ce qui demande donc un besoin de nombreux milieux de culture différents, de l'espace ample, du matériel de laboratoire suffisant pour le stockage et de plus, la technique empêche la croissance de certains groupes spécifiques de microorganismes.
Les études de Lillo et collaborateurs (2006) ont comparé les deux techniques laboratoires; la culture et le clonage pour identifier 137 taxons (espèces ou phylotypes) dans trois échantillons des patients atteints de parodontite en utilisant six différents oligonucléotides.
Dans nos résultats, parmi 137 taxons, 86 ont été identifiés par la technique d’analyse du gène 16SrDNA, tandis que 26 ont été identifiés par la technique de culture et seulement 25 ont été trouvés avec les deux techniques. Ce qui nous amène à constater une diversité des résultats entre les deux techniques ci-dessus.
Le couple d’amorces utilisé pour l'analyse du gène 16SrDNA de notre l'étude a été 27F/1492R, le même que celui suggéré par de Lillo et collaborateurs (2006) qui, selon les auteurs, ont montré des résultats satisfaisants dans la quantité phylotypique et en termes de nombre de phylos et taxons individuels.
Avec la même séquence d’oligonucléotides utilisés dans notre recherche, Grice et collaborateurs (2010) ont étudié, par le séquençage de l'ARN ribosomal 16S, le microbiote d’une plaie longitudinale sélective dans une coupe correspondant à une mauvaise cicatrisation tissulaire chez des souris diabétiques. Il a été démontré un déplacement parallèle de l'expression des gènes longitudinale qui se produit dans un cluster de gènes liés à la réponse immunitaire.
Rolph et collaborateurs (2001) ont utilisé les mêmes amorces pour étudier la diversité microbienne dans le canaux radiculaires infectés et ils ont trouvé des genres comme Enterococcus, Lactobacillus, Propionibacterium et Streptococcus Pantoea,
Prevotella, Selenomonas, Capnocytophaga, Cytophaga, Dialister, Eubacterium,
Fusobacterium, Gemella, Mogibacterium, Peptostreptococcus, Prevotella,
Propionibacterium, Selenomonas Solobacterium, Streptococcus et Veillonella et des
bactéries ultérieurement pas cultivées.
Par contre, Vickerman et collaborateurs (2007) croient que pour une étude plus approfondie, il aurait besoin de deux amorces différentes pour la détection, soit des oligonucléotides universels et d’autres spécifiques à certaines bactéries. En résumé de leurs
conclusions, ce résultat peut indiquer que certaines espèces sont présentes, mais elles ne sont pas détectées ou à un score très faible avec l'amorce universelle. Les auteurs renouvellent l’idée que ces techniques sont le meilleur choix, avec une association entre amorces, pour détecter la présence des bactéries pas encore décrites.
En utilisant la technique ribosomique16S, Preza et collaborateurs (2009) ont publié une étude récente où ils décrivent cette complexité microbienne dans la cavité buccale des patients âgés avec un total de 175 espèces et groupes détectés. Parmi les espèces mises en évidence, S. oralis (taxon oral 707) a été l'espèce la plus abondante dans cette étude. Cette bactérie est représentée comme une cause fréquente d'infections chez les patients immunodéprimés, associée à une endocardite bactérienne.
La prévalence élevée de F. nucleatum subsp. taxon oral 202 polymorphum,
H. parainfluenzae (taxon oral 718) / A. aphrophilus (taxon oral 545) et Leptotrichia ont
également été trouvés. F. nucleatum subsp. taxon oral 202 polymorphum a été préalablement identifié pour être associé avec la surface de la racine en bonne santé chez les personnes âgées.
Du point de vue de la flore sous-gingivale et supra-gingivale, certaines espèces non cultivables (T. taxon oral socranskii 769, S. intermedius taxon oral 576 / S. constellatus taxon oral 644, K. oralis taxon oral 706, S. anginosus taxon oral 543 / S. intermedius taxon oral 644) étaient significativement liées à la plaque sous-gingivale uniquement.
Nous avons également trouvé un total de 68 différents taxons, donc 15,33 % du total de clones réussis, où 50,59 % trouvés en poches parodontales peu profondes et 49,40 % trouvés en poches parodontales profondes. Avec notre travail, un total de 48 genres de bactéries ont été catalogués, 42 ont été trouvés dans le groupe de poches parodontales profondes et 45 dans le groupe de poches parodontales peu profondes.
Faits saillants pour le genre Capnocytophaga, il inclut des pathogènes parodontaux putatifs parmi lesquels se trouvent des espèces comme C. gingivalis avec 27 espèces soit 33 % de cas, C. ochracea avec 22 espèces soit 42 % de cas, C. sputigena avec 12 espèces soit 33 % de cas. Le manuscrit décrit par Ciantar et collaborateurs (2001) a rapporté deux bactérie récentes; C. granulosa retrouvé avec 1 espèce soit 8,3 % de cas et C. haemolytica qui, dans notre étude, n’a pas pu être détectée.
Le travail de Slots et collaborateurs (1995) a suggéré que l’amplification par PCR et l'analyse 16S peuvent être avantageux pour la détection de certains pathogènes parodontaux de manière plus efficace, puisqu’ils ne nécessitent aucune préparation des échantillons pour être sensibles et reproductibles, et aussi que la mise en œuvre est facile d’exécution.
Un étude de comparaison entre patients diagnostiqués avec un gencive saine et des patients diagnostiqués avec une parodontite chronique chez 47 volontaires en utilisant la technique PCR - gradient dénaturant électrophorèse sur gel, a démontré une association significative avec la maladie parodontale pour la bactérie A. actinomycetemcomitans. (Ledder et al., 2007).
Une grande variété d’espèces a été trouvée dans des poches parodontales profondes et des poches parodontales peu profondes, comme par exemple, les espèces principales,
Streptococcus sanguinis pour un total de 104 clones, Fusobacterium nucleatum avec 100
spécimens et des Streptococcus mitis avec 82 échantillons. Une autre espèce importante, mais qui se trouve en petite portion, est A. actinomycetemcomitans avec seulement 1 exemplaire.
La différence entre quantité, présence ou absence des bactéries est un facteur qui doit être considéré comme l’a démontré l’étude de Kim et collaborateurs, (2009) qui ont comparé la différence de la microflore sous-gingivale entre sujets asiatiques et caucasiens présentant une maladie parodontale. Ils ont montré une prévalence plus élevée d’Actinobacillus, Aggregatibacter, Treponema denticola chez les patients caucasiens comparativement aux patients asiatiques.
Parmi les espèces considérées parodontopathogènes ou associées à cette maladie (Rudney et al., 2005), T. forsythia, P. gingivalis et T. denticola, ont été trouvé avec une prévalence plus accentuée en poches parodontales profondes que peu profondes. T.
forsythia a été remarqué dans 3,1 % de cas en profondes et 1,0% de cas en peu profondes. P. gingivalis a été remarqué chez 1,9 % de cas en profondes et 0,7 % de cas en peu
profondes. T. denticola a été remarqué dans 1,8 % de cas en profondes et 0,1 % de cas en peu profondes. Ces espèces sont, conformes aux études de Socransky et collaborateurs, (1998), liées avec la profondeur au sondage où elles sont plus prédominantes en poche avec PS plus que 4 millimètres.
Ces résultats sont en accord avec une étude sur la détection de P. gingivalis, A.
actinomycetemcomitans et T. denticola. La corrélation entre eux au niveau des maladies
parodontales,obtenue par la technique 16S ADNr proposée par Zhan et collaborateurs (2005), a montré que les taux de positivité de la détection de P. gingivalis a été significativement plus élevée que ceux de A. actinomycetemcomitans et T. denticola.
Statistiquement, nous avons trouvé pour le complexe rouge, une différence significative plus élevée en comparaison avec les complexes publiés par Socransky. Pour les autres groupes aucune différence significative n’a été établie.
En ce qui concerne les autres couleurs du complexe, nous avons constaté des tendances similaires déjà décrites dans des publications scientifiques, en particulier du genre Streptococcus, le groupe jaune, pour un total de 176 espèces avec 21,6 % des cas associés aux poches peu profondes et 139 espèces avec 16, 6 % des cas dans des poches parodontales profondes.
Il est très important de noter que A. actinomycetemcomitans n’a pas été trouvé dans les poches parodontales profondes; cependant, nous le retrouvons dans 0,1 % des cas dans les poches parodontales peu profondes, ce qui est confirmé par plusieurs études basées sur la technique 16S.
Par contre, même si la spécificité est proportionnellement faible pour la paire d'amorces utilisées, un autre facteur que l'on présume est la faible présence de A.
actinomycetemcomitans chez les adultes atteints de parodontite (Faveri et al., 2008).
Pour des espèces non cultivables également répertoriées dans la littérature, les plus fréquemment rencontrées appartiennent au groupe Streptococcus avec 33 % des cas et
Veillonella avec 33 % des cas. Une étude de caractérisation biomoléculaire sur la langue,
chez des patients atteints d'halitose, a montré des groupes mis en évidence : Streptococcus,
Veillonella, Prevotella, Actionomyces (Riggio et al., 2008).
Parmi les autres taxons à haute fréquence dans les deux sites, on trouve dans notre travail sp Deferribacteres sp. oral clone JV001, TM7 sp. Oral Taxon 346 Clone AH040 et
Desulfobulbus sp. oral clone CH031 orale.
En comparant avec les espèces cultivables, un ratio de 1,29 pour chaque espèce cultivables par rapport aux espèces non cultivables a été trouvé. Cela peut nous dire que nous avons eu beaucoup de succès dans la détection de plus en plus d’espèces communes,
mais pas encore avec les isolats identifiés comme les taxons rares. Un autre facteur est le taux de 97 % de similarité utilisées dans notre travail.
La plupart des études utilisent des valeurs plus élevées pour l’identification de similarité, comme 99 % qui peuvent contribuer à augmenter le nombre d'espèces.
Dewhirst et collaborateurs (2010) ont utilisé leur travail pour la détection de la microbiote de la cavité buccale qui comprend différents habitats, tels que les amygdales, dents, crevasse gingivale, langue et avec 1000 isolats, dont 34753 clones, ils ont trouvés les valeurs de similarité de 90 % à 259 clones, 95 % à 413 clones, 98 % à 655 clones et 99 % à 875 clones trouvés.
L'évolution de la maladie parodontale se produit de manière isolée à chaque individu qui peut parfois ne pas présenter le même modèle clinique. Ce fait est associé aux mécanismes de défense, l'environnement mais aussi la relation hôte bactérie et les facteurs associés comme le diabète. Donc, des failles dans les études pourront être trouvées afin de caractériser un profil microbien unique.
La méthode de clonage par le gène 16S utilisée dans notre étude a démontré qu’elle peut être d'une grande utilité dans l'étude de la diversité microbienne dans les poches caractérisées comme profondes et peu profondes chez les patients diabétiques atteints de maladies parodontales. De plus, elle a permis de mettre en évidence des espèces communes et des espèces spécifiques entre les groupes.
Les diabétiques possèdent une forte concentration d'espèces considérées comme pathogènes. Cette caractéristique peut être considérée grâce à facteurs individuels face à la réponse à l’agression chez l’hôte.
Pour une analyse plus rigoureuse et approfondie, l’assemblage avec d’autres méthodes de détection est indispensable pour comparer le profil microbiologique de ces maladies.