FACULTÉ DE MÉDECINE W'
. THÈSE PRÉSENTÉE
A L'ÉCOLE DES GRADUÉS
DE L 'UNIVERSITÉ LAVALPOUR L'OBTENTION
DU GRADE DE MAÎTRE ES SCIENCES (M.Sc.)
PAR
Richard ROBITAILLE BACHELIER ES SCIENCES DE L'UNIVERSITÉ LAVAL
INCORPORATION D'ANTIGÈNES VÉSICULAIRES À LA MEMBRANE PLASMIQUE LORS DE L 'EXOCYTOSE MASSIVE DE NEUROTRANSMETTEUR
PRODUITE PAR LE VENIN DE L'ARAIGNÉE LA VEUVE NOIRE
Une étude a été effectuée a 1 a jonction neuro- musculaire de grenouille pour vérifier l'existence du phéno mène d1exocytose, c'est-à-dire la fusion des membranes vési culaires avec la membrane plasmique lors de la libération de
neurotransmetteur. Certaines jonctions neuromusculaires in tactes, préalablement incubées avec des collagénases, sont incubées avec du Black Widow Spider Venom (BWSV) afin de provoquer une libération massive de neurotransmetteur et une exocytose des vésicules. Les jonctions sont immédiatement fixées après ce traitement. D'autres jonctions ne sont pas
incubées avec le BWSV et servent de contrôle. La présence des membranes vésiculaires dans la membrane plasmique est révélée a l'aide d'un sérum antivésiculaire. La membrane plasmique intacte de la jonction empêche la diffusion des immunoglobulines a 1 'intérieur de celle-ci. La seule
possibilité d'obtenir du marquage sur ces jonctions est donc d'incorporer les membranes vésiculaires a la membrane pl as- mi que^pour qu'elles soient exposées à l'extérieur de la ter minaison. La position des anticorps est révélée à l'aide de
la réaction peroxydase-DAB. Les observations sont effec tuées a l'aide d'un microscope avec optique de Nomarski. Les tissus sont ensuite préparés pour les observations en microscopie électronique.
Les observations en microscopie optique montrent que la plupart des jonctions marquées se retrouvent sur les muscles incubés avec le BWSV et le sérum antivésiculaire sauf quelques unes qui sont présentes sur les muscles non- in c u b é s avec le BWSV mais incubés avec le sérum antivésicu laire. Aucune jonction marquée n'est observée sur les mus cles non-incubés avec le sérum antivésiculaire. Les obser vations en microscopie électronique révélent du marquage sur
la membrane présynaptique des profils de jonctions incubées avec le BWSV et le sérum antivésiculaire. Au contraire, la membrane présynaptique des jonctions non-incubées avec le BWSV est rarement marquée. On observe également sur des coupes transverses de jonctions neuromusculaires (l'inté rieur accessible aux immunoglobulines) que le sérum antivé siculaire marque les différents organites impliqués par
Heuser et Reese (1973) dans un recyclage local des membranes vésiculaires. Cette étude nous permet de conclure qu'il y a
incorporation d'antigènes vésiculaires dans la membrane plasmique lors de 1 'exocytose massive de neurotransmetteur produite par le BWSV. Cette étude permet également de con clure que 1'endocytose est spécifique aux membranes vésicu laires et que ces membranes semblent se disperser dans la membrane plasmique 1 ors de 1'exocytose massive produite par le BWSV.
Je voudrais en premier lieu adresser mes remer ciements a mon directeur de recherche, le Docteur Jacques P. TREMBLAY, pour son aide et ses encouragements tout au long de ces travaux. Il a su m'apporter ténacité et persé vérance, qualités essentielles dans le domaine de la recher che. J'apprécie également les liens d'amitié qui se sont
créés, de même que le climat de collaboration qui existait. Je désire souligner l'aide et l'enseignement ap portés par les professeurs du laboratoire, en particulier, le Docteur Richard B. HAWKE S, dans mon apprentissage de la neurobiologie.
Je remercie également Monsieur Gilles GRENON pour les nombreuses discussions, de même que pour l'aide et les conseils techniques, Messieurs Gérard GUANO et René
BOUCHER pour la préparation des photographies, Madame Carole PÉPIN pour la réalisation des schémas et Madame Gabriel le GUAY pour la coupe des tissus.
Je remercie tout spécialement Madame Lyse LAROCHE pour la dactylographie de cette thèse.
Finalement, je tiens a remercier parents et amis pour les encouragements et les sacrifices qu'ils ont fait au cours de ces études. J'en suis très reconnaissant.
TABLE DES MATIÈRES
PAGE AVANT-PROPOS... i i TABLE DES MATIÈRES... i i i
LISTE DES TABLEAUX... vi
LISTE DES FIGURES. ... vi i INTRODUCTION ... 1
1.1 Caractérisation des membranes vésiculaires et des membranes plasmiques... 10
1.2 Production et caractérisation de l'anticorps R.A.S.V.A... 12
1.3 Les effets et les modes d'action du venin d'une araignée, la veuve noire... 17
MATÉRIEL ET MÉTHODES... 22
2.1 Animaux ... 22
2.2 Absorption du sérum anti vésiculaire... 22
2.3 Protocoles expérimentaux... 23
2.3.1 Réaction sur des coupes transverses de jonctions neuromusculaires de grenoui- 1e avec le sérum antivésiculaire (Protocol e A)... 23
2.3.2 Stimulation de la jonction neuromuscu laire de grenouille a l'aide d'un venin d'araignée (Protocole B)... 23
2.3.3 Réactions immunologiques... 25
2.3.4 Différents contrôles... 26
2.3.4.1 Protocole A... 26
2.3.4.2 Protocole B... fT . . 26
2.3.5 Observations des tissus... 27
2.3.6 Préparation des tissus pour la micros copie électronique... 27
2. 3. 6.1 Post-fixation... 27
2.3.6.2 Déshydratation des tissus.... 28
2. 3. 6. 3 Enrobage... 29
2.3.7 Coupe de tissus... 29
2.3.7.1 Tissus du protocole A... 29
2.3.7.2 Tissus du protocole B... 30
PAGE
2.3.9 Solutions utilisées... 30
2.3.9.1 Ringers physiologiques... 30
2.3.9.2 Solutions tampons... 31
2.3.9.3 Sérum normal de cheval... 32
2.3.9.4 Fixateurs... 32
2. 3. 9.5 Epon... 33
2.3.9.6 Solutions colorantes... 33
RÉSULTATS... 35
3.1 Description in situ du muscle cutaneus pectoris de grenouille... 35
3.2 Observations des muscles en microscopie optique... 38
3.3 Morphologie de la jonction neuromusculaire en optique de Nomarski... 41
3.4 Observations de jonctions neuromusculaires intactes stimulées et non stimulées avec le venin d'araignée... 45
3.4.1 Définition des différents types de traitements des muscles... 46
3.4.2 Caractéristiques des muscles non-in c u b é s avec le vennon-in d'araignée et le sérum anti- vésiculaire (type I)... 50
3.4.3 Caractéristiques des muscles incubés avec le venin d'araignée mais non- incubés avec le sérum anti vésiculaire (type II)... 50
3.4.4 Caractéristiques des muscles hon-incubés avec le venin d'araignée mais incubés avec le sérum antivésiculaire (type III)... 53
3.4.5 Caractéristiques des muscles incubés avec le venin d'araignée et le sérum antivésiculaire (type IV)... 57
3.5 Résumé et conclusion des observations en microscopie optique... T.. 61
3.6 Observations de sections transverses de jonctions neuromusculaires en microscopie électronique... 62
3.6.1 Tissus contrôle: coupes incubées avec le sérum normal de lapin... 62
3.6.2 Coupes incubées avec le sérum anti-vésicul aire... 65
3.7 Jonctions inet actes incubées ou non-incubées avec le BWSV... 70
V
PAGE 3.7.1 Jonctions non-incubées avec le venin
d1 araignée mais incubées avec le sérum antivésiculaire (type III)... 70 3.7.2 Jonctions intactes incubées avec le
venin d1 araignée et le sérum antivési
culaire (type IV)... 80 DISCUSSION... 85 4.1 Implications des résultats de microscopie
optique obtenus avec les muscles non-incubés avec le sérum anti vésiculaire: non -incubés (type I) et incubés (type II) avec le venim
d1 araignée... 86 4.2 Implications des résultats de microscopie
optique obtenus avec les muscles incubés avec le sérum antivésiculaire: non-incubés (type III) et incubés (type IV) avec le venin
d1 araignée... 87 4.3 Interprétation des résultats en fonction de
11 hypothèse vésiculaire et de l'opérateur.... 89 4.4 Comparaison des résultats avec d1 autres études
similaires... 89 4.5 Conséquences de l'utilisation de l'enzyme
collagénase... 92 4.6 Evidences de microscopie électronique favori
sant une incorporation d'antigenes vésiculai res a la membrane plasmique lors de 1'exocy
tose ... ... 93 4.7 Mécanismes d'exocytose et d‘endocytose... 94 4.8 Absence de corrélation entre la présence de
vésicules synaptiques dans les terminaisons et 1'intensité du marquage de la membrane
pr êsynapti que... 9 7 4.9 Variations dans 1'intensité du marquage des
différentes jonctions incubés avec le sérum
antivésiculaire et le venim d'araignée....T.. 99 4.10 Implications du marquage des vésicules claires
et "coated", et des vacuoles dans 11 hypothèse
du recyclage des membranes vésiculaires... 101 4.11 Implications de l'organisation du marquage de
la membrane présynapti que... 102 4.12 Significations du marquage de la membrane
des cellules de Schwann... 104 CONCLUSION... 106 BIBLIOGRAPHIE... 110
Tableau 1
Tableau 2
PAGE
: Définition des différents types de
traitements appliqués sur les jonctions
neuromusc ul aires intactes... 47
: Fréquence de marquage en microscopie optique rencontré sur les différents types de traitements appliqués sur les
LISTE DES FIGURES
PAGE
Figure 1 : Hypothèse du recyclage des membranes
vésiculaires... 5
Figure 2: Représentation schématique in situ du
muscle cutaneus pectoris de grenouille... 36
Figure 3: Muscle cutaneus pectoris de grenouille
épinglé dans une chambre de support... 39
Figure 4: Jonction neuromusculaire de grenouille observée au microscope avec optique de
Nom ar ski... 43
Figure 5: Jonction neuromusculaire marquée suite au traitement de type III, non-incubée avec le BWSV et incubée avec le sérum antivé
siculaire ... 55
Figure 6: Jonctions neuromusculaires marquées suite au traitement de type IV, incubées avec le BWSV et le sérum anti vésiculaire... 58
Figure Figure Figure Figure Figure Figure PAGE
7 : Profil d'une section transverse d'une jonction neuromusculaire de grenouille
incubée avec le sérum normal de lapin.... 63
8: Profils de coupes transverses de jonctions neuromusculaires incubées avec le sérum
anti vésiculaire... 67
9: Absence de marquage de la membrane présy-naptique d'une coupe transverse de jonction neuromusculaire incubée avec le sérum
anti vésiculaire... 71
10: Profils de jonctions neuromusculaires non- incubées avec le BWSV et incubées avec le sérum antivésiculaire... 7 3
11: Marquage de la membrane présynaptique d'une jonction non-incubée avec le BWSV et incubée avec le sérum anti vésiculaire... 76
12: Marquage des vésicules synaptiques contenues a 1'intérieur d'une jonction
IX
PAGE
Figure 13: Marquage de la membrane présynaptique de jonctions neuromusculaires incubées avec
Malgré 11 abondance et la diversité des techniques utilisées, le ou les mécanismes impliqués dans la libération de neurotransmetteur au niveau des synapses chimiques demeu rent un sujet contreversé. Deux écoles de pensée s'oppo sent: certains préconisent une libération de neurotransmet teur par l'intermédiaire de vésicules synaptiques
(Ceccarel1i et co1 1 . , 1972, 1973 ; Heuser et Reese, 1973; Heu s er et co11 . , 74); d'autres favorisent une libération du neurotransmetteur directement du cytoplasme (Dunant et
col!., 1974, Israël et col 1., 1975 ; Marchbanks, 1975,
1978). Selon cette dernière hypothèse, les vésicules synap tiques auraient un rôle dans l'entreposage du neurotransmet teur et dans la séquestration du calcium (Dunant et c o11 . , 1982b). Le but de la thèse est donc d'étudier s'il y a vraiment exocytose des vésicules synaptiques durant une li bération massive de neurotransmetteur.
Les premiers enregistrements de potentiels miniatu res de plaque motrice (ME P P s) ont été effectués par Fatt et Katz ( 1 952) et del Castillo et Katz ( 1 956). Ce s auteurs ont suggéré a la suite de ces enregistrements, que la libération de neurotransmetteurs (dans ce cas, l'acétylcholine) se fait sous forme de petits paquets de molécules auxquels ils ont donné le nom de "quanta". Parallèlement a cette découverte,
2
des tissus pour la microscopie électronique, a permis d'ob server dans les terminaisons synaptiques centrales et péri phériques, la présence de petits organites sphériques, que les microscopistes ont nommé vésicules synaptiques (Palade, 1954; Palay, 1954 ; De Robertis et Bennett, 1955 ; Robertson, 1956). De Robertis et Bennett (1955), del Castillo et Katz (1 955, 1956) et Palay (1 956) ont relié la nature "quanti que" de la libération de neurotransmetteur a la présence de vési cules synaptiques au niveau des synapses chimiques. Ils ont donc proposé que le neurotransmetteur est contenu a 1'inté rieur de ces vésicules. Par la suite, del Castillo et Katz
(1957) et Katz (1962) ont proposé que le neurotransmetteur est libéré dans la fente synaptique lors de la fusion des membranes vésiculaires avec la membrane plasmique. De Robertis et col 1 . (1961) ont par la suite démontré que cer taines vésicules synaptiques contiennent effectivement de
11acétylcholine.
Suite a la formulation de 11 hypothèse vésiculaire, certains se sont appliqués a produire des modèles moléculai res expliquant la fusion des membranes (Curtis, 1962;
Libermann, 1966; Lucy, 1970) alors que d1 autres comme
Bittner et Kennedy (1970) , Douglas et coll. (1970) et Heuser et Mil edi (1971) se sont intéressés a la relation entre le nombre de quanta libérés et la quantité de vésicules synap tiques présentes dans les terminaisons nerveuses. Ce s der niers ont d'ailleurs montré que le nombre de vésicules
sy-naptiques contenues dans la jonction neuromusculaire de gre nouille était plus petit que le nombre de quanta libérés. Ils ont donc proposé qu'il y avait un mécanisme de recyclage local permettant aux vésicules synapti ques de libérer des quanta a plusieurs reprises.
Plusieurs études effectuées a la jonction neuromus culaire ont rapporté des changements, généralement une bais se, dans la densité des vésicules synapti ques suite a la stimulation (Hubbard et Kwanbunbumpen, 1968; Ceccarel1i et col 1 ., 1973 ; Heuser et Reese, 1973; Holtzman, 1 977 ; Pumplin et Reese, 1977 ; Rose et col 1 . , 1978; Suszkiw et co 1 1 . , 1978; Heuser et co1 1 ., 1979; Fritz et col 1 ., 1980a). D'autres auteurs ont effectué des études sur les terminaisons neuro neuronal es et ont obtenu des résultats similaires (Qui 11iam et Tamarind, 1973; Model et coll., 1975; Fried et Blaustein, 1978; Philippe et Tremblay, 1981; Tremblay et Philippe,
1981; Dickinson-Ne1 son et Reese, 1983). Cependant une hausse de la densité des vésicules synaptiques est parfois observée (Philippe et Tremblay, 1983) alors que d'autres (Bel humeur, 1984) n'ont observé aucun changements. Parallè lement a une baisse dans la densité numérique des vésicules, la plupart des auteurs ont également observé une baisse dans l'amplitude des potentiels synaptiques. Ils ont relié ces deux observations en proposant que la baisse de l'amplitude de ces potentiels électriques est une conséquence de la baisse du nombre de vésicules synaptiques.
4
Certaines évidences en faveur de i1 hypothèse vési culaire ont été obtenues suite a des études morphométriques, morphologiques et de cryodécapage. D'une part, les analyses morphométriques révèlent une baisse dans la densité numéri
que des vésicules synaptiques et une augmentation de la sur face de la membrane présynaptique suite a une stimulation
intense (Heuser et Reese, 1973 ). D1 autres évidences pro viennent d'études morphologiques utilisant des traceurs ex trace 1 1 ul a i res comme le HR P et le Dextran. Ce s molécules ne peuvent pas diffuser au travers d'une membrane intacte, dû à leur poids moléculaire élevé (Fried et Blaustein, 1976). C'est pourquoi Turner et Harris (1973) et Fried et Blaustein
(1978) suggèrent que la présence de vésicules contenant ces traceurs suite a la stimulation est un indice de la partici pation des vésicules synaptiques a la libération du neuro transmetteur. Ce genre d'études (morphométriques et morpho
logiques) a amené Heuser et Reese (1973) a proposer une hy pothèse d'un recyclage local des membranes vésiculaires. Cette hypothèse propose que le neurotransmetteur est libéré a partir des vésicules synaptiques de type clair lors de 1 1 exocytose (Fig. 1). Les membranes vésiculaires demeurent incorporées un certain temps a la membrane plasmique et sont reprises par endocytose formant alors des vésicules
"coated". Ces dernières se fusionnent entre elles pour for mer des vacuoles. Le fractionnement de ces vacuoles donne des vésicules claires réutilisables pour la libération de
membranes vésiculaires telle que proposée par Heuser et Reese (1973). Le neurotransmetteur est libéré a partir des vésicules claires lors de 11 exocytose (1). Les membranes vésiculaires demeurent incorporées a la membrane plasmique un certain temps (2) puis sont reprises par endocy tose sous forme de vésicules "coated" (3). Les vésicules "coated" se fusionnent entre elles pour former des vacuoles (4). Ces dernières se frac tionnent pour donner les vésicules claires conte nant le neurotransmetteur (5).
-5-neurotransmetteur. Heuser (1977) indique aussi que des va cuoles peuvent être formées directement a partir de la mem brane plasmique. Finalement, 11 avènement de techniques de congélation rapide et de cryodécapage ajoute une autre di mension a l'étude de 11 hypothèse vésiculaire. Ce procédé permet d1observer certains changements de la membrane présy- naptique apres la stimulation. Ceccarel1i et col 1. , (1979 a,b) et Heuser et Reese (1981) ont remarqué de petits puits d'environ 50 nm de diamètre qu'ils ont nommé "V.A.S." pour "vesicle attachment site" a cause de leur similitude de taille avec les vésicules synaptiques. Ce s mêmes auteurs ont également noté l'apparition de particules d'environ 11 nm de diamètre dans la membrane plasmique. Ce s particules proviendraient de vésicules synaptiques puisque celles-ci contiennent des particules de même taille. De plus, puisque cette technique congèle de minces couches de tissus rapide ment (quelques millisecondes), cela a permis a Heuser et
Reese, (1981, fig. 2) d'observer des vésicules synaptiques fusionnées a la membrane plasmique au moment précis ou le neurotransmetteur serait libéré.
Cependant, malgré ces évidences, 1'hypothèse vési culaire n'est pas acceptée par tous les neurobiologistes. Ceccarelli et Hurl but (1980a) rapportent que Marchb an ks
(1975, 1978) résume en six points précis les principales objections des opposants a 1'hypothèse vésiculaire. 1: La
8
premiere objection provient de la difficulté de faire baisser le nombre des vésicules synaptiques suite a une stimulation intense prolongée. D'apres Marchbanks ( 1 975, 1978) cette baisse dans la densité des vésicules suite a une stimulation intense prolongée est pourtant un postulat de base de 11 hypothèse vésiculaire; 2: Peu d'images en micros copie électronique montrent la fusion des vésicules synapti- ques avec la membrane plasmique; 3: La majeure partie de l'acétylcholine n'est pas contenue dans les vésicules synap ti ques mais plutôt dans le cytoplasme ou dans d'autres com partiments; 4: L'utilisation de précurseurs radioactifs in dique que c'est l'acétylcholine néoformée qui est libérée préférentiellement. Cependant elle ne se retrouve pas ou très peu dans les vésicules synaptiques; 5: L'estimation du nombre de molécules d'acétylcholine dans un quantum est plus grand que le nombre estimé de molécules d'acétylcholine dans une vésicule; 6: Finalement, le taux de synthèse et d'échan ge de l'acétylcholine est très lent pour des vésicules
synaptiques isolées.
Plus récemment, Dunant et coll. (1982b) ont proposé une alternative a 1 'hypothèse vésiculaire, suite a des étu des de congélation rapide et de cryodécapage effectuées sur 1 'organe électrique de la torpille (Dunant et coll., 1980, 1982a; Israël et coll., 1981, 1982, 1984). Ils suggèrent que le neurotransmetteur est libéré directement a partir du
cytoplasme, par l'intermédiaire de complexes protéiques im plantés dans la membrane plasmique. Ils nomment ces com plexes "opérateur" d'ou le nom de 11 hypothèse de 11 opéra teur.
Il y a donc une remise en question du rôle des vé sicules synaptiques et de 11 existence du phénomène d1 exocy tose lors de la libération du neurotransmetteur. L'étude que nous présentons ici tente donc de vérifier l'existence de ce phénomène d'exocytose, c'est-à-dire une fusion des membranes vésiculaires avec la membrane plasmique lors de
la libération de neurotransmetteur. Les travaux présentés dans cette thèse utilisent des techniques immunohistochimi ques et mettent à profit le développement récent d'anticorps contre les vésicules synaptiques (Carlson et Kelly, 1980). Le but de l'étude peut donc être reformulé, en tenant compte cette fois de la terminologie immunologique: il s'agit de vérifier l'incorporation d'antigènes vésiculaires à la mem brane plasmique pendant une libération intense de neuro transmetteur qui serait produite par 1'exocytose. L'étude est donc basée sur la différence antigénique entre la
membrane vésiculaire et la membrane plasmique et sur l'im possibilité pour les immunoglobulines de diffuser au travers d'une membrane plasmique intacte du à leur haut poids molé- c ulaire.
10
1.1 Caractérisation des membranes vésiculaires et des mem branes plasmiques
Whittaker (1 959) et De Robert is et c o11. (1961) ont introduit une technique d'ultracentrifugation qui permet d'isoler des organites membranaires comme des mitochondries, des vésicules synaptiques et autres types de membranes, ob tenues a partir d'un homogénat de tissus frais. L'ultracen trifugation a donc été une technique de base dans l'isola tion, la purification et la caractérisation des membranes vésiculaires et des membranes plasmiques.
Les premières études visant a connaître la composi tion des constituants synaptiques (McBride et Vantasse!, 1972 ; Davis et Bloom, 1973; Morgan et col 1 . , 1 973 ; Jones et Matus, 1974; Livett et col 1 ., 1974; Walters et Matus, 1975 ) ont révélé que les membranes plasmiques et vésiculaires ont plusieurs composantes protéiques et lipidiques communes . Une différence est toutefois notée au niveau du rapport pro- téolipidique qui est plus faible dans le cas des membranes vésiculaires. Cependant, un problème majeur rencontré dans ce type d'études, est la contamination de la préparation des membranes vésiculaires et plasmiques par les membranes mito chondriales, réticulaires, etc. C'est sans doute suite a
ces contaminations que ces études n'ont pu révéler des dif férences importantes entre les composantes des membranes vé siculaires et plasmiques (Howe et co1 1 . , 1977; Carlson et
coll., 1978; Mena et coll., 1980; Miljanick et coll.,
1982). Suite aux améliorations apportées aux techniques de préparation des membranes, les études plus récentes ont permis d'observer des différences importantes entre les mem branes plasmiques et vésiculaires (Kelly et Cotman, 1977;
Carlson et co1 1 ., 1978; Wagner et co1 1 ., 1978; Bab itch et Benavides, 1979; De ut sc h et Kelly, 1979; Zi sape! et c o11. , 1980; Mena et co11., 1981; Ueda, 1981; Huang et co1 1 ., 1982, Huttner et col 1. , 1983) . D'une part, sur l'ensemble des protéines des membranes vésiculaires (environ 23 protéines dont 8 composantes majeures) environ six sont spécifiques aux vésicules synaptiques (Babitch et Benavides, 1979; Wagner et Kelly, 1979) . Ce s études récentes rapportent
également que certaines composantes des membranes plasmiques ne se retrouvent pas dans les membranes vésiculaires.
D'autre part, Carlson et coll. (1978), Wagner et co 11 . (1978) et Deutsch et Kelly (1979) ont noté que certains lipides (gangliosides) sont presque absents des membranes vésiculaires alors qu'ils sont très abondants dans les membranes plasmiques. Ils ont également confirmé que le
rapport protéolipidique est plus faible dans les membranes vésiculaires .
Toutes ces études de caractérisation des membranes vésiculaires n'ont pas révélé d'activité enzymatique qui
d'au-12
tres marqueurs ou traceurs spécifiques permettant de suivre la production des vésicules synaptiques de même que leur présence (ou absence) lors de 11 exocytose. C'est en s'o rientant dans cette direction que plusieurs auteurs (Ulmar et Whittaker, 1973; Widlund et col 1. , 1973; Howe et col 1. , 1977; Carlson et Kelly, 1980; Matthew et col 1 ., 1981;
Buckley et col 1., 1983; De Camilli et col 1 . , 1983b) ont pro duit des anticorps dirigés spécifiquement contre les compo santes des vésicules synaptiques. Ce s anticorps sont prépa rés soit a partir de synaptosomes de cerveaux de rats ou de cochons d'Inde ou encore a partir de synaptosomes de la tor pille électrique. L'anticorps ainsi produit est, par la suite, caractérisé de deux façons. D'une part, 11 anticorps est caractérisé par le poids moléculaire et le point isoé
lectrique de l'antigêne qu'il reconnaît. D'autre part, 1'anticorps est aussi caractérisé par la distribution de l'antigêne dans différents tissus (Bloom et col 1 . , 1979; Cheng et co1 1 ., 1979; DeCamilli et co1 1 ., 1979; Matthew et col 1 . , 1981; DeCamilli et c o1 1 . , 1983a, b). Les sérums an tivésiculaires développés jusqu'à maintenant reconnaissent, pour la plupart, des antigênes différents. Cela est surtout basé sur les différences observées au niveau du poids molé culaire des antigênes.
1.2 Production et caractérisation de l'anticorps R.A.S.V.A. L'anticorps utilisé lors de cette étude est celui produit par Carlson et Kelly (1980) dirigé contre les
vési-cules syn apt iques . Ils ont nommé cet anticorps "Rabbit Anti-Synaptic Vesicles Antibody" ou R.A.S.V.A.
Pour préparer cet anticorps, il a d'abord fallu purifier des vésicules synaptiques a partir de l'organe
électrique du Narcine brasili ensis (Carlson et coll., 1978; Wagner et coll., 1978). Le degré de pureté de la prépara tion a été évalué lors de la dernière étape de 1'isolation des vésicules synaptiques en utilisant des procédés biochi miques pour mesurer le contenu des vésicules, soit l'ATP et
l'acétylcholine. Pour effectuer ce genre de dosage, il faut rupturer les vésicules synaptiques présentes lors de la der nière étape de purification, afin d'en libérer le contenu pour le rendre accessible soit aux instruments de mesure ou aux réactions biochimiques. Carlson et col 1 . (1978) et Wagner et coll. (1978) ont montré que la lyse des vésicules synaptiques résulte en une augmentation de près de 98% du taux d'ATP en solution. Ils ont donc conclu que leur prépa ration contenait bien des vésicules synaptiques et que, d'autre part, ces vésicules étaient intactes avant la lyse. Par ailleurs, Wagner et Kelly (1979) ont identifié les frag ments de membrane vésiculaire grâce a leur contenu élevé en AT P. Une solution contenant des fragments de vésicules sy napti ques est passée dans une colonne de chromatographie contenant des billes de verre poreuses (CPG-3000). Cette chromatographie sépare les fragments membranaires de la so lution selon leur taille. La densité optique des aliquotes obtenus par cette chromatographie est ensuite mesurée a
14
310 nm (maximum d1 absorbance des protéines) et a 260 nm
(maximum d'absorbance de VATP). Wagner et Kelly (1979) ont alors observé que certains ali quotes de 1'éludât correspon dant aux petits fragments de membranes donnent une absorp tion élevée pour les protéines et l'ATP. Ils ont donc conclu que ces petits fragments membranaires sont ceux des vésicules synaptiques. Ils ont également observé que
d'autres ali quotes de l'éludât contenant des fragments plus gros et donnant donc une forte absorption a une longueur
d'onde correspondant a celle des protéines ne produisaient pas une forte absorption a la longueur d'onde de l'ATP. Ils ont donc conclu que ces gros fragments membranaires
n'étaient pas des constituants des vésicules. Wagner et Kelly (1979 ) les ont nommés "fragments rejetés". Pour clai rement identifier les protéines des fragments vésiculaires, Wagner- et coll. (1978) et Wagner et Kelly (1979) ont égale ment procédé a une électrophorèse sur gel des ali quotes ob tenus lors de la chromatographie. Les résultats qu'ils ont obtenus montre que les vésicules synaptiques sont composées de 23 protéines dont 8 sont des composantes majeures et 15 des composantes mineures. Sur les huit protéines majeures, six sont spécifiques aux membranes vésiculaires.
Wagner et Kelly (1979) ont également étudié la ré partition de ces composantes majeures sur la face externe (en contact avec le cytoplasme) ou interne des membranes vé siculaires. Cette étude nécessite des vésicules synaptiques intactes et des enzymes protéolitiques (par exemple, trypsi
ne, pronases, etc) incapables de pénétrer a 11 intérieur des vésicules et qui hydrolysent les protéines avec lesquelles ces enzymes entrent en contact. Ils observent par la suite sur un gel d1électrophorèse quelles protéines sont demeurées intactes apres le traitement. Wagner et Kelly (1979) ont montré qu'en utilisant des vésicules synaptiques intactes,
cinq des six composantes spécifiques majeures des vésicules sont hydro!ysés par ces traitements. Elles se trouvent donc sur la face externe des vésicules. La sixième protéine
spécifique n'est pas hydro!ysée a moins que les vésicules aient été rupturées. Ils ont donc conclu que cette protéine (protéine 17, poids moléculaire de 30, 000 kilodaltons) se trouve sur la face interne des membranes vésiculaires.
Carlson et Kelly (1980) ont utilisé les fragments vésiculaires obtenus par chromatographie sur colonne pour produire chez le lapin un anticorps polyclonal dirigé contre les composantes des vésicules synaptiques. Dans un premier temps, ils ont montré que leur anticorps réagit bien contre les vésicules synaptiques en utilisant deux procédés diffé rents. D'une part, a l'aide d'un test d'Ouchter1ony ils ont démontré que le sérum R.A.S.V.A. produit une ligne de préci pitation contre les composantes des vésicules. D'autre part, ils ont montré 1'interaction du sérum avec les frag ments vésiculaires a l'aide "d'essais sur phase solide".
Cela consiste a fixer 1'antigene sur un substrat solide, et de le faire réagir avec l'anticorps radioactif. En faisant ce test, ils observent que la proportion du sérum
antivêsi-16
cul aire fixé au substrat augmente linéairement avec la con centration de protéines vésiculaires attachées au substrat
(Carlson et Kelly, 1980).
Carlson et Kelly (1980) ont également montré que le sérum R.A.S.V.A. reconnaît des protéines situées non seule ment sur la face externe mais aussi sur la face interne des
vésicules synaptiques. En effet, une certaine proportion d1anticorps est absorbée par des vésicules intactes alors que tous les anticorps sont absorbés par des vésicules bri sées. Ils ont donc conclu que les anticorps qui ne sont pas
absorbés par des vésicules intactes, reconnaissent des pro téines situées sur la face interne des membranes vésiculai res. Ils ont évidemment fait le lien entre cette caracté ristique du sérum R.A.S.V.A. et la présence de la protéine 17 sur la face interne des membranes des vésicules (Wagner et Kelly, 1979) .
Ce s études pour caractériser 11 anticorps ont toute fois révélé que le sérum R.A.S.V.A. réagit aussi avec des membranes différentes des membranes vésiculaires. Car 1 son et Kelly (1980) ont observé que près de la moitié des anti corps sont retenus lors d'une absorption avec les "fragments rejetés". Étant donné qu'une absorption du sérum avec les fragments rejetés diminue la quantité d'anticorps radioactif qui se lie aux vésicules, ils ont conclu que ce sérum poly clonal reconnaît des composantes membranaires communes aux vésicules synaptiques et aux contaminants (fragments reje tés) .
Sanes et coll. (1979) et Hooper et coll. (1980) ont montré que ce sérum anti vésiculaire reconnaît différentes
classes de terminaisons nerveuses chez les mammifères, les oiseaux et les amphibiens. Ces auteurs ont observé la pré sence de 11 antigene dans les terminaisons cholinergiques, incluant la jonction neuromusculaire, les ganglions sympa thiques et parasympathiques et dans les parties de l'hyppo- campe et du cervelet qui ont une réaction positive a l'acé tylcholinestérase. Le sérum reconnaît également des régions non-cholinergiques mais avec beaucoup moins d1intensité. Finalement, ce qui est important pour l'étude que nous pré sentons, c'est la réaction positive de ce sérum a la jonc tion neuromusculaire de grenouille (Sanes et col 1 . , 1979). Il faut aussi ajouter que cet anticorps a déjà été utilisé pour étudier le phénomène d'exocytose produit par le lantha num a la jonction neuromusculaire de grenouille (Von Wedel et co11., 1981). Ce s résultats seront comparés lors de la discussion, aux résultats que nous avons obtenus avec le BWSV.
1.3 Les effets et les modes d'actions du venin d'une arai gnée, la veuve noire
Au cours des expériences présentées dans cette thèse, 1'exocytose massive qui devrait provoquer l'incorpo ration d'antigènes vésiculaires a la membrane plasmique, est assurée par 1'action du venin d'une araignée appelée veuve noire (BWSV, pour Black Widow Spider Venom). Les effets du
18
BWSV ont été caractérisés par des études électrophysiologi ques et morphologiques. Les données électrophysiologiques montrent que le BWSV produit d'abord une augmentation de la fréquence des potentiels miniatures de plaques motrices
(MEPPs) et par la suite un blocage complet de la transmis sion synaptique (Longenecker et col 1., 1970; del Castillo et Pumplin, 1975 ; Fritz et col 1. , 1980a, b). Les données mor phologiques montrent que le BWSV produit une baisse dans le nombre des vésicules synaptiques, un gonflement des mito chondries et l'apparition de replis membranaires (Clark et col 1 . , 1970, 1972 ; Gorio et col 1 . , 1978; Du c h en et col 1 . , 1980; Watanebe et Me 1 do 1 esi, 1983) . Des études de cryodéca page (Pumplin et Reese, 1977; Ce cc are 11i et c o1 1 . , 197 9 a) ont également montré que les particules présentes aux zones actives sont désalignées.
Ceccare 11i et col 1 . (1979 a) ont aussi montré que le phénomène d'exocytose (évalué par 1'apparition de particules dans la membrane plasmique) ne semble plus se limiter a la zone active, mais se retrouve plutôt un peu partout sur la membrane.
Par ailleurs, une incubation de quelques heures avec du BWSV entrai ne le gonflement des terminaisons synap tiques et, a plus long terme, la dégénérescence des termi nai sons (0k amoto et col!., 1971; Duchen et col! ., 1980). L'action du BWSV est observée tant au niveau du système
nerveux central (Tzeng et cell., 1978; Tzeng et Siekevitz, 1978; Baba et Cooper, 1980; Yamamoto et Mat s ui, 1982 ) qu'aux systèmes périphériques (Gorio et col 1 . 1978; Rubin et col 1. , 1978; Fritz et coll. 1980a,b). Ces études démontrent aussi que les effets du BWSV sont présents dans plusieurs espe ces. Fritz et coll. (1980a,b) ont toutefois noté que l'ac tion du BWSV dans différentes especes peut être due a diffé rentes composantes protéiques du venin. Frontali et coll.
(1976) ont isolé et purifié les quatre composantes principa les du venin d'araignée. La protéine majeure responsable des effets du BWSV à la jonction neuromusculaire de gre nouille a été nommée a -1atrotoxine (Frontali et coll.,
1976; Meldolesi, 1982). Va 1 tort a et coll. (1 984) ont, par ailleurs, montré que 1' a-1atrotoxine se fixe spécifiquement sur la membrane des terminaisons présynaptiques.
Plusieurs évidences montrent que les protéines du BWSV agissent comme un ionophore (Finkelstein et coll., 1976; Smith et coll., 1977; Gorio et coll., 1978; Nicholls et coll.,'1982). Finkelstein et coll. (1976) ont montré a l'aide de membranes lipidiques bilamellaires artificielles, que la protéine a-1atrotoxine augmente la conductance aux cations alcalins, possiblement en formant de nouveaux pores sur la membrane. Certains ions divalents (Ca++ ou Mg++, mais surtout le Ca++) et le Na+ ont un rôle très important dans 1'action du BWSV (Misler et Hurl but, 1979; Baba et
20
Cooper, 1980 ; Ceccarelli et Hurl but, 1980b; Madeddu et coll., 1984). Misler et Hurlbut (1979) ont observé qu'en absence de Na+ et de Ca + + le BWSV ne produit pas d1 augmenta tion de la fréquence des MEPPs a la jonction neuromusculaire de grenouille. Cependant si la même préparation est ulté rieurement placée dans une solution contenant ces ions (Ca++ et Na+) la fréquence des MEPPs est alors augmentée considé rablement. Misler et Hurlbut (1979) ont donc conclu qu'une ou des protéines du venin d'araignée devaient s'attacher ir réversiblement à la membrane plasmique formant alors des pores ou des canaux spécifiques a ces cations. L'action du BWSV peut être modifiée selon la présence de Ca++ ou de Mg++ et selon la concentration du Ca++. Grace a un traceur
extracellulaire (HRP), Ceccarelli et Hurlbut (1980b) ont montré qu'il y a un faible taux d'endocytose lors de 1'incu bation avec du BWSV en présence de Ca++ alors que ce phéno mène est complètement absent lorsque 1'incubation est faite dans une solution contenant du Mg++. Par ailleurs, Smith et col 1 . (1 977) ont observé qu'une concentration élevée de Ca+ +
(5 a 20mM) bloque 1'action du BWSV. Ils proposent qu'une dose élevée de venin (environ 0.15 glande/ml et plus) provo que une forte entrée de Ca++. Cette augmentation de la con centrât ion du Ca++ interne provoque 1'agglomération des vé sicules synaptiques, interrompant ainsi le processus de li bération de neurotransmetteur.
Finalement, del Castillo et Pump!in (1975) ont étu dié l'action du BrWSV (Brown Widow Spider Venon), un venin
analogue a celui du BWSV (McCrone et Netzlabb, 1965 ). Ils ont démontré que son action est plus intense a certaines régions de la jonction neuromusculaire de grenouille. L'action du venin varie également d'intensité, d'une jonction a l'autre, sur une même préparation.
Ainsi , le BWSV produit une libération intense de neurotransmetteur qui se reflète souvent par une baisse de la densité des vésicules synaptiques et par une augmentation de la fréquence des MEPPs . Ainsi, le BWSV sera utilisé pour
l'étude, à l'aide d'anticorps, de l'incorporation d'antigè nes vésiculaires a la membrane plasmique lors de 1'exocy tose.
2- MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1- Animaux:
De petites grenouilles (2 a 3 cm de corps) R an a
pipiens ont été utilisées pour cette étude. Les animaux ont été conservés au réfrigérateur, a 4°C, dans une solution aqueuse de bleu de méthylène (1 % V/V ) . D'autres animaux ont
également été conservés dans un aquarium a la température de la pièce.
2.2- Adsorption du sérum antivésiculaire
Le sérum antivésiculaire a été obtenu du laboratoi re du Dr Régis B. Kelly, de 1'Université de Californie à San-Fr ancisco.
Le cutaneus pectoris est isolé de l'animal et épin glé dans une chambre de support. Il est alors fixé avec de la paraformaldéhyde 2% (W/V) pendant 4 heures a 4 ° C. Après un rinçage de 30 minutes dans du tampon phosphate salin
(TPS) 0.1M, la partie centrale (innervée) du muscle est pré levée et coupée en bandes suivant l'axe longitudinal des fibres musculaires. Ces bandes sont enrobées dans quelques gouttes d'agar (7%) et coupée en tranches de 80 pm avec un "tissue-sectioner" (Smith et Falquhar). Ces tranches sont effectuées transversalement a l'axe des fibres musculaires de façon a ce que les jonctions neuromusculaires soient, elles aussi , coupées transversalement. Les tranches de tis su sont replacées dans du TPS .IM a 4 ° C pour la nuit avant d'être utilisées pour 1'adsorption.
L'adsorption est effectuée avec un nombre de tran ches de tissu ayant un volume total, équivalent a celui du
sérum antivésiculaire pur. Ce sérum est toutefois dilué à 1/50 avec du sérum normal de cheval (SNC) 10%. L' incubation des tissus s'effectue pendant une nuit, a la température de la pièce, dans la solution de sérum dilué.
2.3 Protocoles expérimentaux
2.3.1 Réaction sur des coupes transverses de jonctions neuromusculaires de grenouille avec le sérum anti vésiculaire (Protocole A)
Les muscles (cutaneus pectoris) sont préparés de la même façon que celui utilisé pour 11 adsorption du sérum antivésiculaire. La procédure décrivant l'incubation des tissus avec le sérum ad sorb é sera décrite ultérieurement
(voir section 2.3.3).
2.3.2 Stimulation de la jonction neuromusculaire de gre nouille à l'aide d'un venin d'araignée (Protocole
IL
Les muscles (cutaneus pectoris) sont isolés de 1 ' animal et épinglés séparément dans une chambre de support contenant une solution de collagénases (160 unités/ml) di luée dans du Ringer physiologique a haute teneur en Ca++ (5mM Ca++). Les muscles sont par la suite rincés dans une solution saline a teneur normale de Ca++ (2 rinçages de 10 min. chacun) afin d'éviter une implication du Ca++ lors de
la stimulation des jonctions par le BWSV. Cette haute
24
1976). Ce traitement a une durée de 90 minutes. Pendant ce temps, une dissection de 3 a 4 épaisseurs de fibres muscu laires superficielles est effectuée a l'aide de micro
ciseaux pour ne laisser qu'une ou deux épaisseurs de fibres musculaires intactes. Cette dissection s'effectue a l'aide
d'une loupe stéréoscopique a lumière tangentielle. Les débris de fibres musculaires sont enlevés avec une pince fine pour dégager la région disséquée. La dissection des fibres superficielles est nécessaire pour repérer les
jonctions neuromusculaires avec un microscope a optique de Nomarski (Zeiss), car l'effet Nomarski ne peut pas être obtenu si le tissu est trop épais. Chaque muscle est
ensuite observé avec ce microscope afin de s'assurer de la présence de jonctions neuromusculaires.
Si des jonctions intactes sont présentes le muscle observé est laissé ainsi jusqu'à la fin de la réaction des collagénases, sinon il est rejeté. Après le rinçage dans une solution saline a teneur normale de Ca++, les muscles sont traités avec le venin d'une araignée, la veuve noire (Lactrodectus mactans). La solution de venin est préparée en homogénéisant des glandes d'araignées pour obtenir une concentration finale de 0.2 gland e/ml. Cette solution est préparée dans un Ringer physiologique a teneur normale de
Ca++ (1.8 mM Ca++ ). La durée de la réaction du venin varie entre 10 et 60 minutes. L'action du venin peut être
confirmée par un léger fébrilement des fibres musculaires. Apres cette réaction les muscles sont fixés avec de la paraformaldéhyde 2% pendant 4 heures a 4°C. Ils sont ensuite rincés dans du TPS .IM pH 7.4 toute la nuit. Les muscles sont alors prêts pour les réactions immunologiques.
2.3.3 Réactions immunologiques
Les tranches de tissu obtenues selon le protocole A et les muscles obtenus selon le protocole B subissent les mêmes réactions immunologiques.
Les tissus sont d'abord incubés toute la nuit a la température de la pièce, avec la solution adsorbêe de sérum antivésiculaire. On procède ensuite a trois(3) rinçages de 10 minutes dans du TPS .IM pH 7.4, avant d'effectuer l'incu bation avec le second anticorps. Il s'agit d'un anticorps de porc, couplé a de la peroxidase et dirigé contre les im munoglobulines de lapin (Cederlane Laboratories). Il est
dilué 1/50 dans du SNC 10%. Cette incubation a une durée de 2 heures a la température de la pièces. Elle est suivie d'un rinçage de 10 minutes avec du TPS .IM pH 7.4 et d'un autre rinçage de 10 minutes avec un tampon Tris 0.05M pH 7.4. La peroxidase est révélée par une solution faite a partir de 10 ml de tampon Tris contenant 5 mg de 3-3'-diami- nobenzidine (DAB) et 30 p1 de peroxide d'hydrogène. La
so-26
luti on est filtrée a l'aide d'un filtre de papier avant l'utilisation. Le temps de réaction varie de 5 a 6
minutes. Finalement, les tissus sont rinçés une premiere fois avec du tampon Tris .05M pH 7.4 pendant 10 minutes et une autre fois avec du TPS .IM pH 7.4 pendant 10 minutes.
2.3.4 Différents contrôles
Différents contrôles sont effectués au cours des protocol es :
2.3.4.1 Protocole A :
Les tranches de tissus sont incubées avec du sérum normal de lapin ( S NL ) plutôt qu'avec le sérum antivésiculaire adsorb!. Le sérum normal de lapin est fourni par les services d'animaux de laboratoires de 1'université Laval et est dilué 1/50 avec du SNC 10%.
2.3.4.2 Protocole B:
Les contrôles s'effectuent a deux(2) éta pes différentes. D'une part, certains muscles ne sont pas traités avec le venin d'araignée. La solution de venin d'arai gnée est alors remplacée par du Ringer physiologique a teneur normale de Ca++. D'autre part, certains muscles traités avec le venin d'araignée et d‘autres non- traités ne sont pas incubés avec le sérum
anti vésiculaire adsorbé. Le sérum étant remplacé par du sérum normal de lapin
(SNL) dilué 1/50 avec du SNC 10%. 2.3.5 Observations des tissus
Les muscles préparés selon le protocole B sont ob servés au microscope optique afin de repérer les jonctions marquées et de les photographier a l'aide d'un appareil 35 mm (Zeiss). Les régions dans lesquelles des jonctions ont
été préalablement identifiées sont observées avec atten tion. Par la suite les. autres parties du muscle sont aussi observées .
2.3.6 Préparation des tissus pour la microscopie élec tronique
Des morceaux de muscles sur lesquelles se trouvent les jonctions neuromusculaires marquées, sont isolés pour être préparés pour la microscopie électronique. Les jonc tions neuromusculaires des muscles contrôles sont également isolées, en se basant, cette fois, sur les observations faites lors de la dissection. Les morceaux de muscles obte nus selon le protocole B et les tranches de tissus du proto cole A subissent une série de manipulations.
2.3.6.1 P ost-fixation
Les tissus sont rinçés dans deux bains de tampon cacodylate .12M, pH 7.4, chacun d'une durée de 10 minutes. Ils subissent
28
ensuite une post-fixation d'une heure a l'osmium 2% (W/V). Elle est effectuée au noir a 4°C. Les tissus sont de nouveau rinçés deux fois dans du tampon cacodylate
.12M, pH 7.4.
2.3.6.2 Déshydratation des tissus
Les tissus musculaires sont déshydratés a 40 C, en les incubant dans des concentra tions croissantes d'éthanol (voir le tableau ci-aprés). Des pièces non osmi- fiées de cerveau de rat sont également déshydratées. Elles serviront, lors de la mise en capsule, a soutenir les morceaux de muscles (protocole B) au centre de la capsule. Ce s pièces ont une taille d'en viron 1 mm d'épaisseur par 5 mm de long et 3 à 4 mm de large. Elles subiront, a par tir de cette étape, les mêmes traitements que les tissus musculaires.
T ableau Pourcentage Ethanol Temps (min) 30 10 50 10 70 10 80 15 95 15 100 20 100 20
2.3.6.3 Enrobage
Les tissus sont alors placés brièvement (10 min) dans deux bains d'oxyde de propy lene a la température de la pièce. Ils trempent ensuite pendant une heure dans une solution d'oxyde de propylene et d'épon (mélange 1:1). Finalement, les tissus sont transférés dans une solution d'épon pure contenant 1.4% (v/v) de DMP-30 pendant 1 heure.
Les tissus sont mis en capsules alors que les
tranches obtenues selon le protocole A sont placées dans des capsules cylindriques a fond plat pendant que les morceaux de muscles obtenus du protocole B sont placés dans des cap sules allongées et plates. Ce s morceaux de tissus sont sup portés par les pièces de cerveau de rat et sont orientés de façon a pouvoir effectuer des coupes transverses des jonc tions neuromusculaires. Les capsules sont placées a l'étuve a 60°C pendant 3 a 4 jours.
2.3.7 Coupe de tissus
2.3.7.1 Tissus du protocole A:
Des coupes fines (0.06 pm) sont effectuées à la surface seulement des blocs d'épon. Ces coupes sont placées sur des grilles de cuivre de 200 mailles.
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2.3.7.2 Tissus du protocole B:
Des coupes semi-fines (épaisseur de lpm) sont effectuées et colorées avec un mélan ge de bleu de méthylène et d'Azur B. Les blocs sont coupés jusqu'à ce que les jonc tions soient repérées. Une dizaine de coupes fines (0.06 pm) sont ensuite effec tuées à tous les 10 pm à 20 pm d'interval 1 e.
2.3.8 Coloration des grilles
Les grilles sont d'abord observées sans colora tion. Si le contraste du tissu est inadéquat, les grilles sont alors colorées très légèrement.
Uranyl acétate 5%: 6 minutes Rinçages: bains d'eau distillée Citrate de plomb: 6 minutes 2.3.9 Solutions utilisées
Ringers physiologiques
Teneur normale en Ca++
PM Molarité lOOOcc NaCl 58.44 116mM 6.78g KC1 74. 56 2mM 0.149g CaCl2 110.99 1.8mM 0.199g Na2HP04 141.96 2.16mM 0.307g NaH2P04 137.99 0.85mM 0.117g Glucose 180.6 5mM 0.901g Le pH est ajusté à 7.2
Teneur élevée en Ca + + PM Molarité 250cc CaClg 110.99 5mM 0.138g NaCl 58.44 lll.SmM 1.628g KOI 74.56 2mM 0.038g Hepes 238.3 5mM 0.298g 61uc ose 180.6 3mM 0.135g Le pH est ajusté a 7.5
Sol ut ions tampons
Tampon phosphate
Préparation de la solution stock de tampon phosphate 0.4M pH 7.4.
Solution A: NaHgPO^ .4M
Il faut diluer 11.03g de N a H 2 P 0 4 (P.M. 137.99) dans 200ml d'eau distillée. Solution B: Na2HPO4 .4M
Il faut diluer 51.08g de NagHPO^ (P.M. 141.96) dans 900ml d'eau distillée.
Lorsque les deux solutions sont bien homo gènes, 810 ml de la solution B est ajouté
a 190 ml de la solution A. Le pH est a - justê à 7.4. Pour obtenir du tampon phos phate .IM, la solution stock est diluée quatre fois avec de l'eau distillée.
32
Tampon phosphate salin
9g de NaCl (P.M. 58.46) sont ajoutés a 1 litre de tampon phosphate 0.1M pH 7.4. Molarité finale de NaCl: 0.15M.
Tampon Tris
6.07g de tris (hydroxymethyl )-ami nométhane (P.M. 157.6) sont dilués dans lOOOcc d'eau distillée pour une molarité finale de
0.05M. Le pH est ajusté a 7.4.
Tampon cacodyl ate
5.37g de sodium de cacodylate (P.M. 214.02) sont dilués dans 200cc d'eau distillée pour une molarité finale de 0.12M. Le pH est ajusté a 7.2.
2.3.9.3 Sérum normal de cheval
Du sérum de cheval (Flow Laboratories) inactivé a 56°C est dilué à 10% avec du tampon phosphate salin . IM , pH 7.4. 2.3.9.4 Fixateurs
Paraformaldéhyde 2%
2g de paraformaldéhyde est dissout dans lOOcc de tampon phosphate. Il faut pré voir lOOcc de ce fixateur par muscle ut i - 1 i sé.
Acide osmique 2%
0.5g d'acide osmique est dissout dans 25 cc de tampon cacodylate 0.12M, pH 7.4. La solution est conservée a 4°C, au noir. 2.3.9.5 Epon Mélange A : DOSA: 86g Epon 812: 80g Mélange B : NMA: 72g Epon 812: 100g
L'épon consiste en un mélange moitié- moitié des solutions A et B. Il faut également ajouter 1.4% (v/v) de DMP-30 au mélange.
2.3.9.6 Solutions colorantes
Uranyl acétate 5%
5g d'uranyl acétate est dilué dans 100ml d'eau distillée. La solution est ensuite filtrée.
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Citrate de plomb
0.2g de citrate de plomb est dissout dans 30ml d'eau distillée. Il faut ajouter 0.5ml de NaOH ION pour dissoudre complète ment le citrate de plomb. La solution est complétée a 50ml avec de l'eau distillée et filtrêe.
3.1 Description in situ du muscle cutaneus pectoris de grenouille
Le muscle cutaneus pectoris est un petit muscle (environ 8mm x 15mm) situé a la surface de la région pecto rale de la grenouille. Sa description anatomique et la technique de prélèvement sont connues depuis longtemps
(Reichert, 1851 ; Ecker, 1864; Blioch et coll. 1968). L'o rientation du muscle est telle que l'axe principal des fi bres musculaires se trouve dans l'axe rostro-caud al de l'a nimal. Le tendon de la partie rostrale du muscle (Fig. 2) est attaché a la peau alors que le tendon de la partie cau dale est attaché au cartilage ensiforme (Blioch et coll. 1968). Le muscle cutaneus pectoris est innervé par le nerf pectoral i s proprius qui émerge du nerf ulnaire situé au fond de la cavité thoracique, près de l'épaule. Le nerf pénétre sur la face dorsale (face interne du muscle), au milieu du côté latéral et il se prolonge entre les fibres musculaires vers le côté médian (Fig. 2). Le prélèvement du muscle se fait par la dissection des structures sur lesquelles il
s'attache: le morceau de peau relié a la partie rostrale du muscle et le cartilage ensiforme relié a la partie caudale. Une portion du muscle rectus abdominis est prélevée en môme temps que le cartilage afin de faciliter 1'épinglage du muscle effectué dans l'étape suivante.
Figure 2 : Representation schématique in situ du muscle cutaneus pectoris de grenouille
Schema montrant la position et l'emplacement du muscle cutaneus pectoris de grenouille qui est
situé sur la face ventrale de 11 animal. Le côté droit de la figure représente le muscle avant le début de son excision alors que le côté gauche de la figure représente la situation une fois la partie rostrale dégagée et repliée vers le bas de
l'animal. (Tiré de Blioch et col 1 ., 1968).
-36-NERF
PECTORALIS PROPRIUS
MUSCLE
CUTANEUS PECTORIS
PEAU
PEAU
NERF PECTORALIS PROPRIUS
MUSCLE CUTANEUS PECTORIS
38
3.2 Observation des muscles en microscopie optique
Le muscle cutaneus pectoris, une fois prélevé, est épinglé a 11 intérieur d'une chambre de support (Fig. 3). Cette opération, de même que la dissection des fibres muscu laires superficielles et les différentes observations sont grandement facilitées par l'utilisation d'une loupe stéréo scopique avec un éclairage tangentiel sous le spécimen. Cette loupe donne une image ayant un haut contraste et une bonne profondeur de champ. Le muscle est maintenu en place à l'aide de petites aiguilles placées au niveau du muscle rectus abdominis et au niveau de la peau (Dreyer et Peper, 1974). Le muscle cutaneus pectoris est installé de façon à ce que sa face ventrale se retrouve sur le dessus. Une
incision est alors faite avec un ciseau a lames fines (lames de 75pm d'épaisseur) au centre des fibres musculaires super ficielles. Le nerf moteur est donc éloigné de la région où s'effectue cette dissection des fibres musculaires superfi cielles. Il produit des ramifications (axones intramuscu laires) qui se propagent a travers le muscle jusqu'à son ex trémité médiane, perpendiculairement au grand axe des fibres musculaires. Les axones intramusculaires se ramifient à leur tour de façon un peu désordonnée et donnent naissance à des ramifications secondaires. Ces ramifications secondai res consistent en un petit groupe d'axones myélinisés (sou vent 3 ou 4) à partir desquels émergent les jonctions neuro musculaires (McMahan et col 1 . 1972). Chaque fibre musculai
-On note la présence des épingles (flèches) qui retiennent le muscle au niveau du morceau de peau
(partie rostrale du muscle, au haut de la photo) et au niveau du muscle rectus abdominis (partie caudale du muscle, au bas de la photo). On note également l'arrivée du nerf pectoral is proprius (pp) qui pénétré dans le muscle et qui se ramifie (têtes de flèches). Grossissement : 20X.
-re -reçoit l'innervation d'au moins une jonction neuromuscu laire (Katz, 1966) . La disposition, la forme et 1'étendue des axones intramusculaires et de leurs ramifications secon daires sont variables d'un muscle a l'autre. Ces axones myélinisés sont reconnaissables grâce a la teinte blanche que leur procure la source lumineuse de la loupe (Fig. 3).
La dissection des fibres musculaires superficiel les produit, de chaque côté de la zone dégagée, un amas de cellules musculaires lésées qui ont été coupées lors de la dissection et qui se sont rétractées par la suite. Cepen dant, plusieurs axones intramusculaires et leurs prolonge ments demeurent intacts apres cette dissection. Cette étape
procure donc une préparation suffisamment mince pour permet tre l'observation des jonctions neuromusculaires a l'aide du microscope avec optique de Nomarski .
3.3 Morphologie de la jonction neuromusculaire de grenouille en optique de Nomarski
L'utilisation d'un microscope avec optique de
Nomarski facilite grandement le repérage et l'observation des jonctions neuromusc ul aires (McMahan et Spitzer, 1971; McMahan et col 1. 1972 ; Dreyer et Peper, 1974). Ce microsco pe produit une image qui donne une impression de relief grâ ce â 1'utilisation de polariseurs et de filtres placés a an gle précis (Padawer, 1968).
d'axo-42
nes myelini ses permet de localiser les jonctions qui émer gent du dernier segment myélinisé de ces axones (Fig. 4). Telle qu1 illustrée, la jonction présente deux embranchements qui se prolongent longitudinalement a la surface de la fibre musculaire. On note également la présence de noyaux de cel
lules de Schwann, reconnaissable par l'excroissance fusifor me qu'ils produisent autour de la jonction. Dans ces condi tions d'observation, on peut décrire une jonction neuromus culaire de grenouille comme une petite structure tubulaire située à l'intérieur d'un sillon. Elle a une allure fusi forme et allongée qui se prolonge parallèle a l'axe de la fibre musculaire. Les jonctions neuromusc ulaires observées varient en longueur de 75pm a près de 4OOpm et par le nombre et le pattern des branches secondaires.
Par ailleurs, les fibres musculaires et les axones myélinisés sont aussi mis en évidence par l'effet Nomarski. D'une part, les stries des fibres musculaires sont observées en relief ce qui produit une alternance de petits monticules et de creux perpendiculaires au grand axe de la fibre. Cet effet est toutefois moins important que celui observé sur les jonctions neuromusculaires (Fig. 4). D'autre part, l'effet Nomarski sur les axones myélinisés augmente le con traste de la myéline qui les recouvre. Ceci en fait une structure plus évidente lors des observations ce qui facili te d'autant le repérage des jonctions rattachées aux axones myêl inisés.
On note la présence d'un axone myélinisé qui don ne naissance a un petit segment myélinisé (sm) d1ou émerge la jonction neuromusculaire (JNM). À noter également la présence des noyaux de cellu les de Schwann (ne s) et le relief des structures, en particulier la jonction neuromusculaire.
Grossissement: 620X.
-43-Ce s observations au microscope avec optique de Nomarski permettent de repérer entre 3 et 7 jonctions par muscle, généralement dans la région médiane du muscle, la ou on note la présence du plus grand nombre de ramifications secondai res.
3.4 Observations de jonctions neuromusculaires intactes stimulées et non-stimul ées avec le venin d'araignée
Deux caractéristiques générales se retrouvent sur tous les muscles contrôles et stimulés incubés avec le sérum normal de lapin ou le sérum antivésiculaire. La première consiste en une coloration non-spécifique résultant de
11 action de la peroxidase endogène sur le DAB utilisé pour révéler la peroxidase couplée au second anticorps (anticorps de porc dirigé contre les immunoglobulines de lapin). La majeure partie de cette peroxidase endogène se trouve au
niveau des molécules a grande capacité réductrice ( Mes ul am, 1981) comme la myoglobine des fibres musculaires et l'hémo globine des globules rouges. Ainsi les fibres musculaires lésées ou coupées lors de la dissection des fibres musculai res superficielles ont une coloration brunâtre. Ce précipi té brun est donc surtout abondant au niveau des fibres mus culaires coupées qui bordent la zone dégagée lors de la dis section. Par ailleurs, les vaisseaux sanguins contenant des hématies sont également colorés d'un brun très foncé,
46
légère teinte brunâtre sur la surface des cellules musculai res intactes de même que sur de petits axones myélinisés.
La deuxieme caractéristique générale de ces mus cles dépend de 1 'action de la paraformaldéhyde lors de la fixation. En effet, les jonctions neuromusculaires ne sont plus visibles en microscopie optique de Nomarski , suite a cette fixation. La présence du fixateur sur le tissu semble amener des changements dans la propriété de diffraction des tissus qui annulent l'effet Nomarski.
3.4.1 Définition des différents types de traitements des musc!es
Le tableau I schématise les différents types de traitements rencontrés avec le protocole de stimulation des jonctions neuromusculaires produit par un venin d1 araignée.
Le premier type de traitement (type I) regroupe les muscles ou le BWSV a été remplacé par une solution phy siologique a teneur normale de Ca++ et ou le sérum antivési culaire a été remplacé par du sérum normal de lapin (SNL) .
Dans ces conditions, les muscles sont considérés comme des contrôles. D'une part, selon Clark et coll. (1970, 1972) et Ceccarelli et coll. (1979a) 1'absence de BWSV implique une absence d'exocytose massive et d'autre part l'absence de sérum antivésiculaire rend impossible la révélation
intactes
Ce tableau résume les différents types de traite ments effectués sur les jonctions neuromusculai
res intactes. Le signe - indique que les incuba tions avec le sérum antivésiculaire et/ou le BWSV sont remplacées par la solution contrôle adéquate soit, respectivement, le sérum normal de lapin et une solution physiologique a teneur normale de calcium. Le signe + indique alors que les incu bations avec le BWSV et/ou le sérum antivésicu laire sont effectuées.
-47-Traitements
Contrôles Expérimental
Type I Type II Type III Type IV
Sérum
a n tiv é sic u1 aire - - + +
Le deuxieme type de traitement (type II) regroupe les muscles incubés avec le BWSV et du sérum normal de lapin plutôt qu'avec du sérum antivésiculaire. Ce s muscles cons tituent une deuxieme catégorie de contrôles car l'absence du marqueur spécifique des vésicules synaptiques empêche la reconnaissance des antigènes vésiculaires dans la membrane plasmique même si le phénomène d'exocytose a eu lieu lors du traitement au BWSV.
Le troisième type de traitement (type III) regrou pe les muscles non-incubés avec le BWSV mais incubés avec le sérum antivésiculaire. Ces muscles représentent le dernier type de contrôle puisque 1'exocytose massive n'a pas été provoquée suite a 1'absence du BWSV. Toutefois, dans ce type de contrôle, la présence d'antigènes vésiculaires dans
la membrane plasmique pourrait être révélée par le sérum antivésiculaire.
Finalement, le dernier type de traitement (type IV) regroupe les muscles incubés avec le BWSV et le sérum antivésiculaire. Ce type représente donc le groupe expéri mental puisque: 1) 1'exocytose est provoquée par le BWSV
(incorporation d'antigènes vésiculaires dans la membrane plasmique) et 2) les muscles sont incubés avec le sérum antivésiculaire pouvant ainsi révéler la présence des anti gènes vésiculai res .
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3.4.2 Caractéristiques des muscles non-incubés avec le venin d'araignée et le sérum antivésiculaire (Type I).
Les muscles de cette catégorie n'ont pas été trai tés avec le BWSV de même qu'ils n'ont pas été incubés avec le sérum antivésiculaire. Leur principale caractéristique est donc 1'absence de jonctions neuromusculaires marquées suite a ce traitement même s'ils ont été incubés avec le deuxieme anticorps et que 1'activité de la peroxidase a été révélée avec le DAB (Tableau II). On observe cependant une coloration non-spécifique sur les fibres musculaires lésées de même que sur les vaisseaux sanguins, ceci étant dû a 11 action de la peroxyd ase endogène sur le DAB. La trajec toire des axones intramusculaires de même que les ramifica tions secondaires de ces axones sont encore visibles. Ce s axones sont généralement de teinte blanchâtre alors que les fibres musculaires sont d'une teinte bleue due au filtre de couleur du microscope. Les jonctions neuromusculaires ne sont cependant plus visibles sur les fibres musculaires.
3.4.3 Caractéristiques des muscles incubés au venin d'araignée mais non-incubés avec le sérum antivé siculaire (Type II)
Les muscles de cette catégorie, incubés avec le BWSV mais non-incubés avec le sérum anti vésiculaire, présen tent les mêmes caractéristiques que les muscles obtenus avec
ments appliqués sur les jonctions neuromusculai res intactes
A noter que la presque totalité des jonctions
marquées se retrouvent sur les muscles traités selon le type IV, incubés avec le BWSV et le sérum antivésiculaire. A noter également 1 1 ab sence de jonctions marquées sur les muscles non-incubés avec le sérum antivésiculaire (typeI et II). Le signe + implique que les incuba tions avec le sérum anti vésiculaire et/ou BWSV sont effectuées alors que le signe - implique qu'elles sont remplacées par le contrôle adéquat (sérum normal de lapin pour le sérum anti vésicu laire et une solution a teneur normale de cal cium pour le BWSV). Anti-ves: sérum antivésicu- 1 aire.
-Type de traitement Nombre total de muscles Nombre de muscles avec jonction(s) marquée( s) Pourcentage Ant i ves -Type I BWSV -12 0 0 An t i v es -Type II BWS V + 12 0 0 An t i - v es + Type III BWSV -12 2 17 An t i - v es + Type IV BWS V + 12 10 83
le traitement de type I. L'incubation avec le BWSV n'a pas amené de changements structuraux au niveau des fibres muscu laires, des axones myélinisés et des jonctions neuromuscu laires, tel qu1 observés avec le microscope avec optique de Nomarski avant la fixation. Toutefois, comme a la suite du traitement de type I, les jonctions neuromusculaires ne sont plus visibles apres la fixation. De plus, aucune jonction marquée n'a été observée dans cette catégorie de muscle au
cours des expériences (Tableau II). Comme les jonctions gardent leur forme caractéristique apres l'action du BWSV,
1'absence de jonctions marquées n'est donc pas due a une déformation des jonctions suite a 1 'action du BWSV qui les rendraient difficiles a reconnaître.
3.4.4 Caractéristiques des muscles non-incubés avec le venin d'araignée mais incubés avec le sérum anti vésiculaire (Type III)
Ce dernier type de traitement contrôle regroupe les muscles non-traités au BWSV mais incubés avec le sérum antivésiculaire. Ils présentent essentiellement les mêmes caractéristiques que les types de traitement contrôles I et II. On note la présence de la coloration non-spécifique suite a l'action de la peroxydase endogène sur le DAB et 1'impossibilité de voir les jonctions neuromusculaires suite a la fixation. Généralement, les muscles ne présentent pas de jonctions neuromusculaires marquées, sauf deux jonctions
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qui ont été observées sur des muscles différents suite a ce traitement (tableau II). Ces jonctions marquées ont gardé une forme caractéristique. Elles sont allongées, fusiformes et elles se prolongent parallèles au grand axe de la fibre musculaire (fig . 5). Le marquage se caractérise par une apparence granulaire, probablement dû a la striation de la fibre musculaire puisque les endroits ou le marquage est intensif correspond fréquemment a la position des stries de la fibre musculaire. Dans tous les muscles ayant subi ce type de traitement, les noyaux des cellules de Schwann ne
sont plus visibles. Ceci est aussi vrai pour les deux jonc tions marquées.
Le marquage de ces deux jonctions neuromusculaires peut s'expliquer par la présence d1 activité spontanée dans ces jonctions avant la fixation. L1 activité spontanée est sans doute élevée pendant le traitement aux collagénases puisqu'une solution a haute teneur en Ca++ est employée pour favoriser l'action de cet enzyme. Il est en effet reconnu que non seulement le Ca++ est nécessaire a la libération de neurotransmetteur (Pfenninger et Rovainen, 1974) mais aussi qu'une concentration élevée en Ca++ augmente la libération spontanée de neurotransmetteur (Barton et coll. 1983).
La rareté des jonctions neuromusculaires marquées dans cette catégorie de muscles confirme que le sérum a n t i - vésiculaire ne reconnaît pas les composantes des membranes
