Utiliser la FPTM pour comprendre l'effet déconstructif des enzymes hydrolytiques sur la biomasse lignocellulosique

(1)

(Re)valorisation de la fibre

cellulosique papetière

Valorisation dans une stratégie de bioraffinage

forestier intégré

Pierre-Louis BOMBECK,

Sous la direction des Prof. Aurore RICHEL et Jacques HEBERT Gembloux Agro-Bio Tech – Université de Liège

pl.bombeck@ulg.ac.be Pluribois 2017

(2)

Contexte de la thèse:

2

Bio-Ingénieur forestier Bio-Ingénieur chimiste et bio-industries Chimie et Bois

• Chimie pour le bois: durabilité, colle, etc, • Xylochimie - Chimie du bois

(3)

3

Hamilton, 1998

(4)

4

(5)

Contexte local de la thèse

 Intérêt croissant pour le bioraffinage forestier

The “integrated (forets) biorefinery” concept will lead to commercial exploitation of

each component of lignocellulosic biomass by converting them into a wide

spectrum of marketable bioproducts and bioenergy (Ragauskas et al., 2006; Yang et al., 2013)

 Filière bois wallonne peut adaptée à l’arrivée d’un nouvel acteur (pression

sur l’approvisionnement)

 Quelle industrie déjà existante serait la mieux adapter à une conversion

vers le bioraffinage?

 Une industrie qui possède déjà sa logistique d’approvisionnement et qui maîtrise des processus de déconstruction du bois

(6)

Le candidat idéal:

Industrie papetière, actuellement sur le déclin:

6

Les gros papetiers sont déjà en

reconversion vers le bioraffinage forestier - Tembec - Domtar - Kruger - Borregaard - Sappi - …

La recherche est importante dans le domaine:

- FPInnovation (Canada) - Innventia (Europe du nord) - Scion (Nouvelle-Zélande) - …

(7)

(source: COBELPA 2013)

7

Kraft CTMP

(8)

Contexte de la thèse:



Développement du concept de bioraffinage forestier

intégré

8

 Principe: Conversion des

usines de pâtes vers des unités de bioraffinage de la biomasse

forestière

 Nombreux avantages:

approvisionnement déjà existant, maîtrise des

procédés, etc.

(9)

9

(10)

Contexte de la thèse:

Industrie papetière déclinante

+

Développement du bioraffinage forestier intégré



Recherche de nouveaux produits à plus haute valeur ajoutée



Volonté de conserver un aspect valorisation fibre-matériau (ne pas

déconstruire plus que nécessaire)



Nanocellulose issue de la pâte à papier, selon un procédé

valorisant les coproduits

« Potentiel de valorisation de cellulose papetière en nanocellulose et en produits à haute valeur ajoutée issus de ses procédés de production »

10

(11)

Contexte de la thèse:

11

Utilisation d’une partie

de la production en fin de chaine pour une filière nanocellulose

Purification  Cellulose de spécialité

Hydrolyse  Sucres simples  Biofuels et Synthon

Fibre  Produits papetiers  Nanocellulose

Usine de pâte + usine de papier

(12)

La nanocellulose

 Définition large: matériau cellulosique dont au moins une des dimensions est inférieure à 100 nm

12

Type de nanocellulose Synonymes Taille moyenne Microfibrillatted cellulose (MFC) Nanofibrils, microfibrils, cellulose nanofibers (CNF), nanofibrillated cellulose (NFC) Diamètre : 5 – 60 nm

Longueur : jusqu’à plusieurs micromètres

Cellulose Nanocrystals (CNC) Nanocrystalline cellulose (NCC), crystallites, whiskers (Wh), cellulose nanowhiskers (CNW), rodlike cellulose microcrystals Diamètre: 5 – 70 nm Longueur: 100 – 250 nm

Bacterial nanocellulose (BNC) Bacterial cellulose, microbial

cellulose, biocellulose

Diamètre: 20 – 100 nm

Différents types de réseaux de nanofibres

(13)

La nanocellulose, pour quoi, pour qui?



Propriétés mécaniques, chimiques et optiques très différentes de la

fibre de base



Biosourcée, biodégradable, biocompatible



Nombreuses applications potentielles, des biocomposites novateurs

(automobile, aéronautique) aux usages pharmaceutiques et

biomédicales

(14)

14

Roshni, 2016

(15)

15

(16)

Traitements mécaniques courants

(17)

L’hydrolyse enzymatique comme

prétraitement avant un traitement

mécanique des fibres de pâte à papier



Intérêts:

-

Diminution de consommation énergétique

-

Technologie « verte »

-

Coproduits d’hydrolyse valorisables

(18)

L’hydrolyse enzymatique comme

prétraitement avant un traitement

mécanique des fibres de pâte à papier



Intérêts:

-

Diminution de consommation énergétique

Via une diminution du nombre de cycle

nécessaire, vérifiée par essais et dans la littérature

(19)

L’hydrolyse enzymatique comme

prétraitement avant un traitement

mécanique des fibres de pâte à papier



Intérêts:

-

Diminution de consommation énergétique

-

Technologie « verte »



Optimisation des conditions d’hydrolyses

Durée, T°, charge enzymatique et en substrat

(20)

L’hydrolyse enzymatique comme

prétraitement avant un traitement

mécanique des fibres de pâte à papier



Intérêts:

-

Diminution de consommation énergétique

-

Technologie « verte »

-

Coproduits d’hydrolyse valorisables

 Équilibre adéquat « état fibre traitée /

hydrolysat »

(21)

Choix des enzymes



Mélanges commercials de cellulases et

d’hémicellulases (Novozymes)

• CelluClast 1.5L, cellulases from Trichoderma

reesei (T)

• Carezyme 1000L, cellulases from Aspergillus sp.

(A)

(22)

Choix des enzymes

22

T CelluClast from T. reesei A Carezyme from A. sp.

(23)

Caractérisation des 2 mélanges

enzymatiques (mixtures commerciales)

 Dosage Bradford:

 Mesures d’activités (selon des conditions spécifiques):

23

Mélange enzymatique Concentration (mg/ml) CelluClast, from T. reesei (T) 55,42 Carezyme, from A. sp. (A) 10,85 Mélange

enzymatique Act. Cellulase (U/mg) Act. Xylanase (U/mg) Act. Mannanase (U/mg) T 24,7 18,9 3,9 A 17,9 13,8 4,2

(24)

Choix des pâtes à papier

 Pâtes mécaniques (CTMP) et chimiques (Kraft)

 De feuillus et de résineux

 Provenant des usines belges (+ canadiennes)

24

Code Essence Procédé Blanchiment

HMUb Peuplier CTMP Non Blanchie HMB Peuplier CTMP Blanchie SMUb Épicéa CTMP Non Blanchie SMB Épicéa CTMP Blanchie HKUb Mix feuillus Kraft Non Blanchie HKB Mix feuillus Kraft Blanchie SKUb Mix résineux Kraft Non Blanchie SKB Mix résineux Kraft Blanchie

Fibers characteristics (average values) HM SM HK SK Length (mm) 0,71 1,31 0,76 2,35 Fines (0 to 0.2 mm) (%) 15,31 13,25 13,64 3,01 Width (µm) 22,6 27,4 17,7 26,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 HM SM HK SK Pr opor tion ( % ) Pulps Lignin Arabinose Galactose Mannose Xylose Glucose

(25)

Hydrolyse enzymatique

25

CelluClast from T. reesei Carezyme from A. sp. 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 CT24 CA24 KT24 KA24 ppm Glucose Xylose Cellobiose Hydrolyse 24h

(26)

26

Pâte chimique Kraft prétraitée et passée au Microfluidizer®, images SEM

Après prétraitement enzymatique Après 5 passages et séchage

(27)

Production de MicroFibrillated

Cellulose (MFC) par microfluidisation

(28)

Avant d’arriver à la nanocellulose,

quelles fibres avons-nous?



Quel a été l’impact de l’hydrolyse enzymatique sur les fibres?



Doit-on nécessairement déconstruire jusqu’à l’échelle nano après le

traitement enzymatique pour mieux valoriser nos fibres?

 Collaboration et financement d’un projet avec l’UQTR (Canada)

(29)

Utiliser la FPTM pour comprendre l’effet

déconstructif des enzymes hydrolytiques sur

la biomasse lignocellulosique

Synthèse des recherches et résultats obtenus à l’UQTR

Pierre-Louis BOMBECK,

Prof. Marc BEAUREGARD, Daniel Montplaisir, UQTR Dr. Fatma Meddeb-Mouelhi, UQTR

(30)

Contexte général

 Bioraffinerie lignocellulosique  Bioproduits cellulosiques  Valorisation des fibres à différentes échelles (ex: nanocellulose)  Hydrolyse (enzymatique) légère

 « Soft enzymatic hydrolysis »  affecte principalement surface de fibre Comprendre quels composants et quels paramètres sont affectés par l’hydrolyse permettra d’adapter celle-ci au produit recherché

FPTM VS caractérisation « classique » trop simple ou longue et fastidieuse

(31)

31

0,000 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 600,000 700,000 800,000

HM_T HM_A SM_T SM_A HK_T HK_A SK_T SK_A

C on cen tr a tio n (mg /l)

Concentration en Cellobiose, Glucose, Xylose et Mannose des hydrolysats

[Cello] [Glu] [Xyl] [Man]

(32)

Fluorescent Protein Tag Method (FPTM)

 Ingénierie génétique en vue de combiner:

1) Le module de liaison (Carbohydrate Binding Module, CBM)

32

(33)

Fluorescent Protein Tag Method (FPTM)

 Ingénierie génétique en vue de combiner:

2) Une protéine fluorescente

33

Source: V. KHATRI, PhD work (2016)

FP

Genetic Coupling Linker

(34)

mOrange2

_{Excitation 549}

Emission 565

34

(35)

Fluorescent Protein Tag Method (FPTM)

4 sondes CBM-FP développée par l’équipe de M. Beauregard à l’UQTR:

eGFP-CBM3a: module de liaison spécifique à la CELLULOSE CRISTALLINE

mCherry-CBM17: module de liaison spécifique à la CELLULOSE AMORPHE mOrange-CBM15: module de liaison spécifique au XYLANE

eCFP-CBM27: module de liaison spécifique au MANNANE

Chaque sonde possédant des longueurs d’onde Excitation/Émission différentes

(36)

Fluorescent Protein Tag Method (FPTM)

Avantages:



Méthode simple d’utilisation en terme d’équipement

(lecteur de plaque) et de lecture des données



Rapide (heures)



Haut débit (plaque 96 puits)



Suivis des modifications de surface

(37)

FPTM Probes

37 CBM

FP

Crystalline

Cellulose

Amorphous

Cellulose

Xylan

Mannan

3a

17 or 4-1

15

27 488/507

587/610

549/565 434/477

Ex/Em

(38)

3

8 FPTM protocol

Figure 1: Microplate Preparation

Step1: Punch the

handsheet to obtain 3 mm (diameter) paper discs

Step2: Put all paper

discs in petri dish shining face down

Step3: Put a drop of nail

polish into weighing cupule

Step 4: Put a small dot of

transparent nail polish into the bottom of a well.

Step 5: With the vacuum apparatus take a

paper punch Deposit it on the dot of transparent nail polish

Repeat steps 4 and 5

(39)

1st_Reading

Paper disc Autofluorescence

Milk Blocking (3%)

Blocking 1h, Room T°C under agitation

Buffer Washing

(3×5 min)

2nd_Reading

Blocked paper disc Autofluorescence

Protein Binding

1h Incubation, RT

3rd_Reading

Remove unbound (Free solution) and measure Total bound protein

on paper disc

4th_Reading

Buffer bound

5th_Reading

Tween bound

Actual Fluorescence = 5th_{Reading - 2}nd_Reading Step 2 Step 10 Step 8 Buffer Washing (3×5 min) 0.05% Tween 20 Washing (3×5 min)

96 wells plate prepared with 3 mm paper discs (Costar, cat # 3631) Step 3 Step 4 Step 5 Step 6 Step 7 Step 9 Step 1

FPTM binding Assay

3

9

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000

Blank After Milk Total

Protein BufferAfter Wash After Tween 0.05% Wash After Tween 1% Wash Flu or es cence Intens ity KP

(40)

FPTM protocol

Binding Assay

40

Area 488:488,507 A1 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 FP-CBM Washing (Tween 20)

remove the non specific binding Area scanning Reading parameters 3x3, gain 25/50/75/100 Top detection: 4.5 mm 9mm bandwidth filter

(41)

41

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 HM_Std SM_Std HK_Std SK_Std B o und pr o be s (µ g /m m ²) Paper Discs eGFP-CBM3a mC-CBM17 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 HM_Std SM_Std HK_Std SK_Std B o un d P ro bes ( µg /m m ²) Paper Discs mO-CBM15 eCFP-CBM27 Cellulose cristalline Cellulose amorphe Xylane Mannane

Pâtes initiales

(42)

42

* * * * * * -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100

HM_T HM_A SM_T SM_A HK_T HK_A SK_T SK_A

B o un d pro be v a ria tio n fro m Std v a lue ( %) Paper Discs

eGFP-CBM3a mC-CBM17 mO-CBM15 eCFP-CBM27

Variation de la réponse des sondes

après traitement enzymatiqu

(43)

Suivi des variations d’exposition de 4 polymères en

surface des fibres

43

0 20 40 60 80 100 HM-Std HM-T HM-A Pr o b e s p ro p o rt io n ( % ) Enzymatic treatement HM Pulps CBM27 CBM15 CBM17 CBM3a 0 20 40 60 80 100 SM-Std SM-T SM-A Pr o b e s p ro p o rt io n ( % ) Enzymatic treatment SM Pulps CBM27 CBM15 CBM17 CBM3a 0 20 40 60 80 100 HK-Std HK-T HK-A Pr o b e s p ro p o rtion (% ) Enzymatic treatment HK Pulps CBM27 CBM15 CBM17 CBM3a 0 20 40 60 80 100 SK-Std SK-T SK-A Pr o b e s p ro p o rtion (% ) Enzymatic treatment SK Pulps CBM27 CBM15 CBM17 CBM3a Mannane Xylane Cellulose amorphe Cellulose cristalline

(44)

Invitation à collaborer

 Usages de ces (nano)fibres traitées (ex: biocomposite, emballage,…)

 Adéquation traitement/ propriétés recherchées

 Autres modifications des fibres, autres traitements à envisager  …

Particularité de cette thèse:

 Souplesse dans la thématique et l’orientation du projet  Encore 2 ans de financement

(45)

Merci de votre attention

Questions

?

pl.bombeck@ulg.ac.be