TPL3GEN2

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Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

Licence L3 Génétique Semestre 6

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T.P. N°01

 Matière : Immunogénétique

 Intitulé : Réalisation du frottis sanguin

 Protocole :

 Principe:

 Méthodologie (succincte):

- Déposez une petite goutte de sang à l’extrémité d’une des deux lames (lame1)

- Tenir la lame 1 horizontalement par ses 2 côtés.

- Placer la lame 2, inclinée à 45°, contre la goutte de sang, jusqu’à temps que le sang s’étale par capillarité sur l’ensemble de la largeur de la lame 2.

- Faire alors glisser la lame 2, rapidement et sans à-coup sur toute la longueur de la lame 1 de façon à étaler le sang (ne pas répéter l’opération plusieurs fois sur la même lame).

- Agiter la lame 1 jusqu'au séchage complet du frottis. Appeler le professeur pour vérification.

2. Fixation du frottis

Si vous colorez le frottis avant de l'avoir fixé, les cellules exploseront en raison du choc osmotique. Pour éviter cela, il faut fixer le frottis avant la coloration.

A l’aide d’un compte-goutte, recouvrir entièrement la lame par de l’éthanol (au-dessus de la barquette en plastique !). Poser sur du papier absorbant et laisser agir 2 minutes.

3. Coloration du frottis

Afin de colorer les noyaux cellulaires, déposer sur la lame toujours au-dessus de la

barquette en plastique plusieurs gouttes de bleu de méthylène afin de la recouvrir. Déposer sur du papier absorbant et laisser agir 2 minutes avant de rincer avec la pissette d’eau (toujours au-dessus de la barquette en plastique !) et de faire sécher la lame en l’agitant. Observer votre préparation au microscope afin d’en distinguer les principaux.

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- Les hématies

Chez les mammifères, les hématies sont dépourvues de globules rouges. Elles représentent à elles seules 43 % du volume sanguin total. Elles transportent le dioxygène.

- Les leucocytes

Représentent 2 % du volume sanguin total. Elles font partie du système de défense de l’organisme. On y trouve les phagocytes avec un noyau lobé et les lymphocytes avec un noyau simple occupant plus de la moitié de la place dans la cellule.

Produits chimiques Consommable /Verrerie Petits Matériels

 GIEMSA (solution)  MAY GRUNWALD(solution)  ALCOOL  Lame  Seringue  Eprouvettes (50 et 100ml)  Pipette pasteur  Béchers (50 et 100 ml)  Vaccinostyl  Coton  Papier absorbant  Papier filtre  Microscope (10)  Micropipette

 Bac de coloration pour lame

 Portoir pour tube et pour lame

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T.P. N°02

 Intitulé : Les groupes sanguins ABO et Rhésus

 Protocole :

 Principe:

Le système de groupes sanguins ABO correspond à la présence éventuelle de marqueurs A ou B à la surface des globules rouges ou hématies (cellules majeures du sang qui transportent les gaz respiratoires : dioxygène O2 et dioxyde de carbone.CO2).

- Chez les personnes de groupe O, il n’y a ni marqueur A, ni marqueur B. - Chez les personnes de groupe A, il n’y a que des marqueurs A.

- Chez les personnes de groupe B, il n’y a que des marqueurs B.

- Chez les personnes de groupe AB, il y a des marqueurs A et des marqueurs B.

Les tests d’identification des groupes sanguins se basent sur une reconnaissance ou non de ces marqueurs de surface A et B des hématies.

Les substances du test qui reconnaissent ces marqueurs sont appelées des anticorps et sont spécifiques d’un seul marqueur à la fois.

Ainsi les anticorps anti-marqueur A (= anti-A) ne reconnaissent que les marqueurs A, et les anticorps anti-marqueur B (= anti-B) ne reconnaissent que les marqueurs B.

S’il y a reconnaissance, alors on observe une réaction positive dite « D’agglutination ».

Dans votre compte rendu vous pouvez construire un tableau qui reprend vos différentes expériences d’identification du groupe sanguin.

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Produits chimiques Consommable /Verrerie Petits Matériels  ALCOOL  ANTICORPS Anti A  Anti B  Anti A+B  Anti D  Plaque de réaction d’agglutination  Vaccinostyl  Coton  Microscope (100 µl)

T.P. N°03

 Intitulé : Réaction immunitaire de type latex (ASLO)

 Protocole :

 Principe:

-Prélèvement sanguin sur tube sec -Centrifugation

-Réaction antigène anticorps avec le sérum (50 µl du sérum avec 50µ -D’antistreptolysine O ASLO

-Comparer les résultats avec le témoin positif et le témoin négatif

 Coffret Anticorps antistreptolysine O  ALCOOL  Tube sec  Seringue  Coton  Centrifugeuse  Micropipette  Agitateur rotationnel

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T.P. N°04

 Intitulé : Immunohistochimie

 Protocole :

 Principe: détection des cellules cancéreuse par une réaction immunitaire entre anticorps et antigène en utilisant un colorant de révélation de la réaction.

 Méthodologie (succincte): - Durée de l'expérimentation

- 10 mn de blocage des péroxydases - 30 mn de démasquage antigénique - 1 h d'incubation de l'anticorps Iaire - 10 mn de chromogène

- 2 h de bains et de rinçages divers - TOTAL : 4 heures

Mode opératoire

- Déparaffiner la section dans 3 bains de xylène de 5 minutes chacun.

- Laver la section dans des bains d‘alcool benzylique à 96 %, 80 % et 70 % pendant 5 minutes chacun.

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- Bloquer les peroxydases endogènes en incubant le tissu dans du peroxyde d'hydrogène (H2O2) 3% pendant 10 min.

- Rincer à l'eau distillée.

- Pour démasquer l'antigène : immerger la lame dans du tampon Tris-EDTA buffer, pH 9.0, 0.05% Tween- 20*, et incuber à 95°C dans un bain-marie pendant 30 minut es. (Sinon adapter à votre protocole interne en gardant le pH requis)

- Sortir la lame à température ambiante et la laisser refroidir dans du tampon Tris-EDTA buffer, pH 9.0 pendant 15 min.

- Rincer à l'eau distillée.

- Laver dans du tampon Tris-Hcl 0,05 M (pH 7,6) avec 0,2 % de Tween-20 (Tampon A) pendant 5 minutes.

- Appliquer sur le tissu l'anticorps primaire dilué dans du tampon Tris-Hcl 0,05 M (pH 7,6) avec 0,05 % de Tween- 20 selon une dilution comprise entre 1/100 et 1/200 pendant 1 heure en chambre humide.

- Laver 2 fois pendant 5 minutes dans le tampon A.

- Appliquer l'anticorps secondaire (le protocole dépend du fournisseur) et appliquer le protocole standard d'immunohistochimie (HRP – Peroxyde – DAB).

- Laver 2 fois pendant 5 minutes dans le tampon A. - Ajouter le chromogène (DAB), laisser 10 minutes. - Rincer à l'eau.

- Colorer à l'hématoxyline pendant 5 minutes. - Laver à l'eau pendant 10 minutes.

- Déshydrater le tissu dans 2 bains d‘alcool benzylique à 96% pendant 5 minutes chacun. - Laver le tissu dans 2 bains de xylène pendant 2 minutes chacun.

- Monter la lame pour l'observation.

 Un (ou plusieurs) anticorps primaire couplé(s) ou non et spécifiques de votre(s) molécule(s) d'intérêt  Kit de révélation  Chromogène  Tampons  Xylène  Bains d'alcool à 70%, 80% et 95%

 Péroxyde d'hydrogène (H2O2)  Tris EDTA, Tris HCl

 Tween-20

 Euparal ( liquide conservation des preparation microscopiques  Huile a emerssion

 Lame  Des pipettes et un Pipet-aid

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T.P. N°05

 Intitulé : Réaction immunitaire/Méthode chaine Eliza laveur et lecteur

 Protocole :

 Principe:

On souhaite mettre en évidence la présence d’un anticorps spécifique dans le sérum d’un individu à tester et réaliser le dosage de cet anticorps. Pour cela, les etudiants vont utiliser un test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).

Technique courante immuno-enzymatique de détection, le test ELISA permet de visualiser une réaction antigène – anticorps grâce à une réaction colorée produite par l’action d’une enzyme qui réagit à un substrat chromogène. Cette enzyme (ici la peroxydase) est couplée à l’anticorps traceur (anticorps secondaire) qui lui est capable de se lier spécifiquement à l’anticorps primaire que l’on cherche à doser.

L’antigène est quant à lui fixé sur les parois des puits d’une plaque de microtitration. La réaction enzymatique produit un composé bleu, l’intensité de la coloration sera donc proportionnelle au nombre d’anticorps secondaire fixé sur l’anticorps primaire. Dans ce protocole, on se propose de doser la quantité d’anticorps anti BSA (sérum albumine bovine) dans un sérum de lapin immunisé (présente Ac1 anti-BSA). Ces activités sont l’occasion d’exercer les élèves à l’élaboration d’un protocole de dosage par colorimétrie appliquée aux sciences de la vie.

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Avant le TP

L’antigène BSA Les plaques sont prêtes à l’emploi, elles possèdent un « coating » , traitement qui consiste à fixer électrostatiquement l’antigène (BSA) sur le fond des cupules. Préparation de la gamme de concentration de l’anticorps (anti–BSA) Ac1 Afin de pouvoir réaliser l’activité sur une seule séance, il est préférable de fournir aux élèves des solutions d’anticorps à différentes concentrations connues. Ces tubes préparés peuvent être conservés 1 ou 2 jours au réfrigérateur ou 1 mois à -20 °C. Le gradient de solution d’anticorps Ac1 anti–BSA s’étend de [C1] 17 µg d’anticorps.mL-1 pour le tube C1 à [C7] 0,26 µg d’anticorps.mL-1 pour le tube C7. Pour se faire, suspendre le sérum de lapin immunisé anti–BSA (Ac1) livré dans 15 mL de solution de PBS. Ce premier tube correspond à la concentration [C1]. En cascade, diluer de 50 % chaque solution en prélevant 7,5 mL de la solution Cn-1 et en complétant avec 7,5 mL de PBS.

Pour obtenir C2 (C1/2 soit 8.5 µg d’anti-corps.mL-1) : prélever 7,5 mL de C1 et ajouter 7,5 mL de PBS. Pour obtenir C3 (C2/2 soit 4.25 µg d’anti-corps.mL-1) : prélever 7,5 mL de C2 et ajouter 7,5 mL de PBS. Répéter ainsi de suite cette opération jusqu’à C7. Le tube St correspond au sérum à tester dont on cherche le dosage : on le réalise en prenant, par exemple, une quantité aléatoire de C1 suspendue dans quelques mL de du PBS. Témoin négatif Suspendre dans 10 mL de PBS le contenu du tube de sérum non-immunisé. Préparation de l’anticorps secondaire (anti–IgG de lapin) Ac2 Reprendre dans 30 mL de PBS le contenu du microtube Ac2. Le substrat TMB est fourni prêt à l’emploi, veiller à bien le stocker à l’obscurité.

Pendant le TP

Numéroter les puits comme indiquer sur le schéma, nommer St pour sérum du sujet test le puits 7 et T- le puits 8 pour le témoin négatif.

On détermine un seuil en dessous duquel le sujet est considéré comme non immunisé, par exemple ici [C5] 1,06 µg d’anticorps.mL-1. Déposer : - 80 µL de C1 dans le puits 1, - 80 µL de C2 dans le puits 2, 80 µL de C4 dans le puits 3, 80 µL de C5 dans le puits 4, -80 µL de C6 dans le puits 5, - -80 µL de C7 dans le puits 6, - -80 µL du sérum S du sujet testé, de concentration inconnue, dans le puits 7 (St), - 80 µL du sérum non immunisé T-(tube fourni dans le kit). Il est nécessaire d’être très attentif et de bien déposer une seule fois la solution dans chaque puits. Laisser incuber 10 min à température ambiante. D’un geste rapide, vider la barrette en la renversant horizontalement de manière à éviter le mélange des produits. Essuyer la surface des puits avec du papier filtre pour éliminer l’excès de produits et éviter la contamination, puis la remettre à l’endroit. Sans débordement, remplir tous les puits avec de la solution de lavage PBS Tween, et vider immédiatement en suivant la même procédure que précédemment. Répéter 2 fois ce lavage.

A l’aide d’une micropipette, mettre dans les 8 cupules 80 µL de la solution d’anticorps de détection Ac2 lequel est conjugué à l’enzyme peroxydase. Patienter 15 minutes à une température minimum de 20 °C sinon placé à l’étuve 30 °C. En profiter pour ranger et nettoyer la paillasse. Comme précédemment, vider les puits et laver 3 fois les 8 cupules de la barrette avec du PBS Tween. Ajouter dans les puits 80 µL de TMB (substrat de l’enzyme peroxydase). Laisser incuber 10 minutes à température ambiante (éviter l’exposition en plein soleil). Une coloration bleue se développe immédiatement en présence d’anticorps Ac2. Comparer la coloration du puits 7 (St) correspondant au sujet testé avec l’échelle de teinte de référence. La phase de comparaison doit être réalisée

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assez rapidement car la réaction n’est pas stabilisée, la couleur évolue ainsi le T-apparaitra bleu après plusieurs minutes d’exposition à la lumière.

 Sodium hypochlorite, solution aqueuse (1 litre)

 Kit antigene BSA ET anticorps BSA

 Solution lavage  Solution rinçage

 Microplaque de 96 puit  Tube de 5ml

 Becher Erlen Meyer  Eprouvette

 Cônes jaunes 10-200 µL pour micropipettes (lot de 1000 en vrac)  Feutres permanents  Micropipette  Multicanon à volume variable autoclavable  Décompteur de temps

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