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Université de Sherbrooke
. . . . I1q E1: L'INHIBITIO~ MÉT ABOLI QUE:
HETEROGENEITE DANS LA REPONSE DES CELLULES SOUS-ENDOCARDIQUES ET SOUS-ÉPICARDIQUES?
par
Yann Rioux
Département de physiologie et biophysique
Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de
maître ès sciences (M. Sc.)
...
en physiologie (biophysique)l+I
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0-612-21825-2
II
TABLE DES MATIÈRES
TABLE DES MATIÈRES ... II LISTE DES FIGURES ... V LISTE DES TABLEAUX ...
vn
LISTE DES SYMBOLES ET ABBRÉVIA TIONS . . . .vrn
RÉSUMÉ ... .CHAPITRE I: INTRODUCTION ... I
1.1 Notions d'hétérogénéité ... 2
1.1. I L'hétérogénéité au sein du coeur entier ... 2
1.2.1 L'hétérogénéité au sein du ventricule ... .5
1.2 Objectifs du projet et travaux antérieurs ... 7
CHAPITRE II: MATÉRIEL ET MÉTHODES ... I 0 2.1 Préparations biologiques ... I I 2.2 Solutions et drogues ... I 5 2.3 Montage expérimental . . . ... I 7 2.3. l Électrodes . . . I 7 2.3 .2 Équipements . . . ... 18 2.4 Mesures électrophysiologiques ... 18
2.4.1 Critères de viabilité cellulaire ... 18
2.4.2 Propriétés passives . . . . ... 19
2.4.3 Courants membranaires ... 22
CHAPITRE 111: RÉSULTATS ... 26
3. 1 Caractérisation des propriétés passives ... .2 7 3.2 Caractérisation du courant potassique à rectification entrante chez les deux types cellulaires ... 30
3 .2. I Isolation de IK1 •••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 I 3.2.2 Effet des variations de la [K '"0
l
sur I,.. ... 343.3 Réponse à l'inhibition métabolique ... .36
3.3. l Description générale: qualitative ... .36
3.3.2 Description générale: quantitative ... 39
3.3.3 Effet du Ba2~ sur le courant développé par le CCCP ... 44
3.3.4 Effet de la GLIB sur le courant développé par le CCCP .. .46
3 .3 .5 Effet du MIA sur le courant développé par le CCCP ... .51
CHAPITRE IV: DISCUSSION ... .58
4.1 Propriétés passives ... .59
4.2 Courant de fond Iss ... 60
4.2. I Isolation d1K1 par le barium ... 62
4.2.2 Dépendance d1K1 pour K-0 • • • • • • • • • • • • • • • . • • • . • . . • • • . 63
4.3 Courant induit par le CCCP ... 64
4.3. I Bref historique ... 64
4.3.2 Réponse à l'inhibition métabolique ... 65
IV 4.4. l Implication possible d'autre(s) courant(s) ... 70 4.5 Importances physiologiques et pathologiques ... 7 l
REMERCIEMENl"S ... 75 LISTE DES RÉFÉRENCES . . . . ... 76
LISTE DES FIGURES
Figure No. Page
1.1 2.1 2.2 ? .., -·-' 2.4 2.5
2.6
3.1 3.2 .., .., .) ·-' 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10Hétérogénéité dans la morphologie du potentiel d'action de
différentes cellules cardiaques ... .4 Montage employé pour l'isolation cellulaire ... 13 Photographie montrant le coeur pendant la perfusion ... 14 Photographies de la préparation cellulaire à deux agrandissements
différents ... 20 M esures es propnetes e ectnques passives ... -d ... ·1 . . ?I Protocoles de stimulation ... .24 Enregistrements typiques du courant de fond et du courant calcique I ca.L .•... 25 Relation courant-voltage du courant de fond (I.J en condition témoin ... .32 Effets du Ba2• sur la relation courant-voltage du courant de fond (IsJ
dans des cellules sous-endocardiques et sous-épicardiques ... 35 Effet de la variation de la [IC
L
sur la relation courant-voltge du courantde fond Issdans une cellule sous-épicardique ... 37 Effet du CCCP sur le courant de fond f 55 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .40 L'effet de 600 nM CCCP sur les courbes courant-voltage du courant
de fond ... 42 Regroupement des réponses au CCCP selon leur amplitude ... .45 Effet du Ba2• sur le courant de fond en présence de CCCP . . . ... 4 7 Effet du Ba2• et de la
GLIB
sur le courant de fond en présence de CCCP . . . 50 Effets de l OO µM et 30 µMGLIB
sur le courant de fond en présencedeCCCP ... 52 Effet du MIA (lµM) sur le courant de fond Iss ... .54
VI 3.11 Effet du MIA suite au régime établi de l'effet du CCCP ... .56 3.12 Effets de lµM MIA sur le courant de fond en présence de CCCP ... .57
LISTE DES TABLEAUX
Tableau No. Page
CCCP: DMSO: DPA: EGTA: GLIB: Hepes: Hz:
Ica.t:
IK-ATP: IKI:IH:
Ip;c: Iss: IN: KB: MIA: PR:LISTE DES SYMBOLES ET DES ABBRÉVIA TIONS
Carbonyl cyanure m-chlorophenylhydrazone Capacité d'entrée
Capacité rnembranaire spécifique Diméthylsulfoxyde
Durée du potentiel d'action
VIII
Éthylène glycol-bis (p-aminoéthyléther)-N,N,N',N'-acide tétraacétique Potentiel d'inversion
Glibenclamide
N-2-hydroxyéthylpiperazine-N'-2-acide éthanesulfonique Hertz
Courant calcique de type L
Courant potassique sensible à l'ATP Courant potassique à rectification entrante Courant de maintien
Courant au pic
Courant au régime établi ou courant de fond Relation courant-voltage
"Kraft Brühe"
Méthylisobutyl amiloride Potentiel de repos
Rent:
E.S.M.:
Résistance d'entrée
Erreur standard de la moyenne Potentiel de membrane
RÉSUMÉ
Objectifs: Le but de ce travail était d'étudier si la réponse à l'inhibition métabolique était la même dans des cellules cardiaques en provenance de différentes régions du ventricule, soit de la Tégion sous-endocardique et de celle sous-épicardique. En deuxième lieu, nous voulions confirmer la participation de "l'inward rectifier" dans l'augmentation de la composante sortante du courant de fond en inhibition métabolique. Méthodes: Les expériences ont été effectuées sur des cardiomyocytes isolés, obtenus par dissociation enzymatique. Les courants membranaires ont été mesurés avec la technique du patch-clamp en voltage imposé, en configuration cellule entière. Toutes les expériences ont été réalisées
à température de la pièce. La condition d'inhibition métabolique a été induite par exposition au carbonyl cyanure m-chlorophenylhydrazone (CCCP) à une concentration de 600 nM. Le Ba2- ( 1 OO µM) et le méthylisobutyl amiloride (MIA) ont été employés pour bloquer I Kt alors que nous avons employé la glibenclamide (GLIB) comme bloqueur spécifique du courant potassique sensible à l'A TP (IK·ATP)- Résultats: Les cellules endocardiques et sous-épicardiques ont une relation courant-voltage (I/V) du courant de fond (lss) similaires en conditions contrôles en ce qui a trait à la densité de courant et à la forme en "N-amorti". Ces deux types cellulaires réagissent d'une façon identique à la variation en potassium extracellulaire et au blocage par le Ba2-. En conditions d'inhibition métabolique en présence de substrats, nous avons retrouvé une réponse hétérogène dans l'augmentation du courant sortant, mais n'étant pas reliée au type cellulaire. En effet, indépendamment du type cellulaire, certaines cellules répondaient très fortement au CCCP alors que d'autres démontraient une amplitude de courant moindre. La GLIB inhibait seulement de façon
blocage additionnel mais toujours l'impossibilité de recouvrer les niveaux de courants sortants initiaux à des potentiels de membrane plus positifs que -50 m V. Conclusions: Nous avons donc trouvé une hétérogénéité n'étant pas reliée à l'arrangement des cellules en couches. Le courant de "l'inward rectifier" participe à la réponse à l'inhibition métabolique avec le IK-ATP- L'augmentation de la composante sortante d1K1 contribue au raccourcissement du potentiel d'action en conditions de stress énergétique. Toutefois, l'impossibilité de retrouver les niveaux de courants initiaux au-delà de -50 m V, suggère que dans nos préparations, le courant chlore sensible à l'étirement pourrait être impliqué dans cette réponse. Des extrapolations en vue d'expliquer l'impact de ces résultats in vivo doivent être faites avec précaution, car les mécanismes y sont beaucoup plus complexes.
Mots clés: électrophysiologie cardiaque; inhibition métabolique; patch clamp; hétérogénéité cellulaire; canaux potassiques sensibles à l'A TP.
CHAPITRE 1 INTRODUCTION
1.1 Notions d'hétérogénéité électrophysiologiq ue
1.1.1 L'hétérogénéité au sein du coeur entier
L'hétérogénéité inhérente à différentes régions du coeur est connue depuis le début du siècle. À cette époque, on savait déjà que la région du noeud sino-auriculaire possédait le plus haut degré d'automaticité. Au sein du coeur, les cellules disposant d'une auto-excitation rythmique autonome, dites pacemaker, se retrouvent au niveau des noeuds sino-auriculaire et atrio-ventriculaire ainsi que dans les tissus spécialisés pour la conduction: le faisceau de His et ses branches, en plus du réseau de Purkinje. Ces cellules produisent et distribuent les influx électriques stimulant la contraction des fibres musculaires. Ces fibres musculaires constituant le muscle ordinaire sont d'origine auriculaire et ventriculaire et représentent 99 % des cellules myocardiques en conditions normales.
Plus tard, vers les années 1950 les chercheurs ont remarqué, entre autre, une différence en terme de la morphologie du potentiel d'action entre les cellules nodales et celles ventriculaires. Quelques différences au sein de ces deux types cellulaires seront énumérées ici, cette partie étant introductive à la présente étude. La figure 1.1 A illustre la différence entre le décours temporel d'un potentiel d'action d'une cellule nodale et d'une ventriculaire. Les différences électrophysiologiques majeures entre ces deux potentiels d'action sont: l'influx rapide de sodium au niveau ventriculaire responsable d'une dépolarisation très rapide, environ 150 Vis; l'entrée soutenue en calcium suscitant la durée prolongée du potentiel d'action au niveau ventriculaire vs nodale et l'activition des courants potassiques contribuant à la repolarisation du potentiel d'action. La grande vitesse de
..,
.J dépolarisation du potentiel d'action ventriculaire permet une conduction très rapide de la vague d'excitation. En conséquence, l'activation de la masse ventriculaire se fait à l'intérieur d'environ 1 OO ms ce qui permet la contraction synchrone des ventricules. La phase de montée des cellules nodales, attribuée au courant calcique, est beaucoup plus lente ( 10-15 V /s) et la durée de son potentiel d'action est moindre. Le potentiel de repos de ces deux types cellulaires diffèrent, les cellules ventriculaires étant plus polarisées (-80 mV) que celles nodales (-50 m V). Au niveau de l'histologie, les cellules nodales sont plus petites et sont ramifiées, alors que les cellules ventriculaires ont en général un arrangement ordonné de façon parallèle. Les cellules ventriculaires ont une plus grande quantité de protéines contractiles organisées en filaments et elles ont beaucoup plus de mitochondries que les cellules nodales. En effet, les myofibrilles et les mitochondries combinées occupent plus du 314 du volume de la cellule ventriculaire. L'activité contractile des cellules nodales est quant à elle faible car les filaments sont peu développées et ne sont pas structurés en myofibrilles. Elles ont aussi moins de mitochondries.
Mais l'élément distinguant vraiment une cellule ventriculaire d'une cellule nodale est sûrement le fait que la cellule nodale soit capable de s'autoexciter de façon rythmique et autonome: cette propriété est appelée l'automaticité électrique cardiaque. C'est la dépolarisation diastolique spontanée qui confère l'automatisme des cellules nodales. Les morphologies des potentiels d'action sont différentes car les courants ioniques qui les génèrent sont différents.
Le
potentiel d'action le plus complexe se trouvant au niveau des cellules ventriculaires, ce sont ces cellules qui exercent le plus grand travail et en conséquence leur intégrité fonctionnelle est beaucoup plus dépendante de l'état énergétique cellulaire.A
B
ÉPI
MID
ENDO
o-1
mV 50
0-200 msec
Figure 1.1: Hétérogénéité dans la morphologie du potentiel d'action de différentes cellules cardiaques. A. Représentation schématique d'un potentiel d'action d'une cellule nodale à gauche et d'une cellule d'origine ventriculaire à droite. Dans ce schéma, les enregistrements ne sont pas à l'échelle. B. Potentiels d'action du ventricule gauche du chien. Cellule sous-épicardique (ÉPI), de milieu du myocarde (MID) et sous-endocardique (ENDO). Modifié de Lukas et Antzelevitch, 1996.
5
1.1.2 Hétérogénéité au sein du ventricule
Pendant longtemps, les ventricules ont été vus comme étant composés de deux types de tissus: le myocarde ventriculaire ordinaire et les tissus conducteurs (système His-Purkinje). C'est seulement vers les années 1980 qu'une hétérogénéité intrinsèque au sein d'une même région cardiaque, le ventricule, a été décrite. Trois différentes formes de potentiel d'action ont été identifiées chez le ventricule gauche du chien par le groupe d'Antzelevitch (Lukas et Antzelevitc~ 1996). La figure 1.1 B montre la morphologie de
chacun de ces potentiels d'action. Le potentiel d'action des cellules sous-épicardiques se distingue des deux autres par une amplitude moins grande (phase 0), une entaille proéminente et une durée moindre. L'entaille proéminente au niveau sous-épicardique a aussi été décrite dans le myocyte ventriculaire du chat adulte (Furukawa et al., 1990, Kimura et al., 1990) et au niveau du coeur du lapin (Fedida et Giles, 1991 ). L'importance de l'entaille varie d'une espèce à l'autre et est absente chez certaines espèces. Dans notre laboratoire, celle-ci n'a jamais été observée au niveau des cellules sous-épicardiques du coeur entier du lapin. L'hétérogénéité s'étend aussi en terme de ventricule où cette encoche
est plus prononcée au sein du ventricule droit (Di Diego et al., 1991 ). Toutefois, le potentiel de membrane au repos est le même dans les cellules épicardiques et sous-endocardiques. Le deuxième type de cellule est les cellules en milieu du myocarde appelées
cellules M. Elles sont à mi-chemin entre les cellules épicardiques et sous-endocardiques en terme de l'importance de l'entaille. Ce qui est caractéristique de ce type
cellulaire est la dépendance de la durée du potentiel d'action en fonction de la fréquence de stimulation. Ces cellules ont aussi été caractérisées dans le ventricule humain mais ne sont pas présentes chez celui du lapin. Enfin les cellules sous-endocardiques n'ont pas d'encoche
et leur phase de montée est plus grande que dans les deux autres types cellulaires.
D'autres différences sont remarquées dans différentes conditions physiologiques ou pathologiques. Trois études seront présentées de façon brève pour témoigner des différents types possibles d'hétérogénéité. Entre autres, l'équipe de Liu ( 1993)
chez le chien a rapporté dans une étude en voltage imposé que le courant transitoire à
rectification sortante (I10) est plus grand dans les cellules sous-épicardiques, une peu
moindre au niveau des cellules M et très petit dans les cellules sous-endocardiques. La cinétique d'inactivation de ce courant suggère que I 10 contribue significativement à la phase
1 du potentiel d'action, donc serait responsable de l'encoche. Le groupe de Furukawa chez le chat ( 1990) et de Fedida et Giles ( 1991) chez le lapin ont remarqué une différence de la morphologie du potentiel d'action et de sa durée, attribuée à une distribution inégale de I1a Ces différences entre les cellules provenant de la région endocardique et sous-épicardique supportent l'hypothèse d'une plus grande expression du canal dans les cellules sous-épicardiques.
Un autre type d'étude a été fait par Furukawa et al., ( 1994) sur la réponse du courant calcique de type L (Iea.1.) en inhibition métabolique au niveau du ventricule hypertrophié chez le chat. En conditions contrôles, les cellules normales et celles hypertrophiées n'étaient pas significativement différentes en terme de la densité de I ca.L mais
suite à l'exposition au cyanure ( 1 mM), les cellules hypertrophiées voyaient leur courant calcique diminué fortement et de façon parallèle la durée du potentiel d'action était significativement abrégé. Au niveau des cellules normales, la densité d'Iea.L ne variait pas de façon significative. Le courant calcique de type L semble donc particulièrement affecté par une perturbation métabolique au niveau de cellules hypertrophiées. Dans une autre
7
étude, Furukawa et al., (1991) ont remarqué une différence dans la sensibilité du canal potassique dépendant de la concentration intracellulaire en A TP (K-A TP) au niveau des cellules sous-endocardiques et sous-épicardiques chez le chat. Le raccourcissement du potentiel d'action suite à l'exposition des cellules au cyanure ( 1 mM) était plus prononcé chez les cellules de la région sous-épicardique. Les expériences réalisées en patch arraché (inside-out) révèlent que l'activité des canaux K-ATP était beaucoup plus grande chez ces cellules. Suite à l'établissement de la relation dose-réponse, ce groupe a remarqué que le l K· ATP était activé par une réduction moindre de la concentration en A TP au niveau des cellules
sous-épicardiques, donc que cette différence de sensibilité pourrait être responsable de la différence du raccourcissement du potentiel d'action en inhibition métabolique aux deux sites. La notion d'hétérogénéité électrophysiologique est donc assez bien documentée mais une étude semblable pour le ventricule du lapin n'a pas été répertoriée dans la littérature.
1.2 Objectifs du projet et travaux antérieurs
Dans ce présent travail nous voulions en premier lieu étudier si la réponse à l'inhibition métabolique induite par le carbonyl cyanure m-chlorophenylhydrazone (CCCP) était la même entre des cellules provenant de différentes régions du ventricule, soit de la région sous-endocardique et de celle sous-épicardique. Deuxièment, nous voulions confirmer que "l'inward rectifier" participait à la réponse électrique induite par l'inhibiton métabolique. Nous avons donc utilisé des bloqueurs classiques des deux systèmes de courant soit le cation divalent barium reconnu depuis fort longtemps comme étant très spécifique (à basse concentration) pour le courant potassique
à rectification entrante (IK1) (Kameyama et al., 1983) et le sulfonylurée de deuxième
génération glibenclamide (GLIB) comme bloqueur du courant potassique sensible à l'A TP
(IK-ATP)- De façon alternative, nous avons utilisé un bloqueur non-conventionnel de IK1, le méthylisobutyl amiloride (MIA), qui en soi est un inhibiteur de l'échangeur Na 7H +mais que nous avons découvert bloquer aussi IK1 (Ruiz Petrich et al., l 996b ).
La justification de l'intérêt pour ce projet concernant l'hétérogénéité réside
dans le fait que différents groupes ont rapporté chez le chat et le chien que ces deux types cellulaires répondent différemment dans diverses conditions comme l'ischémie simulée, l'hypoxie et l'acidose (Furukawa et al., 1991, Kimura et al., 1990, Gilmour et Zipes, 1980). Ces réponses différentielles pourraient produire des inhomogénéités électrophysiologiques et donc faciliter le développement d'arythmies. De plus, des travaux antérieurs avaient démontré que IK1 contribue à la réponse électrique à l'inhibition métabolique au niveau du
coeur entier du lapin (de Lorenzi, 1993, Ruiz-Petri ch et al., 1991) et des cardiomyocytes isolés ( Cai, 1993, de Lorenzi et al., 1994 ). Des conditions d'ischémie entraînent une augmentation de la concentration en potassium extracellulaire, cette augmentation étant le dénominateur commun qui peut rendre compte des divers constituants de la réponse électrophysiologique du myocarde à l'ischémie. Le tissu en stress énergétique répondra par une diminution de la durée de son potentiel d'action, une perte cellulaire potassique causée par une augmentation de l'eftlux de K- (Vleugels et Carmeliet, 1976, Ruiz Petrich et al., 1991) et l'activation d'un courant sortant K+ indépendant du temps tout en conservant un potentiel de repos normal (Isenberg et al., 1983 ). De plus, dans les études de Cai ( 1993) et de Lorenzi ( 1993) l'usage de la GLIB n'entraînait pas un blocage complet du courant sortant activé dans ces conditions et une partie de cette dernière composante était sensible au Ba 2
9
Les conditions hypoxiques en présence de substrats exogènes utilisées dans nos expériences sont comparables à des situations in vivo tant physiologiques (altitude) que pathologiques (insuffisance cardiaque, insuffisance respiratoire, anémie etc.). L'hypoxie est un élément de l'ischémie mais aussi une séquelle fréquente des maladies cardiovasculaires et respiratoires. Il est accepté qu'en stress métabolique sévère comme dans des conditions de blocage métabolique complet, la diminution de la durée du potentiel d'action est due à l'augmentation du courant sortant K-A TP. Par contre, en conditions d'inhibition métabolique moins sévères comme dans nos conditions de découplage de la phosphorylation oxydative tout en gardant le glucose comme substrat métabolique pour la glycolyse, les réponses sont moins bien connues.
Nous voulions donc déterminer si il y avait une réponse hétérogène. suite à l'inhibition métabolique, au sein de ces deux types cellulaires et à la fois déterminer si la contribution d'IK1 dans cette réponse serait différente en fonction d'une hétérogénéité
CHAPITRE D
l l
Les expériences ont été effectuées sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés, obtenus par dissociation enzymatique selon les procédures conventionnelles (Fermini et al., 1992). Les courants membranaires ont été mesurés avec la technique du patch clamp en voltage imposé, en configuration cellule entière (Hamil et al., 1981 ). Toutes les expériences ont été réalisées à température de la pièce.
2.1 Préparations biologiques
Des lapins de type Nouvelle-Zélande de sexe mâle et femelle, pesant de 1.6 à 2.1 kg étaient anesthésiés avec un mélange de kétamine (35 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) par voie intra-musculaire. Ils étaient aussi héparinés par injection intra-péritonéale (750 U/kg), puis euthanasiés par dislocation cervicale. La cage thoracique était ouverte le long du sternum, les vaisseaux sectionnés et le coeur rapidement excisé, rincé dans du Tyrode à température de la pièce et dépourvu du péricarde et des autres tissus conjonctifs, tout en étant oxygéné ( l 00% 02). L'aorte était séparée de l'artère pulmonaire puis coupée
en dessous de la sortie des artères carotides. Le coeur était par la suite monté sur un appareil de perfusion et perfusé selon la méthode de Langendorff avec une solution Tyrode contenant 2 mM de CaC12 à 38 °C. Cette première étape ( 4-5 min) permettait de laver le
sang restant dans le système coronarien et d'atteindre la température et les conditions de perfusion requises pour une dissociation enzymatique efficace.
La figure 2.1 montre le montage utilisé. li consistait principalement en une colonne de condensation (C, Harvard, Modèle 50-8358) maintenue à une température de 39 ± 0.5 °C par un bain thermostatique (Haake,Type FE). Cette colonne permettait de
déceler les variations de pression lors de la perfusion grâce au niveau du perfusat dans le tuyau central agissant ainsi comme manomètre (m). Un débit coronaire d'environ 30 ml/min était ajusté et maintenu à l'aide d'une pompe péristaltique (P, Masterfle~ modèle No
7520-00, Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL, USA). Une branche latérale permettait de trapper les bulles
gazeuses
(t). Le coeur était maintenu dans une chambre à double paroi (D)afin d'éviter les variations de température et le phénomène d'évaporation. La photo de la figure 2.2 focalise sur la partie du montage où le coeur est attaché à la cannule.
Après l'étape initiale, les coeurs étaient perfusés avec la même solution, mais dépourvue de calcium jusqu'au moment d'arrêt de la contraction visible, soit environ 4
minutes. L'exposition à une solution exempte de Ca2- ferme les jonctions gaps des disques intercalaires de façon à ce que chaque cellule devienne structurellement et fonctionnellement isolée des cellules voisines. La digestion enzymatique était effectuée avec la même solution Tyrode sans Ca2-, additionnée de 120 U/ml de collagénase (CLS II,
Worthington Biochemical, Freehold, NJ, USA) et 0.1 % d'albumine de sérum bovin (Sigma Chemicals, St-Louis, MO, USA). Les solutions dépourvues d'enzyme étaient perfusées en un mode de non-recirculation alors que la solution contenant la collagénase l'était en circuit fermé.
Après environ 6 minutes de digestion, une diminution de la résistance au flux était observée. Elle était drastique ou progressive selon les coeurs, témoignant de la rupture du lit vasculaire. Le débit était par la suite réajusté et maintenu autour de 30 ml/min, la perfusion était poursuivie avec l'enzyme pour une période additionnelle de 2 à
4 minutes. On procédait par la suite au rinçage du coeur avec la solution Tyrode sans Ca 2-pour environ 3 minutes. L'extérieur de coeur était aussi rincé avec la même solution 2-pour
Retour d'eau vers
le bain -
v---.Entrée d'eau __ _
du bain -
...---..
m
D
Sortie de
l'effluent
u
1-.
~p
r
@- '
... 1Figure 2.1 : Montage employé pour l'isolation cellulaire. Une pompe péristaltique (P) achemine les différents perfusats (r) au niveau du tube central de la colonne de condensation (C). Le tuyau central de cette colonne agit comme manomètre (m) où le niveau de perfusat reflète la pression de perfusion. Le débit est contrôlé au point (b) à l'aide d'une pince d'Hoffman. Le coeur est suspendu à la cannule et entouré d'une chambre à double paroi (D) chauffée par un bain thermostatique afin d'éviter les variations de température. Une branche latérale (t) de la cannule pennet de trapper les bulles d'air.
15 s'assurer qu'il n'y aie plus de collagénase. Le coeur était détaché de l'appareil de perfusion et déposé dans une solution d'acclimatation (Kraft Brühe, KB, Isenberg et K.lockner, 1982) modifiée, dans laquelle la dissection était effectuée. À l'aide de fins ciseaux, deux échantillons de myocarde étaient prélevés, le septum interventriculaire ainsi qu'environ 20
% de la couche externe de la paroi libre. Ces deux échantillons constituaient respectivement les cellules sous-endocardiques et sous-épicardiques. Les morceaux de tissus étaient transférés dans du KB frais, émincés et incubés pour 15 minutes à la température de la pièce. Par la suite, les cellules étaient dispersées par aspiration à l'aide d'une pipette Pasteur et les morceaux éliminés. Après un délai de 15 autres minutes les cellules déposées au fond de la cuvette étaient prélevées et déposées dans du KB frais pour 30 minutes supplémentaires, pour par la suite, être transférées dans une solution Tyrode normale contenant une concentration de 1.25 mM CaClz Les myocytes étaient gardés à température de la pièce et utilisés pour les expériences de 2 à 8 heures suivant leur isolation.
2.2 Solutions et drogues (produits)
Toutes les solutions étaient préparées avec de l'eau déionisé (Milli-Q UF Plus, Millipore S.A., Résistivité 18.2 MQ·cm). La solution Tyrode normale servant à l'isolation cellulaire était composée de (mM): NaCl 126, KCl 5, MgC12 1, NaH2P0-1 0.3,
Hepes 5, Glucose 11, CaCl2 2. Le Tyrode exempt de Ca2~ était préparé simplement en
omettant le CaCl2• Le pH était ajusté entre 7.35 et 7.40 avec NaOH. La composition de la solution d'acclimatation KB était de (mM): KCl 20, KHif>04 lO, Glucose 10, Albumine 0.1 %, Acide Glutamique 88, Acide Hydroxybutyrique 10, Taurine 9.5, EGTA 10. Le pH de
cette solution était ajusté avec du KOH à des valeurs de 7.35 à 7.40. La solution extracellulaire utilisée pour superfuser les cardiomyocytes était similaire au Tyrode sauf en ce qui a trait au NaCl 140 mM, CaCl2 1.25 mM et Glucose 5.6 mM, le pH était ajusté de la même façon, aux mêmes valeurs. La solution de la pipette pour les mesures de courant en régime établi était constituée de (mM): K-Aspartate 120, NaCl 10, EGT A 5, Hepes 5 et MgA TP 5. Pour les expériences réalisées avec le méthylisobutyl amiloride (MIA), la solution de la pipette était la suivante (mM): KCl 137, Hepes 5, EGTA 0.1, AMPc 0.3 et MgATP 5. Pour les deux types de solutions de la pipette, le pH était ajusté à 7.20-7.25 à l'aide de KOH. Pour les protocoles en inhibition métabolique, le MgA TP était omis et remplacé par 1 mM de MgCl2 et ce, pour les deux solutions.
Dans les expériences faites avec le barium, celui-ci a été ajouté sous fonne de BaCl2 à partir d'une solution stock aqueuse de 50 mM. Le carbonyl cyanure
m-chlorophenylhydrazone (CCCP, Sigma Chemical Co.) et la glibenclamide (GLIB, Sigma Chemical Co.) étaient dissout dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) en solution stock de 5 mM et de 50 mM respectivement. Les concentrations finales de véhicule n'ont pas excédé 2/1000. Le 4-aminopyridine (4-AP, Sigma Chemical Co.) a été utilisé à quelques reprises, pour la mesure des courants calciques, à partir d'une solution stock aqueuse de 0.6 M. Le méthylisobutyl amiloride (MIA, Research Biochemicals lnc.) était préparé avec de l'éthanol (95 %) en deux solutions mères différentes de IO et de 100 mM respectivement en fonction de la concentration finale utilisée soit 1 µMou 10 µM. Le véhicule n'excédait pas 0.01 %
17
2.3 Montage expérimental
Une chambre de perfusion (1 ml) faite sur mesure était placée sur un microscope inversé (Olympus, Modèle CKJ monté sur une table anti-vibration (TMC, Peacoby, ~ USA). Le tout était entouré d'une cage de Faraday. Au milieu de la chambre,
en amont de la cellule choisie, se tenait un embout duquel sortait la solution à perfuser contenue dans des flacons placés à un niveau supérieur . Le perfusat coulait donc par gravité à un débit de 1.5 ml/min. La chambre de perfusion renouvelait son contenu en moins d'une minute car le niveau de la solution était limité à 3
mm
par la succion, à partir d'un tube de petit diamètre placé à l'extrémité de la chambre, relié à deux autres bouteilles connectées en série et à une pompe à eau.2.3.1 Électrodes
Les électrodes utilisées étaient faites de verre (Pyrex 7740, Corning Glass Work, New-York, NY, USA, diamètre interne 0.975 mm et externe 1.470 mm). Les électrodes étaient confectionnées en 2 étapes à l'aide d'une étireuse verticale (Narishige, Type PP-83, Scientific Instrument Lab., Japon). Les électrodes remplies avaient une résistance (dans la solution extracellulaire) de 4 à 7 MQ. La solution de la pipette était filtrée à travers un filtre Millipore (0.22 µm) et maintenue sur la glace durant toute la durée des expériences. L'électrode de référence est une pastille de Ag-AgCl 2 (Modèle RC 1, WPI
2.3.2 Équipements
Les enregistrements des courants ioniques transmembranaires ont été effectués à l'aide d'un amplificateur Dagan 8800 (Dagan Corporation, Minneapolis, MN, USA) avec un préamplificateur ayant une résistance de rétroaction CRrn) de 100 MQ. L'amplificateur était couplé à un stimulateur Grass S88. La visualisation des signaux était réalisée à l'aide d'un oscilloscope à mémoire Tektronix (Modèle 5113, Beaverton, OR, USA) et filtrés à 3 kHz (Frequency Devices, modèle 902). L'amplificateur était aussi relié à un ordinateur IBM AT via un interface analogue-digitale (fNDEC Systems Inc., Sunnyvale, CA, USA). L'acquisition automatique des données et la génération des pulses de commande se faisaient via le programme Basic Fastlab V.4.5 (fNDEC Systems Inc. ).
2.4 Mesures électrophysiologiques
2.4.1 Critères de viabilité cellulaire
Quelques gouttes de cellules en suspension étaient ~outées dans la chambre.
Avant de démarrer la perfusion, un temps d'attente d'environ 5 minutes était nécessaire pour permettre aux cellules de se déposer et d'adhérer au fond de la chambre. La sélection des cellules devait répondre à plusieurs critères d'inclusion. Au niveau morphologique, les cellules devaient avoir des striations bien visibles et des sarcomères de longueur uniforme. De plus, leur cytoplasme ne devait pas avoir une apparence granuleuse et la surface du sarcolemme devait être lisse sans bulles ou grosses irrégularités. De façon fonctionnelle, seules les cellules relaxées, sans activité contractile ("quiescent") ayant un potentiel de membrane au repos (PR) égal ou plus négatif que -70 mV étaient considérées. Finalement,
19 si une cellule montrait des variations au niveau de son potentiel de membrane (V m)
démontrées par des fluctuations prononcées du courant de maintien (IH), elle était abandonnée. La figure 2.3 8 donne un exemple de cellule répondant aux critères morphologiques de sélection. En A, on observe une vue d'ensemble à un moindre grossissement où on remarque des cellules en bon état, des débris cellulaires et une cellule nécrosée.
2.4.2 Propriétés passives
Après avoir mesuré la résistance de l'électrode dans le bain, le potentiel de jonction était corrigé à zéro. Suite au choix d'une cellule, le joint électrique pipette-cellule était formé par apolication d'une pression négative. Celui-ci devait avoir une résistance égale ou supérieure à l GQ. Par la suite, la capacité du système électrode-bain était compensée. Après rupture de la membrane cellulaire par une pression négative, le potentiel de membrane au repos (PR) était estimé en voltage imposé comme le potentiel auquel le courant de maintien (IH) était égal à zéro. La figure 2.4 illustre la méthode employée pour déterminer les propriétés électriques passives ainsi que le circuit équivalent du système cellule-électrode en configuration cellule entière (A). Le courant capacitif induit par l'application d'un pulse dépolarisant et d'un hyperpolarisant de 10 m V, d'une durée de 25 ms, à partir d'un potentiel de maintien (V
i.J
de 0 m V était déterminé (8). Par intégration de ce courant, nous pouvions déterminer la capacité d'entrée (C"'J et la surface membranaire assumant une capacité membranaire spécifique (Cm) de 1 µF/cm2• La résistance d'entréeA
B
Figure 2.3: Photographies de la préparation cellulaire à deux agrandissements différents. La cellule en B correspond à celle retrouvée au milieu en A. Cette cellule a un diamètre de
25µm.
25µm
A
B
c
-1
1V
~----:..-i
______,~
11
I~
- -__ -_--_-_-_-_-_-_--_-_-_-_-
_t_-_~2---'-\l
v--21
Figure 2.4: Mesures des propriétés électriques passives. A. Diagramme représentant les éléments du circuit équivalent de la cellule en configuration cellule entière. Rs> résistance série,
R.nt>
résistance d'entrée etcent>
capacité d'entrée. Les deux derniers constituent les propriétés passives de la cellule. B. Courant capacitif induit par un pulse dépolarisant (trace du haut) ou hyperpolarisant (trace du bas) de 10 mV à partir d'un potentiel de maintien de 0 mV. C. Mesure du courant en régime établi. Ce courant (lb li) nous permet de calculer la résistance d'entrée. Réalisé à partir du même protocole de stimulation mais à partir d'un potentiel de maintien égal au potentiel de repos membranaire, ici de -70 m V. Calibrations pour B. et C.: 2 ms et 290 pA.égal au PR (C).
La résistance série (RJ était alors compensée au maximum possible, soit jusqu'au point où débuteraient des oscillations. Le courant de maintien était mesuré tout au long des ~xpériences (valeur directe). La plupart des résultats présentés dans le chapitre
suivant sont corrigés pour le courant de maintien.
2.4.3 Courants membranaires
Les
relations courant-voltage (JJV) ont été prises à une fréquence de 0 .2 Hz. La figure 2.5 montre les différents protocoles de stimulation utilisés. Pour toutes les expériences, le potentiel de maintien était de -80 mV. Pour le courant de fond {I,,.) (A), l'étendue de la courbe W était de-120 à .;-40 mV. Pour l'enregistrement du courant calciqueOc.,J
{B), le potentiel de maintien était aussi de -80 m V mais un prépulse de 200 ms à un voltage de -40 m V était appliqué afin d'inactiver le courant sodique. L'étendue de la courbeIN était de -50 à +40 mV. Dans toutes les expériences quelque soit le courant enregistré, l'incrément était de 10 m V et la durée du pulse de 400 ms. Pour suivre le décours temporel des effets à l'étude, les cellules étaient stimulées chaque minute par un train de cinq impulsions d'une fréquence de 0.5 Hz, dont le protocole dépendait du courant étudié. Pour Iss, la cellule était stimulée du potentiel de maintien à -1 OO ou +20 m V en fonction de la drogue utilisée (C). Pour~ la cellule était stimulée à 0 m V, soit près du courant maximal
· (D). Ces deux derniers protocoles de pulse avait une durée de 200 ms, durée similaire au potentiel d'action chez le lapin. Ceux-ci permettaient d'établir la présence d'un "run-down", le régime établi pour chacun des effets et aussi de déterminer le moment approprié pour la mesure subséquente de la relation IN.
La figure 2.6 montre un exemple d'enregistrement pour chacun des courants. Pour le courant de fond (~), les mesures étaient prises à la fin du pulse de 400 ms en
prenant la valeur moyenne du courant entre les deux curseurs par rapport au courant de maintien (IH)- Quant au courant calcique, les valeurs de courant pic étaient mesurés entre le maximum de courant entrant et le niveau de courant à la fin du pulse.
2.5 Statistiques
Lorsqu'une comparaison statistique entre une condition expérimentale et son témoin était appropriée, le test-T de Student a été utilisé. Quand une comparaison s'avérait nécessaire au sein et entre différents groupes (3 et plus), une analyse de variance (ANOV A) était appliquée suivie d'un post-test de Tukey.
Le
degré de signification choisi est de P <0.05, sauf si indication contraire. Les données ont été exprimées comme moyenne± l'erreur standard de la moyenne (E.S.M.) (n =nombre de cellules, N =nombre de coeurs).
A
B
c
400 ms +40 m\' V11 = -80 mV -120 mV 400 ms-40~
200 ms 1 +40 mV _5() mVL
V11=
-80
mV 200 msD
.---, +20 mV 200 ms ,_ V11 = -80 mV .___ ______ ____. -1 OO m VFigure 2.5: Protocoles de stimulation. A. Pulses de voltage employés pour l'enregistrement du courant de fond (I..) afin de déterminer la courbe VV. B. Pulses utilisés pour construire la relation VV du courant calcique Ciea.1J C. Protocole de pulses servant au suivi du décours temporel des effets des drogues utilisées pour le courant de fond. En fonction de la drogue utilisée, la cellule est soit hyperpolarisée à -1 OO m V ou dépolarisée à + 20 m V. D. Pulse utilisé pour le suivi du courant calcique.
A
lss
lss
B
---····--·---·---·----··
t
Figure 2.6: Enregistrements représentatifs du courant de fond (A) et du courant calcique
(8). Les tracés en A ont été obtenus pour un potentiel de -60 et -1 OO m V à partir d'un Vu de -80 m V. Calibration: 50 ms et 640 pA B. Tracé obtenu à 0 m V selon le protocole illustré
à la figure 2.5 B. Calibrations: 50 ms, 875 pA
CHAPITRE ID RÉSULTATS
27
Au niveau du ventricule. la conductance de fond majeure est la conductance potassique gK1 (Irisawa et al., 1987). Le courant macroscopique (IK1) en association avec
cette conductance possède des caractéristiques qui lui sont propres. Il est indépendant du temps et démontre une courbe courant-voltage
à
rectification entrante. aussi appelée rectification anomale (Katz. 1992). Les enregistrements de la figure 2.6 démontrent cette propriété. Pour une même variation de voltage à partir du potentiel d'inversion du courant. (soit de± 20 mV dans la figure) le courant entrant s'avère être environ deux fois plus grand que celui sortant. De plus. la conductance gK1 varie en fonction, à la fois du potentiel demembrane et de la concentration externe en potassium. Finalement. le canal est bloqué par des cations comme le césium et le bariwn à basses concentrations (Kameyama et al., 1983 ).
3.1 Caractérisation des propriétés passives
Au début de chaque expérience. les propriétés électriques passives ont été déterminées avant le début de chacun des protocoles expérimentaux. Le potentiel de membrane au repos a aussi été déterminé. Le tableau 3.1 présente les valeurs de ces différents paramètres. Les cellules sous-endocardiques étaient au nombre de 78 en provenance de 28 coeurs, alors que celles sous-épicardiques représentaient une population de 19 cellules provenant de 12 coeurs. Au niveau de ce dernier type cellulaire. il était plus difficile d'avoir une résistance joint-pipette plus grande que 1 GQ, d'autant plus que dans environ 75% des cas lorsque la membrane était rupturée, nous avions un courant de fuite important En comparaison avec les cellules endocardiques, celles de la région sous-épicardique semblaient tolérer beaucoup moins bien notre procédé d'isolation avec un
rendement souvent inférieure à 20% et une fragilité membranaire très accrue même si la cellule présentait des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles adéquates.
La résistance cf entrée (l) mesurée lors d'une dépolarisation a une valeur pl us élevée que celle suite à une hyperpolarisation (II), autant dans les cellules sous-endocardiques que sous-épicardiques. Ceci reflète la rectification entrante caractéristique du courant de fond. Si l'on compare les valeurs des résistances d'entrée I et Il, on trouve que la différence entre les deux types cellulaires n'est pas significative. De façon similaire, le potentiel de repos des cellules sous-endocardiques et sous-épicardiques ne diffère pas significativement. D'autres auteurs ont obtenu des résultats semblables autant chez le lapin (Fedida et Giles, 1991) que chez le chat (Kimura et al., 1990 et Furukawa et al., 1991 ). Les valeurs obtenues pour la surface cellulaire de nos cellules sont en accord avec les valeurs rapportées dans la littérature pour des cardiomyocytes de mammifères adultes (Severs, 1989). Elle ne s'est pas révélée être différente au niveau des deux types cellulaires. Liu et al. ( 1993) ont rapporté des valeurs beaucoup moindres chez le chat étant de 4902 ± 628 µm 2
pour les cellules sous-endocardiques et de 4206 ± 1264 µm2pour celles sous-épicardiques.
Ces variations s'expliquent par la façon dont leurs mesures ont été prises. Elles représentent la surface hi-dimensionnelle du contour cellulaire mesurée à l'aide de photographies, en considérant les cellules comme des cylindres. Les valeurs de nos surfaces cellulaires ont été estimées à l'aide de la capacité d'entrée, ce qui tient compte des invaginations membranaires, surtout dûes au système T. Elles représentent alors, la surface membranaire réellement disponible pour le passage des courants ioniques. Nous avons aussi calculé la résistance membranaire spécifique correspondante pour les deux types cellulaires. De façon respective, elle ne s'est
pas
révélée être différente, ce qui suggère une conductance globale29
TABLEAU 3.1. Propriétés électriques passives des cardiomyocytes de lapin.
Variable: Type cellulaire
Sous-endocardique N:28, n:78 Résistance d'entrée I (MQ) 46.69 ± 2.1 0 Résistance d'entrée Il (MQ) 24.93 ± 0.78
*
Capacité d'entrée (pF) 97.03 ± 2.76 Surface cellulaire (µm2 ) 9702.54 ± 275.97Résistance membranaire spécifique 1 (kQ·cm2
) 4.81
Résistance membranaire spécifique II (k Q ·cm2) 2.57
Potentiel de repos (mV) -77.51 ± 0.50 Sous-épicardique N:l2, n:l9 55.97 ± 6.15 27.94 ± 1.75
*
84.95 ± 5.24 8494.57 ± 524.30 6.59 3.29 -75.62 ± 1.07Toutes les données sont exprimées en moyenne ± E.S.M sauf Rm. Les résistances d'entrée I et II correspondent à une dépolarisation et une hyperpolarisation de 10 m V, de façon respective, à partir d'un potentiel de maintien égal au potentiel de membrane au repos. N, nombre de coeurs; n, nombre de cellules.
*
P < 0.05 par rapport à R.01 I.de base similaire pour les deux types cellulaires.
Dans le but de vérifier si la différence de la taille des échantillons (78 vs 19), pouvait avoir biaisé les résultats, nous avons pris ces mêmes paramètres pour 14 couples, c'est-à-dire une cellule sous-endocardique et une sous-épicardique en provenance d'un même coeur. Les 14 couples proviennent de 9 coeurs, chacun comprenant de l à 3 couples. À la suite de tests-t de Student, les trois paramètres (R..,1, Ccn1 et PR) n'étaient pas
significativement différents entre les deux types cellulaires. Suite à ce résultat, nous avons fait une analyse de variance suivie d'un post-test de Tukey, considérant chaque coeur comme étant un groupe, indépendamment du type cellulaire afin de voir s'il pouvait y avoir hétérogénéité intrinsèque entre les coeurs. Les résultats obtenus concordent pour tous les paramètres avec les valeurs du groupe entier, ce qui nous indique que les populations cellulaires sous-endocardiques et sous-épicardiques en conditions témoin sont homogènes dans le coeur de lapin en ce qui a trait aux propriétés électriques passives, à la surface cellulaire et au potentiel de repos. De plus, la différence de la taille d'échantillonage n'a pas biaisée les résultats.
3.2 Caractérisation du courant potassique à rectification entrante chez les deux types cellulaires.
La figure 3.1 A et B montre respectivement la courbe UV du courant de fond pour 14 cellules sous-endocardiques et sous-épicardiques. Les densités de courant entrant et sortant sont similaires pour les deux types cellulaires, tel que rapporté par Sanchez-Chapula et al. (1994) entre le muscle papillaire et les cellules sous-épicardiques du
31 ventricule de lapin.· Les deux courbes IN montrent une rectification entrante avec une région où la pente de la conductance est négative (-120 à -80 m V). Ces relations IN sont de forme "N-amorti" contrairement à d'autres espèces comme le chat où elles ont la forme d'un ''N" (Liu et al., 1993). Il nous arrivait aussi à l'occasion de voir cette forme de relation UV mais elle était toujours, pour nos préparations, associée à un joint pipette-cellule d'une résistance inférieure à l GQ. L'équipe de Liu n'a remarqué aucune différence pour les trois types cellulaires étudiés (sous-épicardique, sous-endocardique et les cellules en milieu du myocarde). Par contre, chez le cobaye Martin et al. ( 1995) ont démontré que la relation IN était aussi de forme "N-amorti".
Le potentiel d'inversion du courant de fond global était aussi similaire pour les deux types cellulaires étant de -78.65 ± 1.41 m V pour les cellules sous-endocardiques et de -75.96 ± 1.32 m V pour celles sous-épicardiques. Les valeurs se rapprochent de celles montrées au Tableau 3.1 pour le potentiel de repos, ce qui suggère que le courant à rectification entrante, déterminant du potentiel de repos, représente la composante majeure du courant 155•
3.2.l Isolation de Ii,:1
Étant donné que Iss est composé principalement par IKh nous avons voulu isoler celui-ci des autres courants de fond possibles retrouvés en régime établi. Nous avons donc superfusé les cellules avec une solution contenant 1 OO µM BaCl 2' Comme mentionné
préalablement ce cation est un bloqueur très spécifique du canal potassique à rectification entrante jusqu'à une concentration de 1 OO µM. Le barium agit sur le canal en réduisant la probabilité d'ouverture de celui-ci (Kameyama et al., 1983).
A
5
0 ,--.._-5
µ..--2'
~ p. -10 '--"' "' "' ... -15 -20 -25 -140-120-1 OO -80 -60 -40 -20 0 20 40 Potentiel de membrane (mV)B
5 0 -5 ,--.._ µ.. -10 p.--
~ p. -15 '--"' "' "' ... -20 -25 -30 -140-120-100-80 -60 -40 -20 0 20 40 Potentiel de membrane (m V)Figure 3.1: Relation courant-voltage du courant de fond Ciss) en condition témoin. A. Correspond à 14 cellules sous-endocardiques (N=9) et B. à 14 cellules de type sous-épicardique (N=9). Les valeurs représentent
X±
E.S.M. et étaient corrigées pour le courant de maintien.En considérant IK1 comme étant la fraction du courant global au régime établi qui est
bloquée par le bari~ nous avons isolé cette composante en faisant la différence entre les
courbes UV en témoin et après l'addition de barium. La figure 3.2 A montre les effets du Ba2• sur la relation courant-voltage (moyenne pour 7 cellules sous-endocardiques ayant un
potentiel de repos de -77.03 ± 2.37 mV) et le courant sensible au Ba2•• La figure 3.2 B représente les résultats obtenus, cette fois chez 6 cellules sous-épicardiques ayant un potentiel de repos moyen de -72.17 ± 2.30 mV. Dans les deux types cellulaires, le barium a aboli la rectification entrante et a déprimé fortement le courant à tous les niveaux de potentiel. L'effet est toutefois moins important pour les courants sortants, en raison de leur plus faible amplitude. En terme de pourcentage, le bloc du courant à -100 mV était d'environ 92 % pour les cellules sous-endocardiques et de 80 % pour celles sous-épicardiques, alors que pour un voltage de -50 m V, il était de 70 % dans les deux types cellulaires. Des résultats similaires ont été obtenus chez le cobaye en présence de 2 mM Ba2-(Hirano et Hiraoka, 1986). Il est intéressant de mentionner que selon leur étude, à cette
concentration en barium, il y a développement d'une activité automatique au niveau des cellules du ventricule, manifestée par l'apparition d'une dépolarisation diastolique lente. Le courant sensible au Ba2• pour les deux types cellulaires n'est pas
significativement différent avec comme moyenne pour un voltage de -100 mV, -12.36 ±
1.30 pA/pF pour les cellules sous-endocardiques et de-13.85 ± 3.33 pA/pF pour les cellules
sous-épicardiques. L'asymétrie entre les valeurs de la résistance d'entrée 1 et II disparaît après l'addition de Ba2•• En plus, la Ren1 à un potentiel de -100 m V est augmentée à 752 MQ
sous Ba2-alors qu'elle était de 30 MO en témoin (voir insert 3.2 A). Le potentiel d'inversion
pour le potassium est similaire. De plus, pour des potentiels plus positifs que -20 m V, le courant est négligeable. On peut clairement remarquer que la courbe JJV sensible au barium est pratiquement la même que la courbe en condition témoin, et ce pour les deux types cellulaires (Figures 3.2 A et 8). Ceci confirme que la composante principale et dominante du courant de fond est IK1•
3.2.2 Effet de la variation de la [
K+L
sur (55Nous avons aussi vérifié la sensibilité de ce courant aux variations de potassium extracellulaire. Il est connu qu'une augmentation de la pente de la courbe IN du courant entrant, se produit avec l'augmentation de la concentration externe en potassium. Plus précisément la conductance du canal, déterminée avec des mesures en canal unitaire,
est proportionnelle à la racine carrée de la [K
-1
0 (Kameyama et al., 1983 ). Ceci correspond aussi au comportement du courant global dans des myocytes du septum chez le lapin (Cai, 1993). Chez le cobaye, le V m au zéro-courant se déplace de 49 m V pour un changement de dix fois de la [Kt (Sakmann et Trube, 1984).Dans nos expériences, les deux types cellulaires ont répondu de façon similaire à une variation du potassium. Furukawa et al., ( 1992) rapportent aussi chez le chat une sensibilité aux ions potassium identique dans les cellules endocardiques et sous-épicardiques. La figure 3.3 présente comme exemple, la réponse d'une cellule sous-épicardique à l'augmentation de K-0 de 5 à 10 mM. Le V m au zéro-courant s'est déplacé de -78 à-63 mV dans les minutes qui ont suivi le changement en potassium, ce qui confinne que le courant
lu
contient une forte composante potassique si on suppose une relation linéaire entre le potentiel d'inversion (Ein .. ) et le logarithme de K-"' on trouve aussi 49 m V.A
35 5 0 0 -5 -5 G:' o.. G:' o.. -10--
< -10 8<
8 -15 -20 -25..
t - - - - ---1? i..
-30 __.___---~~---~---+----~---; -140 -120 -100 -80 -QO -40 -20 0 20 40 Potentiel de membrane (mV) 5 -5 -15 -20 -25 -140 -120 -100 -80 -QO -40 -20 0 20 40 Potentiel de membrane (mV)B
-5 -10tt:
-10<
2 o..<
-15 8-
o.. -15 -20 -20 -25 -25 -30 -30 -140 -120 -100 -80 -QO -40 -20 0 20 40 -140 -120 -100 -80 -QO -40 -20 0 20 40Potentiel de membrane (mV) Potentiel de membrane (mV)
Figure 3.2: Effets du Ba2
- sur la relation courant-voltage du courant de fond (I .. ) dans des
cellules sous-endocardiques, n=7 (A) et sous-épicardiques, n=6 (B). À gauche, les symboles vides représentent les conditions témoins et les symboles pleins, les courbes I/V obtenues en présence de Ba2+ (1 OO µM). À droite, le courant sensible au Ba2+. Les valeurs expriment X ± E.S.M. Valeurs corrigées pour le courant de maintien. L'insert en A, à gauche montre des enregistrements correspondants à des stimulations de -1 OO et 0 m V respectivement en témoin (symboles vides) et après l'ajout de Ba2+ (symboles pleins).
En doublant la concentration externe en potassi~ la densité de courant entrant a augmenté
d'environ 30 %, soit à un voltage de -1 OO m V de -14.21 à -20.57 pNpF. Cependant, ceci ne reflète pas une augmentation de la "chord conductance" mais plutôt l'augmentation de la force motrice à cause du déplacement du Eim Les valeurs calculées pour un potentiel de -100 mV sont de 0.65 pS (K-0=5mM) et de 0.56 pS (K'0=IO mM). L'inspection de la courbe
IN ne reflète pas non plus une augmentation de la pente pour des valeurs négatives au Ein'· Pourtant, la réponse observée correspond à ce qui est connu pour les propriétés de 1 KI et le manque de changement important de gK1 n'est pas évident parce que l'augmentation du K -0
n'était pas très importante. D'autre part, le changement du Eüw que nous avons trouvé correspond à la variation du.PR avec K ~ 0 dans des cellules sous-épicardiques au niveau du coeur entier chez le lapin (Ruiz-Petrich et al., 1991 et Ruiz-Ceretti et al., 1983 ). De plus, le changement du courant entrant montré dans la figure 3.3 reproduit les observations de Cai ( 1993) sur les cellules isolées du septum de lapin. Finalement. le phénomène de "crossing-over" observé est considéré comme étant une propriété caractéristique du courant
IKI·
3.3 Réponse à l'inhibition métabolique
3.3.1 Description générale: qualitative
Dans cette section, nous présenterons la caractérisation de la réponse au carbonyl cyanure m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Le CCCP inhibe la phosphorylation oxydative au niveau de la mitochondrie en réagissant très rapidement avec la cytochrome oxydase (Goodman et Gilman, 1990 et Heytler et Prichard, 1962). L'inhibition métabolique
,... µ... o.
<
o. '--' ~ ~ -0 -10 -20 -30 --- r---1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 Potentiel de membrane (Vm) 37Figure 3.3: Effet de la variation de la [
K-l
sur la relation courant-voltage du courant de fond }55 dans une cellule sous-épicardique. Les symboles pleins représentent une concentration de 5 mM K+0 et ceux vides 10 mM. Les valeurs ont été corrigées pour le courant de maintien.mitochondriale en présence de substrats glycolytiques représente une simulation des conditions retrouvées in vivo en hypoxie modérée. Dans des myocytes isolés, l'inhibition métabolique entraîne l'ouverture des canaux potassiques sensibles aux variations de la concentration intracellulaire en adénosine tri-phosphate (A TP). Le courant induit par ces conditions est indépendant du temps et démontre une rectification sortante. Il a été décrit au niveau cardiaque pour la première fois par Noma ( 1983 ). L'usage du CCCP a été préféré à celui du cyanure (CN") car il présente une plus grande stabilité en solution, donne une réponse identique à celle du cN· et son effet est rapidement réversible même à des concentrations au-delà de 50 µM (de Lorenzi, 1993, de Lorenzi et al., 1994 et Cai, 1993 ).
Les canaux .KATP ne sont pas actifs en conditions normales parce que le niveau intracellulaire physiologique en A TP (5-10 mM) empêche leur ouverture (Nichols et Lederer, 1991). La glibenclamide (GLIB), bloqueur spécifique du courant IK-Arrjusqu'à une concentration de 1 OO µM, n'affecte pas la configuration du potentiel d'action dans les préparations unicellulaires ou multicellulaires perfusées en conditions témoins (Cole, 1993 et de Lorenzi, 1993). Si ce courant était présent, la GLIB aurait dû allonger la durée du potentiel d'action. En accord avec ces observations, la GLIB (30 µM) n'a eu aucun effet sur le courant de fond dans des myocytes isolés en conditions contrôles (Cai, 1993). Ces données appuient la notion que IK·ATP ne contribue pas à la conductance membranaire de base ni au potentiel d'action en conditions physiologiques normales.
Lorsque les cellules ont été exposées au CCCP (600 nM) en absence de Mg-A TP dans la pipette, nous observions une grande augmenëation du courant de fond dans le sens sortant (Fig. 3.4 A). Cette concentration a été choisie en raison du délai raisonnable entre l'exposition au CCCP et l'induction de la réponse. La présence de CCCP n'a pas eu
39 d'influence sur le comantà-100 mV, étant de -697.07 pA en témoin et de -661.18 pA avec le CCCP. À +20 mV, le courant a augmenté de 114.36 pA (témoin) à 4041.54 pA en présence de CCCP, ce qui représente une augmentation d'environ 35 fois par rapport aux conditions contrôles. Cette augmentation ne peut être associée à la perte du joint pipette-cellule, car nous suivions toujours le courant de maintien qui n'a pas subi de modification pendant le développement du courant sortant. De plus, la cellule a conservé les caractéristiques propres aux critères de sélection. On peut aussi remarquer que le courant stimulé par le CCCP est indépendant du temps et en conséquence fait parti du courant de fond La cellule était maintenue à -80 m V et ces tracés n'ont pas été corrigés pour le courant de maintien. La cellule ayant servi à ces enregistrements avait une surface cellulaire de 8043.83 µm2•
La figure 3.4 B montre l'effet du CCCP sur le courant de fond en fonction du temps pour un potentiel de membrane de +20 mV. L'induction du courant sensible à l'A TP ne se manifeste pas avant 6 minutes et que dmant cette période de latence, le courant de fond était très stable, près de 0 pAfpF, reflétant la rectification entrante de I K~ Le courant
sortant augmente rapidement et atteint en moins de 2 minutes une valeur près de 50 pA/pF. Dans l'exemple de la figure 3.4, l'augmentation était de 20 pAfpF en 30 s. Ce décours temporel de la réponse a aussi été observé pour l'effet du 2,4-dinitrophénol (DNP) sur des myocytes isolés du cobaye (Isenberg et al., 1983). La courbe de la figure 3.4 Ba été corrigée pour le courant de maintien.
3.3.2 Description générale: quantitative
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30 G:' o. ~ 20 -5 -10 -§
0 - 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 100 200 300 400 500 Temps (s)Figure 3.4: Effet du CCCP sur le courant de fond Iss A Enregistrements typiques du courant à -100 m V et à + 20 m V à partir d'un V H=-80 m V. Les cercles vides correspondent aux conditions témoins, les pleins à la présence de 600 nM CCCP. Calibrations: 40 ms, 1000 pA. B. Décours temporel de l'augmentation du courant sortant en régime établi à + 20 m V à partir d'un VH de -80 mV, en présence de CCCP. Valeurs corrigées pour le courant de maintien.
41 sous-endocardique (N=l3) et 7 en provenance sous-épicardique (N=4).
La figure 3.5 montre les différentes courbes courant-voltage avant et après l'addition de CCCP (gauche), ainsi que les courbes rN du courant induit par le CCCP, c'est-à-dire la différence de courant entre les conditions contrôles et le courant développé en présence de CCCP (droite). Les deux figures en (A) représentent les cellules sous-endocardiques et en (8) les cellules sous-épicardiques. Dans les deux types cellulaires, on peut remarquer que la courbe IN du courant une fois que l'effet du CCCP a atteint son régime établi ne présente plus la forme de "N-amorti" caractéristique des conditions contrôles. De plus, à des V m de -120 à -70 m V inclusivement, le courant entrant n'a pas
varié de façon significative avant et après l'ajout de CCCP. Les E.S.M. assez élevées au niveau de l'étendue de voltage de -30 à +40 m V des deux courbes IN des cellules sous-épicardiques (B), en présence de CCCP, peuvent être attribuées au nombre restreint de cellules (n=7) en provenance de cette région.
Afin de vérifier si le courant induit par le CCCP était similaire dans les deux
types cellulaires, nous avons effectué des tests-t de Student pour des voltages de -1 OO, -l 0 et +30 mV. La densité de courant n'était pas différente à ces trois voltages, ce qui suggère en principe que les deux populations ne comportaient pas de différences significatives quant au courant induit par le CCCP.
Cependant, en faisant une inspection critique des données individuelles, nous avons remarqué une forte hétérogénéité quant à l'amplitude des courants dans les deux groupes cellulaires.
n
semblait y avoir des cellules qui répondaient très fortement au CCCP et d'autres de façon moindre. Nous avons donc poursuivi une analyse quantitative plus approfondie afin de réaliser une analyse de variance pour vérifier l'hétérogénéité de chacuneG:' c.. ... ~ 8 _ -:. G:' c.. ~ 8 _-:. 50 50 40 40 30 30 20 G:' o. ... 10 ~ 20
-=
V> .!'.! 0 10 -10 0 _____________ L _________ -20 1 1 1 1 1 -30 -10 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60Potentiel de membrane (mV) Potentiel de membrane (mV)
B
60 60 50 50 40 40 30 20 G:' o. 30<
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10 V> 20 1 .!'.! 1 1 0 1 1 10 1 1 -10 1 1 1 0 ---~---20 1 1 1 1 -30 -10 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20Potentiel de membrane (mV) Potentiel de membrane (m V)
Figure 3.5: L'effet de 600 nM CCCP sur les courbes courant-voltage du courant de fond. A. Courbes l/V moyennes de 26 cellules sous-endocardiques et B. de 7 cellules sous-épicardiques. Les figures de gauche représentent les courbes l/V du courant de fond en conditions témoins (symboles vides) et celles du courant une fois que l'effet du CCCP a atteint son régime établi (symboles pleins). Les figures de droite correspondent aux courbes W du courant induit par le CCCP. Toutes les courbes l/V ont été corrigées pour le courant de maintien. Les valeurs sont exprimées en X ± E.S.M.
