Conception, développement et validation
d’un système de co-culture pour
la régénération du tissu vasculaire à partir de
structures d’échafaudages cellularisés
Thèse
Caroline Loy
Doctorat en génie des matériaux et de la métallurgie
Philosophiæ doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
Conception, développement et validation
d’un système de co-culture pour
la régénération du tissu vasculaire à partir de
structures d’échafaudages cellularisés
Thèse
Caroline Loy
Sous la direction de:
Résumé
Le besoin clinique de nouvelles technologies pour favoriser la régénération des tissus et des organes lésés ou malades a permis l’émergence de l’ingénierie tissulaire. Ce concept s’est révélé être une stratégie prometteuse afin de fournir une alternative aux maladies vasculaires dans un futur plus ou moins proche. Les modèles issus du génie tissulaire vasculaire ont également le potentiel d’être utilisés comme des modèles in vitro de tissus pour l’étude des processus physiopathologiques ainsi que pour des essais précliniques de médicaments et de différents dispositifs médicaux.
De nombreuses approches existent dans ce domaine ayant chacune ses avantages et inconvé-nients, mais aucune n’a encore eu un réel succès. Dans ce contexte, le projet de cette thèse a été de concevoir, développer et valider un modèle de la paroi vasculaire en mimant la struc-ture d’une artère nastruc-turelle. Brièvement, une artère est composée de trois couches composées chacune d’un type cellulaire différent qui lui confèrent des propriétés et des fonctions propres à chaque type de cellules. Celles-ci sont enchevêtrées dans une matrice extracellulaire majo-ritairement composée de collagène.
En se basant sur les travaux précédents du Laboratoire de Biomatériaux et Bioingénierie de l’Université Laval, le gel de collagène de type I a été utilisé comme matrice tridimensionnelle grâce à son fort potentiel pour supporter et guider les cellules vasculaires dans le processus de régénération du tissu in vitro. L’objectif a été le développement d’un modèle de tri-culture avec un échafaudage à base de collagène pour imiter intimement l’organisation cellulaire en tri-couches des artères natives.
Dans un premier temps, un modèle plat a été élaboré et caractérisé. Puis dans un deuxième temps, une nouvelle méthode pour créer des tubes cellularisés de collagène a été mise au point. Et enfin, dans un troisième temps, le développement d’un protocole pour la création d’une tri-culture tubulaire soutenue par une matrice de collagène a été conçu et validé.
Abstract
The tremendous clinical need for the development of technologies to facilitate the regener-ation of injured or diseased tissues and organs allowed the openning of tissue engineering field. The concept of vascular tissue engineering has emerged as a promising strategy in order to provide an alternative to animal models of vascular diseases. Engineered arterial models have the potential to be used instantly as an in vitro models of vascular tissue for the investigation of patho/physiological processes and as preclinical tests for drugs and devices. Many approaches exist in this area, each with its advantages and disadvantages but none of the approaches yet had a real success. With this in mind, the objective of this thesis was to design, develop and validate an easy and fast-to-prepare vascular wall model mimicking the natural artery structure. Briefly, an artery is composed of three layers, consisting of different cell types that confer each layer with certain properties and functions. These cells are embedded in extracellular matrix mainly composed of collagen.
Based on the previous work of the Laboratory for Biomaterials and Bioengineering of Laval University, type I collagen gel was used as a three dimensional matrix; thanks to its strong potential to support and guide the vascular cells in the process of tissue regeneration in vitro. The objective was therefore to develop a tri-culture model based on collagen scaffold to closely mimic the cellular organization in tri-layers of native arteries.
First, a flat model was developed and characterized. Then secondly, a new method for creat-ing cellularized collagen tubes was developed. And finally, the development of a protocol for the establishment of a tubular tri-culture supported by a collagen matrix was designed and valided.
Table des matières
Résumé iii
Abstract iv
Table des matières v
Liste des tableaux viii
Liste des figures ix
Remerciements xiii
Avant-propos xv
Introduction 1
0.1 Le système cardiovasculaire . . . 1
0.2 Les principales pathologies cliniques et solutions actuelles . . . 5
0.3 Bref historique sur les biomatériaux en chirurgie vasculaire – « Du rem-placement à la régénération » . . . 7
0.4 Le génie tissulaire vasculaire . . . 8
0.5 Les substituts vasculaires à base de collagène . . . 14
0.6 Historique des travaux utilisant le collagène comme échafaudage pour le génie tissulaire vasculaire réalisé au LBB . . . 18
0.7 La co-culture pour le génie tissulaire vasculaire . . . 21
0.8 Le développement embryonnaire des vaisseaux sanguins . . . 24
0.9 Stratégie et structure de la thèse. . . 27
1 L’ingénierie des tissus tubulaires - revue de littérature 36 1.1 Introduction . . . 36
1.2 Les échafaudages pour le génie tissulaire . . . 41
1.3 La trachée . . . 42
1.4 Le système gastro-intestinal . . . 47
1.4.1 L’œsophage . . . 47
1.4.2 L’intestin . . . 53
1.5 Les vaisseaux sanguins . . . 56
2 A planar model of the vessel wall from cellularized-collagen scaffolds:
Fo-cus on cell-matrix interactions in mono-, bi- and tri-culture models 62
2.1 Résumé . . . 63
2.2 Abstract . . . 64
2.3 Graphical abstract . . . 65
2.4 Introduction . . . 66
2.5 Materials and Methods . . . 67
2.5.1 Cell isolation and culture . . . 67
2.5.2 Cellularized collagen-based construct preparation . . . 68
2.5.3 Evaluation of EC adhesion by shear exposure experiments . . . . 69
2.5.4 Histological analysis . . . 69
2.5.5 Immunofluorescence analysis. . . 71
2.5.6 Western blot . . . 71
2.5.7 Blood clotting studies . . . 72
2.5.8 Statistical analysis . . . 72
2.6 Results . . . 73
2.6.1 Formation of a stable EC monolayer on collagen gel-based 3D models. . . 73
2.6.2 Assessment of cellular organization and cell-mediated matrix re-modeling and deposition . . . 74
2.6.3 Evaluation of the SMC phenotype in 3D models . . . 77
2.6.4 Blood clotting studies . . . 77
2.7 Discussion . . . 79
2.7.1 Endothelialization. . . 81
2.7.2 Expression of SMC contractile phenotype markers . . . 81
2.7.3 ECM synthesis . . . 82
2.8 Conclusion . . . 83
2.9 Acknowledgements . . . 83
3 Rotation-based technique for the rapid densification of tubular collagen gel scaffolds 84 3.1 Résumé . . . 85
3.2 Abstract . . . 86
3.3 Graphical abstract . . . 87
3.4 Introduction . . . 88
3.5 Materials and methods . . . 90
3.5.1 Preparation of collagen gel-based constructs . . . 90
3.5.2 Stress relaxation testing . . . 90
3.5.3 Immunofluorescence . . . 92
3.5.4 Cell viability . . . 92
3.5.5 Histological analysis . . . 93
3.5.6 Image analysis . . . 93
3.5.7 Statistical analysis . . . 93
3.6 Results and discussion . . . 94
3.6.2 Mechanical testing . . . 94
3.6.3 Effects of densification on cell behavior . . . 96
3.7 Concluding remarks . . . 97
3.8 Acknowledgements . . . 99
3.9 Conflict of interest . . . 99
4 A Novel System for the In Vitro Assembly, Maturation, and Stimulation of Advanced Multilayered Multiculture Tubular Tissue Models 100 4.1 Résumé . . . 101
4.2 Abstract . . . 102
4.3 Graphical abstract . . . 103
4.4 Introduction . . . 104
4.5 Materials and Methods . . . 105
4.5.1 Design and assembly of the Tubular Multilayered-Tissue Culture System (TMCS) . . . 105
4.5.2 Cell isolation and culture . . . 106
4.5.3 Preparation of cellularised collagen gel-based constructs . . . 107
4.5.4 Histological and immunofluorescence staining . . . 109
4.5.5 Cell orientation analysis . . . 111
4.5.6 Mechanical characterisation . . . 111
4.5.7 Statistical analysis . . . 112
4.6 Results and discussion . . . 112
4.6.1 Validation of the TMCS using vascular cells in static maturation conditions . . . 113
4.6.2 Validation of the TMCS during culture under mechanical condi-tioning . . . 119
4.7 Conclusion . . . 120
5 Discussion générale 121 5.1 Choix des cellules . . . 122
5.2 Choix du milieu de culture . . . 124
5.3 Développement de techniques de caractérisation biologique . . . 124
5.4 Du substitut de remplacement vasculaire au modèle de la paroi artérielle . 127 5.5 La culture cellule en 3D : du modèle plat au modèle tubulaire . . . 127
5.6 Limites et perspectives . . . 130
5.6.1 Caractérisation biologique plus approfondie . . . 130
5.6.2 Caractérisation mécanique plus approfondie . . . 132
5.6.3 Apport de la stimulation mécanique dynamique . . . 132
5.6.4 Manipulation des constructions vasculaires . . . 133
5.6.5 Propriétés mécaniques et élasticité . . . 134
Conclusion 136
Liste des tableaux
0.1 Cahier des charges des substituts vasculaires issues du génie tissulaire . . . . 9
0.2 Exemple d’applications biomédicales à l’aide de collagène . . . 16
0.3 Avantages et inconvénients d’utilisation du collagène. . . 17
0.4 Principales études ou la co-culture est utilisée pour comprendre les interac-tions entre cellules vasculaires . . . 22
1.1 Comparaison de la structure de la trachée, l’œsophage, l’intestin et les vais-seaux sanguins. . . 39
1.2 Comparaison des propriétés des matériaux utilisés comme échafaudages pour les substituts tubulaires. . . 42
1.3 Propriétés des différents substituts de trachée . . . 43
1.4 Ingénierie tissulaire trachéale in vivo . . . 45
1.5 Ingénierie tissulaire de l’œsophage in vitro . . . 50
1.6 Ingénierie tissulaire de l’œsophage in vivo . . . 51
1.7 Ingénierie tissulaire de l’intestin in vitro . . . 54
1.8 Ingénierie tissulaire de l’intestin in vivo . . . 55
1.9 Ingénierie tissulaire vasculaire in vitro . . . 58
1.10 Ingénierie tissulaire vasculaire in vivo . . . 59
4.1 Composition of culture media used in the study . . . 108
Liste des figures
0.1 Composition de la structure des parois des vaisseaux sanguins . . . 2
0.2 Structure comparative des vaisseaux sanguins . . . 3
0.3 Substituts produits par la méthode d’auto-assemblage . . . 11
0.4 Route biosynthétique vers les fibres de collagène . . . 15
0.5 Essais biologiques sur le collagène . . . 19
0.6 Bioréacteur plat . . . 20
0.7 Les principaux facteurs de croissance régulant la vasculogenèse. . . 25
0.8 Schéma de la formation d’un nouveau vaisseau (angiogenèse). . . 26
0.9 Stratégie de la thèse : construire un modèle simplifié d’artère avec une co-culture de cellules vasculaires à l’aide d’une matrice de collagène en confi-guration plate et tubulaire . . . 28
0.10 Schéma explicatif d’un essai de relaxation de contrainte . . . 32
0.11 Organigramme présentant la démarche scientifique adoptée dans cette thèse . 35 1.1 Niveaux de complexités des tissus et organes. . . 37
1.2 Structure générale des organes tubulaires . . . 38
1.3 Le petit intestin . . . 40
1.4 Un aperçu de l’ingénierie tissulaire des voies gastro-intestinales et des ap-proches de la médecine régénératrice . . . 48
2.1 Graphical abstract. An easy to prepare and manipulate model of vascular wall in a planar shape to investigate physiological and pathological processes of vascular tissue. . . 65
2.2 Representative photograph of SMC-cellularized collagen gel-based constructs and characterization by immunofluorescence of the tri-culture model.. . . 70
2.3 Immunofluorescence staining of ECs on the surface of the tri-culture model . 74 2.4 Histological characterization of transverse sections of the tri-culture model. . 75
2.5 Immunohistochemistry images of transverse sections . . . 76
2.6 Analysis of the expression of SM-α-actin and calponin by SMCs in the mono-bi-, and tri-culture models . . . 78
2.7 Kinetics of whole blood clotting for the different collagen gel models . . . . 80
3.1 Graphical abstract. This study introduces a novel, rapid, and simple rotation-based technique to produce denser and stronger tubular collagen scaffolds under sterile conditions. . . 87
3.3 Collagen gel scaffolds. . . 95
3.4 Mechanical characterisation of the tubular constructs. . . 97
3.5 Cellularised dense collagen scaffolds. . . 98
4.1 Graphical abstract. The design, fabrication, and validation of an original sim-ple cost-effective system for the preparation and maturation of tubular trilay-ered arterial wall models. . . 103
4.2 Components of the tubular multilayered-tissue culture system (TMCS). . . . 107
4.3 Preparation of constructs with two cellularised collagen layers within the TMCS and endothelialisation of the construct lumen. . . 110
4.4 Time course of thickness contraction.. . . 113
4.5 Masson Trichrome staining of the cross-sections. . . 114
4.6 Characterisation of SMCs orientation in the lumen. . . 115
4.7 Characterisation of endothelial cells of the intima-like layer. . . 116
4.8 Characterisation of SMCs or FBs orientation in the external side of constructs. 118 4.9 Stepwise stress-relaxation test. . . 119
5.1 Réseau de cellules musculaires lisses dans un gel de collagène. . . 125
5.2 Plaque à puits rond . . . 128
5.3 Système de bioréacteur plat avec lame commerciale Ibidi . . . 129
5.4 Essai pharmacologique d’un modèle de monoculture de CML. . . 131
5.5 Stimulation d’une tri-culture tubulaire avec le bioréacteur TGT. . . 133
On fait la science avec des faits, comme on fait une maison avec des pierres mais une accumulation de faits n’est pas plus une science qu’un tas de pierres n’est une maison.
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury, Madame Fatiha Chandad, Madame Catherine Le Visage à titre d’examinateur externe qui est venu de France pour ma soute-nance, et Monsieur Jesse Greener qui a eu la gentillesse d’effectuer également la prélecture de ce manuscrit. Je vous remercie pour votre intérêt, vos appréciations et vos commentaires pertinents. Je tiens aussi à remercier Monsieur Gaétan Laroche pour avoir présidé ce jury de thèse.
Je voudrais remercier mon directeur de recherche, Diego Mantovani pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire et de m’avoir fait confiance pour ce projet. Je tiens également à le remercier pour les différentes opportunités que j’ai eues au cours de cette thèse, la par-ticipations à des conférences nationales et internationales, l’enseignent, l’encadrement des étudiants, la collaboration avec d’autres équipes de recherches. Je le remercie pour la liberté qu’il m’a accordée pour mener mon projet et les moyens qu’il a mis à ma disposition. Je voudrais remercier, Jayachandran Kizhakkedathu dit Jay, et son laboratoire au Centre for Blood Research de Vancouver de m’avoir accueilli à l’été 2012 et printemps 2014.
Je voudrais remercier tous ceux qui ont participé à la réalisation de ce projet, de prêt ou de loin, en particulier mes coauteurs pour leur aide et soutien, pour leur précision et leur rigueur, les stagiaires, l’équipe des professionnels de recherche que l’on vient plus souvent voir lorsqu’il y a un problème que quand tout vas bien.
Je voudrais également remercier toutes les personnes que j’ai croisées au long de ces cinq années dans le laboratoire de Biomatériaux et de Bioingénierie, toutes les personnes auX laboratoireS du bloc E de l’hôpital Saint-François d’Assise et au département de génie des mines, des matériaux et de la métallurgie de l’université Laval, que ce soit pour les discus-sions du midi, les discusdiscus-sions de couloirs ou encore lors des sorties, des soirées, des activités comme les pique-niques sur les plaines, les pommes, les fridays beer, les anniversaires... Je voudrais remercier mes parents, pour votre amour et votre soutien. Merci de m’avoir donné
le goût et les moyens d’apprendre et de découvrir. Merci pour les valeurs et l’éducation que vous m’avez transmises. Je voudrais remercier mes frère et sœurs pour nos échanges par messagerie, que ce soit sur facebook ou whatsapp, vous me faites bien rire.
Je voudrais remercier Nicolas. Merci de partager ma vie depuis 8 ans, dont 4 de mariage. Merci de m’avoir suivie ici au Québec pour que puisse faire mon doctorat. Merci m’avoir supporté (et je sais que je ne suis pas facile) et surtout soutenu jusqu’au bout. Merci d’avoir ensemble construit notre petite famille originale (notre tribu canine) qui nous prend beaucoup de temps, mais qui apporte tellement de joie et de réconfort, qui me permet d’aller passer du temps à l’extérieur. Et je voudrais aussi remercier ma belle-famille, pour votre accueil, votre affection et votre soutien dans nos projets de vie.
Avant-propos
La faible disponibilité des greffons, la performance limitée des prothèses et le besoin cli-nique de nouvelles technologies pour favoriser la régénération des tissus et des organes lésés ou malades ont stimulé l’émergence de l’ingénierie tissulaire. Ce concept se révèle être une stratégie prometteuse afin de fournir une solution de remplacement aux maladies vasculaires dans un futur plus ou moins proche. Les modèles artériels issus de l’ingénierie tissulaire vas-culaire ont le potentiel d’être utilisés instantanément comme des modèles in vitro de tissus vasculaires pour l’étude des processus physiopathologiques ainsi que pour des tests précli-niques de médicaments et de différents dispositifs médicaux. Ce projet de doctorat s’inscrit donc dans ce contexte avec l’objectif de développer et valider un modèle de tri-culture à base de collagène pour imiter intimement l’organisation cellulaire en tri-couches des artères natives.
Ce projet a été mené principalement au Laboratoire de Biomatériaux et Bioingénierie (LBB) de l’Université Laval dirigé par le professeur Diego Mantovani et installé dans les locaux du centre de recherche de l’hôpital Saint François d’Assise de Québec. Dans le cadre du programme de médecine régénératrice du NSERC (NCPRM) qui m’a financée les trois pre-mières années, une collaboration a été réalisée avec le centre de recherche sur le sang (CBR) de l’Université de Colombie-Britannique (UBC) dirigé par le professeur Jayachandran Kiz-hakkedathu. Les quelques mois passés dans ce laboratoire m’ont permis d’apprendre et de réaliser les techniques de caractérisation avec le sang, mais aussi d’améliorer mon anglais. L’introduction de cette thèse présente le contexte général dans lequel s’inscrit ce travail, l’in-génierie du tissu vasculaire, la co-culture cellulaire et les problématiques qui leur sont asso-ciées. Le chapitre 1 présente une revue de littérature sur l’ingénierie des tissus tubulaires. Les chapitres 2, 3 et 4 présentent respectivement la conception et la validation du modèle de tissu vasculaire plat, la conception d’une nouvelle méthode de fabrication des gels de collagène de forme tubulaires et de la mise en place de la tri-culture tubulaire. Ces chapitres font l’objet de 3 articles scientifiques, dont 2 sont déjà publiés.
En tant que première auteure de ces trois publications, j’ai mené ces travaux des leurs concep-tion à la validaconcep-tion en collaboraconcep-tion avec des co-auteurs.
CHAPITRE2 : A planar model of the vessel wall from cellularized-collagen scaffolds : Focus
on cell-matrix interactions in mono-, bi- and tri-culture models.
Auteurs : Caroline Loy, Sébastien Meghezi, Lucie Lévesque, Daniele Pezzoli, Heena Kumra, Dieter Reinhardt, Jayachandran N. Kizhakkedathu, Diego Mantovani
Journal : Cet article a été publié dans Biomaterials Science, 2017, 5, 153-162. doi : 10.1039/C6BM00643D
Pour cet article, j’ai effectué toutes les expériences ainsi que la rédaction. Sébastien Meghezi, Lucie Lévesque, Daniele Pezzoli m’ont aidée dans l’élaboration du protocole et l’analyse des résultats et ont corrigé le manuscrit. Heena Kumra a fait les caractérisations (colorations) spécifique à la matrice extracellulaire. Les autres auteurs ont apporté leurs corrections au manuscrit.
CHAPITRE 3 : Rotation-based technique for the rapid densification of tubular collagen gel
scaffolds.
Auteurs : Caroline Loy, Audrey Lainé, et Diego Mantovani
Journal : Cet article a été publié dans Biotechnology Journal, section Biotech Method, 2016, 11(12), 1673-1679. doi : 10.1002/biot.201600268
Pour cet article, les expériences et l’analyse des résultats ont été menées par moi-même et en collaboration avec Audrey Lainé qui s’est plus occupée de la partie caractérisations mé-canique. J’ai rédigé la majeure partie de l’article et Audrey Lainé a rédigé les parties sur les tests mécaniques. L’ensemble a été corrigé par les auteurs.
CHAPITRE 4 : A Novel System for the In Vitro Assembly, Maturation, and Stimulation of Advanced Multilayered Multiculture Tubular Tissue Models.
Auteurs : Caroline Loy, Daniele Pezzoli, Gabriele Candiani et Diego Mantovani Journal : Cet article a été soumis à Biotechnology and Bioengineering.
Dans cet article, j’ai réalisé la conception des bioréacteurs et ai fait toutes les expériences. Daniele Pezzoli m’a conseillée tout au long des travaux. J’ai effectué l’entière rédaction qui a été corrigée et améliorée par Daniele Pezzoli, Gabriele Candiani et Diego Mantovani. Après les résultats, le chapitre 5 présente une discussion générale sur le travail effectué tout au long de cette thèse, mettant en relief les méthodologies et les techniques caractérisations développées ainsi que les défis rencontrés et propose les perspectives envisagées.
Introduction
0.1
Le système cardiovasculaire
Le système cardiovasculaire est composé du cœur et des vaisseaux sanguins qui permettent la circulation du sang dans tout l’organisme. Celui-ci distribue l’oxygène et les nutriments aux organes.
Le cœur est un organe musculaire qui assure, par des contractions automatiques et rythmées, la circulation sanguine dans deux circuits fermés : la circulation systémique et la circulation pulmonaire. On trouve également un système de circulation propre au cœur qui sert à irriguer ce muscle, le système coronarien. Le moindre dommage porté à ce système peut provoquer une altération du fonctionnement du cœur et mener jusqu’à la mort de l’organisme1.
Le cœur est divisé en quatre parties appelées ventricule droit, ventricule gauche, oreillette droite et oreillette gauche. Le sang oxygéné est éjecté du cœur par le ventricule gauche vers l’artère aorte puis est distribué aux organes (hors alvéoles pulmonaires) par les artères sys-témiques. À la suite d’un échange gazeux, le sang désoxygéné revient au cœur par la veine cave. Il s’accumule dans l’oreillette droite, puis dans le ventricule droit où il est éjecté vers l’artère pulmonaire pour être dirigé vers les alvéoles pulmonaires. Une fois enrichi en oxy-gène, le sang retourne au cœur par les veines pulmonaires vers l’oreillette gauche.
Le système vasculaire est un réseau de vaisseaux sanguins permettant la circulation du sang. Ils se divisent en trois grandes catégories, les artères, les veines et les capillaires. Les artères et les veines sont majoritairement composées de 3 couches, appelées tuniques : l’intima, la média et l’adventice (Figure 0.1). Chaque couche possède une structure spécifique en types cellulaires : cellules endothéliales (CE), cellules musculaires lisses (CML), fibroblastes (FB) ; et en composants de la matrice extracellulaire (MEC) : collagène et élastine entre autres, ce qui leur offre des propriétés fonctionnelles propres.
L’intima est la tunique interne du vaisseau sanguin (Figure 0.1). Elle est composée d’un endothélium, un épithélium simple squameux qui tapisse la lumière de tous les vaisseaux.
FIGURE 0.1 – Composition de la structure des parois des artères, des veines, et des capil-laires (modèle général)2. La média est épaisse dans les artères et relativement mince dans les veines, tandis que l’adventice est mince dans les artères et relativement épaisse dans les veines.
Les cellules endothéliales sont des cellules aplaties et polarisées dont la face apicale est en contact avec la lumière du vaisseau. La face basale est, quant à elle, liée à la couche sous-endothéliale et aux cellules adjacentes2. Les cellules endothéliales ont de nombreux rôles importants qui permettent l’intégrité du vaisseau sanguin3. Ces cellules plates s’imbriquent les unes dans les autres et constituent une surface lisse qui réduit au minimum la friction entre le sang et la face interne des vaisseaux. Elles sont recouvertes sur leur face apicale d’une mince couche chargée négativement appelée glycocalyx4. Cette surface est composée de protéines anticoagulantes et antiplaquettaires sécrétées par les cellules endothéliales. Une autre de leurs fonctions est d’assurer la mécanotransduction3. Les cellules endothéliales sont sensibles aux forces et la pression dues à l’écoulement du sang créant alors un stress qui va être transduit dans la cellule. La mécanotransduction qui est un processus complexe est la conversion par les cellules d’un signal mécanique donné par le flux sanguin en signaux
FIGURE 0.2 – Structure comparative des vaisseaux sanguins2. Les différents types de
vais-seaux se distinguent par leur longueur, leur diamètre ainsi que par l’épaisseur et la composi-tion de leurs parois. *Les divers vaisseaux ne sont pas représentés à l’échelle. La taille des petits vaisseaux est exagérée pour montrer certains détails.
physiologiques intracellulaires. Par exemple, suite à une augmentation du débit sanguin, les cellules endothéliales vont sécréter du monoxyde d’azote (NO) qui va diffuser jusqu’aux cellules musculaires lisses. Celles-ci vont se relaxer et on observe alors la vasodilatation, une augmentation du calibre des vaisseaux sanguins.
La média constitue la tunique moyenne des vaisseaux sanguins (Figure0.1). Elle comprend principalement des cellules musculaires lisses disposées en anneaux enchevêtrés dans une matrice extracellulaire composée en partie d’élastine, de collagène de type I et III et de pro-téoglycanes. La média assure la vasomotricité du vaisseau sanguin et est la tunique la plus épaisse dans les artères qui doivent être plus résistantes et plus élastiques que les veines. C’est grâce à ce muscle lisse que selon les besoins de l’organisme on observe la vasodilatation (aug-mentation du calibre due au relâchement des cellules) ou la vasoconstriction (réduction du calibre due à la contraction des cellules). De légères variations du diamètre des vaisseaux ont des effets marqués sur le débit ou la pression du sang, la média joue alors un rôle important
dans la régulation de la circulation2.
L’adventice est la tunique externe ou « gaine » de l’artère (Figure0.1). Elle est composée de fibre de collagène lâchement entrelacée, de quelques fibres élastiques et de fibroblastes. Ces fibres permettent aux vaisseaux sanguins de s’étirer tout en empêchant une trop grande dilata-tion. Cette tunique sert d’encrage au tissu conjonctif environnant. De plus pour les vaisseaux de grand diamètre, l’adventice peut comporter des fibres nerveuses et des petits vaisseaux sanguins appelés vasa-vasorum5. Les fibroblastes et notamment les facteurs de croissance qu’ils sécrètent (FGF) jouent un rôle majeur dans le développement du tissu vasculaire6. Les FGF et les cytokines interviennent dans la régulation de la synthèse de collagène par les cellules musculaires lisses7.
Les différents types de vaisseaux se distinguent par l’épaisseur et la composition de leurs parois comme décrit dans la Figure 0.2. Cette structure hétérogène, mais néanmoins très organisée permet aux vaisseaux sanguins de réaliser efficacement leurs fonctions vitales8. Les artères élastiques sont les grosses artères qui ont une paroi épaisse et qui sont situées près du coeur, soit l’aorte et ses principales ramifications et l’artère pulmonaire. Ce sont ces artères qui possèdent les plus grands diamètres (entre 1 et 2.5 cm) et la plus grande élasticité. Puisqu’elles sont à la sortie du cœur, ces artères doivent être très résistantes et ont une média plus épaisse et plus riche en fibre élastique. Plus loin du cœur, on trouve les artères musculaires aussi appelées artères distributrices apportent le sang aux divers organes (artères coronariennes, radiales, fémorales, tibiales). Leurs diamètres varient de 1 cm à 300 µm. Ce sont elles qui possèdent la média la plus épaisse mais avec moins de fibres élastiques que les artères élastiques. Leurs rôles sont de faire avancer le sang, elles possèdent donc une concentration importante de cellules musculaires lisses qui lui confère une certaine motricité. De plus, leur media est limitée de part et d’autre par une lamelle élastique appelée limitante élastique interne et limitante élastique externe (moins épaisse que l’interne). En périphérie, on trouve les artérioles qui sont les plus petites artères (entre 100 et 300 µm). Elles ont aussi une structure en trois tuniques, mais leur média est très fine avec seulement quelques CML et quelques fibres élastiques. Elles contrôlent la pression et le débit sanguins de par leur forte vasomotricité. Les capillaires sont les plus petits vaisseaux sanguins (5 à 10 µm de diamètre). Ils ne possèdent qu’une tunique constituée d’une seule couche de cellules endothéliales reposant sur une lame basale. C’est au niveau des capillaires qu’ont lieu les échanges avec le liquide interstitiel. Et pour revenir au coeur, on trouve les veines qui sont également composées de trois tuniques. Leur paroi est fine et elles ont un diamètre interne assez grand pour conduire un volume de sang important. Afin d’éviter le reflux du sang dû à une faible pression dans les veines, elles sont équipées de valvules (Figure0.1).
À l’intérieur des vaisseaux circule le sang. C’est un tissu vivant liquide qui distribue aux cellules du corps humain ce dont elles ont besoin pour y maintenir la vie : oxygène, nutri-ments, électrolytes, régulateurs chimiques, hormones, vitamines et substances nécessaires à la protection contre les maladies. Il débarrasse aussi le corps de ses différents déchets. En moyenne, le corps humain contient de cinq à six litres de sang.
Le sang est composé de plusieurs types cellulaires (globules rouges, globules blancs et les plaquettes) en suspension dans un liquide appelé plasma. Les globules rouges (ou érythro-cytes) sont de petits disques biconcaves sans noyau dont la couleur rouge est due à une protéine appelée hémoglobine. Ils ont pour fonction le transport de l’oxygène. Les globules blancs (ou leucocytes) sont un peu plus gros que les globules rouges. Ils remplissent diverses fonctions de purification et de protection contre les infections. Les plaquettes (ou throm-bocytes) sont des fragments cytoplasmique de petits diamètres. Elles ont pour fonction de contribuer à la coagulation sanguine et à la cicatrisation des plaies. Les plaquettes activées se combinent à la fibrine, dérivée du fibrinogène, pour former un caillot9.
0.2
Les principales pathologies cliniques et solutions
actuelles
Les maladies cardiovasculaires sont une des principales causes de décès au monde, repré-sentant environ 17 millions de décès par an, soit 30 % de la mortalité mondiale totale, selon l’Organisation Mondiale de la Santé en 2012. Au Canada, elles représentent 28 % des dé-cès totaux en 2011 (Statistique Canada. Causes de dédé-cès, Canada, 2011. CANSIM. Publié le 28 janvier 2014). L’augmentation des facteurs de risques tels que la sédentarisation, une alimentation trop riche en graisse, le tabagisme, l’hypertension, le diabète, et un taux élevé de cholestérol soutiennent cette tendance.
Une des maladies cardiovasculaires la plus courante est l’athérosclérose. Cette maladie touche les artères : aorte abdominale, coronaires, cérébrales, et artères des jambes. La plaque d’athé-rome qui obstrue le vaisseau est une accumulation de lipoprotéines qui évolue de façon à former un amas de lipides, de débris cellulaires, de macrophages spumeux (saturés en lipides et notamment en cholestérol) et de calcium. Ce noyau lipidique est isolé par un échafau-dage fibreux principalement constitué de matrice extracellulaire et de cellules musculaires lisses qui migrent de la média et prolifèrent entre la média et l’endothélium10. Cette masse fibreuse conduit à un épaississement de la paroi artérielle et à l’occlusion partielle ou totale (sténose) de la lumière du vaisseau avec la formation de plaques d’athérome. Suite à cette obstruction, l’écoulement du sang est diminué et entraine une baisse de l’apport sanguin aux
organes (ischémie) empêchant ainsi leur apport en oxygène (hypoxie) et en nutriments. La masse fibreuse peut croître ainsi jusqu’à’à sa rupture et ainsi rentrer en contact avec le sang provoquant alors le phénomène de coagulation, et la formation d’un patch plaquettaire. La thrombine formée lors de la coagulation s’ajoute aux plaquettes qui sont de plus en plus nombreuses et crée ainsi un thrombus, caillot qui participera fortement à l’obstruction com-plète de l’artère (thrombose)11. En conséquence, on observe des complications tels que des infarctus du myocarde, des accidents vasculaires cérébraux ou des thromboses12,13.
Il est possible de limiter les facteurs de risques et de prévenir l’apparition d’une sténose ou l’aggravation de celle-ci. De saines habitudes de vie, telles que la non-consommation de tabac et d’alcool, la pratique d’une activité sportive régulière, une bonne alimentation permettent de réduire ce risque. Lorsque le patient présente une prédisposition génétique, des antécé-dents familiaux ou lorsque les premiers signes sont déjà apparus ou encore afin de prévenir un nouveau trouble, des médicaments peuvent être prescrits (par exemple l’aspirine ou des bêtabloquants qui ont pour fonction d’être anti-agrégeant et abaissent le rythme cardiaque14). Lorsque la maladie est révélée et que la lésion a atteint un stade complexe, un acte chirurgical est nécessaire afin d’éliminer la plaque d’athérome. L’angioplastie par ballonnet est le pre-mier type d’intervention disponible aux cliniciens pour traiter la sténose artérielle15. Cette méthode consiste à insérer à travers une incision dans l’artère fémorale, un cathéter sur le-quel est placé un ballonnet qui une fois gonflé vient compresser la plaque d’athérome. Cette méthode est le plus souvent associée à la pose d’un stent (ou endoprothèse). Il s’agit d’un tuteur de forme tubulaire constituée par une petite maille souvent métallique. Cette technique permet de rétablir le flux sanguin dans le vaisseau malade, tout en lui apportant un soutien mécanique et permet de diminuer la probabilité de réocclusion.
En dernier recours, lorsque le sang ne peut plus circuler correctement, il faut remplacer le vaisseau. Il s’agit d’une intervention chirurgicale délicate et longue selon le site d’implanta-tion. Lors de l’intervention, un pontage est réalisé, la partie malade est retirée et remplacée par une prothèse ou une greffe afin de rétablir la circulation sanguine. Il est possible aussi d’effectuer un pontage sans ablation de l’artère, permettant au sang de contourner la région sténosée.
Pour le remplacement de vaisseaux de petit diamètre (Ø<6 mm), la greffe est la solution de substitution idéale16 avec un taux de succès de 90 % à un an17. Elle est le plus souvent pré-levée à partir de la veine saphène du patient. C’est une veine de la jambe. Son diamètre et sa longueur font d’elle un substitut bien adapté aux pontages fémoraux, poplités et carotidiens. Ce succès est attribué à la présence d’une surface luminale endothélialisée18. À l’hôpital Saint François d’Assise de Québec, environ 90 % des pontages poplité ou
femoro-tibial sont effectués avec des veines saphènes ou des veines en provenance des membres supérieurs. En l’absence de substituts naturels disponibles, la solution la plus simple est de se tourner vers les substituts synthétiques bien que l’expérience atteste que ces substituts ne sont pas adaptés au remplacement des vaisseaux de petits calibres19.
Pour le remplacement de vaisseaux de diamètre supérieur à 6 mm, différentes options sont disponibles. On trouve deux matériaux principalement utilisés. Le polytétrafluoroéthylène expansé (ePTFE,breveté en 1969))20également appelé Teflon®. Ces prothèses sont indiquées dans le remplacement de vaisseau de moyen calibre, entre 6 mm et 10 mm de diamètre. Le deuxième matériau utilisé est le polyéthylène téréphtalate (PET, breveté en 1950)21 égale-ment appelé Dacron®. Ces prothèses sont indiquées pour le remplaceégale-ment des vaisseaux de gros calibres (>10 mm de diamètre). Cependant, les performances à long terme sont mé-diocres, lors de pontages artériels, les prothèses en ePTFE montrent rapidement un taux d’échec de 45 % au bout de 6 mois22. Pour le PET, le taux de succès pour un pontage de l’artère fémorale après 10 ans d’implantation est de 56 % chez de jeunes patients atteints d’une athérosclérose précoce23.
0.3
Bref historique sur les biomatériaux en chirurgie
vasculaire – « Du remplacement à la régénération »
Les substituts vasculaires utilisés actuellement sont le fruit de longues années de recherche et de perfectionnement. D’importants progrès ont été apportés à ces substituts depuis la réa-lisation de la première greffe vasculaire. Ce fut un français, Alexis Carrel qui en 1902 réalisa les premiers travaux sur les sutures de vaisseaux sanguins et la transplantation d’organes24 (pour lesquels il reçut le prix Nobel de médecine en 1912). À sa suite, en 1906, un espagnol, José Goyanes Capdevila réalisa la première interposition d’une greffe veineuse à la place d’un segment anévrismal artériel chez l’homme. À partir de ce moment, la chirurgie vascu-laire entre dans une ère que l’on peut qualifier de « remplacement » de la partie du vaisseau malade. Les deux guerres mondiales (1914-1918 et 1939-1945) ont permis divers « essais et avancées clandestines » et en 1949, le chirurgien français Jean Kunlin est le premier à uti-liser une veine saphène pour le traitement chirurgical d’une carotide présentant des lésions athérosclérotiques.
Le développement des prothèses synthétiques a pris son essor au cours des années 1950 et ouvre une alternative thérapeutique au remplacement de segments artériels lésés. En 1952, le premier pontage vasculaire synthétique fut effectué par un américain, Arthur B. Voorhees Jr.,
par implantation d’une prothèse textile poreuse en Dacron®25,26. Puis en 1976, fut rapportée la première utilisation du ePTFE (Teflon®). Bien que de nombreuses améliorations aient suivi, la performance clinique de ces prothèses de ePTFE pour les artères de petits diamètres reste décevante. À l’heure actuelle, aucun substitut synthétique n’a pu supplanter l’emploi de la veine saphène pour le remplacement de vaisseau de diamètre inférieur à 6 mm.
Développer des prothèses pour les patients ne disposant pas de vaisseaux utilisables pour un pontage, consécutivement à l’existence de pathologies vasculaires, suite à une chirurgie vas-culaire précédente ou à une qualité insuffisante de leurs vaisseaux prélevés27,28 est devenu une nécessité. Dans les années 1980, cela conduit les chercheurs à combiner leurs savoir-faire dans les domaines de la médecine, de la biologie et des sciences des matériaux afin de dé-velopper des tissus implantables. C’est l’émergence du génie tissulaire. Le futur la chirurgie vasculaire passe ainsi du « remplacement » à la « régénération » du tissu vasculaire. En 1986, l’équipe de Weinberg et Bell ont été les premiers à proposer un biovaisseau moulé composé de 3 couches distinctes : une couche interne constituée de cellules musculaires lisses et une couche externe constituée de fibroblastes bovins, l’intima étant obtenue par ensemencement de cellules endothéliales dans la lumière du vaisseau29. Cependant, la construction possède de très faibles propriétés mécaniques et ne peut être utilisée à des fins cliniques. Dans les années suivantes, de nombreux groupes ont tenté de créer des vaisseaux sanguins issus de la régénération tissulaire, mais les propriétés mécaniques demeurent insatisfaisantes et consti-tue le défi majeur que devront relever les générations de chercheurs30–37.
0.4
Le génie tissulaire vasculaire
Le génie tissulaire fait partie de la médecine régénératrice et vise à restaurer, maintenir et/ou améliorer les tissus naturels en appliquant et intégrant les principes et méthode d’ingénierie, de la biologie et de la médecine12,16,38,39. Le génie tissulaire vasculaire a pour objectif de reconstruire des vaisseaux sanguins de petit diamètre in vitro avec une visée clinique in vivo et aussi comme modèle in vitro pour des études dans des applications telles que la physiologie, pathophysiologie, pharmacologie et toxicologie. Le nouveau tissu doit avoir des propriétés biologiques et mécaniques proches des vaisseaux sanguins et pouvoir s’intégrer parfaitement dans l’hôte c’est-à-dire interagir et s’adapter à son environnent et avoir la capacité de se régénérer et se réparer. Ainsi le substitut idéal obtenu par génie tissulaire doit remplir un cahier des charges très exigeant tel que le montre le tableau0.1.
Afin de construire un nouveau tissu, il faut apporter un support pour soutenir les cellules et leur croissance. Pour apporter cette tridimensionnalité au substitut, on trouve différentes
TABLE 0.1 – Cahier des charges des substituts vasculaires issues du génie tissulaire. Adapté
de Auger et al.40
Ne cause pas de toxicité
Cause peu ou pas d’inflammation par lui-même ou par ses produits de dégradation
Biocompatibilité
Ne cause pas de rejet Perméabilité
Résistance à la pression sanguine
Compliance et propriétés viscoélastiques similaires aux vaisseaux physiologiques*
Fonctionnalité mécanique
Anastomose aisée (pose et rétention prolongée des points de suture)
Non thombogénique Réponse vasomotrice Fonctionnalité biologique
Capacité de remodelage par l’hôte
Conformité régulatoire Les constituants et le mode de production doivent être conformes aux exigences régulatoires
*Le module élastique des artères humaines est environ 1 MPa31, la pression à la rupture et la com-pliance de la veine saphène humaine sont respectivement 1500-2000 mmHg et 0,7-1,5 %/mmHg41
approches issues du génie tissulaire vasculaire qui seront décrites dans la section suivante. Les matrices décellularisées ou acellulaires
L’espace entre les cellules est occupé par une substance appelée la matrice extracellulaire (MEC). C’est un réseau de fibres complexes et très organisées qui soutient les cellules as-surant un soutien structural aux tissus. Elle permet la communication intercellulaire, l’adhé-rence, l’étalement, la différenciation et la prolifération des cellules. Elle est composée de protéines de structure et fibreuses (collagène I, II et V, et élastine), des glycoprotéines d’adhé-sion (fibronectine et laminine) ainsi que de protéoglycanes et de glycosaminoglycanes. Les cellules sont reliées à la MEC par des protéines transmembranaires (les intégrines). Cette matrice est synthétisée par les fibroblastes et les cellules épithéliales.
Cette première approche se base sur ce que la nature a mis tant de temps à créer et améliorer. L’idée est que les matériaux naturels existants sont les plus appropriés pour interagir avec l’hôte. Le principe des matrices décellularisées ou acellulaires consiste alors à utiliser comme support mécanique la MEC naturelle afin d’offrir un environnement adéquat à la croissance et prolifération cellulaire. Cette technique repose sur le fait que ce sont les antigènes cellulaires qui causent le rejet de tissus xéno- ou allogéniques. L’absence de cellules élimine ce problème et permet de ne pas avoir besoin de cultiver les cellules humaines autologues en laboratoire,
ce qui simplifie l’application de la méthode.
Les méthodes de décellularisation combinent des traitements physiques et chimiques. On trouve l’agitation, la sonification, la pressurisation, les massages mécaniques, les cycles de gel et dégel dans la littérature comme méthodes physiques pour briser les membranes des cellules et faciliter leur extraction des tissus. L’usage de détergents ou de solutions ioniques ou un traitement enzymatique tel la trypsination est généralement nécessaire pour complète-ment retirer les cellules de façon chimique.
Différents tissus décellularisés ont déjà été étudiés tels que la peau, la sous-muqueuse de l’in-testin grêle (SIS, Small Inl’in-testinal Submucosa) porcin, la vessie de porc ainsi que des valves cardiaques porcines et des carotides de boeufs qui sont disponibles commercialement. Au niveau vasculaire, des essais d’implantation ont été rapportés avec une SIS chez le chien avec une excellente biocompatibilité, une endothélialisation complète de la paroi et une structure tri-couche possédant une média et une adventice42. Chez le lapin, une SIS recouverte de col-lagène complexée avec de l’héparine démontra de bons résultats avec la régénération d’un endothélium à 3 mois43. Plus récemment, un enfant de 9 ans a reçu une greffe vasculaire avec une veine iliaque allogénique décellularisée et recellularisée avec des cellules souches autologue de moelle épinière44.
Cette technique semble prometteuse, cependant, les traitements que subissent les tissus peuvent évidemment altérer la composition biochimique et les propriétés mécaniques de la MEC et pourraient avoir des impacts sur la réponse immunitaire du receveur45. De nombreuses études sont en cours afin d’évaluer de nouvelles méthodes de décellularisation qui limiterait les im-pacts sur l’intégrité de la MEC mais aussi sur les méthodes de recellularisation de ces ma-trices46,47. De plus l’utilisation de MEC xénogénique est également un point faible de cette technique à cause de la possibilité de transmission de virus à l’homme et l’utilisation de MEC allo ou autogénique pose un problème de disponibilité45.
Les substituts produits par la méthode d’auto-assemblage.
L’ingénierie tissulaire par auto-assemblage se démarque par le fait qu’elle n’utilise pas d’écha-faudage ou de matrice de support à proprement dit. Cette approche a été pionnière dans la création de feuillets pour le génie tissulaire, mais inclut aussi maintenant d’autres méthodes, telles que l’agrégation de microtissus et l’impression cellulaire48(Figure0.3).
L’auto-assemblage a été proposé pour la première fois dans les années 1990 par l’équipe de Nicolas L’Heureux et François Auger49. Elle est basée sur un système de feuillets cellu-laires enroulés, constitués de cellules et de MEC sécrétée par les cellules elles-mêmes. Dans une première étape, chacun des 3 types cellulaires vasculaires est récupéré à partir de tissus
FIGURE 0.3 – Substituts produits par la méthode d’auto-assemblage. (a) Substituts à base
de feuillets cellulaires en 2 dimensions roulés autour d’un mandrin pour former un tube. (b) Assemblage de microtissus cellularisés placés dans un moule. (c) Bioimpression de cellules et MEC déposées couche par couche pour obtenir une construction en 3 dimensions.
humains puis cultivés. La particularité est que ces cellules musculaires lisses (CML) sont cultivées en présence d’acide ascorbique et jusqu’au-delà de la confluence afin d’obtenir un feuillet. La deuxième étape consiste à enrouler les feuillets cellulaires : le feuillet obtenu avec les CML est d’abord enroulé autour d’un mandrin afin de reconstituer la média. Un deuxième feuillet, produit à partir des fibroblastes, est ensuite enroulé autour du rouleau précédent afin de constituer l’adventice. Cette construction est alors mise en culture dans un bioréacteur afin de permettre la cohésion de ces différents feuillets. Après 8 semaines, le mandrin central est retiré et la troisième tunique sera ajoutée par ensemencement de CE à l’intérieur de la lumière du tube. Après 3 mois de culture, ce substitut présente une pression à la rupture su-périeure à 2000 mmHg. Sa facilité de manipulation a permis son implantation à court terme chez le modèle canin avec néanmoins un taux d’échec de 50 % dû à des problèmes d’en-dothélialisation expliqués par la barrière xénogénique. Le point fort de cette technique est que ces substituts de vaisseaux sanguins sont plus élastiques que les greffes de polytétrafluo-roéthylène expansé, cependant ils le sont beaucoup moins que les vaisseaux de petit calibre qu’ils sont censés remplacer, ce qui pourrait potentiellement conduire à des complications qui mènent souvent à une hyperplasie intimale50.
simplifié la méthode. Cela a permis de réduire la complexité et le temps de production de ces substituts qui ne contiennent plus que la couche externe avec des fibroblastes issus de dermes et de cellules endothéliales dans la lumière. La couche médiane est alors absente. Une étude chez l’animal (rats et primates) a été réalisée avec succès41. De son côté, Auger et son équipe ont utilisé la méthode d’auto-assemblage pour réaliser des modèles de la partie musculaire de la paroi vasculaire tant physiologique que pathologique. Ces modèles ont permis d’étu-dier le rôle de certaines molécules telles que l’endothéline qui est un vasoconstricteur51, les polyphénols52ou de microparticules vasculaires53.
De nouvelles approches ont été récemment rapportées impliquant la production de substituts vasculaires par auto-assemblage d’agrégats de microtissus. Ceux-ci sont obtenus en utilisant des agrégats de fibroblastes dérivés d’artères humaines et de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, liés par leur sécrétion de MEC puis assemblés en tubes. Après 14 jours sous flux pulsatile, ces agrégats se sont complètement fusionnés54. Dans une approche si-milaire, la bioimpression en 3D a été utilisée pour produire vaisseaux sanguins simples et ramifiés par dépôt d’agrégat cellulaire sur des bâtonnets d’agarose (support). Ces approches offrent la possibilité de produire des formes complexes, telles que des bifurcations vascu-laires. Cependant, il reste à voir si elles peuvent atteindre la résistance mécanique requise pour une utilisation dans le système circulatoire55.
Cette technique d’auto-assemblage est prometteuse, cependant, le temps de culture et la com-plexité de production pour obtenir un substitut mature sont toujours des facteurs limitants. L’utilisation de feuillets enroulés est potentiellement limitée en termes de géométries qu’elle peut produire. L’ingénierie tissulaire à base d’agrégation de cellules peut être plus appropriée pour des constructions plus complexes, mais elles n’ont pas encore fait leurs preuves. Les systèmes d’échafaudage à base de polymères synthétiques.
Les polymères synthétiques utilisés comme échafaudage permettent de fournir un support principalement mécanique aux substituts. La plupart sont des polymères biodégradables qui lentement vont laisser la place au nouveau tissu régénéré. L’avantage principal de cette tech-nique est la possibilité de contrôler précisément les propriétés initiales de l’échafaudage : mécanique, microstructure, et taux de résorption. De plus, la reproductibilité de production de l’échafaudage initial est élevée.
L’acide poly-glycolique (PGA) est le polymère le plus largement utilisé pour cette applica-tion56. Cependant, le PGA est rapidement résorbé, ce qui peut conduire à un affaiblissement prématuré des tissus avant que les cellules aient la possibilité de régénérer la matrice. De plus la pression d’éclatement élevée des substituts est obtenue au détriment de leur élasticité57.
Différentes tentatives visent à améliorer les propriétés mécaniques de ces échafaudages et à réguler le phénotype cellulaire par l’intermédiaire d’interactions avec le polymère. De nom-breux autres polymères ont été copolymérisés avec le PGA58, tels que l’acide poly-lactique (PLA)59, le poly-caprolactone (PCL)60 et polyéthylène glycol (PEG)61 entre autres. Jusqu’à présent, l’essai clinique le plus long pour un substitut vasculaire a impliqué une construction produite à l’aide d’un échafaudage à base d’un polymère synthétique (25 patients suivis pen-dant 7 ans). Cet échafaudage est poreux et composé d’un mélange de polymère biodégradable de PLLA, de PCL renforcé par du PGA62.
De façon générale, les conditions de culture posent un défi pour l’application de ces échafau-dages. Un certain temps de culture est nécessaire pour l’obtention de substituts fonctionnels58 et la période de maturation in vitro exigée pour obtenir des caractéristiques acceptables est de plusieurs semaines à mois ce qui reste encore trop long. Un autre point négatif est l’adhé-rence des cellules endothéliales dans la lumière de l’échafaudage qui n’est pas optimale et les études actuelles se penchent sur les techniques d’endothélialisation de la lumière de ces échafaudages63.
Les systèmes d’échafaudage à base de polymères naturels.
L’idée ici est d’utiliser des matériaux naturels, c’est-à-dire présents chez les animaux ou vé-gétaux comme échafaudage. L’abondance des protéines et leur fonctionnalité au sein même des vaisseaux sanguins sont largement connues64. Cette approche du génie tissulaire vascu-laire vise donc à créer des matrices protéiques ensemencées de cellules. Le but est de créer une matrice extracellulaire en adéquation avec les cellules et similaire au tissu vasculaire. Dans ce contexte, le collagène de type I est le plus souvent utilisé, car il est présent dans de nombreux tissus et peut être isolé, solubilisé et reconstitué selon de nombreux protocoles64. La fibrine est également utilisée pour ces applications. Cette protéine structurelle impliquée dans la formation de caillots sanguins joue un rôle essentiel dans le processus de cicatrisa-tion et est connue pour sa capacité à stimuler la régénéracicatrisa-tion et le remodelage des tissus58. On trouve également des gels à base d’élastine. Cette protéine est rencontrée dans les parois des artères et dans quelques tissus des mammifères. Elle participe à la vasomotricité du vais-seau sanguin qui lui permet de réguler la pression sanguine et est sécrétée par les cellules musculaires lisses65.
L’utilisation de solutions gélifiantes à base de protéines permet d’ensemencer facilement les cellules en solution66. Cette suspension cellulaire peut alors être versée dans un moule pour obtenir la forme souhaitée, par exemple pour créer des tubes. Les cellules sont dispersées uniformément et immobilisées au sein de la matrice protéique lors de la gélification.
Celle-ci peut être modulée par différentes conditions physico-chimiques telles que le pH ou la température. L’utilisation de gels protéiques est limitée, du fait de leurs faibles propriétés mécaniques. De nombreuses méthodes ont donc été développées afin de renforcer ces ma-trices sans avoir recours à un renforcement qui serait non biologique telles que l’utilisation de solutions chimiques ou de polymères synthétiques64. Les stimulations mécaniques sur les gels protéiques ont montré un changement de la structure de la matrice ainsi qu’une influence sur l’organisation des cellules67.
D’autres approches telles que l’utilisation d’échafaudage hybride synthétique/naturel ont été étudiées. Une revue de littérature détaillée sur le génie tissulaire vasculaire sera présentée au chapitre 1 « L’ingénierie des tissus tubulaires ».
0.5
Les substituts vasculaires à base de collagène
Le collagène
La littérature sur le collagène est foisonnante et remonte au-delà de 1920. Le collagène est le principal composant de la plupart des tissus conjonctifs et de la matrice extracellulaire chez les mammifères et représente environ 25 % de toutes les protéines. Dans certains types de collagène, la molécule entière est une triple hélice alors que dans d’autres types, seule une portion en est formée68. Le collagène mature de type I est formé d’environ 1000 acides aminés et possède lui également cette structure en triple hélice (Figure0.4).
Le collagène est souvent choisi en tant que support pour la régénération tissulaire par les cellules vasculaires grâce à ses excellentes propriétés biologiques. Il favorise l’adhésion et la prolifération des cellules, au sein de la matrice extracellulaire, par interaction entre le site RGD de la protéine et les intégrines des membranes cellulaires70. Il constitue un environ-nement idéal pour la croissance des cellules du tissu vasculaire. Cependant, il est hautement thrombogène. La présence d’un endothélium à sa surface est fortement recommandée. Le collagène possède de très faibles propriétés antigéniques et immunogéniques. Les éventuelles réponses immunitaires pouvant subvenir lors de l’utilisation de produits contenant du colla-gène sont essentiellement dues à des composés présents autres que le collacolla-gène, tels que des impuretés, ou des traces d’agents de réticulation non éliminées71. Il est le principal compo-sant conférant aux tissus conjonctifs, tels que par exemple les os, les dents, les cartilages, les tendons, les ligaments et les matrices fibreuses de la peau et des vaisseaux sanguins, leur résistance et leur forme.
FIGURE0.4 – Route biosynthétique vers les fibres de collagène69. La taille et la complexité du collagène augmentent avec les modifications post-transcriptionnelles et l’assemblage des fibrilles.
plus étudiés actuellement dans le domaine du génie tissulaire avec de nombreuses applica-tions (Tableau0.2).
Les substituts vasculaires à base de collagène dans la littérature
La première utilisation de gels de collagène pour la fabrication de substituts vasculaires re-monte à 198629. Il avait alors été démontré qu’il était possible de reconstruire une adventice à partir de fibroblastes et de collagène, une média à partir de cellules musculaires lisses et de collagène et une lumière enduite d’une monocouche de cellules endothéliales. Malheureu-sement, cette construction avait une résistance mécanique médiocre avec une résistance à la pression inférieure à 10 mmHg et ne pouvait donc pas être utilisée en clinique sans support
TABLE0.2 – Exemple d’applications biomédicales à l’aide de collagène. Formes Exemples Réparation de la peau Solutions Oreilles artificielles Gels Pansements
Poudres Agents hémostatiques72
Fils de suture73
Vaisseaux sanguins artificiels Fibres Valves artificiels Membranes de dialyse Pansements Cornées artificielles Membranes et films Lentilles de contact
Vaisseaux sanguins artificiels Canaux biliaires artificiels Tubes
Membranes alvéolaires artificielles Pansements74
Substituts de cartilage et d’os Agents hémostatiques
Éponges
Peau artificielle
synthétique pour soutenir la construction.
D’autres variantes de la méthode telles que l’enroulement de feuillets autour d’un mandrin pour favoriser la compaction du collagène32, un pré-alignement magnétique des fibres de col-lagène pour augmenter la résistance à la traction75, et la réticulation des fibres de collagène par la transglutaminase33 ont été développées pour améliorer les propriétés mécaniques des substituts. Différentes molécules ont été ajoutées pour réaliser des composites afin d’amé-liorer les propriétés biologiques de ces échafaudages. L’ajout d’insuline et de facteurs de croissance comme le TGF-β permettent d’augmenter la production de collagène par les cel-lules76. L’adhésion des cellules endothéliales à la surface de collagène grâce à l’ajout de sulfate de dermatane permet de réduire l’adhésion des plaquettes et leur activation37. Il a été observé que les cellules musculaires lisses ensemencées dans le collagène restent vivantes31 et sont responsables de la compaction de la matrice de collagène. Si le gel est moulé autour d’un mandrin pour en faire un tube, les cellules s’alignent avec les fibres de collagène36.
Cependant, les propriétés mécaniques des substituts produits à base de collagène seul restent inadéquates pour une implantation et sont toujours le défi actuel du génie tissulaire vasculaire
TABLE0.3 – Avantages et inconvénients d’utilisation du collagène pour le génie tissulaire et
applications biomédicales.
Avantages Inconvénients
Source renouvelable abondante chez les organismes vertébrés
Prix élevé du collagène de type I pur commercialisé
Faibles caractères antigènique et immunogène
2 à 4 % de la population modiale sont allergique au collagène (6 % pour le
latex) Biodégradabilité contrôlable par le taux
de réticulation Difficile à manipuler en tant qu’hydrogel
Environnement propice à la prolifération des cellules
Manque de reproductibilité des propriétés du collagène isolé en laboratoire (densité de réticulation,
impuretés, taille des fibres, etc) Différentes formes disponibles (film,
solution, gel, éponge, nanoparticules)
Faibles propriétés mécaniques du collagène reconstitué (hydrogel)
à base d’échafaudage de collagène77. Une pression d’éclatement très basse par rapport à celle des substituts produits par d’autres méthodes implique que d’autres composantes doivent être ajoutées à la matrice78 ou qu’elles doivent être enveloppées d’un support79. Des bioréacteurs pour stimuler les substituts à base de collagène ont été développés. Il a été observé une légère amélioration des propriétés mécaniques des substituts avec une augmentation de la réorganisation à la fois cellulaire et matricielle34,41,80.
Pour résumer, le collagène été utilisé abondamment dans les dernières décennies pour le génie tissulaire et autre application biomédicale grâce à ses nombreux avantages. Cependant, il possède également de nombreux inconvénients qui font de lui un matériau difficile à utiliser. Ces avantages et inconvénients sont résumés dans le tableau0.3. D’autres études utilisant le collagène seul ou en composite seront présentées dans le chapitre 1 « L’ingénierie des tissus des tubulaires ».
0.6
Historique des travaux utilisant le collagène comme
échafaudage pour le génie tissulaire vasculaire réalisé
au LBB
Ce projet s’inscrit dans le cadre des activités du Laboratoire de Biomatériaux et Bioingénierie de l’Université Laval (LBB) dont l’un des projets est de développer des modèles vasculaires issus du génie tissulaire à base d’échafaudage de collagène.
Le LBB a choisi de travailler sur la régénération du tissu vasculaire à partir d’un échafaudage à base d’un polymère naturel, le collagène. Depuis 2002, le collagène de type I est extrait de tendons de queues de rats et stocké selon un protocole propre et élaboré au sein du labora-toire81,82. Les fibres de collagène ainsi obtenues sont solubilisées dans de l’acide acétique. Afin d’être conservée à -80 °C, la solution est congelée puis lyophilisée afin d’obtenir des éponges. Afin de réaliser les expériences, les éponges sont dissoutes dans de l’acide acé-tique de façon à obtenir une solution homogène et légèrement visqueuse de collagène à une concentration finale de 4 g/L. Avec cette solution, un gel de collagène peut ensuite être réa-lisé avec ou sans cellules musculaires lisses. La gélification du collagène s’effectue à un pH physiologique. Le protocole utilisé amène progressivement la solution de collagène à un pH neutre et apporte les nutriments nécessaires à la viabilité cellulaire. Il est possible de mouler le collagène lors de la gélification grâce à des moules pour leur conférer une forme plane ou cylindrique. Les cellules utilisées sont des cellules musculaires lisses de porc.
Propriétés de l’échafaudage
Différents essais ont été réalisés sur cet échafaudage afin de connaître ses propriétés bio-logiques et mécaniques. Une coloration histologique révèle des zones plus concentrées en collagène (Figure 0.5a et b). Ces zones sont principalement situées à proximité des cellules, ce qui suggère une réorganisation par les cellules de la matrice extracellulaire. La Figure
0.5b montre des cellules musculaires lisses réparties dans le gel de collagène66. L’étude de la viabilité cellulaire (Figure0.5c) montre que les cellules musculaires lisses restent vivantes à l’intérieur de la matrice de collagène84. Ces cellules contractent progressivement le gel de collagène (Figure 0.5d). Les propriétés mécaniques du gel de collagène restent relativement faibles en comparaison de l’artère naturelle. Une étude de la compliance a montré un point de rupture pour une pression de 18 mmHg quand la pression physiologique du sang est de 120 mmHg. Ceci est expliqué par le processus d’extraction du collagène qui va rompre le réseau organisé de fibres. La compliance désigne la capacité d’un vaisseau sanguin à emmagasiner de l’énergie lors de sa distension pendant un battement cardiaque puis à la restituer au flux
FIGURE0.5 – Essais biologiques sur le collagène issu de queues de rat extrait au LBB. (a,b)
Coloration au Trichrome de Masson montrant les cellules ensemencé dans le gel de collagène. (c) Étude de la viabilité et prolifération cellulaire. Les cellules sont vivantes dans le gel. (d) Compaction d’un tube de collagène par les cellules.
sanguin. Cette propriété permet physiologiquement au vaisseau sanguin de réguler la pres-sion artérielle (amortir la prespres-sion sanguine si celle-ci est trop forte et empêcher la prespres-sion artérielle de retomber brusquement lorsque les valves cardiaques sont fermées)85. Différentes méthodes ont été essayées afin d’augmenter les propriétés mécaniques des gels de collagène. Tout d’abord en jouant sur différents paramètres lors de la gélification comme le pH, la force ionique et la température de gélification. Puis en utilisant des agents de réticulation comme les UV ou la riboflavine86–88. Finalement, les meilleures propriétés mécaniques sont obtenues à la suite à la compaction du collagène par les cellules musculaires lisses elles-mêmes89.
FIGURE0.6 – Bioréacteur plat : structure du système. Issue de Bono et al.83. (a) Dispositifs mécaniques utilisés pour appliquer une déformation uniaxiale cyclique. Panneau supérieur : vue de dessus du dispositif où les gels cellularisés (3D, à gauche) et les monocouches de cellules (2D, à droite) ont été cultivées. Panneau inférieur : vue latérale du dispositif de déformation, qui utilise un système sous vide pour stimuler cycliquement les modèles 2D et 3D. (b) Région centrale présentant la plaque UniFlex1. (c) Exemple d’un gel 3D pendant la culture dans un puits UniFlex1. Le ROI représente la région des échantillons récoltés à la fin de la période de culture et utilisés pour des analyses ultérieures.
L’utilisation d’un bioréacteur
Au Laboratoire de Biomatériaux et Bioingénierie, plusieurs bioréacteurs ont été conçus afin de stimuler les gels de collagène. Tout d’abord un bioréacteur de type plat imposant un stress en 2 dimensions sur des gels moulés dans des boîtes de Petri. Une plaque de six puits avec un fond de silicone est posée une sur plaque de téflon comportant six plots (Figure 0.6). Le tout est relié à un système de pompe à vide qui va permettre l’extension de la membrane de silicone et la stimulation des cellules. Ces études ont montré le potentiel d’induire un comportement cellulaire en modulant l’environnement biomécanique83.
Un autre bioréacteur a été mis en place pour des gels de collagène de forme cylindrique et impose une stimulation en 3D. L’échafaudage de collagène est placé dans une chambre où un milieu peut être perfusé dans la lumière du tube ainsi qu’à l’extérieur. Le tout est contrôlé par ordinateur. Il a été observé que la stimulation dynamique des cellules induit une modu-lation dans la production de matrice extracellulaire (collagène, élastine. . . ), un alignement des cellules musculaires lisses selon la contrainte dynamique et un alignement des fibres de collagène90–92. pour à permettre aux cellules musculaires lisses de remodeler la matrice de collagène, un système de bioréacteur statique a également été développé. Ce système permet de mouler directement le tube de collagène sur un mandrin dans la chambre du bioréacteur limitant ainsi la manipulation de la construction pendant le début du remodelage. Le gel tu-bulaire reste sur son mandrin toute la durée de l’étude, il n’y a donc pas de lumière dans ce tube89.
0.7
La co-culture pour le génie tissulaire vasculaire
Puisque le collagène semble être un bon candidat pour régénérer les vaisseaux sanguins, il faut maintenant réussir à le renforcer mécaniquement. Une des premières idées de renforce-ment est de combiner le collagène avec un polymère synthétique comme l’ont fait les pion-niers Weiberg et Bell29. Mais on perd alors l’avantage d’obtenir une construction complète-ment naturelle. En un deuxième temps, on peut alors penser à utiliser les cellules pour recréer un vaisseau sanguin tel qu’il est dans le corps humain, soit composé de différents types cellu-laires. Cependant de nombreux défis se posent à la mise en place d’une co-culture. Beaucoup de modèles de culture cellulaire effectués et publiés dans la littérature utilisent des systèmes de monoculture, et le plus souvent avec des cellules d’un seul phénotype. Néanmoins, l’im-portance des phénomènes d’interactions cellulaires fait qu’actuellement la co-culture est un domaine en plein essor quel que soit le domaine de recherche et certains des modèles ont un degré élevé de complexité93,94. Cela est inévitable dans toute tentative d’utiliser la culture
