Pépite | Recherche et caractérisation du potentiel antiviral et probiotique de nouvelles souches de bactéries lactiques d'origine vaginale

Texte intégral

(1)Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Université étranger. Doctorat Université Libanaise THESE EN COTUTELLE Pour obtenir le grade de Docteur délivré par. L’Université de Lille1 Sciences et Technologie et. L’Ecole Doctorale des Sciences et Technologie (Université Libanaise) Spécialité : Microbiologie Médicale et alimentaire Présentée et soutenue publiquement par. AL KASSAA Imad Le 30 septembre 2014. Recherche et caractérisation du potentiel antiviral et probiotique de nouvelles souches de bactéries lactiques d'origine vaginale. Directeurs de thèse : Pr. HAMZE Monzer. Pr. DRIDER Djamel. Membre du Jury Pr. Dolla SARKIS, Université Saint-Joseph, Beyrouth (Rapporteur) Pr. Berthe Marie IMBERT, Université de Nantes (Rapporteur) Pr. Ghassan MATAR, Université Américaine de Beyrouth Dr. Nour-Eddine CHIHIB, Université de Lille 1 Pr. Jacques MOKHBATE, Université Libanaise Dr. Mohamed AMICHE, CNRS, INSERM, Paris © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(2) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Remerciements. A l'issue de la rédaction de cette thèse, je suis convaincu que la thèse est loin d'être un travail solitaire. En effet, je n'aurais jamais pu réaliser ce travail doctoral sans le soutien d'un grand nombre de personnes dont la générosité, la bonne humeur et l'intérêt manifestés à l'égard de ma recherche m'ont permis de progresser dans cette phase délicate de « l'apprenti-chercheur ». Je remercie Université Lille1 pour leur soutiens financiers (bourse de mobilité) tout au long cette période. Votre soutien m’a beaucoup m’aidé. En premier lieu, je tiens à remercier mon directeur de thèse en France, Professeur Djamel DRIDER, pour la confiance qu'il m'a accordée en acceptant d'encadrer ce travail doctoral, pour ses multiples conseils et pour toutes les heures qu'il a consacrées à diriger cette recherche. J'aimerais également lui dire à quel point j’ai apprécié sa grande disponibilité et son respect sans faille des délais serrés de relecture des documents que je lui ai adressés. Enfin, j’ai été extrêmement sensible à ses qualités humaines d'écoute et de compréhension tout au long de ce travail doctoral.. Mes profonds remerciements vont à mon directeur de thèse au Liban, Professeur Monzer HAMZE, qui m’a accompagné tout au long de ma formation. Sa disponibilité et ses généreux secours au cours de certains de mes moments difficiles ont été d’une très grande qualité, et d’un immense réconfort; merci infiniment Monsieur Monzer HAMZE.. Je voudrais remercier grandement mon co-directeur de thèse en France, Nour-Eddine CHIHIB, pour toute son aide. Je suis ravi d’avoir travaillé en sa compagnie car outre son appui scientiﬁque, il a toujours été là pour me soutenir et me conseiller au cours de l’élaboration de cette thèse. Mes remerciements vont également au Professeur Didier HOBER pour m’avoir accueilli dans son laboratoire de Virologie au CHRU Lille. Votre accueil et soutient scientifique étaient pour moi un grand support qui m'a beaucoup aidé durant ma présence dans votre laboratoire. 2. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(3) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Mesdames Dolla SARKIS et Berthe Marie IMBERT m’ont fait l’honneur d’être rapporteurs de ma thèse, elles ont pris le temps de m’écouter et de discuter avec moi. Leurs remarques m’ont permis d’envisager mon travail sous un autre angle. Pour tout cela je les remercie.. Je remercie aussi tous les examinateurs membres de mon jury qui, à chaque étape de mon cursus de formation, m’ont prodigué d’utiles conseils qui m’ont aidé à bien structurer mon étude : il s’agit de Monsieur Jacques MOKHBATE, Ghassan MATAR et Mohamed AMICHE. Je tiens à remercier Professeur Pascal DHULSTER, directeur de l’institut Charles violette où j’ai travaillé en France, et mes sincères remerciements au Professeur Philippe Jacques, directeur adjoint de l’école doctorale SMRE.. Mes remerciements vont également à M .le Prof Mohamad KHALIL, Directeur du Centre AZM de Biotechnologie- Tripoli, pour la gentillesse et la patience qu'il a manifestées à mon égard durant cette thèse, pour toutes les facilités administratives menées de son part. J’aimerais aussi remercier le doyen de l’école doctorale sciences et technologie, M. le Prof Fawaz EL OMAR, pour son support et sa gentillesse. J’aimerais adresser un remerciement particulier à professeur Fouad DABOUSSI, Professeur à l’université Libanaise, pour sa gentillesse, sa bonne humeur et son soutien tout au long de ces années et surtout les derniers mois difficiles. Je tiens à remercier mes plus proches collègues, docteurs ou futurs docteurs, pour la bonne ambiance de travail : Marwan OSMAN, Michel WEHBE, Dima EL SAFADI, Rayane RAFEI, Sara KHALIFE, Dr. Bachar ISMAIL et Dr. Adnan HALABI.. Je tiens également à remercier tous les membres du "laboratoire" ProBioGEM et plus particulièrement Monsieur Max BECHET et Madame Cathy OUBLION pour leurs aides et leur gentillesse. Je passe mes remerciements avec mes sentiments d’honneurs pour mes amies et collègues au Laboratoire de Microbiologie au centre AZM, et très particulièrement Taha ABDO, Hussam KHALED, Mariam YEHIA, Farah OBEID, Iman DARWISH, Rayane CHAHAL et Hanine EL GHESH. 3. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(4) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Il y a une personne de très grande importance dans ma vie, qui m’accompagne et qui me soutient tout le temps par la force et l’énergie qui lui sont disponibles. Il s’agit de Hawa DAHABI, ma merveilleuse, splendide et vertueuse épouse, dont je ne pourrai mesurer l’apport dans l’accomplissement de cette formation. Dans tout ce que j’ai pu souffrir et obtenir, elle a été l’autre moi. Je te remercie infiniment ma chérie.. De plus, mes remerciements seraient incomplets, si je ne fais pas mention de mes enfants, qui ont pu supporter mon éloignement et ont pu continuer d’être sages en dépit de mon absence. Je vous adresse mes chaleureux remerciements, Tala et Omar. De même, que tous les membres de la grande famille AL KASSAA trouvent ici toute ma reconnaissance pour le soutien que chacun d’eux a pu apporter pour faire aboutir ce rêve.. 4. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(5) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Valorisation scientifique. Publications dans des revues à comité de lecture 1. Imad Al Kassaa, Monzer Hamze, Didier Hober, Nour-Eddine Chihib & Djamel Drider (2014) Identification of Vaginal Lactobacilli with Potential Probiotic Properties Isolated from Women in North Lebanon. Microbial Ecology. 67:722-734.. 2. Imad Al Kassaa, Ddier Hober, Monzer Hamze, Delphine Caloone, Anny Dewilde, NourEddine Chihib and Djamel Drider (2014). Vaginal Lactobacillus gasseri CMUL57 can inhibit herpes simplex type 2 but not Coxsackievirus B4E2. (soumis dans le journal Applied of Microbiology). 3. Al Kassaa, Didier Hober, Monzer Hamze, Nour-Eddine Chihib and Djamel Drider (2014). Antiviral potential of lactic acid bacteria and their bacteriocins. Probiotics and Antimicrobial proteins. Probiotics & Antimicro. Prot. DOI 10.1007/s12602-014-9162-6. 4. Ait Ouali F, Al Kassaa I, Cudennec B, Abdallah M, Bendali F, Sadoun D, Chihib NE, Drider D. (2014). Identification of lactobacilli with inhibitory effect on biofilm formation by pathogenic bacteria on stainless steel surfaces. Int. J. Food Microbiol. 191, Pages 116–124. Chapitre d'ouvrage Imad AL Kassaa, Yanath Belguesmia, Nour-Eddine Chihib, Monzer Hamze, Farida Bendali, Karim Naghmouchi, Ismail Fliss, Djamel Drider. Applications des bactériocines et bactéries lactiques dans le contrôle des pathogènes alimentaires. Book Chapter in Economica Edition (2014). 5. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(6) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Communications par Affiche 1.. Imad AL Kassaa. Recherche des nouvelles bactéries lactiques (LAB) à effet antibactérien et antiviral pour des applications médicales et alimentaires. Doctoriales® Lille Nord de France: Posters 2013.. 2. Imad AL Kassaa, Nour-Eddine Chihib et Djamel Drider. Evaluation of anti-herpetic activity of vaginal lactobacilli strains. 19eme Club des bactéries lactiques (CBL) 16 – 18 Octobre 2013, Bordeaux-France.. 3. Fatima Ait Ouali, Imad AL Kassaa, Nour Eddine Chihib, Djamel Drider et Farida Bendali. Valorisation of anti-biofilm activity of environnement lactobacilli strains agains S. aureus biofilm in different condition. 19eme Club des bactéries lactiques (CBL) Octobre 2013, Bordeaux-France.. Distinction scientifique (jeunes chercheurs) 1. Prix de l’innovation. Doctoriales 2013, 2 - 7 juin 2013 Lille-France. 2. Prix du meilleur poster dans le domaine de biologie. Journée doctorale 25 juin 2013, EDST-Beyrouth –Liban. 6. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(7) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Résumé Dans ce travail, nous avons déterminé la composition de la flore vaginale d'un échantillon significatif de femmes Libanaises, puis nous avons évalué l’effet antagoniste des souches lactiques notamment des lactobacilles contre certains pathogènes impliqués dans des infections chez la femme. Ainsi, sur les 135 prélèvements effectués, 53 isolats ont été identifiés par les méthodes de galerie API50 CH (Bio Mérieux, France) et pyroséquençage des régions variables (V1 et V2) du gène ADNr 16S. Les résultats obtenus ont montré une discordance entre les deux méthodes utilisées. Par ailleurs, un effet antagoniste, a été mis en évidence chez les isolats, contre les pathogènes suivants : Gardnerella vaginalis CIP7074T ), Staphylococcus aureus ATCC33862, Escherichia coli CIP103982, et Candida albicans ATCC10231. L’identification des espèces des bactéries antagonistes a été confirmée par séquençage complet du gène ADNr 16S. Sur la base de ce séquençage,. les 7 isolats antagonistes sont: Lactobacillus gasseri CMUL34, L.. fermentum CMUL54, L. gasseri CMUL57, L. acidophilus 67, L. gasseri CMUL80, L. gasseri CMUL99 et L. plantarum CMUL140. A noter que la souche L. plantarum CMUL140, a montré une forte activité anti-Staphylococcus aureus, et a été co-cultivée, ainsi, en présence de cette bactérie. L’activité anti-S. aureus a été révélée par un suivi de la cinétique de croissance. En sus du potentiel antagoniste de ces lactobacilles, nous avons regardé d'autres propriétés biologiques de ces souches pouvant permettre une application probiotique. Ainsi, nous avons évalué le taux d’hydrophobicité et le pouvoir d’autoaggrégation de 7 isolats antagonistes. En plus, l’absence du caractère pathogène chez les isolats, a été évaluée par l’absence du pouvoir hémolytique, l’absence de résistance aux antibiotiques et finalement l’absence de(s) plasmide(s). Trois. isolats. ont. montré des. propriétés intéressantes. d'hydrophobicité,. d'autoaggrégation et sont dépourvues d'activités hémolytiques. Afin d’évaluer l’effet antiviral de ces 3 isolats, des tests de cytotoxicité et d’adhésion sur une lignée cellulaire "Véro cell" ont été effectués. Les résultats ont montré que les trois isolats ne sont pas cytotoxiques. Le score et le pourcentage d’adhésion des lactobacilles sur les cellules Véro ont été déterminés, les résultats ayant montré que les trois isolats ont une capacité d’adhésion qui dépasse de loin les 80%. L’activité antivirale a été évaluée in vitro, vis-à-vis du virus herpétique de type-2 (HSV-2) et du virus non enveloppé CVBE4 comme virus contrôle. Les lactobacilles ont montré un effet anti-HSV-2. 7. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(8) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. modeste atteignant 30% environ, tandis que l’effet anti-CVBE4 était pratiquement absent. Les résultats de l’effet antiviral des lactobacilles sur le virus HSV-2 /CVBE4 ajoutés, en même temps que les lactobacilles, sur les cellules Véro (co-incubation) ont montré un effet antiviral remarquable, avec une réduction d’environ 60% de l’infection virale pour le HSV-2 et non pour CVB-4. L’évaluation de l’effet antiviral des lactobacilles ajoutés après infection des cellules Véro par HSV-2/CVBE4 (post-infection) ont montré un effet antiviral non significatif des lactobacilles. En plus, nous avons évalué l’effet antiviral du surnageant de cultures des lactobacilles sur la réplication virale. Ainsi, l’effet antiviral des surnageants, semble être dû à l’acide lactique puisque l’effet était notable avant la neutralisation. Finalement nous avons étudié l’éventuel effet de "Piégeage" des virus par les lactobacilles. La souche qui a montré la meilleure activité anti-HSV-2, L. gasseri CMUL57, a été retenue pour la suite de l’étude. L’activité antivirale de cette souche (CMUL57) a été étudiée plus largement dans le but d’expliquer le mécanisme de cette interaction bactérie/virus.. 8. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(9) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Abstract The aim of this work was to study the lactobacilli diversity of vaginal origin targeting samples from Lebanese women. Besides, we investigated the antagonistic properties of all isolated lactobacilli against a wide range of bacteria considered as pathogens and therefore responsible for urogenital infections in women. To this end, 135 samples were collected from different gynecological units in the region of North Lebanon. Overall, 53 lactobacilli isolates were obtained and identified by the API50 CH system (BioMerieux, France), and by a pyrosequencing method targeting the variable regions (V1 and V2) of the 16S rDNA gene. Notably, these two independent methods showed discrepancy and the discussion of our data was based on the identification obtained by the pyrosequencing method. Therefore, the antagonism was observed and confirmed only for 7 isolates. These antagonistoic isolates were then fully identified by sequencing the 16S gene (16S rDNA). The upomost activity was registered for Lactobacillus plantarum CMUL140 (L. plantarum CMUL140). Afterwards L. plantarum CMUL140 was challenged with Staphylococcus aureus and death curve of this pathogen was determined by cell count numbers and epifluorescence. In addition to the antagonism properties, we looked at other features that can be used in their design as potential probiotics. Among these properties, we assessed the antiviral effect of these three isolates, their cytotoxicity and adhesion tests on a "Vero cell" cell line. None of the tested isolates was cytotoxic and all of them carried out a strong adhesion activity. The antiviral activity in vitro was evaluated against the herpes simplex virus type-2 (HSV-2) and CVBE4, a nonenveloped virus used as a control. The anti-HSv-2 activity was studied under different experimental conditions including pre-post infection processes. As matter of fact, L. gasseri CMUL57 showed the strongest anti-HSV-2 activity; by a trapping mechanism, that needs to be fully deciphered.. 9. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(10) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Table de matières Valorisation scientifique........................................................................................................................5 Résumé ...................................................................................................................................................7 Abstract ..................................................................................................................................................9 Liste des Abréviations .........................................................................................................................12 INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................................... 14. Description des objectifs de recherche ..............................................................................................17 CHAPITRE I- REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................... 19. I-Revue Bibliographie .........................................................................................................................19 I.1 Bactéries lactiques ............................................................................................................................... 19 I.1.2. Caractéristiques, taxonomiques et bactériologiques des bactéries lactiques ................................... 19 I.1.3. Origines, diversités et classification des bactéries lactiques ........................................................... 20 I.1.4. Intérêts des bactéries lactiques dans le domaine alimentaire .......................................................... 21 I.1.5. Intérêts des bactéries lactiques dans le domaine médical ................................................................ 22 I.1.6. Lactobacillus ................................................................................................................................... 22 I.1.7. Rôle protecteur des lactobacilles au niveau vaginal ....................................................................... 24 I.1.7.1. Exclusion des pathogènes............................................................................................................. 25 I.1.7.2. Substances élaborées par les lactobacilles à effet antimicrobien ................................................. 25 A. Acides organiques (majoritairement acide lactique)........................................................................... 25 B. Peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée) ................................................................................................ 26 C. Bactériocines et substances similaires "Bacteriocin like inhibitory substances (BLIS)" ..................... 26 D. Arginine désaminase ............................................................................................................................ 26 I.1.8. Lactobacilles comme probiotiques .................................................................................................. 27 I.1.8.1. Généralités sur le terme "probiotique" ......................................................................................... 27 I.1.8.2. Critères de sélection des souches potentiellement probiotiques ................................................... 28 I.1.8.3. Effets bénéfiques des probiotiques ............................................................................................... 29 I.2. La flore vaginale normale naturelle (Microbiote vaginal) ................................................................. 31 I.2.1. Facteurs environnementaux et génétiques de la variation du microbiote vaginal ........................... 34 I.2.2. Définition et diagnostique de la vaginose bactérienne (VB) .......................................................... 35 10. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(11) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. I.2.3. Étiologie de la vaginose bactérienne ............................................................................................... 36 A. Vaginose bactérienne endogène........................................................................................................... 36 B. Vaginoses bactériennes iatrogènes....................................................................................................... 37 I.2.4. Epidémiologie de la vaginose bactérienne ..................................................................................... 40 I.2.5. Infections vaginales fongique : Candidose Vulvo-vaginite (CVV)................................................ 41 I.2.6. Les Infections sexuellement transmissibles (IST) .......................................................................... 41 I.2.6.1. IST bactériennes .......................................................................................................................... 42 I.2.6.2. IST parasitaire ............................................................................................................................. 45 I.2.6.3. IST virales (infections herpétiques) ............................................................................................ 47 I.2.7. Association entre vaginose bactérienne et IST y compris le VIH ................................................... 51 I.2.8. Antibiothérapie de la vaginose bactérienne et la question de récurrence ....................................... 52 I.2.9. Probiotique comme alternatif thérapeutique de la vaginose bactérienne ........................................ 53. Références .................................................................................................................................. 55 ARTICLE I – Revue.................................................................................................................. 83 Antiviral potential of lactic acid bacteria and their bacteriocins .............................................................. 84. Partie Résultats ........................................................................................................................ 109 Article II ................................................................................................................................... 109 Résumé ................................................................................................................................................... 111 Identification of vaginal lactobacilli with potential probiotic properties isolated from women in North Lebanon .................................................................................................................................................. 112. Partie Résultats ........................................................................................................................ 147 Article III ................................................................................................................................. 147 Résumé ................................................................................................................................................... 149 Vaginal Lactobacillus gasseri CMUL57 can inhibit herpes simplex type 2 but not Coxsackievirus B4E2 ................................................................................................................................................................ 151. Conclusion générale et perspectives ...................................................................................... 171 Annexe ...................................................................................................................................... 173 Chapitre d’ouvrage ................................................................................................................................. 173. 11. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(12) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Liste des Abréviations A.vaginae. Atobium vaginae. ACV. Acyclovir. ADN. Acide désoxyribonucléique. BLIS. Bacteriocin like inhibitory substances. BLSE. Beta-lactamase à spectre étendu. BVAB. Bacterial vaginosis associated bacteria. C. albicans. Candida albicans. C. trachomatis. Chlamydia trachomatis. CO2. Dioxyde de carbone. CVV. Candidose vulvo-vaginale. E. coli. Escherichia coli. FAO. Food and agriculture organization. FCV. Fmciclovir. FVI. Flore vaginale intermédiaire. G. vaginalis. Gardnerella vaginalis. GC. Guanine/cytosine. GRAS. Generally regarded as safe. H2O2. Peroxyde d’hydrogène. IC. Intervalle de confiance. IL1. Interleukine 1. IST. Infection sexuellement transmissible. IVU. Infection des voies urinaires. KOH. Hydroxyde de potassium. L.. Lactobacillus. M. hominis. Mycoplasma hominis. MRS. Man Rogosa Sharpe. MST. Maladie sexuellement transmissible. N. gonorrhoeae. Neisseria gonorrhoeae. NRPS. Non-ribosomial peptide- synthetase. OMS. Organisation mondiale de la santé. PCR. Polychain reaction. R. Rough. RC. Rapport de Cote 12. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(13) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. RENAGO. Réseau national des gonocoques. RR. Risque relatif. S. Smooth. S. aureus. Staphylococcus aureus. SCT. Syndrome du choc toxique. SCTM. Syndrome du choc toxique menstruel. SGB. Streptococcus de groupe B. SIP. Syndrome inflammatoire pelvien. T. pallidum. Tréponèma pallidum. T. vaginalis. Trichomonas vaginalis. TS. Travailleuses du sexe. TSCT-1. Toxine du syndrome du choc toxique. USA. United State of America. VACV. Valacyclovir. VB. Vaginose bactérienne. VCU. Virginia commonwealth university. VHS-2. Virus de l’herpès simplexe type 2. VIH. Virus de l’immunodéficience humaine. VPH. Virus de la papillome humain. VZV. Varicella-zoaster virus. WHO. World health organization. 13. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(14) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. INTRODUCTION GENERALE Le phénomène de phagocytose et l’existence de bactéries dont l’effet bénéfique pour la santé ont été découverts, au début du 20ème siècle, par Elie Metchnikoff (Gordon, 2008). La conclusion des travaux de Metchnikoff était que l’on pouvait annuler les effets pathogènes de certaines bactéries par l’adjonction des bactéries lactiques. Selon Pilar et ses collaborateurs (2008), les lactobacilles sont les bactéries lactiques les plus abondantes et importantes dans la flore vaginale. Les effets bénéfiques susmentionnés ont été ultérieurement étudiés donnant lieu à un nombre important des publications scientifiques. Les bactéries lactiques sont connues pour produire des composés actifs, à l'instar des acides organiques qui acidifient le milieu, le peroxyde d’hydrogène (H2O2), et des substances de nature peptidique appelées "bactériocines". Les bactériocines sont dotées d’activités antagonistes, contre de nombreuses bactéries, leur permettant ainsi de se développer préférentiellement et de s'implanter dans divers écosystèmes et matrices alimentaires (Klainhammer 1988; Jack et al., 1995; Matilla-Sandholm et al., 1999). Les bactériocines sont synthétisées par voie ribosomique et excrétées dans le milieu extracellulaire, et présentent une activité bactéricide ou bactériostatique (Klaenhammer 1988). Le spectre d’activité des bactériocines produites par les bactéries lactiques, a été longtemps décrit comme étant limité aux espèces phylogénétiquement proches des souches productrices (Jack et al., 1995; Chen et al., 2003). Néanmoins, plusieurs travaux ont montré des activités contre des souches bactériennes phylogénitiquement éloignées comme Campylobacter jeujuni (Line et al., 2008; Messaoudi et al., 2011; Messaoudi et al., 2012). En sus de cette activité antibactériennes, plusieurs études ont montré des spectres plus larges avec des activités antivirales notamment antiherpétiques (Wachsmann et al., 2003, Todorov et al., 2010, Al kassaa et al., 2014), et des activités antifongiques (Stoyanova et al., 2010). Ceci permet de qualifier les bactériocines de molécules intéressantes pour des recherches académiques, et offrant de réelles applications biotechnologiques. Les bactéries lactiques sont utilisées dans le secteur alimentaire comme starters ou agents d'affinage dans les fromageries. Outre les applications alimentaires, l'utilisation des bactéries lactiques est grandissant notamment comme probiotiques pour lutter , par exemples, contre les gastroentérites, les pathologies inflammatoires du tubes digestif (Liu et al., 2014), ulcères à Helicobacter pylori (Elliott et al., 1998 ; Ahmad et al., 14. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(15) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. 2013), syndrome du côlon irritable (Krzysztof et al., 2001), immunomodulation de la réponse immunitaire locale et systémique (Valeur et al., 2004 ; Vitality et al., 2014) et des vaginoses (Cianci et al., 2008 ; Bodean et al., 2013). Les probiotiques sont des micro-organismes vivants, lorsqu’ils sont ingérés d’une quantité suffisante, peuvent améliorer l'état de santé de l'hôte (FAO/WHO 2001). La notion de ''probiotiques'' a été développée par Metchnikoff en (1907), qui avait constaté que les paysans Bulgares, grands consommateurs de laits fermentés, vivaient très longtemps et en bonne santé. Ainsi, Metchnikoff avait suggéré l’ingestion des bactéries vivantes, particulièrement les bactéries lactiques pour réduire les désordres intestinaux et améliorer l’hygiène digestive, et donc augmenter l’espérance de vie (GournierChateau et al., 1994). Les lactobacilles sont des bactéries lactiques présentes naturellement chez l’homme et l’animal (Ring and Gatesoupe 1998). En effet, ils sont retrouvés dans la cavité buccale (Hammes et al., 1992), le tractus intestinal (Chen et al., 2013), l'estomac (Zaman et al., 2010) et le vagin (Petricevic et al., 2014). A la suite de cette partie introductive, nous focaliserons notre dissertation sur la flore vaginale humaine. En effet, la flore bactérienne vaginale saine est constituée d’un consortium de micro-organismes en équilibre et colonisant le vagin. Dans ce consortium, les lactobacilles sont considérés comme dominants formant une sorte de biofilm protecteur sur la muqueuse vaginale, empêchant ainsi la prolifération des germes pathogènes par inhibition de leur croissance, et leur adhésion (Mayaud et al., 1997). En absence de lactobacilles, la flore vaginale serait déséquilibrée, laissant la voie libre aux bactéries pathogènes de s'installer, se développer et provoquer des infections (Mayaud et al., 1997). La vaginose bactérienne est l’infection la plus fréquente des voies génitales de la femme dans le monde, et plus particulièrement dans les pays en développement (Smith et al., 2014). La prévalence de la vaginose bactérienne se situe entre 9% et 18% selon les études cliniques effectuées au Royaume Uni (Morris et al., 2001), et atteindrait 29% selon les enquêtes menées aux Etats-Unis (Koumans et al., 2007), et enfin elle dépasserait 50% dans les populations rurales en Afrique (Taylor et al., 2014). La vaginose bactérienne constitue un vrai problème de santé publique et sociétal. Elle fait l’objet de nombreux débats, surtout depuis l’avènement de l’infection à Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) (Remis et al., 2013). La première vague de ces débats a porté sur le rôle de la vaginose bactérienne dans les infections des voies génitales hautes telles que le Syndrome Inflammatoire Pelvien (SIP) (Schwebke et al., 15. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(16) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. 2003; Miller et al., 2004), dont les issues sont défavorables à la conception, telles que les fausses couches, les accouchements prématurés, et la prématurité (Donders et al., 2000; Hay 2004; Oakeshott et al., 2004; de Seta et al., 2005). Il y a aussi les échecs de la fécondation in vitro (FIV) (Ralph et al., 1999; Liversedge et al., 1999). La deuxième vague des débats a porté, quant à elle, sur le rôle de la vaginose bactérienne dans la survenue ou l’évolution clinique des Infections Sexuellement Transmissibles (IST) comme la trichomoniase, la chlamydiase, ou la gonococcie (Moi et al., 1990; Joesoef et al., 1996; Uma et al., 2005), l'herpes simplex virus de type 2 (HSV-2) (Nagot et al. 2007 ; Kaul et al., 2007), et les infections par le VIH (Taha et al., 1998; Jamieson et al., 2001). La dominance des lactobacilles dans le microbiote vaginal sain et leur diminution significative lors de la vaginose bactérienne a conduit à l'utilisation, comme probiotiques, de diverses espèces de lactobacilles par voies orale et vaginale afin de reconstituer la flore vaginale normale (Reid et al., 2001). Ravel et al (2011) ont rapporté que Lactobacillus crispatus, L. iners, L. jensenii et L. gasseri sont les espèces les plus fréquentes d'origine vaginale. Par ailleurs, certaines souches de lactobacilles semblent coloniser le vagin après administration orale ou vaginale (Morelli et al., 2004). A noter que les lactobacilles peuvent être utilisés pendant une longue période sans effets secondaires, ce qui constitue une alternative prometteuse pour le traitement antimicrobien, en particulier dans le contexte de la vaginose bactérienne récurrente (Reid et al., 2002; Falagas et al., 2007).. 16. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(17) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Description des objectifs de recherche Le travail de recherche développé dans le cadre de cette thèse inclut: Partie 1: Une revue bibliographique sur le potentiel antiviral des bactéries lactiques et des bactériocines.. Partie 2 : Une étude de la diversité de la flore lactique, et plus particulièrement des lactobacilles, isolés de prélevéments vaginaux d'un échantillon significatif des femmes de la région nord du Liban. Les souches isolées ont été caractérrisées pour leur potentiel probiotique. Partie 3: Une étude consacrée aux interactions bactéries lactiques-virus, il s'agit plus particulièrement d'étudier le potentiel inhibiteur des lactobacilles isolés dans cette étude vis à vis Herpès génitaux (HSV-2). 17. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(18) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Chapitre I Revue Bibliographie. 18. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(19) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. CHAPITRE I- REVUE BIBLIOGRAPHIQUE. I-Revue Bibliographie. I.1 Bactéries lactiques I.1.1. Généralités et historique des bactéries lactiques Les micro-organismes du lait acidifié ont été définis comme bactéries lactiques depuis le 20eme siècle (Snowdon et al., 2006). Lister avait isolé en 1873, la première bactérie lactique qu’il a dénommé alors Bacterium lactis, et il s’agissait de Lactococcus lactis selon Axelsson et al. (2004). Les bactéries lactiques sont fréquentes dans le lait, la viande, les boissons fermentées, et les végétaux. Elles font également partie des flores buccale, intestinale et vaginale des mammifères (Salminen et al., 2004; Audisio et al., 2010). Orla Jensen (1949) a consacré une partie de sa carrière à l'étude des bactéries lactiques (monographie 1919). Il a utilisé des caractéristiques taxonomiques, cidessous, pour classer ces bactéries: 1- morphologie (cocci ou bâtonnet, formation tétrade), 2-fermentation de glucose (homo ou hétérofermentation), 3- croissance à des températures extrêmes entre 10° C et 45° C. La mise en culture des bactéries lactiques nécessite des milieux riches en différents nutriments (sucres, acides aminés, acides gras, sels, vitamines) et des conditions de culture pauvres en oxygène (Hammes and Hertel 2006). I.1.2. Caractéristiques, taxonomiques et bactériologiques des bactéries lactiques Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif, immobiles, non-sporulantes, dépourvues de catalase. Elles exigent des nutriments simples en raison de leur faible capacité protéolytique et lipolytique. Elles nécessitent des acides aminés, purines et pyrimidines et des vitamines comme besoins nutritifs (Jay et al., 2005). Il existe des bactéries lactiques mésophiles avec une température optimale de croissance comprise entre 20°C et 30° C, et les thermophiles, avec une température optimale de croissance comprise entre 30°C et 45°C. La majorité des bactéries lactiques se développent à des pH compris entre 4,0- 4,5 (Jozala et al., 2005). Elles sont essentiellement cultivables 19. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(20) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. dans le milieu Man Rogosa Sharpe (MRS) qui est un milieu riche offrant différentes sources de carbone et d’azote (de Man and Sharpe, 1960).. I.1.3. Origines, diversités et classifications des bactéries lactiques Les bactéries lactiques ont été également retrouvées dans des sédiments datant de 2,75 milliards d’années bien avant l’apparition de l’oxygène dans l’atmosphère, ce qui pourrait expliquer leur caractère anaérobie (Quiberoni et al., 2001). Des études sur la phylogénie bactérienne ont mentionnées leur apparition avant celle des cyanobactéries (Quiberoni et al., 2001). D’autres études montrent que certaines bactéries lactiques, comme Lactococcus lactis, sont en voie d’acquérir une chaîne respiratoire (Duwat et al., 2001). Les bactéries lactiques regroupent les genres suivants: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella (Figure 1). L’utilisation des séquences des gènes codant les ARN ribosomiales 16S et 23S a conduit à l’identification de nouveaux genres comme Carnobacteria, Tetragenococcus et Vagococcus (Pilar et al., 2008). . Le genre Lactobacillus est le genre le plus répandu dans les flore animale et humaine (Sascha et Magdalena 2010), comprenant de nombreuses espèces avec certaines caractéristiques phénotypiques, biochimiques et génétiques (Jin et al., 2009; Doi et al., 2014).. Figure 1. Arbre phylogénique des bactéries lactiques (Schleifer et al., 1995) 20. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(21) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. A ce jour, plusieurs classifications des bactéries lactiques ont été proposées. Ainsi, une classification reposant sur la composition de la paroi cellulaire en acides gras a été rapportée (Gilarová et al., 1994 ; de Ambrosini et al., 1996). Une autre classification basée sur les différents modèles de fermentation du glucose définit trois groupes de bactéries lactiques (McLeod et al., 2008). -. Le groupe I qui est composé de bactéries lactiques réalisant exclusivement. l’homofermentation.. Ce. groupe. comporte. majoritairement les souches du genre Lactobacillus (Figure 2) -. Le groupe II inclut les bactéries lactiques réalisant l’hétérofermentation et regroupe Leuconostoc, Oenococcus, Weissella et quelques espèces appartenant au genre Lactobacillus (Figure 2). -. Le groupe III regroupe, quant à lui, quelques espèces appartenant au genre Lactobacillus et la majorité des espèces appartenant aux genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus (Figure 2). Ce groupe présente une position intermédiaire entre le groupes I et II réalisant ainsi l’homofermentation ou l’hétérofermentation selon les conditions environnementales (McLeod et al., 2008). Les études d’hybridation ADN-ADN, puis des séquences du gène codant l’ARN ribosomiale 16S sont devenues depuis quelques années des outils essentiels permettant l’identification et la classification taxonomique des bactéries lactiques (Stanckebrandt et Teuber 1988; Woese et al., 1990; Mäkelä et al., 1992; Vandamme et al., 1996). Une étude basée sur la comparaison des séquences d’ADN ribosomique 16S et/ou 23S proposa une classification en 3 groupes. Le groupe 1 correspond au groupe des Leuconostocs, Le groupe 2 est le groupe des Lactobacillus delbrueckii (L. delbrueckii) et le groupe des L. casei- Pediococcus correspond au 3ème groupe (Rodrigues et al., 1991). I.1.4. Intérêts des bactéries lactiques dans le domaine alimentaire De nombreuses bactéries lactiques sont utilisées dans le secteur alimentaire comme outils technologiques et se font attribuer le statut anglo-saxon d’organismes GRAS (Generally Regarded As Safe) (Aguirre et Collins 1993; Adams et Marteau 1995). 21. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(22) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Cependant, certaines espèces appartenant aux genres Streptococcus et Enterococcus sont considérées comme des pathogènes opportunistes (Aguirre et Collins 1993).. I.1.5. Intérêts des bactéries lactiques dans le domaine médical Les bactéries lactiques peuvent vivre en symbiose avec l’hôte colonisé (Pilar et al., 2008). La symbiose est une association intime et durable entre deux organismes hétérospécifiques (Pilar et al., 2008). Le tractus gastro-intestinal des mammifères est colonisé par des bactéries lactiques appartenant aux genres, Lactobacillus, Leuconostoc et Weisseilla. Par ailleurs, l’appareil génital de la femme est principalement colonisé par des bactéries lactiques, telles que Lactobacillus dont l’implantation est favorisée par la présence du glycogène (Spear et al., 2014). En acidifiant le milieu, ces bactéries lactiques apportent une protection contre des pathogènes responsables des infections vaginales comme Trichomonas vaginalis, responsable de la trichomonase vaginale (Björkroth et Holzapfel 2006; Ruiz et al., 2009) et/ou Candida albicans à l’origine de la vulvo-vaginite (Pirotta et al., 2004; Falagas et al., 2007).. I.1.6. Lactobacillus Le microbiologiste Hollandais, Beijerinck a identifié en 1901, le genre Lactobacillus. Il a regroupé les bactéries bacilles à Gram positif fermentatives isolées de produits laitiers (Klein et Bonaparte 2000) (Figure 2). D’un point de vue phylogénétique, le genre Lactobacillus est très proche du genre Pediococcus, mais très loin de Bifidobacterium (Collins et al., 1991). Le genre Bifidobacterium possède un pourcentage de guanine-cytosine (GC) très élevé par rapport au genre Lactobacillus (Stackebrandt et al., 1997). Les bactéries du genre Lactobacillus ont des aspects variables allant du bacille long et fin au coccobacille en passant par la forme bâtonnet court ou légèrement flexueux (Prescott et al., 1995). Les lactobacilles sont non-sporulés, fréquemment associés en chainettes et habituellement immobiles. Les lactobacilles semblent généralement plus résistants au stress acide que les lactocoques (Siegumfeldt et al., 2000). Orla Jensen (1949) répartit pour la première fois ce genre en trois groupes phénotypiques différents qui sont Streptobacterium, Betabacterium et Thermobacterium. -. Streptobacterium se caractérise par l’homofermentation. C’est le cas de L. casei, L. plantarum, L. paracasei, L. casei, L. sake… Dans ce groupe,. 22. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(23) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. on peut distinguer aussi les lactobacilles ayant la capacité de se développer à une température basse (2 et 15°C). -. Betabacterium contient des lactobacilles hétérofermentaires comme L. brevis, L. vaginalis, L. fermentum…. -. Thermobacterium contient les lactobacilles homofermentaires ayant la capacité de se développer à une température élevée (45°C) et non pas à une température basse. L. gasseri, L. salivarius, L. helveticus, L. acidophilus, L. crispatus et L. delbrueckii appartiennent au groupe des Thermobacterium.. Kandler et Weiss (1986) ont divisé le genre Lactobacillus en trois groupes sur la base de la voie de fermentation du sucre utilisé. Les hexoses sont métabolisés en acide lactique par voie homofermentaire (sans production de CO2), alors que les pentoses sont dégradés par. voie hétérofermentaire. Les lactobacilles sont des bactéries. anaérobies facultatives, à l’exception de quelques souches, ou microaérophilies, immobiles, dépourvues de catalase et d’oxydase (Klein et Bonaparte, 2000). La morphologie des colonies varie en fonction du milieu de culture utilisé. Sur un milieu sélectif, les colonies sont très petites, souvent sous forme S ou SR ? (S: Smooth ; R: Rough) (Klein and Bonaparte, 2000). Les besoins nutritionnels des lactobacilles sont très complexes (acides aminés, vitamines, acides gras, précurseurs des bases puriques et pyrimidiques). Les lactobacilles sont présents naturellement chez l’homme et l’animal. L. casei, L. rhamnosus et L. paracasei occupent le plus souvent la cavité buccal (Hammes et Vogel 1995). Les lactobacilles constituent la flore autochtone dominante de la partie supérieure du tractus intestinal, estomac inclus. Les espèces les plus représentées sont L. acidophilus,. L. gasseri, L. reuteri (Hammes et Vogel 1995). Dans la partie. inférieure de l’intestin, en particulier dans le côlon, elles ne représentent que 0,1 à 1% de la flore totale (Klein et Bonaparte 2000). La flore vaginale a été étudiée par McGroraty et collaborateurs (1992). Ainsi, ils ont rapporté que les espèces dominantes sont L. jensenii, L. acidophilus, L. gasseri et L. casei et en particulier L. reuteri qui produit de la peroxydase qui joue un rôle très important dans l’inhibition des pathogènes dans l’écosystème vaginal.. 23. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(24) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Figure 2. Représentation schématique des principales voies de fermentation des hexoses chez les bactéries lactiques (Makhloufi, 2012).. I.1.7. Rôle protecteur des lactobacilles au niveau vaginal L'écosystème vaginal est dominé par L. crispatus, L. iners, L. jensenii et L. gasseri (Zhou et al., 2007; Ravel et al., 2011). La compréhension des interactions entre les espèces bactériennes et l'hôte est également essentielle à la compréhension du microbiote vaginal. Chez les femmes préménopausées, deux stratégies ont été proposées pour expliquer la dominance des lactobacilles: i) exclusion compétitive grâce à l'adhésion aux cellules épithéliales et ii) la production des agents antimicrobiens, tels que les bactériocines, des substances similaires aux bactériocines appelées "Bacteriocins Like Inhibitory Substances (BLIS)" (Chikindas et al., 1997), des peptides synthétisés par voie non ribosomal (NRPS) (Strieker et al., 2010), le peroxyde d'hydrogène (H2O2) et de l'acide lactique (Boris et al., 2000) (Figure 3). 24. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(25) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. I.1.7.1. Exclusion des pathogènes Les espèces de Lactobacillus ont une grande affinité d’adhésion aux cellules épithéliales. Ainsi, les lactobacilles vont saturer les récepteurs et exercer un effet de barrière vis-à-vis des pathogènes impliqués dans des infections urogénitales chez la femme comme les streptocoques du groupe B "SGB", Staphylococcus aureus (S. aureus) (Za’rat et al., 2006), Gardnerella vaginalis (G. vaginalis), Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) et Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) (Osset et al., 2001). Il faut noter aussi que le pouvoir adhésif aux cellules de l’hôte varie en fonction de l’espèce et de la souche (Chauvière et al., 1992). I.1.7.2. Substances élaborées par les lactobacilles à effet antimicrobien A. Acides organiques (majoritairement acide lactique) La production de l’acide lactique est un mécanisme de défense important qui empêche la croissance de bactéries acido-sensibles telles que celles associées à la vaginose bactérienne (Boskey et al., 1999). Par ailleurs, Hanlon et collaborateurs (2011) ont rapporté que l'acide lactique réduit la viabilité des bactéries associées aux vaginoses, comme G. vaginalis et Atopobium vaginae (A. vaginae), à des concentrations généralement trouvées chez les femmes avec un microbiote vaginal "Lactobacillus-dominant". Graver et collaborateurs (2011) ont constaté que dans des expériences de co-culture, les espèces de Lactobacillus productrices d'acide lactique inhibent la croissance de N. gonorrhoeae. De plus, Hanlon et collaborateurs 2011 ont rapporté que le changement du pH de 7 à 4,5 réduit la viabilité des bactéries associées à la vaginose bactérienne entre 102 et 106 fois selon l’espèce pathogène. Cependant, des concentrations physiologiques de l'acide lactique, mais non pas d’acide acétique réduisent considérablement la viabilité des micro-organismes associés à la vaginose bactérienne entre 106 et 108 fois, démontrant ainsi que l'activité antimicrobienne de l'acide lactique n'est pas uniquement due à l'acidification vaginale.. 25. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(26) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. B. Peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée) Les lactobacilles producteurs de peroxyde d’hydrogène (H2O2) jouent un rôle essentiel dans l’équilibre de la flore vaginale: 96 % des femmes saines possèdent ces lactobacilles producteurs de H2O2 (dont notamment L. crispatus et L. jensenii), alors que ces mêmes lactobacilles ne sont isolés que dans 3,5 % des femmes atteintes de vaginose bactérienne (Eschenbach et al., 1989). Cependant, il reste à démontrer si la production de H2O2 est directement responsable du mécanisme d’exclusion compétitive des autres espèces. L’absence de production d'H2O2 par les lactobacilles a été associée à des complications vaginales dont la vaginose bactérienne (Wasiela et al., 2008), à la colonisation vaginale par Escherichia coli (Gupta et al., 1998), aux accouchements prématurés (Wilks et al., 2004), et à l’endométriose (Haggerty et al., 2004). Il a été rapporté aussi que l’activité antimicrobienne du H2O2 peut être bloquée par les secrétions génitales comme le sperme et les sécrétions cervicovaginales, ce qui remet en cause l’activité antimicrobienne d’H2O2 in vivo (Beigi et al., 2005). C. Bactériocines et substances similaires "Bacteriocin like inhibitory substances (BLIS)" La production d'agents antimicrobiens par les lactobacilles contribue également à la stabilité de la flore vaginale normale (Spear et al., 2014). En effet, deux bactériocines produites par des souches de lactobacilles d'origine vaginale ont été identifiées (Ocana et al., 1999; Turovskiy et al., 2009). La bactériocine la plus importante est la lactocine 160, elle est active contre G. vaginalis, et agirait sur la membrane plasmique de cette bactérie (Turovskiy et al., 2009). D. Arginine désaminase Les lactobacilles, possédant l’enzyme arginine désaminase, inhibent la croissance et la prolifération des bactéries anaérobies pathogènes associées à la vaginose: ils métabolisent l’arginine en citrulline et ammoniac, et privent ainsi les pathogènes de cet acide aminé. Une étude sur différentes femmes traitées avec une souche de L. brevis ayant une forte activité arginine désaminase, a montré un net déclin de la concentration de polyamines vaginales ainsi qu’un rétablissement de l’équilibre de l’écosystème vaginal (Lepargneur Rousseau, 2002). . 26. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(27) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Figure 3. Les différents mécanismes anti-pathogènes des lactobacilles adapté de Lepargneur et Rousseau 2002.. I.1.8. Lactobacilles comme probiotiques I.1.8.1. Généralités sur le terme "probiotique" Le terme "probiotique" est un mot relativement nouveau qui signifie "en faveur de la vie". Le concept probiotique est né de la théorie de la longévité de Metchnikoff en 1907. Il était le premier qui a proposé l'utilisation des lactobacilles des yaourts pour la restauration du microbiote dans le tractus gastro-intestinal. Les probiotiques ont d'abord été développés dans les années 1960 pour les élevages d'animaux afin de 27. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(28) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. prévenir les infections et stimuler le gain de poids. La première définition officielle a été proposée par Fuller et collaborateurs en 1989. Il définit un probiotique comme étant "un supplément alimentaire microbien vivant qui affecte positivement la santé de l'animal en améliorant sa balance microbienne intestinale". Cette définition a été revisitée plusieurs fois, notamment par la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), et la WHO (World Health Organization). En 2001, la nouvelle définition était comme suit: "Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui lorsqu'ils sont administrés en quantité adéquate, produisent un effet bénéfique pour la santé de l'hôte". I.1.8.2. Critères de sélection des souches potentiellement probiotiques Les micro-organismes doivent posséder diverses propriétés de survie pour répondre à la définition des probiotiques (Gagnon et al., 2007). Ils doivent présenter une activité positive et persister durant leur passage dans le tractus digestif (probiotique intestinal), et résister à l’écosystème vaginal. Ces propriétés sont propres à chaque souche et ne peuvent pas être extrapolables d'une souche à l'autre même au sein d'une même espèce (O'Mahony et al., 2001). Plusieurs critères de sélection ont été établis par différents auteurs dont le but de sélectionner les souches potentiellement probiotiques. Ces critères, résumés dans le Tableau 1, sont répartis en trois catégories, à savoir les critères de sécurité, fonctionnels, et technologiques. Chaque souche doit être identifiée par des techniques moléculaires fiables et confrontée à une nomenclature actualisée (FAO/WHO 2002). Actuellement, le séquençage du gène qui code pour l'ADN ribosomial 16S est la méthode moléculaire de référence pour identifier l'espèce d'une souche, mais cette méthode requiert une large collection de souches de référence (FAO/WHO 2002). L'origine de la souche est également une condition importante car l'interaction spécifique avec l'hôte est maximisée lorsqu'elle provient de la même niche écologique (Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001).. 28. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(29) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Tableau 1 : Principaux critères de sélection des probiotiques. Adapté de (Klaenhammer and Kullen, 1999; Saarela et al. 2000; Salminen et al. 2002; Gueimonde and Salminen 2006).. -. Identification taxonomique précise. -. Souche caractérisée par des techniques phénotypiques et génotypiques. -. Historique de son pathogénicité et non-invasion de l’épithélium intestinal. Critères de sécurité. -. Pas de transmission possible des gènes de résistance aux antibiotiques.. -. Tolérance de l’acidité à la bile et aux enzymes digestives. -. Adhésion aux cellules intestinales/ vaginales et persistance dans le tractus intestinal. -. Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides organiques,. Critères fonctionnels. peroxyde. d’hydrogène. ou. autres. composés. inhibiteurs) et antagonisme vis-à-vis des pathogènes. -. Immunomodulation. -. Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé de l’hôte.. -. Stabilité au cours des procédés de fabrication et dans le produit final. Critères. -. Conservation des propriétés probiotiques après production. technologiques. -. Non modification des qualités organoleptiques du produit finale.. I.1.8.3. Effets bénéfiques des probiotiques Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des probiotiques (Mercenier et al., 2003). La Figure 4 illustre la diversité des effets sur la santé documentés et rapportés dans la littérature. L'apport de probiotiques doit être régulier (Gagnon et al., 2004). Les probiotiques sont souvent considérés comme des. 29. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(30) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. aliments fonctionnels ou des compléments alimentaires, mais pas comme des médicaments (FAO/WHO 2002).. Figure 4. Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. (Mercenier et al., 2003).. I.1.8.4. Activité antimicrobienne des probiotiques L'activité antimicrobienne des probiotiques est probablement l'activité la plus documentée. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer ces activités (Figure 5). Un des mécanismes suscitant de plus en plus d'intérêts dans le domaine des probiotiques est la production de substances inhibitrices telles que les acides organiques et les bactériocines (Sanders 2012). Paradoxalement, très peu d'études ont montré, par des tests in vitro ou in vivo, l'implication de ces substances inhibitrices dans l'activité antimicrobienne des probiotiques. 30. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(31) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. Figure 5. Mécanismes d'action des microorganismes probiotiques dans le traitement des infections entériques et vaginales adapté Kaur et al., 2009.. I.2. La flore vaginale normale naturelle (Microbiote vaginal) Le microbiote humain est constitué par un nombre important de micro-organismes colonisant des niches écologiques bien déterminées chez les êtres humains. Ce microbiote exerce des fonctions biologiques différentes. Ainsi, différents microorganismes habitant dans le tissu vaginal, les voies respiratoires supérieures, la peau, la voie gastro-intestinale, l’urètre et d’autres sites de l'organisme humain, ont été décrits 31. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(32) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. dans la littérature. La flore correspond aux micro-organismes hébergés pour l’homme qui contribuent à sa bonne santé (Madigan et al., 2007). La flore normale après son développement, procure des avantages à son hôte en prévenant la croissance de microorganismes nuisibles. Ce phénomène appelé antagonisme microbien ou effet barrière, fait intervenir la compétition entre les microbes (Perry et al., 2007). Afin de mieux comprendre le rôle des différents "microbiotes humains", dans la lutte contre les infections d'un écosystème déterminé, un grand projet scientifique appelé "The Human Project" a été lancé en 2008 (Peterson et al., 2009). Par ailleurs, le projet sur le microbiote vaginal humain à "Virginia Commonwealth University" (VCU) (Fettweis et al., 2011) a été réalisé sur un grand nombre d’échantillons composés par des milliers de femmes. Certains paramètres cliniques ont été pris en compte afin de déterminer la relation entre le microbiote vaginal, et les différentes conditions physiologiques et infectieuses (Fettweis et al., 2011). De plus, centaines jumelles monozygotes et dizygotes ont été évaluées afin de déterminer à la fois l'influence des facteurs génétiques et ceux de l’environement sur la composition du microbiote vaginal humain (Fettweis et al., 2011). La flore vaginale résidente est constituée en grande partie de micro-organismes ayant migré depuis la région périnéale ou issus de la flore cutanée ou intestinale; il s’agit d’une flore aérobie/anaérobie mixte à prédominance anaérobie (Briese et al., 2011). Cette flore vaginale est complétée de germes transitoires externes dont l’introduction dans le vagin est due à la convergence d’une multitude de facteurs de risque sociaux, épidémiologiques, organiques et individuels (Briese et a l., 2011). Par rapport aux autres sites du corps humain, comme le tractus gastro-intestinal, moins d'espèces bactériennes ont été rapportées dans le vagin. Néanmoins, de nombreuses espèces bactériennes vaginales restent à caractériser. Plusieurs études ont montré la complexité et la variabilité de la flore vaginale selon le cycle menstruel et l’étape de la vie, principalement à cause de changements hormonaux et physiologiques (Wilks et al., 1987; MacGraarty et al., 1993). Pour une femme saine, d’âge moyen (postpubertaire et pré-ménopausée), non enceinte et non menstruée, la flore vaginale est dominée par des lactobacilles de différentes espèces composant "la flore de Döderlin" (Figure 6). L’identité de ces espèces a longtemps été incertaine du fait d’identifications phénotypiques insuffisamment discriminantes (Redondo-Lopez et al., 1990; Nagy et al., 1992). Grâce aux techniques récentes de la biologie moléculaire, la taxonomie des Lactobacillacae a été revue. Ainsi, de nouvelles études ont permis de caractériser la flore de Döderlin. L'épithélium et le microbiote vaginal subissent des changements 32. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(33) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. relatifs et proportionnels aux changements hormonaux tout au long de la vie d’une femme (Bourne 1947). Par exemple, les taux d'œstrogènes augmentent pendant la puberté, le glycogène est secrété ainsi dans les différents types d’épithélium vaginal : stratifié, squameux et non-kératinisé. Pour la plupart des femmes, ce changement physiologique est en relation avec l’augmentation naturelle de la prévalence des espèces de lactobacilles.. Figure 6. Flore de Döderlin observée par microscopie optique (X 100) (http://www.dac.uem.br/f3.jpg ).. Les lactobacilles vaginaux prédominent généralement pendant les années de reproduction (Fettweis et al., 2011). Les espèces de lactobacilles sont capables de fermenter. le. glycogène,. produisant. ainsi. de. l'acide. lactique. maintenant. l’environnement vaginal à un pH acide (pH <4,5) (Redondo-Lopez et al., 1990). Cette acidité est traditionnellement considérée comme un marqueur de la santé vaginale (Redondo-Lopez et al., 1990). Des études récentes sur le microbiote vaginal suggèrent que le marqueur traditionnel de la santé vaginale ne s'applique pas à toutes les femmes. Plusieurs auteurs ont rapporté que la valeur moyenne du pH vaginal pour les femmes afro-américaines et latino-américaines est plus élevée (pH> 4,5) que les femmes de la race blanche (Fiscella et al., 2004). L’utilisation des techniques moléculaires dans des études récentes, a montré que les espèces de Lactobacillus ne prédominent pas dans le microbiote vaginal pour une proportion importante des femmes en bonne santé et en âge de procréer (Neggers et al., 2007; Wilson et al., 2007; Ravel et al., 2011). Un simple regroupement de ces microbiotes suggère l'existence de multiples "Vagitypes" dont beaucoup sont dominés par un taxon bactérien (Fredricks 2011). Des 33. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(34) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. études transversales ont été faites afin d’identifier la constitution de la flore vaginale des femmes saines et des femmes atteintes de la vaginose bactérienne. Ces études permettent de distinguer les femmes asymptomatiques (déficientes en lactobacilles), de celles des femmes atteintes de la vaginose bactérienne ou autres complications vaginales (Fredricks et al., 2011; McCook et al., 2011). I.2.1. Facteurs environnementaux et génétiques de la variation du microbiote vaginal L’influence de la variété raciale sur le microbiote vaginal a été déjà rapportée par Fiscella et al. (2004), Zhou et al. 2007 et Ravel et al. (2011). De plus, l'influence relative des facteurs génétiques et environnementaux est aussi établie. Certains facteurs tels que le tabagisme (Cherpes et al., 2008; Ryckman et al., 2009), les douches vaginales (Ness et al., 2002; Hawes et al., 1996; Cherpes et al., 2008), et certaines pratiques sexuelles (Marrazo et al., 2002; Beigi et al., 2005; Cherpes et al., 2008) ont été caractérisés comme influençant d'une manière significative la diminution. des. lactobacilles vaginaux (Beigi et al., 2005). Par ailleurs, l’influence de l'œstrogène sur la flore vaginale reste la plus étudiée. En effet, le déficit en œstrogène lors de la ménopause entraîne souvent une diminution des lactobacilles (Pabich et al., 2003; Heinemann et al., 2005; Wilson et al., 2007). Dans certains cas, cette diminution serait associée à des infections urogénitales (Pabich et al., 2003). Á noter que le traitement par l'œstrogène conduit généralement à un rétablissement des lactobacilles vaginaux (Heinemann et al., 2005). A ce jour, l’influence des facteurs génétiques sur la composition du microbiote vaginal reste contreversée. Des hypothèses avancées, supposent que le polymorphisme génétique peut avoir une influence majeure sur l’état de santé vaginale chez la femme. Ainsi, Verstraelen et collaborateurs (2009) ont montré que la présence d’A. vaginae et G. vaginalis dans le tractus vaginal au cours du premier trimestre de la grossesse est associée aux polymorphismes génétiques codant pour l’immunité innée chez les femmes, plus précisément, aux niveaux des gènes impliqués dans "Toll-like receptormediated signaling". De plus, Genc et collaborateurs (2004) ont démontré, chez les femmes africaines, que le polymorphisme allélique dans l'intron d'un gène de la famille des cytokines "interleukine 1", plus précisément IL1RN2, est associé à une valeur de pH vaginal élevée entraînant une baisse du niveau des lactobacilles.. 34. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(35) Thèse de Imad Al Kassaa, Lille 1, 2014. I.2.2. Définition et diagnostique de la vaginose bactérienne (VB) La vaginose bactérienne (VB) est un syndrome polymicrobien dans lequel les lactobacilles de la flore vaginale normale, en particulier ceux produisant du peroxyde d'hydrogène, sont remplacés par une variété des bactéries anaérobies et des mycoplasmes (Mayaud 1997). La symptomatologie clinique de la vaginose bactérienne est caractérisée par des pertes vaginales avec "odeur de poisson", des démangeaisons, des brûlures et des douleurs vaginales (Mayaud 1997). Cependant, ces symptômes peuvent être rencontrés dans d'autres types d'infection vaginale. Plus de 50% des patientes sont asymptomatiques (Woodrow et Lamont 1998), et à ce jour aucun agent microbien unique n'a encore été isolé comme causant la vaginose bactérienne. D'où la définition clinique proposée par Amsel et al. (1983) basée sur le fait que trois des quatre critères suivants soient remplis: 1- pertes vaginales fluides, homogènes, uniformément adhérentes, blanches; 2- pH vaginal > 4,5; 3- odeur de poisson à l'addition d’hydroxyde de potassium (KOH) à 10% aux sécrétions vaginales; 4- 20% de "clues cells" (cellules épithéliales dont les marges sont obscurcies par des bactéries) à l'examen microscopique des frottis vaginaux.. Plus tard, en 1991, Nugent et collaborateurs (Nugent et al., 1991) ont renforcé le diagnostic microscopique par l'établissement d'un score basé sur le profil de la flore vaginale à la coloration de Gram: plus les lactobacilles sont rares et les bactéries polymorphes prédominantes, plus le score est élevé. Selon l'échelle, une flore vaginale est classée comme: -. normale lorsque le score est compris entre 0 et 3;. -. intermédiaire pour un score entre 4 et 6;. -. caractéristique de la vaginose bactérienne pour un score de 7 à 10 (Holst et al.,. 1987).. En utilisant le score de Nugent comme référence (Gold standard), la sensibilité et la spécificité de la méthode d’Amsel sont respectivement de l’ordre de 35–56% et 96– 99%. (Gratacos et al., 1999 ; Mastrobattista et al., 2000).. 35. © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.