence provoque l’arrêt définitif de la prolifération. Une modification de l’architecture chromatinienne à lieu favorisant la répression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire. L’expression de certains gènes est toutefois est favorisée, comme par exemple les gènes codant pour des protéines impliquées dans le phénotype excrétoire associé à la sénescence (Ohtani et Hara, 2013). La sénescence peut être induite par différentes conditions (Ohtani et Hara, 2013). La plupart des cellules humaines ne peuvent se diviser indéfiniment. Il s’agit de la sénescence réplicative (Campisi, 1997). La télomérase responsable de la synthèse des télomères et de la coiffe protectrice est déficiente dans la plupart des cellules somatiques humaines. Lors de la division cellulaire et de la réplication des chromosomes, les télomères raccourcissent exposant éventuellement les extrémités des chromosomes. Ces extrémités peuvent être reconnues comme des cassures bicaténaires et donc induire la réponse aux dommages à l’ADN et l’arrêt du cycle cellulaire (Shawi et Autexier, 2008). Certaines cellules cancéreuses acquièrent la capacité à produire de la télomérase, ce qui leur permet d’échapper à la sénescence réplicative et donc à se diviser indéfiniment (Shay et Wright, 2011). La sénescence peut également être induite en présence de dommages irréparables à l’ADN (Liguori et al., 2018). Un stress oxydatif provoqué par du peroxyde d’hydrogène ou des espèces réactives de l’oxygène (ROS) libérées naturellement lors de la synthèse d’ATP par.

(25) 13 la mitochondrie par exemple, peuvent induire des dommages à l’ADN, dont des cassures bicaténaires. La phosphorylation de l’histone H2AFX au site de cassures permet le recrutement et l’activation des acteurs de la réponse aux dommages à l’ADN, tels que ATM et les kinases CHK1 et CHK2. L’activation de p21 par p53 induit l’inactivation de CDK1 et CDK2 permettant l’activation de pRb et ainsi, l’arrêt définitif du cycle cellulaire. Certains groupes de recherche ont démontré que la sénescence jouait le rôle de barrière antitumorale par la mise en évidence de cellules en sénescence à des sites lésions précancéreuses ou encore dans des foyers de tumeurs bénignes de mélanocytes (Leikam et al., 2015; Sidik et Smerdon, 1990)..

(26) 14. 2. L’expression des gènes. 2.1 Généralités Nos observations sur l’impact de fluctuations du pHe sur la génotoxicité nous incitent à revoir certains éléments clé de l’expression génétique. L’expression génique de la bactérie jusqu’à l’homme repose sur un ensemble de principes fondamentaux appelés le dogme central de la biologie moléculaire. La séquence nucléotidique est transcrite sous forme d’ARN messager (ARNm) puis traduite afin de synthétiser la protéine attendue. Un organisme possède un matériel génétique identique au sein de ses cellules, mais comporte des phénotypes cellulaires différents soulignant la présence d’évènements qui permettent l’activation et la répression différentielle des gènes (Reynolds et al., 2013). La chromatine peut à elle seule moduler la transcription (Grunstein, 1997; Strahl et Allis, 2000). En absence d’activateurs de la transcription, la chromatine est souvent compactée sous forme d’hétérochromatine et adopte diverses signatures chimiques, telles que la méthylation d’histones H3 sur la lysine 9 et 27 par les histones méthyltransférases (HMT) et la désacétylation d’histones par les histones déacétylases (HDAC) (Hansen et al., 2011).. 2.2 Le pré-ARN messager Brièvement, l’initiation de la transcription nécessite la présence de protéines activatrices qui vont se lier spécifiquement, permettant le recrutement de la polymérase de type II au point d’initiation de la transcription (Alberts et al., 2011). Des facteurs de transcription tels que TFIID, TFIIB et TFIIF sont également nécessaires à l’initiation de la transcription. Ils se fixent sur des séquences précises de l’ADN et ont des rôles spécifiques, comme TBP qui reconnait la boite TATA. La communication entre la polymérase, les facteurs de transcription et les protéines activatrices se fait à l’aide du complexe protéique médiateur. Comme expliqué ci-dessus, la chromatine a besoin d’être modifiée localement afin d’initier la transcription et favoriser l’élongation. L’acétylation d’histones par les HAT, sur la lysine 9.

(27) 15 et 14 de l’histone 3 par exemple, permet l’ouverture locale de la chromatine et l’avancement de la polymérase II (Karmodiya et al., 2012). Des protéines chaperones peuvent également retirer des histones ou les remplacer par des variants, telle l’histone H2AZ, qui permettent de conserver un libre accès de la région à transcrire. Lors de l’élongation, des tensions surperhélicoïdales sont observées, créant des surenroulements positifs en amont de la polymérase et des surenroulements négatifs en aval. Chez les eucaryotes, les topoisomérases I et II sont responsables du retrait de ces tensions (Nitiss et al., 2012). Plusieurs études ont démontré le lien entre l’expression altérée des topoisomérases et l’apparition d’instabilité génétique (Chen et al., 2015; Tuduri et al., 2009). Une fois l’élongation terminée, le pré-ARN messager est modifié à plusieurs reprises afin d’obtenir un ARNm mature tel que décrit plus loin. Plusieurs groupes de recherche ont démontré des modifications de l’expression génique lors de fluctuation du pHe dans plusieurs lignées cellulaires (Bumke et al., 2003; Petronini et al., 1995). Ces études laissent croire que la machinerie transcriptionnelle serait affectée lors de modification du pHe. L’acétylation des histones étant modulée lors d’acidose, les dynamiques de la chromatine peuvent, par exemple, affecter l’expression des gènes. Le séquençage à haut débit des ARNm est un outil robuste permettant une analyse du transcriptome lors de conditions suboptimales.. 2.3 L’épissage du transcrit Suite à l’étape d’élongation et de l’ajout de la coiffe à la terminaison 5’, le pré-ARNm subit des réactions d’épissages afin de le rendre mature (Lee et Rio, 2015). Chez les eucaryotes, les séquences codantes, dites exons, sont interrompues par des séquences non codantes, dites introns. Le splicéosome, un macro-complexe ribunocléoprotéique, permet le retrait des introns du pré-ARNm. Des séquences spécialisées d’ARN de moins de 200 nucléotides (ARNsn) s’associent avec des sous unités protéiques afin de former des petites ribonucléoprotéides nucléaires (RNPsn). Des séquences consensus dans le pré-ARNm sont reconnues par ces RNPsn afin de signaler les introns à épisser. Deux activités phosphoryl-.

(28) 16 transférases sont nécessaires afin d’éliminer l’intron sous forme de lasso et lier les deux extrémités des exons. Malgré la présence de séquences consensus, le splicéosome peut ne pas reconnaître certains introns, ouvrant la voie à de l’épissage alternatif. En effet, un gène transcrit peut conduire à la formation de nombreuses alternatives d’ARNm matures produisant une forte variabilité protéique (Wang et al., 2015). Deux familles de facteurs d’épissage régulent l’épissage alternatif du transcrit en se liant aux séquences consensus, les protéines riches en sérine et arginine (protéine SR), ainsi que les particules ribonucléoprotéiques hétérogènes nucléaires (hnRNP). Succinctement, les protéines SR se fixent aux séquences consensus favorisant leur reconnaissance par le splicéosome, alors que les hnRNP agissent comme répresseur en se liant aux séquences inhibitrices. Afin d’augmenter la diversité des transcrits, plusieurs évènements d’épissages peuvent avoir lieux. L’évènement le plus communément observé est l’exclusion d’exon.. Figure 5. Représentation des différents patrons d'épissages alternatifs communs. Chez les cellules eucaryotes, le splicéosome est responsable d’éliminer les séquences introniques de l’ARN pré-messager afin de le rendre mature. Les protéines SR et les.

(29) 17 particules hnRNP peuvent masquer des sites d’épissages ouvrant la voie à de l’épissage alternatif. Ainsi, un gène peut coder pour plusieurs protéines favorisant la variabilité du protéome.. Certains agents chimiques tels que les antibiotiques permettent de moduler l’épissage alternatif (Effenberger et al., 2017). Dans le cas du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), des changements de sites d’épissages combinés à des traitements antiviraux s’avèreraient des pistes de thérapies prometteuses (Martin Stoltzfus, 2009). De nombreuses pathologies sont causées par des modifications d’épissage (Tazi et al., 2009). Certaines mutations dans des séquences codantes changent les patrons d’épissages produisant ainsi un ARNm différent et donc une protéine non fonctionnelle. Lors de l’acidification du pHe, des groupes de recherches ont rapporté des modifications des ratio d’isoformes exprimés (Borsi et al., 1995; Elias et Dias, 2008; Mauduit et al., 1999). D’autres travaux ont également démontré la présence de changements d’épissage alternatif dans des cellules cancéreuses (David et Manley, 2010). Dans le cas de cancers du sein et de l’ovaire, il a été rapporté qu’une mutation non-sens héréditaire dans l’exon 18 du gène BRCA1 conduisait à son exclusion complète lors de l’épissage alternatif (Orban et Olah, 2003)..

(30) 18. 3. Le pH. 3.1 Généralités L’homéostasie du pH est l’une des fonctions essentielles de l’organisme. En conditions physiologiques, le pH plasmatique est situé entre 7.38 et 7.42 permettant l’oxygénation des tissus, le maintien de la structure des molécules, ainsi que l’efficacité des réactions biochimiques (Casey et al., 2010). En l’absence de pathologie, l’organisme doit sans cesse éliminer un excès de protons (Hamm et al., 2015). En effet, l’alimentation et les produits du métabolisme génèrent une charge acide importante. Le CO2 sanguin ainsi que les acides organiques, tels que l’acide lactiques sont les principaux produits acides du métabolisme. L’équilibre entre acides et bases est finement régulé par différents processus chimiques et physiologiques (Hamm et al., 2015). Différents systèmes tampons permettent de prévenir les variations du pH de l’organisme. Le tampon bicarbonate est le système le plus connu et le mieux caractérisé. Il intervient principalement dans le pouvoir tampon du sang. En présence d’une charge acide, l’excès de proton va être capté par les ions bicarbonates circulant, créant ainsi de l’acide carbonique. Cet acide se dissocie en eau et en dioxyde de carbone pouvant ainsi être éliminé par la voie respiratoire. Le système rénal permet la réabsorption des ions bicarbonates nécessaires au fonctionnement du système tampon. De plus, les reins permettent l’élimination des protons en excès (Koeppen, 2009). En cas d’insuffisance rénale, les poumons peuvent compenser en éliminant l’excès de CO2 sanguin..

(31) 19. Figure 6. L'homéostasie du pH chez l'humain. L’alimentation et le métabolisme cellulaire provoque une charge acide importante dans l’organisme. Divers systèmes tampons permettent la régulation du pH sanguin afin de conserver l’homéostasie. Les poumons et les reins sont les principaux organes permettant l’élimination de la charge acide.. L’acidose métabolique est caractérisée dans un premier temps par la diminution de la concentration du tampon bicarbonate dans le sang, suivie par la diminution de la pression partielle de dioxyde de carbone (PaCO2) conduisant à l’acidification du sang (Kraut et Madias, 2010). L’acidose métabolique aiguë causée par la surproduction d’acides organiques dans l’organisme peut survenir pendant moins d’une minute jusqu’à plusieurs jours, alors que l’acidose chronique, résultant d’une perte du tampon bicarbonate ou d’un mauvais fonctionnement du système rénal, peut être retrouvée pendant plusieurs semaines voire plusieurs années (Carnaubaet al., 2017). Ce débalancement aigue du pH augmente le taux de mortalité en affectant les différentes fonctions biologiques cellulaires. Dans les unités de.

(32) 20 soins intensifs aux États-Unis, plus de la moitié des patients se présentant avec une acidose métabolique sévère (pH 7.2), en décèdent (Jung et al., 2011).. 3.2 Le pH intracellulaire Le pH intracellulaire (pHi) est un paramètre important de l’environnement intracellulaire. Son étroite régulation est indispensable afin de permettre aux cellules d’effectuer leurs fonctions biologiques. Physiologiquement, le pHi a une valeur de 7.2 (Casey et al., 2010). Le potentiel transmembranaire créé par la membrane plasmique est en partie responsable de cette baisse du pHi en comparaison avec le pHe. Les ions du côté du cytosol favorisent l’absorption de protons. De plus, les ions sont générés par de nombreuses réactions métaboliques, telles que l’acide lactique produite par la glycolyse lors de la synthèse d’ATP (Rogatzki et al., 2015). De nombreux mécanismes sont donc présents afin de transporter l’excès de protons, au travers de la membrane plasmique, du cytoplasme vers l’extérieur de la cellule (Casey et al., 2010; Damaghi et al., 2013). Des échangeurs présents à la membrane plasmique peuvent être responsables de l’alcalinisation du pHi. Les plus communs sont les échangeurs cations-H+ (NHE). Lors de l’acidification du cytoplasme, l’échangeur Na+-H+ permet l’exportation des protons en excès et l’importation de sodium. Le transporteur Na+-HCO3- (NBC) permet l’entrée d’ions bicarbonates dans la cellule afin de neutraliser les protons libres. Certaines cellules peuvent également importer des ions bicarbonates à l’aide de l’échangeur Na+Cl-HCO3- (NDCBE). Le gradient électrochimique de la membrane cytoplasmique créé par la pompe Na+-K+-ATPase (NKA) fournit l’énergie nécessaire au fonctionnement des échangeurs présentés ci-dessus. Dans certains tissus, comme les muscles où le métabolisme par anaérobie est fortement présent, les protons et les acides lactiques peuvent être exportés hors du cytoplasme par les transporteurs monocarboxylates (MCT). Le transport des protons peut s’effectuer par l’intermédiaire de pompes à protons, appelés H+-ATPase. Trois différents types d’ATPase sont aujourd’hui connues : les ATPases de type.

(33) 21 F, de type P ou E et de type V. L’ATP synthase, soit l’ATPase de type F, retrouvée à la surface des mitochondries, des bactéries et des chloroplastes, permet la synthèse ou l’hydrolyse de l’ATP lorsque qu’il y a translocation du proton à travers la membrane. Les ATPases de type P, H+-K+ par exemple, sont principalement retrouvées à la membrane plasmique des cellules gastriques pariétales. En important du potassium dans la cellule et en exportant des protons, ces pompes acidifient fortement la lumière de l’estomac jusqu’à une valeur de 1.5. L’hydrolyse de l’ATP est cependant nécessaire afin de phosphoryler un intermédiaire permettant le changement de conformation de la pompe à proton. Enfin, les ATPases de type V sont retrouvées chez différentes cellules eucaryotes telles que les macrophages, les ostéoclastes et les cellules rénales, mais également à la surface des membranes de certains organites tels que les vacuoles, les endosomes et les lysosomes. Ces pompes permettent l’acidification du milieu intérieur de ces organites nécessaires à leurs fonctions spécialisées. Contrairement aux types P, aucun intermédiaire n’est phosphorylé pendant l’activation des ATPases de type V. D’autres échangeurs et transporteurs appartenant aux familles décrites ci-dessus permettent cette fois-ci d’acidifier le compartiment intracellulaire lors d’alcalose. L’échangeur K+-H+ appartenant à la famille des NHE permet l’acidification par l’import de protons et l’export de potassium. La Ca2+ ATPase (PMCA), de la famille des ATPases de type P, peut également importer des ions H+ en exportant des ions calcium..

(34) 22. Figure 7. Les échangeurs membranaires responsables de la régulation du pHi chez la cellule. La cellule eucaryote possède différents échangeurs présents à la membrane plasmique permettant de réguler le pH intracellulaire. Lors d’un pHi acide (partie orange de la cellule), les échangeurs NHE et MCT permettent l’exportation de protons à l’extérieur de la cellule. Les transporteurs NBC et NDCBE permettent l’import d’ions bicarbonate pour neutraliser protons libres à l’aide du système tampon bicarbonate. L’échangeur NKA, en plus de réguler la concentration du potassium intracellulaire et le sodium intracellulaire, permet de fournir l’énergie nécessaire au fonctionnement des échangeurs cités ci-dessus et permet également de créer un gradient électrochimique à l’intérieur de la membrane plasmique. Lors d’une alcalinisation de la cellule (partie verte de la cellule), l’échangeur NHE peut permettre l’entrée de protons. L’échanger AE permet la sortie d’ions bicarbonate afin de diminuer la concentration du système tampon bicarbonate. Enfin l’ATPase de type V permet l’acidification d’organites comme les lysosomes représentés en jaune..

(35) . . 3I@?]M]BPG<ODJI?PK&DK@PODI?PDM@?@N?]NJM?M@NH]O<=JGDLP@NDHKJMO<IO@I<AA@>O<IOG< NOMP>OPM@ ?@N KMJO]DI@N @O G@PMN <>ODQDO]N .@MND @O <G

(36) *@N >@GGPG@N I@PMJI<G@N

(37) K<M @S@HKG@

(38) NJIO AJMO@H@IO N@IND=G@N <PS Q<MD<ODJIN ?@ K& 1DIIDIB @O & =I@M

(39) 3I@ ?]M]BPG<ODJIK@PO>JI?PDM@Y>@MO<DI@NK<OCJGJBD@N

(40) O@GG@NLP@G<H<G<?D@?wGUC@DH@M@OG< H<G<?D@?@.<MFDINJI$<IB@O<G

(41) 0PAADI

(42) 1<G<H@C@O<G

(43) . -;>):1)<176;,=8-@<:)+-44=4)1:--<4-;51+:7-6>1:766-5-6<; *<M]BPG<ODJI?PK&@SOM<>@GGPG<DM@K&@ EJP@]B<G@H@IOPIMcG@DHKJMO<IO?<ING@H<DIOD@I ?@NM]<>ODJIN=DJ>CDHDLP@N

(44) H<DN<PNND?<INGwCJH]JNO<ND@?@NODNNPNJD@O+<MPI<F<

(45) &<HH @O <G

(46) 3I ?]=<G<I>@H@IO GJ><GDN] ?P K&@

(47) <>>JHK<BI] K<MAJDN ?wPI ?]=<G<I>@H@IO?PK&D

(48) NPMQD@IOAM]LP@HH@IOGJMN?@>JI?DODJINK<OCJGJBDLP@N *wDN>C]HD@

(49) PI@ ?DHDIPODJI ?@ Gw<KKJMO N<IBPDI ?<IN PI@ K<MOD@ ?P >JMKN JP PI JMB<I@

(50) >JI?PDO M<KD?@H@IO Y PI@ =<DNN@ ?P K&@ EPNLPwY

(51) QJDM@

(52) <GJMN LP@ G< Q<G@PM KCTNDJGJBDLP@@NO?@ MI@OO

(53) 0D@H<II@O<G

(54) P>@MQ@<PK<M@S@HKG@

(55) GwDN>C]HD@A<QJMDN@G<BGT>JGTN@@I<I<]MJ=D@<PBH@IO<IO?M<NODLP@H@IOG<LP<IODO]?w<>D?@ G<>ODLP@@O?@KMJOJIN$MDI<F@O<G

(56) 2JH=<PBC@O1<KJGNFT

(57) *w@S>^N?wDJIN& ?]K<NN<IOG@KJPQJDMO<HKJI?@G<>@GGPG@

(58) >@PS >DNJIOM<KD?@H@IO@SKJMO]N@O<>>PHPG]N Q@MN G@ HDGD@P DIO@MNODOD@G <ADI ?@ >JIN@MQ@M GwCJH]JNO<ND@ ?P HDGD@P DIOM<>@GGPG<DM@ *< ?DHDIPODJI?PIDQ@<P?w2.?<ING<>@GGPG@

(59) DI?PDOK<MG<KMJ?P>ODJIDIO@INDQ@?@G<>O<O@

(60) >JI?PDO Y G< K@MO@ ?w<>ODQDO] ?@ Gw]>C<IB@PM ,) 1<IN >@O ]>C<IB@PM

(61) Gw@SKJMO<ODJI ?@ KMJOJIN

(62) <DINDLP@GwDHKJMO<ODJI?wDJIN=D><M=JI<O@

(63) ?@QD@II@IO>JHKMJHDN@N*@N?JHH<B@N NP=DNK<MG@N>@GGPG@NI@PMJI<G@NJIO]O]>JMM]G]NYKGPND@PMNM@KMDN@N<Q@>Gw<>D?DAD><ODJI?P K&@0PAADI@O<G

(64) P>JPMN?@N<II]@N

(65) ?DAA]M@IO@NCTKJOC^N@NJIO]O]]HDN@N<ADI ?w@SKGDLP@M>@OO@>JMM]G<ODJI3I@?w@IOM@@GG@NJPGDBI<DOG@GD@I@IOM@Gw<>D?DAD><ODJIGJ><GDN] ?PK&@@OG<?]I<OPM<ODJI?@NKMJO]DI@N@O?@N<>D?@NIP>G]DLP@N *wDIAG<HH<ODJI

(66) NJPQ@IO J=N@MQ]@ GJMN ?wDN>C]HD@ N]Q^M@

(67) K@PO ]B<G@H@IO

(68) Y @GG@ N@PG@

(69) DI?PDM@PI@?DHDIPODJIGJ><GDN]@?PK&@.GDT@Q@O<G

(70) 0<E<H[FD@O<G

(71) 0D@H<II.