Neuropathies périphériques et petites protéines de choc thermique

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Neuropathies périphériques

et petites protéines

de choc thermique

NOUVELLE

>Les neuropathies périphériques hérédi-taires, dont la prévalence est d’environ 1/5 000, sont les maladies monogéniques du système nerveux les plus fréquentes. Ce grand groupe de maladies, très hété-rogène tant sur le plan clinique que génétique, présente une caractéristique commune, l’atteinte progressive des nerfs périphériques. L’analyse des vitesses de conduction nerveuse des nerfs périphériques à l’aide de l’examen électromyographique permet de distin-guer deux grands types de neuropathies, les formes démyélinisantes - incluant la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 1, CMT1 - et les formes axonales, incluant les neuropathies motrices dis-tales héréditaires (dHMN) et sensitivo-motrices (CMT2) [1].

De nombreux gènes responsables de ces affections ont été identifiés. Ils codent pour des protéines impliquées dans des processus cellulaires très divers tels que la compaction de la gaine de myéline (PMP22, P0), l’assemblage des neurofila-ments (NEFL), le transport axonal (KIF1B), le trafic intracellulaire (RAB7), l’apoptose (SPTLC1, LITAF), la transcription (EGR2), la traduction (GARS) et la transduction du signal (PRX, MTMR2 et 13) [2, 3]. Deux publications récentes, parues dans la revue Nature Genetics [4, 5], suggèrent l’émergence d’un nouveau mécanisme physiopathologique à partir de l’identifi-cation, par l’équipe de V. Timmerman, de deux gènes codant pour les petites pro-téines de choc thermique (sHSP), HSP22 et HSP27. Ces protéines appartiennent à la superfamille des sHSP connues pour être impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels que l’aide au repliement

des protéines, l’inhibition de l’apoptose, l’organisa-tion du cytosquelette ou la

suppression d’agrégats protéiques [6-10]. Ces travaux ont d’abord porté sur deux familles atteintes de dHMN de type II liées au chromosome 12q24.3. Cette axonopathie motrice pure est caractéri-sée par une atrophie et une paralysie des muscles distaux. Une analyse des haplo-types utilisant des marqueurs poly-morphes a permis aux auteurs de res-treindre la région génétique candidate de 5 Mb à 1,7 Mb entre les marqueurs D12S349 et PLA2G1B. Parmi les neuf gènes connus dans cet intervalle, cinq avaient été préalablement exclus et les quatre autres ont fait l’objet d’un séquençage systématique des exons et des jonctions exon-intron. Cette straté-gie a permis d’identifier une mutation faux-sens dans l’exon 2 du gène HSPB8 codant pour HSP22. Par la suite, une autre mutation faux-sens a été identi-fiée chez deux autres familles. Ces deux mutations conduisent à la substitution du résidu lysine en position 141 par un résidu asparagine (K141N) ou un acide glutamique (K141E).

Cette équipe s’est également intéressée aux CMT2. Cette neuropathie sensitivo-motrice à prédominance distale se caractérise par une faiblesse musculaire et une atrophie des muscles distaux associées à des anomalies sensitives distales. Cette axonopathie est généti-quement très hétérogène. Par exemple, dans les formes autosomiques domi-nantes, huit locus ont été identifiés et cinq gènes sont connus à ce jour (KIF1B, RAB7, GARS, NEFL, MPZ) [3]. Chez une

famille pour laquelle le diagnostic de CMT2F liée au chromosome 7q11-q21 a été porté, l’équipe de V. Timmerman a pu, grâce à une analyse génétique, restreindre la région can-didate à un intervalle de 10 cM entre les marqueurs D7S672 et D7S806. Cinq gènes candidats ont été judicieusement sélectionnés dans cette région et, là encore, le séquençage systématique de ces gènes a permis d’identifier une mutation dans l’un d’entre eux. De façon surprenante, cette mutation faux-sens affecte le gène HSPB1 codant lui aussi pour une sHSP, HSP27. La transition 404C->T identifiée dans ce gène conduit à la substitution d’un résidu sérine par un résidu phényla-lanine en position 135 (S135F).

L’identification de mutations de HSP22 dans les dHMN, de mutations de HSP27 dans les CMT2, et le fait que ces deux protéines interagissent, ont conduit à rechercher des mutations de HSP27 dans d’autres familles atteintes de dHMN ou de CMT. Ce même groupe a ainsi identifié des mutations faux-sens de HSP27 chez des familles atteintes de dHMN, démon-trant que les mutations de ce gène pou-vaient conduire à des neuropathies purement motrices (dHMN) ou à des neuropathies sensitivo-motrices (CMT2). L’ensemble de ces résultats suggère donc l’implication des sHSP dans les neuropa-thies périphériques.

Plusieurs arguments permettent de démontrer la responsabilité des muta-tions faux-sens de ces gènes dans la pathogénie de ces affections. HSP22 et HSP27 sont avant tout des protéines ubi-quitaires, bien exprimées dans les neu-rones sensitifs et moteurs affectés dans ces neuropathies. Ces mutations n’ont pas été retrouvées au sein d’une grande population de sujets sains, un argument Laboratoire de

Neurogénétique moléculaire, Inserm E-0223,

Université d’Évry. 2, rue Gaston Crémieux, CP 5724,

91057 Évry Cedex, France. j.melki@genopole.inserm.fr

faible pour des maladies rares. De plus, les mutations observées chez ces patients sont localisées dans le domaine α-cristalline, fortement conservé au sein de la famille des protéines sHSP, ou dans d’autres résidus très conservés au sein des protéines orthologues. De plus, ces mutations sont situées à proximité de résidus d’autres sHSP telles que l’_α-A cristalline et l’_{α-B cristalline, dont les} mutations faux-sens sont responsables respectivement d’une forme de cata-racte congénitale ou d’une myopathie

[11, 12]. Le caractère « pathologique » de ces mutations a été confirmé en ana-lysant leurs effets dans des modèles cel-lulaires. Une diminution de la survie des cellules de neuroblastomes exprimant l’une ou l’autre de ces protéines mutées (HSP22 K141E et HSP27 S135F) a souligné l’effet délétère des mutations de ces sHSP. De plus, des anomalies intracellu-laires ont été observées. En effet, la mutation HSP22K141E engendre la for-mation d’agrégats de HSP22 cytoplas-mique et périnucléaire. Quant à la muta-tion HSP27S135F, observée dans les CMT2F, elle engendre in vitro un défaut d’assemblage des neurofilaments, rap-pelant celui déjà décrit dans les CMT2E liées aux mutations du gène NEFL. Des anomalies du cytosquelette telles que des agrégats de desmine ont également été observées dans une myopathie liée à des mutations du domaine _{α-cristalline} d’une autre sHSP, l’_{α-B cristalline} [8]. L’altération des filaments intermédiaires suggère donc que le maintien de l’orga-nisation du cytosquelette implique les sHSP. L’intégrité du cytosquelette étant indispensable au bon fonctionnement du transport axonal - un processus essen-tiel dans les neurones de très grande taille - il est possible que les mutations des sHSP conduisent à une altération de ce transport.

L’ensemble de ces travaux souligne plu-sieurs points. Le séquençage systématique des gènes situés dans un intervalle géné-tique important reste parfois le seul recours efficace pour permettre l’identifi-cation des mutations de gènes de

mala-dies rares, quand le nombre de familles ne permet pas une cartographie génétique très fine. La génétique à rebours n’a donc pas fini de nous ouvrir de nouvelles portes vers des mécanismes physiopathologiques inexplorés ! Cette stratégie a ainsi permis d’identifier des mutations au sein des gènes codant pour HSP22 et HSP27 dans les neuropathies périphériques. Ces tra-vaux démontrent le rôle majeur des sHSP dans les maladies neurodégénératives. L’identification de ces deux gènes souligne de nouveau l’hétérogénéité génétique de ces affections. De plus, l’identification de mutations de HSP27 dans des neuropa-thies sensitivo-motrices, ou motrices pures, suggère l’implication de méca-nismes physiopathologiques communs à l’origine de neuropathies pourtant clini-quement distinctes. Cette hypothèse est renforcée par les travaux récemment rap-portés par A. Antonellis et al., qui mon-trent que des mutations du gène GARS codant pour la glycine ARNt synthétase sont responsables de neuropathies sensi-tivo-motrices (CMT2D) ou motrices pures (dHMN-V) [13]. Un nouvel exemple de l’absence de corrélation génotype-phé-notype !

L’existence d’un rôle crucial des HSP dans les maladies neurodégénératives avait déjà été suspectée par l’identification d’une mutation de la protéine chaperon HSP60 au sein d’une famille atteinte de paraplégie spastique, une maladie carac-térisée par une dégénérescence des axones des voies corticospinales [14]. De plus, HSP27 semble jouer un rôle neuro-protecteur dans certaines maladies [10, 15]. Les protéines chaperons, et en parti-culier les petites protéines de choc ther-mique, jouent donc un rôle pivot dans l’intégrité du système nerveux. Néanmoins, les mécanismes moléculaires conduisant à la dégénérescence des axones plutôt que d’autres types cellu-laires restent encore mal connus. De plus, la pathogénie des mutations de HSP27 ou HSP22 dans les neuropathies - effet dominant négatif ou gain d’une nouvelle fonction - reste à élucider.

Comment réconcilier cette

extraordi-naire hétérogénéité génétique et les maladies du nerf périphérique que peu ou pas d’éléments cliniques permettent de distinguer ? S’agit-il de processus physiopathologiques distincts d’un bout (la mutation génique) à l’autre (la dégénérescence axonale), ou de méca-nismes physiopathologiques distincts qui s’engouffrent ensuite vers un même tronc commun pour aboutir à la dégé-nérescence axonale ? Dans le premier cas, cela conduit à une recherche phy-siopathologique et thérapeutique spé-cifique de chaque entité moléculaire. Dans le second cas, la dissection molé-culaire de ce tronc commun pourrait conduire à l’identification de cibles thérapeutiques communes aux neuro-pathies périphériques. Une approche « transversale » de ces affections est désormais possible à partir de modèles murins ou cellulaires de ces maladies utilisant des techniques d’analyse glo-bale du protéome ou du transcriptome. Elle devrait permettre de répondre à cette question clé pour les recherches thérapeutiques à venir. ◊

Neuropathies and small heat shock proteins

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Quand le staphylocoque

a besoin de fer,

il préfère celui de l’hème

NOUVELLE

>Le fer est un nutriment indispensable à quasiment tous les organismes vivants, pour des besoins aussi primordiaux que la respiration et la synthèse d’ADN. On explique ainsi la non-prolifération bacté-rienne dans les profondeurs océaniques par l’absence de fer. La plupart du temps, cependant, la difficulté pour les micro-organismes de trouver du fer réside dans le fait que ce dernier est insoluble et/ou inaccessible. Les bactéries, en particulier le staphylocoque, ont développé diverses stratégies de capture du fer. Il peut s’agir de la sécrétion de sidérophores solubles, qui captent le fer externe puis assurent son entrée dans la bactérie par des trans-porteurs spécifiques. Il existe aussi des systèmes d’importation directe de sels de fer. Un premier mécanisme de défense des organismes supérieurs contre l’invasion bactérienne est une limitation drastique du fer libre dans le sang et les tissus. Ce blocage du fer s’effectue majoritairement par sa fixation sur des protéines qui ont pour lui une forte affinité, la lactoferrine et la transferrine. Les sites de fixation du Fe3+_{de la transferrine sont, en fait,}

rare-ment saturés, laissant toujours un excès de protéine non saturée sous forme d’apotransferrine et assurant ainsi l’éli-mination virtuelle de tout fer libre.

Un récent travail de chercheurs de l’Université de Chicago (États-Unis) a mis en évidence la stratégie employée par le staphylocoque doré (Staphylococcus aureus) pour se procurer le fer néces-saire à sa croissance et à sa différencia-tion [1, 2]. Pour coloniser son hôte, le staphylocoque rencontre un premier obstacle : le manque de fer. La concen-tration dont il a besoin est de l’ordre de 0,4-4,0 mM, alors que la concentration de fer libre se situe autour de 10- 9 M. Deux sources possibles de capture exis-tent dans l’organisme des mammifères : la transferrine, qui ne représente que 1 % du fer total, et l’hème, qui en contient plus de 80 %. Les auteurs ont donc sup-posé que l’hème devait être utilisé de façon préférentielle. Afin de vérifier cette hypothèse, un marquage spéci-fique des deux protéines par un isotope stable du fer a été réalisé pour mesurer la consommation de la transferrine [57Fe] et de l’hémine [54Fe]. Les dosages ont été effectués par une spectrométrie de masse en source plasma ICP-MS (inductively coupled plasma-mass spec-trometry). Dans une première étape, les bactéries sont placées sur un milieu pauvre en fer jusqu’à une limitation de croissance indicatrice de carence

mar-tiale, suivie par l’ajout en quantité équi-molaire des deux protéines marquées. Les mesures sont ensuite effectuées au bout de 9 heures, 12 heures et en phase stationnaire à 24 heures. Le contenu iso-topique des cellules montre, dans les premières heures, un enrichissement (x 4 à 5) en fer héminique en même temps qu’un appauvrissement du milieu. Cette modification des concentrations dimi-nue au cours du temps, mettant en évi-dence la régulation progressive des autres systèmes de capture (à partir de la transferrine ou de sidérophores). La méthode a aussi permis de préciser la localisation subcellulaire du fer extrait des deux protéines : le fer héminique se fixerait sélectivement à la membrane, celui de la transferrine s’orientant vers le cytoplasme.

Parallèlement à ces mesures isotopiques, une analyse du génome de S. aureus a montré sept séquences codant potentiel-lement pour des transporteurs transmem-branaires et présentant une homologie avec des transporteurs connus. Parmi ceux-ci, certains systèmes avaient déjà été mis en évidence par le même groupe de chercheurs. Tout un ensemble de gènes isd A à F (iron-regulated surface determi-nants) fonctionne comme système d’im-Département de génétique,

développement et pathologie moléculaire, Institut Cochin, 24, rue du Faubourg Saint Jacques, 75014 Paris, France. labie@cochin.inserm.fr