ANDRÉ LUIZ BARBAGALLO
ÉTUDE DE LA DIVERSITÉ MICROBIENNE SOUS
GINGIVALE CHEZ DES PATIENTS DIABÉTIQUES
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en sciences dentaires
pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE DENTAIRE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
Résumé
Notre objectif est d’étudier la façon dont le diabète affecte les interactions hôte-bactéries en mettant l'accent sur la diversité microbienne dans les poches parodontales profondes et peu profondes utilisant la technique d’analyse clonage du gène de l'ARNr 16S. Parmi les 1650 clonages en 12 patients sélectionnés pour l’étude, nous avons identifié plusieurs espèces bactériennes. En effet, dans les deux groupes, nous avons mis en évidence des espèces comme Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, Treponema
denticola et Fusobacterium nucleatum, avec peu de différence, sauf une prévalence accrue
des bactéries considérées pathogènes par rapport du complexe de couleur décrit par Socransky.
Avant-propos
Ce travail a été réalisé à la Faculté de médecine dentaire, au sein du Groupe de recherche en écologie buccale de l’Université Laval.
Je tiens à remercier mon directeur de recherche, Dr Reginaldo Bruno Gonçalves, pour ses encouragements, sa convivialité et son aide dans les activités et la normalisation de ce mémoire.
Je remercie également mes collègues ainsi que les professeurs du GREB et en particulier M. Jabrane Azelmat, pour ses conseils scientifiques et son aide avec la langue française.
Je remercie aussi mes parents Madame Maria Andrelina Pinotti et Monsieur Vicente Barbagallo qui m’ont toujours soutenu, surtout dans les moments les plus difficiles.
Je désire remercier mon épouse Valéria pour son appui, ses encouragements et tout l’amour qu’elle m’a donné qui m’a permis de mener ce projet à terme.
Pour finir, à mes enfants Bruno et Enzo, je vous laisse ici une leçon de vie « Étudier c’est comme ramer contre-courant, si tu n’avances pas, tu recules ».
Table des matières
Résumé ... ii
Avant-propos ... iii
Table des matières ... iv
Liste des figures ... vi
Liste des tableaux ... vii
Liste des abréviations ... viii
Introduction ... 1 1.0 Diabète Mellitus ... 1 1.0.1 Classification ... 1 1.0.2 Diabète de type 2 ... 2 1.0.3 Manifestations buccales ... 3 1.1 Maladies parodontales ... 6 1.1.0 Considérations générales ... 6 1.1.2 Classification et diagnostic ... 7 1.1.3. Étiologie ... 9
1.1.4. Mécanismes de l’infection bactérienne ... 11
1.2 Diversité microbienne du biofilm buccal ... 14
1.2.1 Classification bactérienne selon Socransky ... 16
1.2.2 Maladies parodontales chez les patients atteints de diabète ... 18
1.2.2.1 Modifications vasculaires ... 18
1.2.2.2 Évolution de la réponse chez l’hôte ... 18
1.2.2.3 Changement du comportement de l’activité tissulaire ... 19
1.2.2.4 Excitation de la réponse inflammatoire ... 19
1.3 Techniques de biologie moléculaire utilisées pour les études de la diversité microbienne ... 19
1.3.1 L’analyse ribosomique 16S ... 20
1.4 Pertinence du projet ... 22
1.5 Hypothèses de travail ... 23
1.6 But et objectifs du projet ... 24
Chapitre 2 - Matériel et méthodes ... 27
2.0 Procédures cliniques ... 27
2.0.1 Prélèvements et ses critères ... 27
2.0.2 Procédures de laboratoire ... 28
2.0.3 Extraction de l'ADN... 29
2.0.4 Amplification de l'ADNr 16S par PCR... 29
2.0.5 Préparation et électrophorèse sur gel d’agarose ... 30
2.0.6 Clonage et transformation du fragment cible dans le plasmide de la bactérie Escherichia coli ... 31
2.0.7 Extraction du plasmide ... 31
2.0.8 Analyse partielle de séquences ... 32
Chapitre 3 - Résultats ... 34
3.0 Introductions des résultats ... 34
3.0.2 Résultats par espèce ... 40
3.0.3 Résultats par phylotypes non cultivables ... 49
Chapitre 4 - Discussion ... 54
Chapitre 5 - Conclusion ... 60
Liste des figures
FIGURE 1. Séquence de colonisation des complexes de biofilms supra gingivaux de la
plaque …...……….………... 17
FIGURE 2. Technique de clonage: extraction, amplification, liaison et insertion... 25
FIGURE 3. Clonage, extraction et séquençage... 26
FIGURE 4. Nombre total des clones regroupés par genre ...…... 36
FIGURE 5. Pourcentage total des clones regroupés par genre………... 37
FIGURE 6. Pourcentage des espèces bactériennes analysées pour le complexe des couleurs trouvées en poches parodontales profondes... 42
FIGURE 7. Pourcentage des espèces bactériennes analysées pour le complexe des couleurs trouvées en poches parodontales peu profondes... 43
Liste des tableaux
TABLEAU 1.Classification des maladies parodontales révisée en 1999 par l’Académie Américaine de Parodontologie (AAP) ..…………... 8 TABLEAU 2.Amorces pour la technique de PCR ..…………... 30 TABLEAU 3.Amorces pour la réaction de séquençage ...…………... 32 TABLEAU 4.Quantités totales des genres bactériens et leurs pourcentages par groupe de poches ... 38 TABLEAU 5. Nombre total des espèces bactériennes mises en évidence et leurs pourcentages par groupe de poches selon le complexe de couleurs ... 44 TABLEAU 6.Nombre total des espèces bactériennes mises en évidence et leurs pourcentages par groupe de poches ... 46 TABLEAU 7.Nombre total des phylotypes mis en évidence et leurs pourcentages par groupe de poches ... 51
Liste des abréviations
C° Degré Celsius
AAP American Academy of Periodontology
ADN Acide désoxyribonucléique
ARN Acide ribonucléique
BANA N - benzoyl- DL- arginine- 2 -maphthylamide
CIA Chloroforme alcool isoamyl
DNase Désoxyribonucléase
DNTPs Désoxyribonucléotides
DM Diabètes mellitus
DO Densité optique
EDTA Acide éthylène diamine tétra acétique
HCl Acide chlorhydrique H2S Sulfure d’hydrogène IL-6 Interleukine 6 IL-8 Interleukine 8 KCl Chlorure de potassium LB Luria Bertani LPS Lipopolysacharides M Molaire ml Millilitre mg Milligramme MgCl2 Chlorure de magnésium
MgSO4 Sulfate de magnésium
Min Minute
mM Millimolaire
MMP Métaloprotéinases matricielles
NaCl Chlorure de sodium
NH3 Ammoniac
OT Oral Taxon
PCR Polymerase Chain Reaction
PGE2 Prostaglandine E2
PMNs Neutrophiles polymorphonucléaires
PS Profondeur au sondage
rDNA rDNA - ribosomal deoxyribonucleic acid
rpm Rotations par minute
RNase Ribonucléase
S S - Svedberg, unité de sédimentation
SDS Sodium dodécyl sulfate
TNF- Facteur de nécrose tumorale
TRIS 2-Amino-2-hydroxyméthyl-propane-1,3-diol
µl Microlitre
1.0 Diabète Mellitus
Le diabète Mellitus (DM) est une maladie multifactorielle, résultant de l'interaction de divers gènes et d’une variété de facteurs environnementaux. Il se présente comme un désordre métabolique défini par une hyperglycémie qui se caractérise par la résistance à l'insuline et qui précède souvent le diabète de type 2. Le diabète Mellitus est caractérisé par une diminution de la réponse des tissus cibles à des niveaux normaux d'insuline en circulation (Kidambi et Patel, 2008). Ces tissus cibles affichent un besoin en insuline plus élevé que la normale pour répondre de manière adéquate.
Cette résistance peut s'étendre sur plusieurs années (Taylor et Borgnakke, 2008) et va ralentir l'action de l'insuline dans différents tissus, plus précisément de l'incapacité du pancréas à libérer l'insuline en quantités précises, pour contrôler le métabolisme du glucose (Correa et al., 2010).
1.0.1 Classification
Habituellement, le diabète est classifié en trois groupes: diabète de type 1 (DM1), aussi dénommé diabète juvénile, le diabète de type 2 (DM2) et le diabète gestationnel qui se développe pendant la grossesse (Ismail et al., 2011). La plupart des individus diabétiques, soit plus de 90% des cas, sont atteints de diabète de type 2 (Salvi et al., 1997).
1.0.2 Diabète de type 2
Le DM2 est l’une des anomalies du métabolisme les plus fréquentes chez les humains. Le nombre croissant de personnes atteintes, ainsi que la liste des complications à long terme, fait du DM2 un problème de santé public primordial (Correa et al., 2010).
Cette maladie chronique et progressive est caractérisée par la résistance périphérique d’action de l’insuline, qui favorise une altération de la sécrétion de cette dernière et une incapacité des cellules à métaboliser le glucose. Cette anomalie est appelée résistance à l'insuline. Par ailleurs, il existe une dégradation progressive de l’activité des cellules bêta qui empêche la correction de cette résistance en augmentant la sécrétion d'insuline (Guven et al., 1996).
Même si nous ne connaissons pas clairement les causes du diabète, nous associons essentiellement sa prévalence à l'âge, à l'obésité qui est bien connue pour être un important facteur de risque pour diverses maladies de l'adulte, telle que l'hyperlipidémie, l'hypertension artérielle, la lithiase biliaire, l'artériosclérose et les complications cardio-vasculaires et accidents cérébraux (Dietrich et al., 2008), au sédentarisme, au faible poids à la naissance (Khader et al., 2009)et à la mauvaise nutrition (Demmer et al., 2008).
Dans le diabète de type 2, le facteur génétique proposé pour le génome mitochondrial, connu pour jouer un rôle important dans le glucose, est d’induire la sécrétion d'insuline dans les cellules bêta du pancréas. Une transmission maternelle dans certains cas de diabète de type 2 suggère que les anomalies mitochondriales peuvent être diabétogènes (Yang et al., 2002).
Les individus diabétiques qui ont un contrôle inadéquat de leur maladie peuvent développer diverses complications comme des dysfonctionnements et/ou une défaillance de différents organes. Cette détérioration est favorisée par les diminutions des tissus, des capillaires sanguins et des nerfs. Cette défaillance peut conduire aussi à des complications chroniques progressives telles que la rétinopathie, la néphropathie, l’insuffisance rénale et/ou une neuropathie avec des risques de fièvre aphteuse, d’ulcères, d’amputations, d'athérosclérose accélérée (Correa et al., 2010), et un dysfonctionnement du système autonome (Yu et al., 2010).
1.0.3 Manifestations buccales
Les maladies bucco-dentaires chez les patients diabétiques, présentent une incidence et une progression accélérée quand un contrôle du glucose sanguin est inadéquat.
Une hyperglycémie avancée peut causer des dommages aux reins, aux nerfs, au cœur, aux yeux, ainsi qu’une altération de la fonction des glandes salivaires entrainant une réduction du flux salivaire (Kidambi et Patel, 2008).
Alors que le flux salivaire diminue en raison de l'hyperglycémie, de nombreuses manifestations bucco-dentaires peuvent survenir, telles que l’augmentation du niveau de la mucine et du glucose, la diminution de l'action de plusieurs facteurs antimicrobiens, l'absence d'une métalloprotéinase contenant du zinc et étant responsable de la maturation constante des papilles, un mauvais goût et la mauvaise haleine, de la candidose buccale, une exfoliation des cellules après un contact dû à un manque de lubrification, ou encore une prolifération des micro organismes pathogènes (Negrato et Tarzia, 2010).
Ces modifications retardent en général la cicatrisation et augmentent la susceptibilité à l'infection, à la chéilite, aux muqueuses sèches avec fissures, aux lèvres gercées et à l’augmentation de la prévalence des caries dentaires (Negrato et Tarzia, 2010).
Une prédominance de la diminution du flux salivaire est également observée. On peut associer à une élévation de la viscosité, qui devient visqueuse et mousseuse. Le pH salivaire tend aussi vers l’acidité, surtout si la glycosurie est haute, ce qui est observé simultanément à cause de la faible production de glucose ou encore une forte concentration en ions de potassium, de calcium, de magnésium (Ibayashi et al., 2009).
Les altérations immunologiques causées par le diabète Mellitus sont également considérées comme un facteur de risque important. Les personnes immuno-compromises ne possèdent pas les capacités d’éliminer les agents pathogènes, ce qui perpétue l’infection et le processus inflammatoire.
Les symptômes décrits sont importants, cependant, ces changements ne sont pas toujours présents et d’autres facteurs externes peuvent modifier la réponse de l’hôte face à la microflore déjà existante.
Plusieurs études ont été réalisées pour définir les changements biochimiques qui surviennent dans la salive des patients diabétiques. Ces transformations sont liées à la concentration de glucose, aux niveaux des protéines totales, de l’albumine, du lysozyme de la peroxydase, de l’amylase, des IgA, des électrolytes (sodium, potassium, phosphore, magnésium et calcium) et à la capacité tampon de la salive (Armitage, 2010; Jawed et al., 2010).
Les travaux de Kidambi et Patel (2008) ont montré des effets néfastes du diabète sur la santé parodontale et de la maladie parodontale sur le contrôle glycémique, le pH, le pouvoir tampon, le calcium et le phosphate de 30 sujets atteints de DM2 et 30 sujets atteints DM1. Ils ont conclu que les deux maladies induisent des changements dans la composition et/ou la production de la salive.
L’inflammation produit des radicaux libres de l'oxygène qui activent les métalloprotéinases matricielles qui, à leur tour, dégradent le collagène du ligament parodontal et entraînent une baisse de la synthèse des composantes de la matrice osseuse. Les radicaux libres causent ainsi une diminution de la fixation dentaire dans le système alvéolaire et peuvent augmenter la profondeur du sillon gingival (Herring et Shah, 2006). Ainsi, ce syndrome ralentit le processus de cicatrisation et accélère celui de la destruction au niveau parodontal (Salvi et al., 1997).
Dans l'étude réalisée avec un groupe de rats diabétiques et un groupe témoin pour évaluer l'influence du DM sur les tissus parodontaux, les animaux diabétiques ont montré une distorsion de l'attache parodontale et une tendance agressive à la perte osseuse par rapport aux témoins sains, suggérant que le DM a un effet indépendant sur la destruction des tissus parodontaux (Um et al., 2010).
L'augmentation de la susceptibilité à la maladie parodontale est liée à une altération des activités des leucocytes. Une défaillance au niveau du chimiotactisme, de l'adhésion et de la phagocytose des leucocytes est à l’origine d’une réduction de la résistance de l’hôte (Cutler et al., 1991).
Dans une étude, Cutler et collaborateurs (1993) ont mis en évidence un nombre diminué de polymorphonucléaires (PMNs) au niveau sanguin chez les patients atteints de
DM avec une altération des fonctions de phagocytose dirigées contre Porphyromonas
gingivalis.
La relation entre P. gingivalis et le niveau glycémique, chez les patients atteints de DM2 suivant un traitement parodontal, suggère que le niveau glycémique dans le diabète est affecté par la persistance microbienne dans les poches parodontales après le traitement. (Makiura et al., 2008).
Une étude réalisée par culture microbienne, a vérifié, au cours d’une période de 3 ans, l'état parodontal de 16 patients avec DM par rapport à 16 patients en bonne santé. L’analyse par la technique de culture des échantillons prélevés de deux sites a montré une absence sur la différence statistiquement significative dans les paramètres cliniques entre les deux groupes, mais une augmentation de Prevotella intermedia, P. gingivalis et Capnocytophaga
spp dans le groupe desdiabétiques (Sbordone et al., 1998).
Une étude réalisée par la technique de microscopie, a montré la présence de cocci et de spirochètes chez 47 patients diabétiques, dont 26 avaient un diabète mal contrôlé et 21 avec diabète bien contrôlé. Cent seize (116) échantillons ont été évalués dans 55 sites sains et 51 poches parodontales. Selon les résultats, le pourcentage de spirochètes chez les patients atteints de problèmes parodontaux avec un diabète mal contrôlé est beaucoup plus élevé que chez le groupe de patients sans problèmes parodontaux avec un diabète mal contrôlé. D’autres réductions moyennes des cocci ont été trouvés chez des sujets atteints de maladies parodontales et ayant un diabète bien contrôlé (Seppaa et Ainamo, 1996).
Des évidences à l'appui de la plausibilité biologique du concept de l'infection parodontale qui affecte le contrôle de la glycémie chez les personnes atteintes de diabète sont tirées d'études sur la relation entre la résistance à l'insuline et la réponse inflammatoire (Taylor, 2003). Cependant, des études épidémiologiques ont démontré que le DM2 peut être prédictif de maladies parodontales lorsque la condition systémique est mal contrôlée (Ryan et al., 2003).
Une étude de Fernandes et collaborateurs (2009) a évalué l'association entre le contrôle glycémique et les différents niveaux de progression de la maladie parodontale chez les Afro-Américains avec DM2.
Le rôle de la maladie parodontale comme facteur de complication dans la sévérité du diabète indique systématiquement que les individus atteints de parodontite sévère ont plus de complications du diabète par rapport à ceux qui ne sont pas atteints de parodontite ou atteint de parodontite légère, suggérant ainsi que la parodontite sévère confère un risque important pour ces complications.
En terme de gestion des maladies parodontales, il est maintenant clairement reconnu que les patients diabétiques ayant un mauvais contrôle de la glycémie sont exposés à un risque accru de progression de la maladie, et que le diabète doit être considéré comme un facteur de risque de parodontite (Preshaw et al., 2007).
1.1 Maladies parodontales
1.1.0 Considérations générales
La parodontite est une maladie inflammatoire d'origine bactérienne qui attaque les tissus de support de la dent et est causée par des groupes spécifiques de micro-organismes et par la réponse immune destructrice de l’hôte. Ces facteurs étiologiques provoquent une destruction progressive du ligament parodontal et de l'os alvéolaire et conduisent à la formation d'une poche parodontale et d'une récession gingivale (Jeffcoat et Reddy, 1991; Listgarten, 1986).
La parodontite est une maladie où l’évolution peut être différente d’un individu à l’autre. Les facteurs personnels et systémiques de cette maladie comprennent l’agent bactérien, les choix de style de vie, les composantes systémiques comme le diabète et les facteurs psychosociaux, l’ensemble étant influencé par l’environnement social de l’individu.
Le passage d’une flore saine à une flore pathogène est à l’origine du déclenchement de la maladie parodontale. Cette infection est la conséquence d’un déséquilibre chez l’hôte et plus précisément d’une modification des conditions environnementales buccales, d’une diminution de la proportion des bactéries bénéfiques et d’une diminution de l’efficacité du
système immunitaire de l’hôte. Toutes les formes de parodontites sont dépendantes des mécanismes d’action de l’hôte.
L'exposition au saccharose dans un environnement buccal entraîne de profonds changements dans le développement de l'organisation de la composition microbienne. L'augmentation des niveaux de bactéries spécifiques en réponse au saccharose pourrait être caractéristique des organismes particulièrement importants dans les maladies buccales (Sissons et al., 2007).
La maladie parodontale est simultanément responsable de la mobilité dentaire et de la perte de la dent chez l’humain (grande majorité des cas) car elle est caractérisée par une initiative indolore et chronique, qui s’amplifie de façon constante et sans symptôme. Elle est souvent diagnostiquée dans les dernières étapes lors de l’atteinte des poches profondes et l’apparition de la mobilité dentaire (Albandar et al., 2000).
1.1.2 Classification et diagnostic
Les maladies parodontales sont parmi les infections chroniques les plus fréquemment rencontrées dans la population adulte avec une prévalence d’environ 80% chez les populations adultes occidentales (Doucet et Lowenstein, 2006).
Les classifications des maladies parodontales sont nécessaires pour établir le diagnostic et ajuster les traitements à chaque patient. En 1999, l'Académie Américaine de parodontologie (AAP) a présenté un nouveau consensus sur leur classification, mais encore aujourd’hui, les facteurs étiologiques ne sont pas pleinement connus ce qui rend le pronostic difficile et nécessite des études plus approfondies.
Le rapport de l’AAP de 1999 a classifié les différentes maladies parodontales en huit catégories (tableau n°1). Cette classification reconnaît l’effet des maladies systémiques sur la santé parodontale, facilite la classification des patients dans des catégories plus appropriées et diminue le chevauchement existant entre les catégories (Wiebe et Putnins, 2000).
Tableau 1 : Classification des maladies parodontales révisée en 1999 par l’Académie Américaine de Parodontologie (AAP).
PAC : perte d’attache clinique. Tiré de Wiebe et Putnins, (2000).
I. Maladies gingivales
A. Maladies gingivales induites par la plaque B. Maladies gingivales non induites par la plaque
II. Parodontite chronique
(légère : 1-2 mm PAC ; modérée : 3-4 PAC; sévère : > 5 mm PAC) A. Localisée
B. Généralisée (affectés > 30% des sites)
III. Parodontite agressive
(légère : 1-2 mm PAC ; modérée : 3-4 PAC; sévère : > 5 mm PAC) A. Localisée
B. Généralisée (affectés > 30% des sites)
IV. Parodontites associées aux maladies systémiques
A. Association aux désordres hématologiques B. Association aux désordres génétiques C. Association non spécifiée
V. Maladies parodontales nécrotiques
A. Gingivite ulcéro-nécrotique B. Parodontite ulcéro-nécrotique
VI. Abcès du parodonte
A. Abcès gingival B. Abcès parodontal C. Abcès péri-coronaire
VII. Lésions endodontiques-parodontales
Le diagnostic de la parodontite repose principalement sur les caractéristiques cliniques, bien que des différences au niveau de la composition de la flore sous gingivale puissent être observées. La parodontite non traitée se manifeste d'une part par des saignements au sondage, par une augmentation de la mobilité dentaire, par un déplacement dentaire et finalement par une exfoliation de la dent (The American Academy of
Periodontology, 1999).
1.1.3. Étiologie
La maladie parodontale est le résultat d'un déséquilibre entre le biofilm microbien associé aux surfaces dentaires et la réponse immunitaire de l’hôte, corrélé avec plusieurs facteurs de prédisposition tels que des facteurs iatrogéniques, malocclusion, complications associées aux traitements orthodontiques, mauvaises habitudes et thérapie avec des radiations.
Cette colonisation microbienne, sous la forme de biofilm (Socransky et Haffajee, 2005) est aussi définie comme une matrice de populations bactériennes qui adhèrent les unes aux autres et/ou à des surfaces ou interfaces inorganiques (Costerton et al., 1994), composées à 25% d’aggloméré extra cellulaire organique (polysaccharides, glycoprotéines et lipides) (Jin et Yip, 2002), qui sont des dérivés de la salive et des produits bactériens (Schupbach et al., 2001; Ramberg et al., 2003) et le restant à 75% de bactéries comme
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas intermedia, Streptococcus intermedius, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Tannerella forsythia, Treponema denticola et des espèces du genre Eubacterium.
Le biofilm, c’est une structure appropriée pour la croissance de la plupart des espèces bactériennes. La formation de biofilm sert de protection contre l'invasion des microorganismes compétitifs, contre les molécules et les cellules du système de défense de l'hôte, et contre les molécules antimicrobiennes exogènes (antibiotiques) (Fux et al., 2005).
D’autre part, le biofilm facilite l'absorption des nutriments et l'évacuation des produits métaboliques. Ces caractéristiques créent un environnement adéquat pour les espèces microbiennes (Ramberg et al., 2003; Socransky et Haffajee, 2002).
La formation du biofilm dentaire débute par le dépôt sur la surface dentaire d'une pellicule salivaire qui sert en principe de protection contre l'usure dentaire et la diffusion d'acide dans l'émail (Christersson et Genco, 1990; Ramberg et al., 2003; Manson et al., 2000). Cette couche de 0,5 à 1 µm (Christersson et Genco, 1990) est constituée essentiellement de glycoprotéines salivaires et adhère fermement à la surface dentaire par affinité électrostatique. Cependant, en quelques minutes, on peut observer l'adhésion de bactéries dont certaines possèdent des structures d'attache spécifiques, comme les espèces du genre Streptococcus et Actinomyces (Faveri et al., 2008).
Par la suite, il se produit une multiplication de ces bactéries et la formation d'une matrice extracellulaire. Après l'adhésion et la multiplication des Streptococcus et des
Actinomyces sur la pellicule salivaire, plusieurs autres espèces s'ajoutent pour former le
biofilm. Parmi les espèces bactériennes rencontrées dans le biofilm, nous trouvons P.
intermedia, Prevotella loescheii, Capnocytophaga spp., T. denticola, F. nucleatum et P. gingivalis. Ces dernières s'attachent aux autres bactéries par coagrégation (Socransky et
Haffajee, 2002).
Même si la présence de bactéries parodontopathogènes est essentielle à l’initiation de la parodontite, celle-ci n’est pas suffisante pour faire progresser la maladie. En effet, la réponse immunitaire de l’hôte joue également un rôle clé dans l’évolution de la parodontite (Kinane et Lappin, 2001; Okada et Murakami, 1998). Toutefois, la réponse de l’hôte est le facteur clé pour expliquer l'expression de la maladie parodontale (Albandar et Rams, 2002). Les facteurs de risque associés à la maladie parodontale et à sa progression sont l’hygiène buccale inadéquate, le tabagisme, l’immunosuppression, le statut socio-économique bas, un antécédent d’atteinte parodontale, les facteurs génétiques, le dysfonctionnement hormonal, la déficience nutritionnelle sévère, le stress, la flore présente et aussi le diabète.
1.1.4. Mécanismes de l’infection bactérienne
Quatre propriétés ont été attribuées aux microorganismes pour être considérés comme pathogènes: avoir la capacité de coloniser, de se multiplier dans l’environnement en utilisant les sources nutritionnelles disponibles, de contourner les mécanismes de défense de l’hôte et de produire des substances qui peuvent contribuer à la destruction des tissus de l’hôte.
On définit des bactéries comme parodontopathogènes quand leur élimination des sites affectés résulte à une amélioration clinique et par conséquence à la fin de la pathologie.
Certaines bactéries telles que P. gingivalis, sont considérées d’une extrême importance dans la colonisation et la destruction de l'épithélium gingival en raison de leur capacité d’adhésion. Les espèces, A. actinomycetemcomitans et T. forsythia sont également reconnues pour leur capacité à adhérer et envahir l'épithélium buccal (Kaizuka et al., 2003).
L’activité de destruction de ces espèces considérées parodontopathogènes, en raison de leur tendance à envahir le tissu conjonctif et leur persistance au niveau des cellules épithéliales, favorise l'agglutination des érythrocytes et provoque leur lyse, ce qui aboutit à la libération de l'hémoglobine, un élément indispensable à la croissance de ces bactéries (Chandad et Mouton, 1995).
P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans et T. forsythia ont la propriété d’adhérer à
l'épithélium buccal (Kaizuka et al., 2003). A. actinomycetemcomitans possède la caractéristique de traverser l'épithélium de jonction pour pénétrer le tissu conjonctif sous-jacent, subséquemment P. gingivalis peut envahir et persister dans les cellules épithéliales (Holt et Bramanti, 1991).
Ces bactéries provoquent une réaction immune spécifique chez l’hôte, ce qui expose des facteurs de virulence qui collaborent aux manifestations cliniques et leur potentiel maléfique pour le parodonte.
Plus récemment, Rudney et collaborateurs (2005) ont identifié T. forsythia en tant que membre de la flore polymicrobienne envahissant les cellules épithéliales buccales, provenant directement de la cavité buccale. Ils ont suggéré que les cellules épithéliales buccales fournissent un environnement protégé in vivo et constituent un réservoir pour la recolonisation des poches gingivales.
Brièvement, Inagaki et collaborateurs (2006) ont montré dans leur approche de travail sur l'adhésion ceux cellules épithéliales et les capacités d'invasion de T. forsythia et de P.
gingivalis qu’ils peuvent moduler l'adhérence des cellules épithéliales et l'envahissement de
l'hôte. Il a été rapporté dans leurs conclusions qu'il existe une activité d’association avec d'autres bactéries de la flore buccale, et une capacité d'induire la sécrétion de cytokines pro inflammatoires et de chimiokines par les cellules de l’hôte. Ils relatent aussi que la maladie parodontale est le résultat de l’interaction complexe de micro-organismes multiples. Il est essentiel d'étudier les interactions entre les différentes bactéries parodontopathogènes et les cellules épithéliales qui peuvent jouer un rôle dans la virulence par la promotion de l'attachement à la cellule hôte et l'invasion.
Les bactéries à Gram négatif possèdent de nombreux facteurs de virulence : des adhésines, des protéases, des toxines et des vésicules de la membrane bactérienne externe (Henderson et Wilson, 1996). Parmi ces facteurs de virulence, les molécules de type adhésines ou les fimbriae ont la propriété d’aider l'adhérence aux autres bactéries ou aux tissus (Fortunato et al., 1995).
La propriété d'adhérence est une pierre angulaire pour les espèces bactériennes qui forment la plaque dentaire. Plus précisément, la plaque dentaire est un enduit adhésif de coloration blanchâtre et constitué de bactéries associées à des déchets de cellules, de la salive ainsi que des résidus d'aliments, qui vient se déposer à la surface des dents et des gencives.
Partout, la croissance bactérienne est de grande importance pour l’abondance des différentes espèces bactériennes (Darveau et al., 1997). D’autres bactéries, comme par exemple A. actinomycetemcomitans, fabriquent des facteurs qui diminuent la réponse immunitaire guidée contre eux ou contre d’autres bactéries. Aussi
A.actinomycetemcomitans et Campylobacter rectus sécrètent une leucotoxine qui tue les
neutrophiles et perturbe la ligne de défense constituée par les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs).
Ces cellules originelles dans la moelle osseuse sont la principale ligne de défense dans le système immunitaire non spécifique. Les PMNs sont engagés au site d'infection de faire la phagocytose des organismes envahisseurs. En outre, les PMNs contribuent à la
réparation des lésions tissulaires pouvantse produire au cours de l'inflammation (Gendron
et al., 2000).
Des enzymes protéolytiques produites par P. gingivalis attaquent et dégradent directement les anticorps et les composantes du complément, ce qui prévient l'agglomération de ces molécules à sa surface et aussi l’attache des récepteurs des macrophages à la surface cellulaire dans les processus de la phagocytose (Cutler et al., 1993; Schenkein, 1989).
Ces mécanismes permettent à plusieurs bactéries d’occuper les tissus et d'éviter la proximité avec les neutrophiles et les molécules du système immunitaire (Shenker et al., 1990).
Les secrétions originaires du métabolisme bactérien telles que le H2S, le NH3 ou les acides gras sont également dangereux pour les tissus environnants. Les lipopolysaccharides (LPS), composantes de la membrane externe des bactéries à Gram négatif, sont responsables de la sécrétion de certains médiateurs de l'inflammation qui collaborent pour la destruction tissulaire (Fortunato et al., 1995; Holt et Bramanti, 1991).
Même si la présence de bactéries parodontopathogènes est essentielle à l’initiation de la parodontite, celle-ci n’est pas suffisante pour faire progresser la maladie. En effet, la réponse immunitaire de l’hôte joue également un rôle clé dans l’évolution de la parodontite (Kinane et Lappin, 2001; Okada et Murakami, 1998).
Les LPS sont de puissants antigènes qui ont la propriété de stimuler la production de cytokines et de médiateurs de l’inflammation par les monocytes, lymphocytes, fibroblastes, cellules épithéliales et endothéliales.
La présence d’une capsule polysaccharidique chez P. gingivalis, par exemple, accentue sa virulence, car elle fournit un moyen d’éviter les défenses de l’hôte. Cette espèce bactérienne est considérée comme un des pathogènes les plus importants dans une colonisation des sites gingivaux grâce à ses capacités d’adhérer, de pénétrer dans les cellules épithéliales et d’agglutiner des érythrocytes en provoquant leur lyse afin de faciliter l’utilisation de l’hémine. Ce dernier est un élément indispensable à la croissance propre de la bactérie (Chandad et Mouton, 1995).
D’autres bactéries peuvent produire des facteurs qui compromettent la réponse immunitaire dirigée contre eux ou contre d’autres bactéries. Par exemple, A.
actinomycetemcomitans et C. rectus sécrètent une leucotoxine qui tue les neutrophiles
directement et perturbe la ligne de défense de l’hôte. Ce mécanisme permet à plusieurs bactéries d’envahir les tissus et d’éviter le contact avec les neutrophiles et les molécules du système immunitaire (Shenker et al., 1990).
Dans une étude comparative de 40 échantillons de tissus gingivaux, obtenus à partir de 20 patients diabétiques (type 2) et 20 personnes non diabétiques pour une évaluation quantitative des immunoglobulines G, A et M du tissu gingival, il a été constaté que les niveaux d'IgG et IgA dans les tissus des sujets diabétiques atteints de parodontite étaient significativement plus élevés que ceux des sujets sains et non diabétiques(Anil, 2006).
Ces résultats appuient l'idée que la réponse immunitaire humorale joue un rôle important dans la pathogenèse de la maladie parodontale chez les diabétiques pour qu’il y ait diminution de la réponse immunitaire et une susceptibilité accrue aux infections.
1.2 Diversité microbienne du biofilm buccal
Il n’est pas clair qu’une altération de la flore microbienne contribue à une plus grande incidence et à une augmentation de la sévérité de l’infection parodontale chez des patients diabétiques. Il existe des études qui ont montré que des individus ayant un mauvais contrôle de la glycémie peuvent présenter une maladie parodontale et une perte osseuse plus rapide. Le déséquilibre du métabolisme du glucose crée un environnement favorable à la formation du biofilm, ce qui provoque un changement important et un déséquilibre de la flore microbienne.
Le rôle du biofilm comme un des facteurs étiologiques de la maladie parodontale est bien établi dans la littérature (Offenbacher et al., 2007). Le biofilm comprend des populations microbiennes qui adhèrent entre elles ou à des surfaces et baignent dans une matrice extracellulaire (Lamont et Jenkinson, 2000). À l’intérieur du biofilm, il existe un système circulatoire aqueux primitif qui facilite l’apport en nutriments et permet l’évacuation des déchets métaboliques. Les interactions bactériennes existant à l’intérieur du biofilm sont nombreuses et contribuent à l’équilibre de la microflore (Tian et al., 2010).
Pour les mêmes raisons, la composition de la microflore varie selon les sites anatomiques d'une dent et les conditions environnementales locales. La microflore résidente d'un site peut être bénéfique à l'hôte en prévenant la colonisation par des micro-organismes exogènes souvent pathogènes; mais peut aussi être environnement favorable aux microorganismes parodontopathogènes. Aujourd’hui, plus de 700 espèces bactériennes différentes ont été décrites dans la littérature comme colonisateurs de la cavité buccale (Kumar et al., 2005).
La construction de biofilm est facilitée par les bactéries qui produisent des polymères extracellulaires, lesquels renforcent la cohésion de l'ensemble. La plaque mature dépend du maintien de l’équilibre entre les différentes espèces, avec leurs interactions métaboliques et leurs différentes chaînes alimentaires. Le maintien de l'homéostasie microbienne dans une population augmente avec sa diversité. Cette diversité augmente avec le développement des chaînes alimentaires entre les espèces et l'apparition de stratégies métaboliques complémentaires pour le catabolisme des nutriments endogènes (Christopher et al., 2010).
L'antagonisme est aussi un mécanisme déterminant dans cette homéostasie. Les bactériocines et leurs sécrétions sont produits par de nombreux genres parmi les bactéries buccales. Des acides organiques et des enzymes peuvent aussi exercer un effet inhibiteur. La population du biofilm se maintient globalement en équilibre mais les proportions des différentes espèces peuvent évoluer en cas de modifications des conditions de l'environnement (Arweiler et al., 2004). Le biofilm peut même assurer une protection des micro-organismes contre les mécanismes de défense de l’hôte.
Il assure une protection de défense contre l'agression des microorganismes compétitifs, contre les molécules médicamenteuses (antibiotiques) et les cellules du système de défense chez l'hôte (Fux et al., 2005).
D'autre part, le biofilm facilite l’apport en nutriments et l'expulsion de résidus métaboliques nocifs les bactéries du biofilm. Ces caractéristiques créent un environnement idéal pour des espèces microbiennes (Ramberg et al., 2003; Socransky et Haffajee, 2002).
Certaines études ont spécifiquement associé des microorganismes parodontopathogènes à des patients atteints de la maladie parodontale et de diabète. Il a été rapporté que la microflore chez les sujets diabétiques est composée principalement des
bactéries A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, C. rectus et chez certaines populations on peut retrouver les espèces P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia et Fusobacterium
nucleatum (Seppaa et Ainamo, 1996).
1.2.1 Classification bactérienne selon Socransky
Le regroupement des bactéries dans un biofilm n'est pas laissé au hasard. La complexité de la microflore sous gingivale a été reconnu depuis le premier examen microscopique de cet écosystème par Van Leeuwenhoek en 1683 (Tal, 1980). Depuis cette époque, de nombreuses études ont évalué la composition du biofilm, en utilisant diverses techniques de recherche. Selon Van Leeuwenhoek, le biofilm sous gingival est composé d'un grand mélange complexe d’espèces bactériennes.
Une série d’échantillons de biofilms a suggéré qu'il y avait un ordre dans le microbiote qui colonise les poches parodontales. Grâce à des techniques moléculaires, il a été possible d’observer l’ordre incroyable dans les modèles de la colonisation.
Socransky et collaborateurs (1998) ont défini une norme en respectant des techniques moléculaires où ils ont partagé certaines espèces par couleur (figure n°1) de telle manière qu’elles étaient associées de façon spécifique (coaggrégation et par groupes parodontopathogènes) en six groupes.
Il y a le complexe bleu (espèces du genre Actinomyces), le complexe jaune qui comprend les streptocoques, le complexe vert qui centralise les espèces Capnocytophaga, A. actinomycetemcomitans, E. corrodens ainsi que Campylobacter concisus, et le complexe violet qui regroupe V. parvula et Actinomyces odontolyticus. Le complexe orange lie les bactéries à gram-négatifs qui comprend Campylobacter gracilis, C. rectus, C. showae, E.
nodatum, les sous-espèces F. nucleatum, F. periodonticum, P. micros, P. intermedia, P. nigrescens et S. constellatus. Et pour finir, le complexe rouge est constitué de T. forsythia, P. gingivalis et T. denticola.
Figure 1: Séquence de colonisation des complexes de biofilms supra gingivaux de la plaque.
Base - Complexe formé par les couleurs jaune, vert, violet et bleu: colonisateurs primaires, principalement à Gram positif et anaérobies facultatives. Complexe Orange: première et les plus anaérobies à gram négatives. Complexe Rouge: anaérobies gram négatives et les spirochètes (Anonyme. 2012a).
1.2.2 Maladies parodontales chez les patients atteints de diabète
1.2.2.1 Modifications vasculaires
Le contact prolongé à l’hyperglycémie est le facteur étiologique majeur à l’origine des variations vasculaires qui se manifestent lors du diabète. En conséquence, l’élévation chronique du degré de glucose sanguin résultera en la formation de substrats finaux de glycosylation. Ces derniers coïncident à une classe hétérogène de protéines glycosilées et de lipides retrouvés au niveau du plasma et des tissus vasculaires (Stolar et al., 2008).
Un étude Salvi et collaborateurs (1997) a rapporté que des modifications structurelles indispensables consistent en une glycosylation du collagène de type 1 posé au niveau de la membrane basale de la paroi vasculaire, ce qui va conduire à l'amplification de la rigidité des vaisseaux sanguins et donc l’altération du passage des leucocytes, de la distribution d’oxygène et des dégâts métaboliques. En conséquence, une tension oxydative s’installe avec peroxydation lipidique et sécrétion de cytokines proinflammatoires contribuant à la destruction parodontale.
1.2.2.2 Évolution de la réponse chez l’hôte
L'amplification de susceptibilité à la maladie parodontale est due à un changement des fonctions des leucocytes : un déséquilibre au niveau chimiotactique, de l’adhérence et la phagocytose des leucocytes sont à l’origine d’une diminution de la résistance de l’hôte (Cutler et al., 1993).
D’autre part, le déséquilibre du métabolisme lipidique dû au diabète et l’élévation des lipides sanguins modifient significativement la fonction de phagocytose des PMN.
Une autre étude a exposé que la prostaglandine E2 est considérée comme un inhibiteur des lymphocytes producteurs d’anticorps (Salvi et al., 1997).
De ce fait, nous pouvons conclure que la maladie DM a comme résultat une dérégulation métabolique pouvant augmenter la sévérité de la maladie parodontale (Salvi
et al., 1997).
1.2.2.3 Changement du comportement de l’activité tissulaire
Le collagène de type 1 représente l’élément primordial de la matrice extracellulaire, du ligament parodontal, du tissu gingival et de l’os alvéolaire. L’hyperglycémie produit une réduction de l’activité mitotique des fibroblastes avec l'amplification de l’activité de la collagénase.
Ensuite, il y a production de composants de la matrice osseuse, comme la synthèse du collagène par les fibroblastes du tissu gingival et du ligament parodontal. Le collagène de type 1 va rester bloqué ce qui, par conséquence, aura une modification de la cicatrisation parodontale, (rôle capital du collagène durant cette étape) subséquemment d’une aggravation de la sévérité de la maladie parodontale.
1.2.2.4 Excitation de la réponse inflammatoire
Une inflammation exagérée des monocytes en réponse à une stimulation par le lipopolysaccharide bactérien a été relevée chez les patients diabétiques. La réponse se déclare par une sécrétion augmentée des médiateurs proinflammatoires: l’interleukine 1β, la prostaglandine E2 et le TNF, coupables d’une amplification de la dévastation parodontale.
Dans une étude réalisée chez des rats, Doxey et collaborateurs (1998) a démontré un taux gingival élevé des IL-1β sécrétés par les macrophages, et cela en présence de diabète et de parodontite.
1.3 Techniques de biologie moléculaire utilisées pour
les études de la diversité microbienne
Les techniques basées sur la culture bactériennes sont d’une grande importance, mais ont des limitations pour l’identification de la spécificité de certaines espèces de microorganismes (Armitage et Cullinan, 2010; Paster et al., 2006; Papapanou, 2002).
Il a été estimé qu’entre 50-60% des bactéries présentes dans la cavité buccale ont été cultivées jusqu'à présent (Armitage, 2010). Pour compléter les connaissances sur ce microbiote buccal, en particulier la flore microbienne sous gingivale, il est nécessaire d’utiliser des techniques d'identification indépendantes de la culture.
Malgré leurs limites, les techniques biomoléculaires ont l'avantage de détecter des espèces qui sont difficiles à cultiver comme par exemple les spirochètes, ou qui ne sont pas cultivables.
Les techniques biomoléculaires ont démontré un grand potentiel pour des études qualitatives et comparatives de la composition des niches microbiennes dans la cavité buccale.
Le modèle principal dans la recherche biomoléculaire de la diversité microbienne est l'amplification de l'ARNr 16S (16SrDNA), le clonage des ADNs dans Escherichia coli et le séquençage des ces clones.
1.3.1 L’analyse ribosomique 16S
Le clonage du gène de l'ARN 16S clone a été utilisé pour la première fois en 1994 pour déterminer la diversité génétique des spirochètes cultivables et non cultivables dans les fluides gingivaux des patients atteints de parodontite sévère (Choi et al., 1994; Sakamoto et al., 2005).
Des approches à l’analyse ribosomique sont maintenant disponibles. Il s’agit de méthodes basées sur la biologie moléculaire qui se servent de l’étude des séquences des gènes conservés de l’ADN bactérien 16S, ce qui permet de décrire la biodiversité d’un milieu sans avoir recours à la culture. Elles permettent une description exhaustive et la quantification de la biomasse microbienne dans divers environnements, et permettent aussi d'obtenir des informations sur la variabilité et sur les relations phylogénétiques, ce qui pourrait conduire à la description de bactéries jamais décrites par les méthodes de culture.
Si la culture sous-estime la concentration des microorganismes dans la cavité buccale, elle a également un impact sur l’évaluation de la biodiversité microbienne. Le choix du milieu de culture, les stress subis par les microorganismes lors du changement
d’environnement ainsi que ceux qui leurs sont imposés lors de l’échantillonnage diminuent de façon substantielle le taux de recouvrement des microorganismes par culture.
La technique de clonage est basée sur l’amplification des échantillons d'un gène cible, en préservant son identité génétique, et l'insertion dans un vecteur, un fragment d’ADN capable de se multiplier à l'intérieur d'un plasmide bactérien, exactement au milieu de la portion du gène responsable de la synthèse de l'enzyme lactase dans la bactérie E. coli.
Cette technique permet de mieux comprendre la composition du mélange des communautés microbiennes présentes sur le plan médical. Les bactéries de la cavité buccale ont été un des principaux centres d’intérêt pour cette technique (Kroes et al., 1999; Paster et al., 2006; Rolph et al., 2001; Sakamoto et al., 2006; Socransky et al., 1994; Tanner et al., 1994).
Wu et collaborateurs (2010) ont réalisé leurs travaux scientifiques à travers la technique 16S sur la microflore intestinale qui a été récemment proposée comme un facteur responsable de l'environnement pour le contrôle du poids corporel et le métabolisme énergétique, qui est étroitement lié à l'obésité et les maladies métaboliques telles que le diabète de type 2. Ils ont proposé que la composition du microbiote intestinal a été impliquée dans la régulation de l'homéostasie énergétique et que l'abondance relative des 2 phyllos bactériennes prédominantes (Bacteroidetes et Firmicutes) dans l'intestin distal était liée à l'obésité chez les humains.
Le travail de Sakamoto et collaborateurs (2006) a utilisé ces méthodes pour comparer les espèces bactériennes et les phylotypes dans la salive d’un sujet sain et de deux sujets avec parodontite. L’analyse de séquences de 186 clones a révélé que la diversité bactérienne des infections est plus grande que précédemment décrite par des méthodes de culture et que la structure de la flore diffère sensiblement entre les infections asymptomatiques et symptomatiques.
Dans une étude de Lillo et collaborateurs (2006), trois différents types d’amorces ont été utilisées pour comparer la microflore bactérienne dans la plaque supra gingivale en utilisant la technique PCR et le clonage de l’ARN 16S. Cette méthode a permis l'identification de 38 nouveaux phylotypes bactériens. Des études additionnelles sont nécessaires pour confirmer le rôle de ces espèces dans la pathogenèse de la maladie parodontale.
L'analyse des séquences nucléotidiques de gènes ribosomiques est actuellement la pierre angulaire de la méthodologie d'identification, la phylogénie et la taxonomie des bactéries (Weisburg et al., 1991; Ludwig et Schleifer, 1994; Drancourt et al., 2000).
Utilisées surtout en recherche buccale, les techniques moléculaires indépendantes de la culture et basées sur l'analyse de l'ADN ribosomal 16S doivent être un outil fiable pour la détermination de la diversité bactérienne (Kroes et al., 1999; Rolph et al., 2001).
Cette méthodologie, par exemple, a conduit à la détection de 215 nouvelles espèces dans la plaque supra gingivale (Paster et al., 2001), 47 nouvelles espèces du genre
Treponema dans des poches parodontales (Dewhirst et al., 2000), 14 nouvelles espèces des
genres Bacteroides et Firmicutes en lien avec la parodontite (Hutter et al., 2003) et 27 nouvelles espèces colonisant les canaux radiculaires (Munson et al., 2002).
1.4 Pertinence du projet
Il est bien établi que près de 5% à 15% de la population adulte souffre de parodontite et que le DM est l'une des maladies les plus fréquentes au Canada et ailleurs dans le monde. L'ampleur du besoin de nouvelles initiatives de recherche et des interventions cliniques pour le diabète et les infections associées est très évidente et va en parallèle avec l'augmentation des dépenses médicales et les médicaments (Janket et al., 2008; Southerland
et al., 2006).
Environ deux millions de Canadiens sont diabétiques et un tiers des personnes touchées ignorent leur condition. On estime à 11 milliards de dollars les coûts engendrés par le diabète au Canada (Anonyme 2012b). On prévoit que la prévalence du DM type 2 augmentera de presque 50% d'ici l'an 2030. En plus d'une charge financière, les patients atteints de diabète sont également exposés à un risque plus élevé de décès prématuré lié à des maladies vasculaires comme les maladies coronariennes, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies vasculaires périphériques (Janket et al., 2008; Southerland et al., 2006).
Il est estimé à près de 550 000, le nombre de personnes diabétiques au Québec. De ce nombre, environ 225 000 personnes sous-estiment leur état. L'Organisation Mondiale de la
Santé prévoit que le nombre de personnes diabétiques doublera d'ici l'an 2025, faisant du diabète la nouvelle épidémie (Anonyme 2012c).
Le fardeau économique et social du diabète est énorme. Il est estimé à près de 2 milliards de dollars par année, en coûts directs et indirects à l’ensemble de la société québécoise (Anonyme 2012c).
Dans cette étude, la connaissance de la biodiversité bactérienne peut fournir une analyse plus approfondie de cette relation hôte-bactéries qui nous conduira à l'avenir vers des études plus spécifiques des bactéries qui se trouvent dans le biofilm buccal, ce qui peut augmenter le succès clinique dans le traitement de la maladie parodontale et par conséquent, réduire le ratio entre eux.
1.5 Hypothèses de travail
Les études récentes utilisant des techniques basées sur la biologie moléculaire et l'analyse de l’ADNr 16S ont changé le paradigme microbien de la cavité buccale, qui est maintenant estimé à plus de 700 espèces bactériennes.
Ces méthodes ont été utilisées de manière préliminaire dans l’étude de la microbiologie parodontale, mais n’ont pas encore été appliquées, jusqu'à présent à l’étude du biofilm sous gingival de patients diabétiques, ce qui nous amène à proposer le présent projet.
Cette étude permettra de tester et comparer dans la littérature scientifique, l’hypothèse que la diversité microbienne dans les sites atteints de maladie parodontale chez les patients diabétiques peut être différente en comparaison avec des patients non diabétiques.
1.6 But et objectifs du projet
L’étude que nous proposons est d’explorer et d’évaluer le profil génétique des communautés bactériennes et sa diversité en utilisant la technique d’analyse clonale du gène de l'ARNr 16S (fig. n°2 et n°3) dans les poches parodontales profondes caractérisée par PS ≥ 6 mm et ceux peu profondes, considérées comme sites sains ( 3mm).
Ainsi, compte tenu de l'importance de l’association entre le DM et les maladies parodontales, notre objectif principal est d’étudier la façon dont le diabète affecte les interactions hôte-bactéries en mettant l'accent sur la diversité microbienne dans les poches parodontales profondes et peu profondes chez des sujets atteints de parodontite en utilisant des techniques bien décrites dans la littérature.
L’application de la technique moléculaire indépendante de la culture basée sur l'analyse de l'ADN ribosomal 16S peut nous aider à déterminer s’il existe de nouvelles espèces microbiennes associées à la sévérité de la maladie parodontale chez les patients diabétiques.
Figure 2. Technique de clonage: extraction, amplification, liaison et insertion.
Illustration de la technique de laboratoire partie 1. Extraction de l’ADN (pour la technique d’extraction) et amplification de l’ADN par la technique du PCR. Une fois les ADN(s) isolés, ils seront introduits dans le vecteur (plasmide) et ensuite ils seront laissés pour la croissance en milieu avec antibiotique sélective et X- gal dans les boites de pétri.
Figure 3. Clonage, extraction et séquençage.
Illustration de la technique de laboratoire partie 2. Après la croissance des colonies, des bactéries seront choisies par hasard et inoculées dans le milieu liquide (Luria Bertani et antibiotique) pour une multiplication. Une fois multipliées, les ADN seront isolés par une technique d’extraction et analysé par une étude de séquençage.
2.0 Procédures cliniques
2.0.1 Prélèvements et ses critères
Pour la réalisation de cette étude, des échantillons de biofilm sous - gingival ont été prélevés chez des patients diabétiques, en respectant les normes du comité d’éthique de la recherche clinique, dont le consentement éclairé des patients. Un total de 12 sujets (patients diagnostiqués pour le diabète de type deux avec des poches parodontales établies comme profondes et d’autres peu profondes) ont été recrutés après un examen de dépistage, une revue de leurs historiques médicaux et dentaires et suite à une évaluation intra orale et radiographique.
Les critères d’inclusion pour les sujets atteints de parodontite avec poches parodontales profondes étaient les suivants: les personnes devaient présenter au moins vingt dents naturelles, avec au moins huit dents non contiguës différentes de celles des premières molaires et des incisives et avec un site de plus de 7 mm de profondeur au sondage.
Le saignement lors du sondage et la perte osseuse radiographique faisait aussi partie des critères bien définis.
Nous avons inclus les personnes des deux sexes, âges entre 30 et 65 ans, ne souffrant pas de maladie systémique autre que le DM2, non-fumeurs, non porteurs de prothèses dentaires ni d’appareils orthodontiques, pas de femmes enceintes ou en période d’allaitement, pas d’antécédents d’utilisation d’antibiothérapie et/ou traitement parodontal au cours des six derniers mois avant le prélèvement.
Le site désigné comme poche parodontale peu profonde (site sain) présentait moins de 3 mm de perte d'attache clinique, pas de poche parodontale, sans suppuration, pas de saignement au sondage et sans perte osseuse alvéolaire identifiée par les radiographies.
Dans une deuxième visite, au moment de la collecte, le prélèvement a été fait sur les sites cibles et la plaque supra-gingivale a été soigneusement retirée à l'aide d'un bandage pour éviter la contamination de l'échantillon sous gingival. Puis, deux cônes de papier absorbant ont été placés pendant 30 secondes dans le site pour récolter la plaque sous gingivale parodontale. Les cônes ont été immédiatement transférés dans des microtubes contenant 300 µl de tampon TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) et transportés au laboratoire de microbiologie et d'immunologie de la Faculté de médecine dentaire de l’Université Laval. Ensuite, chaque tube contenant les cônes de papier a été agité dans un mélangeur (vortex) pendant une minute. Les échantillons ont été congelés à -20°C pour les expériences d'extraction et de clonage de l’ADN.
Tous les paramètres cliniques ont été compilés dans une base de données jusqu’à la fin de l’étude.
2.0.2 Procédures de laboratoire
Les paramètres cliniques ont été mesurés une semaine précédant le prélèvement des échantillons. La mesure de la profondeur au sondage a été effectuée par un seul examinateur, avec le sondage de six sites par dent (mésial-buccal, mi-buccal, bucco distale, distale-lingual, mi-lingual, et mésial-lingual) à l’exception des troisièmes molaires.
2.0.3 Extraction de l'ADN
La purification de l'ADN à partir des échantillons cliniques des poches parodontales (24 échantillons initiaux) a été effectuée selon le protocole décrit par Saito et collaborateurs (2006).
Les échantillons ont été conservés dans l'eau du bain-marie à 37°C pendant dix minutes, puis agités pendant 30 secondes sur un mélangeur (vortex). Ensuite, les cônes de papier ont été retirés des microtubes. Les cellules bactériennes ont été précipitées par centrifugation à 20 000 rpm, pendant 10 minutes et les culots conservés à -80°C.
Pour l’extraction, 650 μl de tampon d'extraction ont été ajoutés aux échantillons (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8.0, 100 μg/ml de protéinase K), maintenu à 65°C pendant 30 minutes, émulsionnés avec 650 µl de chloroforme: alcool isoamylique (24:1) par les mouvements d'inversion et centrifugés à 12 000 rpm à 4°C pendant 7 minutes. La partie supérieure de la phase aqueuse a été transférée dans de nouveaux microtubes contenant 200 μl de tampon d'extraction (sans protéinase K) et 650 μl de chloroforme: alcool isoamylique (CIA) (24:1) et centrifugés à 12000 rpm à 4°C pendant 7 minutes.
Cette dernière étape a été répétée deux fois. Ensuite, l'ADN a été précipité avec un volume d’isopropanol froid, centrifugé à 12 000 rpm à 4°C pendant 7 minutes, lavé avec de l'éthanol à 70 %, centrifugé à 12 000 rpm à 4°C pendant 7 minutes, séché à température ambiante et les culots ont été resuspendus dans un tampon TE (10 mM Tris - HCL, 0,1 mM EDTA, pH 7,5). Les échantillons ont été par la suite traités en ajoutant la ribonucléase (10 μg/ml) à 37°C pendant 30 minutes. Nos échantillons d’ADN ont été conservés à -20°C jusqu’à leur future utilisation.
2.0.4 Amplification de l'ADNr 16S par PCR
La technique d’amplification de l’ADNr par PCR consiste en l’amplification du gène de l'ARN 16S extrait du biofilm sous gingival en utilisant une paire d’amorces universelles 27F et 1492R (de Lillo et al., 2006), (tableau n°2).
Tous les échantillons d’ADN extraits des poches profondes et des poches peu profondes ont été amplifiés par la technique d’amplification en chaîne de la polymérase.
Un l d'ADN a été ajouté au mélange réactionnel (volume final de 25 µl) contenant 2,5 µl de tampon (10X), 0,5 µl de DNTPs à 12.5 mM, 0,5 µl de chaque amorce, 1,25 µl de MgCl2 et 0,125 µl de Taq Polymerase (Invitrogen™, Canada).
L’amplification a été effectuée dans les conditions suivantes: la première étape à 94°C pendant 8 minutes, la dénaturation à 95°C pendant 45 secondes, 60°C pendant 45 secondes pour l’hybridation et l’élongation à 72°C pendant 1 minute et 30 secondes. Après 30 cycles d'amplification une dernière étape de 10 minutes à 72°C a été ajoutée. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du QiaQuik PCR purification kit® (Qiagen™, CA,) en suivant les instructions du manufacturier.
Tableau 2. Amorces pour la technique de PCR.
Les amorces et séquences nucléotidiques ont été conformément décrites par de Lillo et collaborateurs (2006).
Amorce Séquence nucléotidique
27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’
R1492 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’
2.0.5 Préparation et électrophorèse sur gel d’agarose Le gel non polymérisé, encore en liquide dans une bécher, a été versé entre deux plaques dans l'appareil d’électrophorèse pour la distribution de son gradient avec un peigne de 36 puits placé entre les plaques pour le dépôt des échantillons. La polymérisation a eu lieu dans les 45 minutes suivantes.
L'appareil a été mis en place correctement selon le manuel du fabricant. Les gels ont été placés dans le réservoir de l'électrophorèse et le module de contrôle et de la température ajusté à 60°C, 96 volts pendant 60 minutes.
2.0.6 Clonage et transformation du fragment cible dans le plasmide de la bactérie Escherichia coli
Les fragments issus de la PCR ont été clonés dans la bactérie réceptrice E. coli en utilisant une trousse de clonage commerciale (TOPO TA cloning kit®, Invitrogen™, San Diego, CA, USA) en observant la procédure établie par le manufacturier.
Brièvement, les cellules d’E.coli compétentes du TOP TA ont été laissées au repos sur la glace pendant 10 minutes. Ensuite, 2 µl du vecteur TOPO 10® (Qiagen™, Canada) a été ajoutés dans un flacon de cellules et mélangé délicatement, suivi d’une incubation sur glace pendant 5 à 30 minutes. Aussitôt après, un choc thermique a été réalisé sur les cellules pendant 30 secondes à 42°C. Par la suite, 250 µl de SOC moyenne (2 % Tryptone, 0,5 % d’extrait de levures, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 nM MgCl2, 10 nM MgSO4 et 20 mM de glucose), à fourni par le fabricant, ont été ajoutés au mélange réactionnel à température ambiante et le tube a été bien agité (horizontalement) 200 fois par minute à 37°C pendant 1 heure.
Les cultures ont été réparties dans des boîtes de Pétri contenant le milieu Luria-Bertani Agar à 37°C (Difco™, Canada), additionnées de 0,27 mM d'ampicilline et incubées pendant toute une nuit. Les colonies ont par la suite été sélectionnées pour la présence d'un insert avec le réactif X-Gal (5-brome-4-chlore-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside, 20 mg/ml). La présence de colonies blanches confirmant l’insertion des fragments d’ADN cibles ont été resuspendues dans des tubes à essai contenant le bouillon Luria-Bertani (LB) supplémenté de 0,27 mM d’ampicilline et incubées à 37ºC pendant 16 heures.
2.0.7 Extraction du plasmide
Les plasmides ont été récupérés en utilisant le système QIAprep miniprep Spin® (Qiagen™, Canada) selon les instructions du fabricant. Les microtubes contenant l’inoculum dans le milieu LB avec ampicilline ont été centrifugés pendant 3 minutes à 8000 rpm par minute à 15°C. Les cutots de bactéries ont été suspendus et précipités dans 250 µl
de tampon P1 (fourni par le fabricant) avant l’ajout de 250 µl de tampon P2 (fourni par le fabricant). Les tubes ont été retournés délicatement pour mélanger leurs contenus. Puis, 350 µl de tampon PE ont été ajoutés (fourni par le fabricant) et les échantillons ont été centrifugé pendant 60 secondes. L'ADN a été élué en ajoutant 30 µl de tampon Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 fourni dans le kit, suivi d'une incubation d’une minute et d’une centrifugation pendant une minute. La concentration de plasmide a été estimée par spectrophotométrie. Les extraits de plasmides (10 ml à 50 ng/ml) ont ensuite été envoyés pour le séquençage.
2.0.8 Analyse partielle de séquences
Pour l’analyse de notre ADN cloné et purifié, nous avons utilisé des amorces M13-20 direct et M13-20 inverse. Le service de séquençage a été réalisé par le Centre de Recherche du CHUL (CHUQ, Centre hospitalier universitaire de Québec, Université Laval, Ville de Québec, QC, Canada).
Tableau 3. Amorces pour la réaction de séquençage
Amorce Séquence nucléotidique
M13F-20 5’- GTAAAACGACGGCCAGT -3’
M13R-20 5’- GCGGATAACAATTTCACACAGG -3
Après une inspection visuelle de la séquence de nucléotides obtenue à partir de la plate-forme d’analyses biomoléculaires, les séquences ont été automatiquement analysées dans un analyseur ABI Prism 3100 génétiques (Applied Biosystems – Hitachi, USA).Les séquences de 600 bases ont été visualisées, ajustées au sens de la lecture du programme BioEdit 7.0, et alignées en utilisant l'algorithme 3.6 MUSCLE (Edgar, 2004).
Les séquences ont été regroupées en clusters (taxons) conformément à une similitude minimum de 97 % du calcul de la matrice de distance, en utilisant le programme
