La protéine Tat du virus d'immunodéficience humaine (VIH) induit la production de l'IL-10 et du TNF-alpha dans le monocyte/macrophage humain : étude des mécanismes d'activation de la voie NF-kappaB

Texte intégral

(1)THÈSE En vue de l'obtention du. DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Immunologie. Présentée et soutenue par Kaoutar LEGHMARI Le 6 Octobre 2008 Titre : La protéine Tat du virus d’immunodéficience humaine (VIH) induit la production de l’IL-10 et du TNF-alpha dans le monocyte/macrophage humain : Etude des mécanismes d’activation de la voie NF-kappaB. JURY Dr. Francisco VEAS Dr. Roger LE GRAND Dr. Marc MOREAU Dr. Daniel GONZALEZ-DUNIA Dr. Ara HOVANESSIAN Pr. Elmostafa BAHRAOUI. Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Directeur de thèse. Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologie Unité de recherche : Laboratoire d'Immuno-Virologie, EA 3038 Directeur(s) de Thèse : Elmostafa BAHRAOUI Rapporteurs : Ara HOVANESSIAN (Absent).

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(3) ]x w°w|x vxààx à{¢áx… A mes parents qui m’ont toujours soutenue pour aller jusqu’au bout de mes ambitions. Qui m’ont fait confiance et m’ont donné confiance en moi. A toi mon papa mon modèle d’ambition de persévérance et d’honnêteté. A toi ma maman, ma source d’énergie et mon exemple de générosité et de courage. Que cette thèse soit le fruit de votre patience et de l’éducation que vous m’avez offert. Les mots sont faibles, j’espère seulement que vous êtes fières de moi. Que dieu vous garde.. A mon mari wajih, qui a apporté à ma vie une belle brise de bonheur, d’amour et de stabilité. Merci de m’avoir toujours soutenu et encouragé à aller de l’avant et ne jamais baisser les bras. Ta kouka.. A mon frère Adil et mes sœurs Lamia et Loubna, pour qui j’ai toujours été la petite sœur protégée, je vous aime. A mes petits neveux chéris que j’aime de tout mon cœur. A Si Mohamed, un jour tu as dis que tu pourrais prendre en charge mes études en France s’il le faut, je ne l’oublierais jamais. C’est comme si s’était fait. A Amor, Merci pour tes encouragements.. A Meriem, qui m’a offert son amitié depuis que nous étions de petites princesses à l’école. Nous avons grandies et notre amitié aussi, Merci d’avoir cru en moi et comprise sans que je dise un mot. Merci Mima.. Au cher Professeur ENAJI, mon maitre, guide et ami. Je vous serais éternellement reconnaissante pour m’avoir pris sous votre aile depuis mes premières années de Fac, et d’avoir toujours été là pour moi. Votre fille kaoutar.. A tous ceux que j’aime, morts ou vivants…….

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(5) ]x ÜxÅxÜv|x… Monsieur le Professeur Elmostafa BAHRAOUI. Merci de m’avoir ouvert votre laboratoire et m’avoir fait confiance pour mener ce sujet. Merci de m’avoir toujours encouragé, orienté vers ce qu’il ya de mieux pour moi, et d’avoir canalisé mon énergie, parfois un peu trop débordante. Je ne vous remercierais jamais assez pour tout ce que vous avez fait.. Fabrice, je n’oublierais jamais les discussions où l’on refaisait le monde du VIH, ni ta disponibilité à chaque fois que mon ordinateur était soufrant. Merci pour les poches de sang. Merci pour ta gentillesse.. Corinne, merci pour ton amitié, ton écoute, et ton aide. Tu as apporté ta touche de douceur au labo. Je te porte dans mon cœur.. Fabienne, pour ta gentillesse, ta disponibilité, tes critiques et ton amitié. Cecile, pour tes conseils ta bonne humeur et ton dynamisme. Merci à toutes les deux de m’avoir supporté pendant cette fin de thèse, et d’avoir su dissiper mes doutes. Vous êtes superbes.. Merci à tous les gens qui ont contribués, de près ou de loin, à ce que cette thèse commence, se déroule et finisse comme je le souhaitais. J’en oublie forcement mais merci à Yvan, Xavier, Nathalie, Isabelle, Cathy, Martine, Mme Becker…...

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(7) RÉSUMÉ Chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1, on observe une modification progressive du réseau de cytokines avec une augmentation du taux de l’IL-10, une cytokine immunosupressive, au cours de l’évolution vers le stade SIDA. Les travaux précédents du laboratoire ont permis de montrer que la protéine Tat du VIH-1 via sa région N-terminale 1-45, induit la production d’IL-10 et de TNF-α par les monocytes humains du sang périphérique en agissant au niveau membranaire. Dans mon sujet de thèse je me suis intéressée à la caractérisation des voies de signalisations impliquées dans la production de l’IL-10 par la protéine Tat du VIH-1 dans le monocyte/macrophage humain, et du rôle du TLR4 comme récepteur potentiel de Tat. L’ensemble des résultats obtenus a permis de montrer que : i) comme dans le monocyte, la protéine Tat est aussi capable d’induire la production de l’IL-10 dans le macrophage de manière PKC dépendante. ii) la présence du calcium, bien qu’elle soit essentielle pour la production du TNF-α, induite par Tat, elle ne semble pas nécessaire pour la production de l’IL-10. Ce nouveau mécanisme de production de l’IL-10 a été probablement développé par le VIH-1 afin d’assurer un état d’immunosuppression, même en absence du TNF-α, cytokine proinflammatoire, qui stimule la production de l’IL-10. iii) Tat est capable de stimuler les deux voies, classique et alternative de NF-κB. L’activation de NF-κB a été analysée au niveau moléculaire à l’aide de l’approche d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), suivie de l’amplification de la séquence promotrice de l’IL-10 par PCR. L’utilisation de différents anticorps a permis de mettre en évidence l’acétylation et la phosphorylation de l’histone H3, ainsi que le recrutement d’IKKα, CBP/p300, p65 et p52 au niveau du promoteur de l’IL-10. iv) l’implication du TLR4 comme récepteur potentiel de Tat, dans la transduction des signaux activés par Tat pour la production de l’IL-10 et du TNF-α. Nos résultats montrent que la production de ces deux cytokines, peut être bloquée par des anticorps anti-TLR4 et que Tat est capable d’interagir directement avec TLR4 via son domaine N-Terminal.. Mots clés : Monocytes/macrophages, VIH-1, Tat, NF-κB, calcium, PKC, MAP kinases, IL-10, TNF-α.

(8) ABSTRACT In human immunodeficiency virus infection, a progressive disturbance of cytokines network is observed. Thus, increasing levels in of the immunosuppressive cytokine, IL-10 and the pro-inflammatory cytokine, TNF-α, are secreted in the HIV-1+ patients sera, before T lymphocytes decrease and seem to be linked in to AIDS progression and HIV associated dementia. The mainly viral factor implicated in this immunodeficiency is the transcription activating protein (Tat). Our previous results have shown that the N-terminal region of Tat protein was able to induce both IL-10 and TNF-α production by human monocytes by acting at the cell membrane. In this thesis, we focused on the characterization of the signaling pathways involved on IL-10 and TNF-α production, by monocytes/macrophages, and the role of TLR4 as a potential Tat receptor. Our results have shown that: i) Like in monocytes, Tat protein is also able to induce IL-10 production by human macrophages, in a PKC dependent pathway. ii) The calcium pathway is not required for IL-10 production, although it is essential in Tat-induced TNF-α production. Our data suggest a new mechanism, implicating Tat protein, by which HIV-1 may maintain a constant production of the immunosuppressive IL-10 cytokine, even in the absence of TNF-α production. In consequence, HIV-1 may escape immune surveillance and thus promote the establishment of an immunosuppressive state. iii) Tat is able to induce both classical and alternative NF-κB pathways. Interestingly, we show that, , Tat stimulates nuclear translocation of IKKα. ChIP assay experiments, after Tat treatment, revealed IKKα and CBP/p300 recruitment to the IL-10 promoter and histone H3 phosphorylation (Ser 10) and acetylation (Lys 14) on this region, presumably leading to chromatin remodeling. iv) TLR4 is implicated as a potential Tat receptor, in the signal transductions activated by Tat to induce IL-10 and TNF-α production. This cytokine production is completely abolished by anti-TLR4 antibodies. Overall, we have shown that Tat interact directly with TLR4 via its N-terminal 1-45 region.. Keywords: Monocytes/macrophages, VIH-1, Tat, NF-κB, calcium, PKC, MAP kinases, IL-10, TNF-α.

(9) TABLE DES MATIERES. INTRODUCTION I- LE VIRUS DE L'IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH). 1- HISTOIRE DU VIH…………………………………………………………………...3 1-1- L’origine simienne du VIH………………………………………………....5 1-2- Modes de transmission du VIH………………………………………….....5 1-3- Classification et Nomenclature………………………………………….....7. 2- STRUCTURE DU VIH.……………………………………………………………..12 2-1- Protéines de structure……………………………………………………...12 2-2- Protéines enzymatiques…………………………………………………….14 2-3- Constituants cellulaires associés à la particule virale……………………15 2-4- Protéines de régulation…………………………………………………….15 2-5- Génome viral………………………………………………………………..23. 3- CYCLE VIRAL……………………………………………………………………...27 3-1- Vue générale du cycle viral………………………………………………27 3-2- Fixation et Internalisation………………………………………………..27 3-2-1- Récepteurs viraux……………………………………………….....27 3-2-2- Entrée du virus………………………………………………….....32 3-3- Transcription inverse du génome viral et intégration dans le génome de la cellule hôte…………………………………………………………….....32 3-3-1- Transcription inverse……………………………………………...32 3-3-2- Intégration de l’ADN proviral…………………………………....35 3-4- Expression du provirus et bourgeonnement de nouveaux virions…….38 3-4-1- Transcription………………………………………………………41 3-4-2- Traduction………………………………………………………....44 3-4-3- Assemblage et bourgeonnement………………………………….47 3-5- Clivage protéique et maturation du virion……………………………...49 4- TROPISME ET PERSISTANCE VIRALE……………………………………….....50 4-1- Les cellules cibles du VIH………………………………………………....50 4-2- Latence et persistance……………………………………………………..53.

(10) II- IMMUNOPATHOLOGIE DE L’INFECTION VIH-1 1- INFECTION VIH-1…………………………………………………………………...56 1-1- La primo-infection………………………………………………………….56 1-2- La phase asymptomatique………………………………………………….56 1-3- La phase SIDA……………………………………………………………....59 2- LES MOLECULES ANTIRETROVIRALES………………………………………...59 2-1- Inhibiteurs de fusion………………………………………………………...61 2-2- Inhibiteurs de la transcriptase inverse………………………………….....61 2-3- Inhibiteurs de l’intégrase…………………………………………………...62 2-4- Inhibiteurs de protéase……………………………………………………...62 2-6- Les vaccins anti-VIH………………………………………………………...63. III- DEREGULATION DU RESEAU DE CYTOKINES PENDANT L’INFECTION VIH-1 1- LES CYTOKINES PRO-INFLAMMATOIRES…………………………………....65 1-1- L’interleukine-1…………………………………………………………...65 1-2- L’interleukine-6…………………………………………………………...66 1-3- Tumor necrosis factor (TNF-α)…………………………………………..67 1-3-1- Caractérisation génétique et moléculaire du TNF-α..................67 1-3-2- Récepteurs du TNF-α…………………………………………....68 1-3-3- Signalisation du TNF-α…………………………………………..70 1-3-4- Rôle biologique du TNF-α……………………………………….70 1-3-5- TNF-α et VIH……………………………………………………..71 2- LES CYTOKINES ANTI-INFLAMMATOIRES…………………………………....73 2-1- L'interleukine-2……………………………………………………………..73 2-2- L'interleukine-12…………………………………………………………....74 2-3- Les interférents……………………………………………………………...74 2-4- L'interleukine-4……………………………………………………………..75 2-5- L'interleukine-10…………………………………………………………....76 2-5-1- Les récepteurs IL-10……………………………………………...76 2-5-2- Les effets de l’IL-10 sur l’immunité innée et adaptatives……....78 2-5-3- IL-10 chez les patients VIH+…………………………………......79 2-5-4- l’IL-10 viral……………………………………………………......81.

(11) IV- LA PROTEINE TAT DU VIH-1 1- LA PROTEINE TAT ENDOGÈNE…………………………………………………..83 1-1- Phosphorylation de Tat…………………………………………………….83 1-2- Acétylation de Tat…………………………………………………………..84 1-3- Désacétylation de Tat…………………………………………………….....85 1-4- Ubiquitinylation de Tat……………………………………………………..85 1-5- Méthylation de Tat……………………………………………………….....85 2- LA PROTEINE TAT EXOGÈNE…………………………………………………....87 2-1 Interaction avec des récepteurs cellulaires………………………………...87 2-2- Internalisation de la Tat exogène…………………………………………..88 2-2-1- Par endocytose……………………………………………….......88 2-2-2- Rôle du domaine de transduction de Tat dans l’internalisation.90 2-3- Effet sur le système immunitaire…………………………………………...92 2-4- Effet sur le système nerveux central…………………………………….....92 2-5- Tat et le sarcome de Kaposi………………………………………………...93 3- TAT CANDIDAT VACCIN ET CIBLE THERAPEUTIQUE……………………...95 3-1- Anticorps anti-Tat et molécules antagonistes…………………………….....95 3-2- Les ARN interférents………………………………………………………....96. V- VOIES DE SIGNALISATION ET PRODUCTION DE CYTOKINES 1- LES TOLL-LIKE-RÉCEPTORS: TLR…………………………………………........98 1-1- Généralités……………………………………………………………………98 1-2- Les TLR endosomaux……………………………………………………….100 1-3- Les TLR de la membrane plasmique……………………………………....103 1-4- TLR et voies de signalisation……………………………………………….106 1-4-1- Signalisation dépendante du MyD88………………………….106 1-4-2- Signalisation MyD88-indépendante…………………………...108 1-4-3- Signalisation via d’autres protéines adaptatrices…………….109 1-5- TLR et remodelage de la chromatine……………………………………....110 2- LA VOIE CALCIQUE………………………………………………………………...111 2-1- Le calcium, libre, lié ou piégé……………………………………………….111 2-2- Maintien de l’homéostasie calcique………………………………………...113 2-2-1- Réduction du calcium intracellulaire…………………………113.

(12) 2-2-2- Augmentation du calcium intracellulaire…………………….113 2-3- Influx calcique et expression de gènes……………………………………...118. 3- LA VOIE DES PROTÉINES KINASES C (PKC)…...……………………………...120 3-1- Distribution des PKC dans l’organisme…………………………………....120 3-2- Structure des PKC……………………………...…………………………...121 3-3- Activation des PKC et leur régulation.…………………………………….123 3-4- Protéines d'ancrage et localisation subcellulaire des PKC.……………....125 3-5- Substrats et fonctions des PKC.…………………………………………….127 3-6- PKC et agents infectieux………………………………………………….....128. 4- LA VOIE DES MAP KINASES……………………………………………………...130 4-1- La famille des MAPK.…………………………………………………….....130 4-2- MAPK et agents infectieux.………………………………………………....133. 5- LA VOIE NF-κB……………………………………………………………………...136 5-1- Les protéines NF-κB………………………………………………………...136 5-2- Les protéines IκB Kinases : IKK…………………………………………..138 5-2-1- Les protéines kinases IKKα et IKKβ………………………...138 5-2-2- La protéine IKKγ……………………………………………....141 5-3- La protéine NIK……………………………………………………………..143 5-4- Les protéines IκB.…………………………………………………………...143 5-5- Les voies de signalisations NF-κB………………………………………….148 5-6- Régulation de l’activité transcriptionnelle des protéines NF-κB………...150 5-6-1- Activation optimale de NF-κB par phosphorylation de p65...150 5-6-2- Rôle de la phosphorylation dans l’activité de RelB et c-Rel...152 5-6-3- Les sous-unités p50 et p52 sont des phosphoprotéines……....154 5-6-4- Régulation par modification des histones…………………….154. PROBLEMATIQUE……………………………………………………………………..160 RÉSULTATS……………………………………………………………………………...161 DISCUSSION ……………………………………………………………………………172 BIBLOGRAPHIE………………………………………………………………………...183.

(13) INTRODUCTION . 1.

(14) Figure 1: Histoire du VIH. 1959 1er cas connu d ’infection à HIV-1 à Kinshasa, RD Congo. 1981 Premiers cas de SIDA identifiés. 1983 identification du VIH-1 1986 identification du VIH-2. 2003 infection à HIV-1 > 40 % de la population générale dans certains pays. 2.

(15) I- LE VIRUS DE L'IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) 1- HISTOIRE DU VIH En 1980, le premier rétrovirus humain a été isolé chez des patients souffrant d’ATL « Adult T-cell Leukemia», et a été nommé « Human T-Lymphotropic virus type-1 » (HTLVI). Plus tard, un autre virus (HTLV-II) isolé chez des patients ateints de « T-hairy cell leukemia » a été identifié. En 1981, les premières descriptions du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise « SIDA » sont apparues dans la littérature médicale (Fig.1). Ces premiers rapports décrivent l’existence d’infections opportunistes causées par des micro-organismes tels que Pneumocystis carinii, qui normalement ne causent pas de maladies chez les personnes dont le système immunitaire est fonctionnel, d’où le terme « Acquise ». En 1983, une équipe de l’Institut Pasteur à Paris, a isolé un virus chez des patients souffrant du syndrome lymphadénopatique, et l’ont nommé « Lymphadenopathy-associated-virus » (LAV) (BarreSinoussi et al., 1983). Ce nouveau virus infecterait et tuerait de manière sélective les lymphocytes T CD4+. En 1984, une équipe de l’Institut National de la Santé du Maryland (USA), rapporte qu’un rétrovirus nommé HTLV-III, qui s’est révélé plus tard être le même que le LAV isolé à l’Institut Pasteur, cause le SIDA (Popovic et al., 1984). En mai 1986, le comité international de la nomenclature des virus et de la taxonomie attribue à ce même virus son nom actuel « Virus de l’Immunodéficience Humaine » (VIH). Enfin, un second type du VIH, le VIH-2 a été isolé en 1986 à l’Institut Pasteur chez des patients d’Afrique de l’Ouest (Clavel et al., 1986). Le VIH est désormais connu comme l’agent étiologique du SIDA. Depuis, il s’est répandu sur tout le globe, infectant des millions de personnes en un temps relativement court. Plus de 25 ans et 25 millions de décès ont été estimés après le premier diagnostic du VIH en 1981 (UNAIDS/WHO, AIDS epidemic update, Décembre 2007). En 2007, près de 33 millions de personnes vivent avec le VIH, et entre 3,4 et 6,2 millions de personnes ont été nouvellement infectées par le VIH, le chiffre annuel le plus élevé depuis le début de l’épidémie. Sur les 16 000 nouvelles infections quotidiennes en 2004, 95% surviennent dans les pays en développement. Cette même année, près de 3 millions de personnes sont mortes du SIDA (ONUSIDA, chiffres publiés en 2006 par United Nations Programme on HIV/AIDS, Repport on the global AIDS epidemic 8). Selon le rapport de l’ONU sida, malgré l’augmentation du financement, de l’engagement politique et les progrès accomplis pour. 3.

(16) Figure 2: Origine simienne du VIH. A) Le VIH-1 est originaire d’un seul sous type de chimpanzés, Pan troglodytes. B) Le VIH-2 est originaire du sooty mangabey, Cercocebus atys . C) Le phénograme radial démontre l’étroite relation entre VIH et SIV. Les distances indiquent le degré relatif d’évolution.. Stebbing, J. et al., 2004; New england journal of medecine. 4.

(17) élargir l’accès aux traitements du VIH, l’épidémie continue d’avancer plus vite que la riposte mondiale. Aucune région dans le monde n’a été épargnée. L’épidémie reste très dynamique, en particulier dans les pays en développement, et le virus continu à muter sans arrêt.. 1-1- L’origine simienne du VIH Plusieurs. données. confirment. que. le. VIH-1. a. pour. origine. le. virus. d’immunodéficience simien (SIVcpz) qui infecte le chimpanzé (Pan troglodytes) (Gao et al., 1999; Santiago et al., 2002). Quant au VIH-2, dont le génome possède 40 à 60 % d’homologie avec le VIH-1, il a pour origine le SIVsm du stooty mangabey (Cercocebus atys), singe de la côte ouest africaine, du Sénégal à la côte d’Ivoire, régions qui constituent l’épicentre endémique du VIH-2 (Hahn et al., 2000; Weiss and Wrangham, 1999) (Fig. 2). Sur la base des études moléculaires et de la distribution des séquences génomiques, le VIH serait passé du chimpanzé à l’Homme entre 1915 et 1941 (Korber et al., 2000; Lemey et al., 2003). Notons que cette estimation ne coïncide pas avec l’hypothèse d’une transmission à partir des vaccins anti-poliovirus, administrés par le Dr Koprowski à un million d’africains au Congo belge à la fin des années 50, et qui seraient contaminés par SIVcpz (Blancou et al., 2001). Curieusement chez son hôte naturel, le SIV ne provoque ni le SIDA, ni une déplétion des cellules T CD4+ même en présence d’une forte charge virale (Hahn et al., 2000; Silvestri et al., 2003). En revanche, la transmission du SIV à une autre espèce telle que le macaque rhésus (Macaca mulatta) ou l’Homme, engendre une perte progressive des cellules T CD4+ et une forte prédisposition aux infections opportunistes.. 1-2- Modes de transmission du VIH Le VIH-1 est transmissible d’une personne infectée à une autre par exposition directe à des liquides organiques contaminés. On retrouve le virus dans le sang, le sperme, les sécrétions vaginales et aussi dans le lait maternel. De façon globale, 70 à 80% des cas de contamination sont imputables à une transmission sexuelle (Quinn, 1989). Lors de chaque contact, le risque de transmission est de l’ordre de 0,1 à 1% (Cohen, 2004; Galvin and Cohen, 2004). La transmission sanguine peut avoir lieu par l’échange d’aiguilles contaminées chez les toxicomanes, ou bien de façon accidentelle chez les personnels de santé et les chercheurs ou encore au cours d’une transfusion sanguine ou suite à une transplantation. Enfin, la. 5.

(18) Figure 3: Exemples de rétrovirus. Micrographie électronique des particules virales représentatives des rétrovirus. Le diamètre de toutes les particules est d’environ 100 nm. A- Particule type A dans le reticulum endoplasmique B- Betarétrovirus: MMTV, morphologie type B (haut: intracytoplasmique, milieu: bourgeonnant, bas: mature extracellulaire) C- Gammarétrovirus: MuLV, morphologie type C (haut: bourgeonnant, bas: mature extracellulaire) D- Alpharétrovirus: ALV, morphologie type C (haut: bourgeonnant, bas: mature extracellulaire) E- Betarétrovirus: Mason-Pfizer monkey virus, morphologie type D (haut: intracytoplasmique, milieu: bourgeonnant, bas: mature extracellulaire) F- Deltarétrovirus: BLV (haut: bourgeonnant, bas: mature extracellulaire) G- Lentivirus: Bovine immunodeficiency virus (haut: bourgeonnant, bas: mature extracellulaire) H- Spumavirus: Bovine syncytial virus (haut: intracytoplasmique, milieu: bourgeonnant, bas: mature ). Field’s Virology, 2007. 6.

(19) transmission verticale (mère-enfant) peut avoir lieu à trois stades : in utero, pendant l’accouchement et lors de l’allaitement maternel. Actuellement, cette transmission mèreenfant est fortement contrôlée grâce aux traitements antirétroviraux administrés aux femmes enceintes soit au début ou au dernier trimestre de la grossesse (Blanco et al., 2004). Ce traitement semblerait diminuer le taux de transmission verticale à 10% comparé à 25% de transmission en absence de traitement (Royce et al., 1997).. 1-3- Classification et Nomenclature Le VIH appartient à la famille des Retroviridae, famille de virus à ARN de polarité positive, dont le génome est diploïde, et possédant une transcriptase inverse. Les Retroviridae tiennent leur nom d’une caractéristique propre à leur cycle viral : la transcription inverse de leur molécule d’ARN génomique en ADN double brin. La famille des Retroviridae est actuellement subdivisée en 7 genres selon divers critères tels que la pathogénicité, la morphologie, la structure du génome, les propriétés antigéniques (d’après l’ICTV, the International Comitee on taxonomy of viruses, www.virustaxonomyonline.com) (Fig. 3). On distingue : Des rétrovirus simples qui codent uniquement pour des protéines de structure Gag « Groupe antigène », Pro « Protéase », Pol « Polymérase » et Env « Enveloppe » : - les Alpharétrovius (virus type: Avian Leukosis Virus, ALV) - les Betarétrovirus (virus type : Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) - les Gammarétrovirus (virus type : Murine Leukemia Virus, MLV) Des rétrovirus complexes qui, en plus des protéines Gag, Pro, Pol et Env, codent pour des petites protéines régulatrices possédant un grand nombre de fonctions : - les Deltarétrovirus (virus type : Bovine Leukemia Virus, BLV), contiennent les gènes régulateurs comme tax ou rex exprimés à partir d’un épissage alternatif de l’ARNm. - les Epsilonrétrovirus (virus type : Walleye Dermal Sarcoma Virus, WDSV), contiennent un à trois gènes ORF A, B et C. Le gène ORFa est un homologue viral du gène de la cycline D de l’hôte et permet ainsi la régulation du cycle cellulaire. Ces cinq genres sont impliqués dans des leucémies et des cancers. - les Spumavirus (virus type : Human Foamy Virus, HFV). Le génome viral code pour au moins deux gènes accessoires (tas/bel-1, et bet) (Flugel et al., 1987; Mergia et al., 1991). Le gène tas code pour un transactivateur transcriptionnel.. 7.

(20) - les Lentivirus (Latin : Lenti=lent), sont des virus responsables d'infections virales à développement lent, non oncogènes. Ils incluent des virus responsables d’arthrites (chèvre) et d’anémies infectieuses équines (cheval). Le VIH en fait également partie et code pour plusieurs gènes régulateurs (vif, vpr, vpu, tat, rev et nef) qui contrôlent la transcription, l’assemblage des virions, l’expression des gènes de l’hôte et d’autres fonctions de la réplication. Les virus VIH sont classés en deux types : le VIH-1, type majoritaire et le VIH-2, type endémique localisé en Afrique de l'Ouest. Le VIH-1 est divisé en trois groupes : ° Le groupe M « majeur » ou groupe majoritaire qui lui même a été sous-divisé durant son expansion mondiale jusqu’à au moins 10 sous-types de (A à D, A/E, A/G, F, H, J et K) (Korber et al., 1995; Robertson et al., 2000). L’analyse de la distribution actuelle du VIH-1 dans le monde montre que les sous-types A/E et C sont prévalents et sont responsables de la grande majorité des infections VIH globales (Burke, Dhopesh, and Lainfester, 1996; Montano et al., 1997). Le sous-type C prédomine dans l’Afrique subsaharienne ; le sous-type B, dans le nord de l’Amérique et l’Europe et le sous-type E, dans le sud-est de l’Asie. Le sous-type C semble être transmis plus efficacement que les autres (Essex et al., 1997). En effet, on estime actuellement que plus de la moitié des personnes infectées par le VIH dans le monde porte le virus de sous-type C (Esparza and Bhamarapravati, 2000), et présentent une forte charge virale plasmatique et un taux significativement faible de lymphocytes T CD4+ (Neilson et al., 1999). ° Le groupe O « Outlier » a été isolé chez des individus vivant au Cameroun, Gabon et Guinée équatoriale. Son génome présente 65% d’homologie avec le virus groupe M (Takehisa et al., 1999). ° Le groupe N « New ou Non M, Non O » identifié par Simon et al., en 1998 dans un prélèvement. datant. de. 1995. chez. une femme du Cameroun. Ce groupe est. phylogénétiquement lié au virus de l’immunodéficience simienne (SIV) qui infecte les chimpanzés (Roques et al., 2004). La relation entre le sous-type du virus, ses propriétés biologiques et sa pathogénicité reste à déterminer, en partie du fait que la réplication virale ait été étudiée presque exclusivement dans le sous-type B. Le VIH-2 présente 40 à 50% d’homologie avec le VIH-1 au niveau des gènes gag et pol. Le VIH-2 compte 5 sous-types de A à E (UNAIDS, 2000, AIDS epidemic update. Geneva : UNAIDS. www.unaids.org). En comparaison avec le VIH-1, le VIH-2 est moins. 8.

(21) facilement transmissible (moins infectieux) et possède une longue période d’incubation entre la primo-infection et la manifestation de la maladie. De plus, les patients infectés par le VIH-2 montrent une faible charge virale et une progression plus lente de la maladie (Cunningham et al., 1997).. 9.

(22) Figure 4: Structure du VIH A). B). A) Représentation schématique du virion VIH-1 mature (adaptée de Freed et al., 1998) B) Micrographie électronique des particules virales du VIH (Kuby, J., 2003; Immunology). 10.

(23) Figure 5: Structure des glycoprotéines d’enveloppe. A). Interne. B). externe. C). A) Structure primaire des glycoprotéines d’enveloppe gp120 et gp41: sites de clivage; C1-C5 régions constantes; V1-V5 régions variables; FD domaine de fusion; HR1, HR2 Heptad repeat; TM domaine transmembranaire. B) Diagramme de la gp120: dans cette orientation la membrane virale est en haut et la membrane cellulaire est en bas. Les domaines interne et externe sont connectés par un pont de 4 feuillets beta. C) Structure trimérique de gp41: N36 et C34 régions fonctionnelles formant une structure en α hélice stable. Les hélices N36 et C34 pointent dans des directions différentes (gauche). Vue du haut, N36 forme le core interne entouré des hélices C34.. Modifiée d’après Prabakaran, P. et al., 2007; Advances in pharmacology. 11.

(24) 2- STRUCTURE DU VIH. Le VIH-1 est un virus enveloppé, de 80 à 120 nm de diamètre, dont l’enveloppe renferme une matrice, une capside et 2 molécules d’ARN de polarité positive (Fig. 4).. 2-1- Les protéines de structure - Les protéines de l’enveloppe virale (Fig. 5) sont synthétisées sous forme d’un précurseur de 160 kDa (gp160), qui est ensuite maturé par une endoprotéase cellulaire de la famille des « subtilisine-like » endoprotéases, de type furine, pour donner les glycoprotéines gp120 et gp 41. Ces molécules s’associent par des liaisons non covalentes et forment un complexe trimérique à la surface de la particule virale et des cellules infectées (Chan et al., 1997; Weissenhorn et al., 1997). Le précurseur gp160 fait environ 840-860 aa selon les isolats dont au moins 480 résidus appartiennent à la gp120 fortement glycosylée. L’analyse de la séquence de la glycoprotéine de surface gp120 montre l’existence de 5 régions relativement conservées (C1-C5) et 5 régions significativement variables de 60 à 80% (V1-V5) (Prabakaran et al., 2007). La glycoprotéine transmembranaire gp41 est plus conservée et comporte un domaine de fusion (FD) constitué d’une région hydrophobe d’environ 20 aa du côté N-terminal, deux domaines en hélice « Heptad Repeats » HR1 et HR2, un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique (Prabakaran et al., 2007). La gp120 en se liant aux cellules hôtes via les récepteurs membranaires CD4 et CXCR4 ou CCR5 joue un rôle indispensable dans la pénétration du virus. Ces interactions conduisent à des changements de structure de la gp41, lui permettant de s’ancrer, grâce à son domaine de fusion, dans la membrane de la cellule cible. Cette étape est suivie par l’interaction entre les domaines HR1 et HR2, dans leur forme trimérique, permettant ainsi le rapprochement puis la fusion des membranes virale et cellulaire. - Les protéines de la matrice MA (17 kDa), produits de maturation du précurseur Gag, tapissent l’intérieur de l’enveloppe virale en interagissant avec la membrane lipidique interne grâce à leur groupement myristate. Une région MA (54-68 aa) de Gag correspondant à l’hélice α4 (Hill et al., 1996; Massiah et al., 1994) a été impliquée dans l’assemblage de la particule virale en permettant la formation de trimères MA (Cannon et al., 1997).. 12.

(25) Figure 6: La transcriptase inverse (RT). Diagramme de la protéine hétérodimérique la transcriptase inverse du VIH-1, montrant les deux sous unités p66 et p51 qui portent les activités: ‘ADN polymérase’ et ‘Rnase H’ Field’s Virology, 2007. 13.

(26) - Les protéines de la capside CA (24 kDa) sont les produits de maturation de Gag les plus conservés et se caractérisent par la présence d’une région majeure d’homologie MHR « Major Homology Region ». Sous forme dimérique, les CA du VIH-1 forment la capside du virus mature qui lui confère une structure conique (Fields Virology, fifth edition, 2007). - Les protéines de la nucléocapside NC (7 kDa) sont de petites protéines avec des domaines en doigt de zinc type CCHH (Cys-His-Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys) (Covey, 1986), flanquées par des séquences basiques impliquées dans la liaison avec les acides nucléiques (Cimarelli and Luban, 2000; Morellet et al., 1992). Les structures en doigt de zinc contribuent à l’encapsidation de l’ARN viral et ainsi à son infectivité (Gorelick et al., 1990; Summers et al., 1992).. 2-2- Les protéines enzymatiques - La transcriptase inverse RT catalyse la synthèse d’ADN à partir du génome d’ARN viral (Baltimore, 1970). Il s’agit d’un hétérodimère constitué de deux sous-unités p66 et p51 (Fig. 6) douées de deux activités principales : une activité ADN polymérase capable d’incorporer les déoxyribonucléotides aussi bien sur l’ADN que l’ARN, et une activité RNase H ARN/ADN dépendante (Tanese and Goff, 1988). L’activité ADN polymérase de la RT est généralement lente (1 à 100 nucléotides/seconde) et présente une faible fidélité (10-4 erreurs/base incorporée). Contrairement à l’ADN polymérase de l’hôte, elle est incapable de corriger les bases erronées. Par conséquent, au moins une mutation/génome et par cycle de reverse transcription est introduite (Battula and Loeb, 1976) (Fields Virology, fifth edition, 2007). Notons que cette incapacité d’édition de la RT est à la base de la forte variabilité observée chez le VIH-1. La RNase H est une exonucléase capable de dégrader uniquement l’ARN sous forme hybride (ARN : ADN) dans les deux sens 5’Æ3’ et 3’Æ5’. Cette action engendre des oligonucléotides, 3’OH et 5’-P de 6 à 10 résidus de long, qui servirons d’amorces pour l’initiation de la synthèse d’ADN grâce à l’activité ADN polymérase de la RT (Gopalakrishnan, Peliska, and Benkovic, 1992). - L’intégrase IN est une protéine de 32 kDa codée par le gène Pol (Panganiban and Temin, 1984), qui catalyse l’insertion du génome viral ADN dans le génome de la cellule cible. La structure du site actif de l’intégrase, qui appartient à la famille des polynucléotidyl-. 14.

(27) reductases, a été récemment résolue. La séquence primaire de la protéine présente du côté Nterminal un motif très conservé de type His-His-Cys-Cys (HHCC). Comparées. aux. caractéristiques canoniques des motifs en doigt de zinc, celles de l’intégrase diffèrent sur trois points : l’orientation est HHCC au lieu de CCHH, la boucle liant le résidu H au résidu C apparaît particulièrement longue (23 aa) et enfin, le motif est unique. Bien qu’indispensable à l’activité enzymatique, ce motif ne semble pas être impliqué dans la fixation de la protéine sur l’ADN. - La protéase PR produit du gène Pol, est une petite enzyme (100 aa) de la famille des aspartyl-protéases. Le premier clivage catalysé par PR se produit durant ou immédiatement après la libération du virion. Ce clivage est vraisemblablement intramoléculaire (Pettit et al., 2004) et permet la libération de PR de son précurseur Gag-Pol. La protéine active est sous forme d’homodimère. Elle clive spécifiquement les liaisons Phe-Pro et Tyr-Pro, qui ne sont pas hydrolysées par les protéases des mammifères. Ce clivage induit la maturation des précurseurs Gag et Gag-Pro-Pol (Katoh, Ikawa, and Yoshinaka, 1989; Loeb et al., 1989) qui participe au changement de la morphologie des virions et conduit à leur maturation.. 2-3- Constituants cellulaires associés à la particule virale En plus des protéines codées par le génome viral, on trouve entre autres, un ARN de transfert (ARNtlysine) qui intervient comme amorce dans l’étape d’initiation de la réverse transcription et la cyclophiline A qui participe au repliement de la protéine Gag lors de l’assemblage des particules infectieuses. Lors du bourgeonnement viral, des protéines de la membrane cellulaire sont insérées dans l’enveloppe virale tels que des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) (Franke, Yuan, and Luban, 1994).. 2-4- Les protéines de régulation et accessoires - Tat (Activateur de transcription) est indispensable à la réplication virale. Elle permet une élongation efficace de la transcription du génome viral. La protéine Tat (14 kDa) est exprimée précocément dans la cellule, elle peut être aussi associée à la particule virale. Tat est codée par 2 exons. L’exon 1 code pour la région (1-72 aa) et l’exon 2 code pour la région Cterminale (Bayer et al., 1995; Rubartelli et al., 1998). La protéine Tat est composée de plusieurs domaines (Fig. 7) :. 15.

(28) Figure 7: Structure de la protéine Tat. Séquence des acides aminés de Tat (Genbank :AAL12703). 16.

(29) - Domaine I (1-20 aa) en N-terminal. Une mutation dans cette région n’affecte pas trop l’activité de transactivation. - Domaine II (20-40 aa) contenant 7 cystéines hautement conservées important pour l’activité de Tat. - Domaine III (40-48 aa) ‘core’. Une seule mutation au niveau de la lysine 41 abolit l’activité de Tat. - Domaine IV (49-57 aa) basique contenant une séquence de localisation nucléaire et impliqué dans l'interaction et la pénétration de Tat extracellulaire dans les différents types cellulaires infectés ou non (Mann and Frankel, 1991). - Domaine V (57-76 aa) riche en acides glutamiques permettant la liaison à l’ARN. - Domaine VI (78-80 aa), un tripeptide arginine-glycine-acide aspartique RGD impliqué dans l'interaction avec les intégrines αvβ3 et α1β5 (Zocchi, Poggi, and Rubartelli, 1997). Des variations significatives ont été observées au niveau des acides aminés de la protéine Tat entre différentes classes ou sous-types viraux. Cependant, seule, la protéine Tat est peu structurée; elle ne possède pas d’hélice α ni de feuillet β. En revanche, elle semble se structurer lorsqu’elle interagit avec ses partenaires (Long and Crothers, 1999; Seewald et al., 1998). Contrairement à d’autres transactivateurs, Tat a pour cible la région TAR de l’ARN localisée dans la région R du LTR « Long Terminal repeat » (Voir génome viral). L’interaction avec la région TAR du génome viral s’accompagne de la formation d’une hélice α courte dans la région 59-72 de Tat (Loret et al., 1992). Tat recrute alors des kinases cellulaires qui phosphorylent l’ARN polymérase II, permettant ainsi l’élongation de la transcription (Bannwarth and Gatignol, 2005). - Rev (Protéine Régulatrice des gènes Viraux), est une phosphoprotéine de 19 kDa et 116 aa localisée majoritairement dans le nucléole. Cette protéine précoce est codée par deux exons. Sa structure primaire contient deux régions fonctionnelles : un domaine riche en arginines qui intervient dans la fixation à l’ARNm et la localisation nucléaire. Ce domaine est flanqué par des séquences qui permettent la multimérisation de Rev et un segment hydrophobe entre les résidus 73-84, responsable de. l’export nucléaire en mobilisant la. machinerie d’export cellulaire (Bartel et al., 1991; Malim et al., 1991). En se liant à l’élément de réponse Rev (RRE) situé au niveau des ARN viraux mono-épissés ou non-épissés, Rev permet leur transport du noyau vers le cytoplasme où a lieu leur traduction.. 17.

(30) Figure 8: Rôle de la protéine Vif. Vif induit la dégradation de APOBEC3G par le protéasome: Vif fonctionne comme un adaptateur pour connecter APOBEC3G au complexe Ubiquitine ligase E3. APOBEC3G est ubiquitynilée puis dégradée via le protéasome.. Strebel K., et al., 2007; Advances in pharmacology. 18.

(31) - Nef (facteur Négatif) est une protéine myristylée de 25 à 27 kDa associée aux virions et essentielle pour leur infectivité. Le gène codant pour Nef est localisé à l’extrémité 3’ du génome viral et recouvre partiellement le début du LTR U3. Il existe quelques zones très conservées dans la séquence de Nef : une séquence signal de myristylation à la partie Nterminale et une séquence répétée de prolines (PXXP) flanquée de résidus acides. Comme Tat, Nef est exprimée immédiatement après l’infection, et certains ARNm sont détectés avant même l’intégration du provirus (Wu and Marsh, 2001). Initialement, Nef était considérée comme un élément de régulation négatif (d’où son nom) de l’expression des gènes viraux. Cependant, il est bien établi actuellement que Nef a, au contraire, une action facilitatrice de la réplication virale en particulier dans les lymphocytes primaires infectés en phase G0 puis stimulés après infection (Chowers et al., 1994). La myristylation de Nef permet par ailleurs son interaction avec les récepteurs CD4 et par conséquent leur internalisation et dégradation. En diminuant le nombre de CD4 et de CMH-I de la cellule hôte, Nef d’une part, inhibe la surinfection des cellules et facilite la dissémination de particules virales et d’autre part, protège les cellules infectées de la destruction par les lymphocytes CD8 cytotoxiques spécifiques du virus (Piguet et al., 1999). En plus de sa présence dans la particule virale, la protéine Nef se trouve majoritairement associée à l’appareil de Golgi et à la membrane plasmique au niveau des cellules infectées (Kestler et al., 1991). Nef est impliquée également dans l’activation des cellules T (Geyer, Fackler, and Peterlin, 2001) et l’inhibition de l’apoptose des cellules infectées par le VIH en inhibant ASK1 « Apoptosis Signal Regulating Kinase 1 », une sérine thréonine kinase de la voie Fas (Geleziunas et al., 2001). - Vif (Facteur d’Infectivité Virale) est une protéine de 23 kDa, ayant une localisation essentiellement cellulaire (Fig. 8). Des anticorps anti-Vif sont détectés chez les patients infectés par le VIH durant tous les stades de l’infection. Les virions n’exprimant pas cette protéine présentent un caractère infectieux environ mille fois plus faible que les virions sauvages (Park, Myrick, and Sodroski, 1994). Vif ne semble pas agir sur la transcription ou la traduction des protéines virales mais plutôt sur la maturation ou l’assemblage des protéines de structure. Elle stabiliserait le complexe de préintégration (Ohagen and Gabuzda, 2000). Elle serait aussi impliquée dans l’étape d’encapsidation et favoriserait la réplication virale dans les lymphocytes et macrophages (Bardy et al., 2001; Hassaine et al., 2001). Vif permettrait d’effectuer une étape tardive du cycle viral en inhibant un processus antiviral naturel des lymphocytes T induit par l’enzyme APOBEC3G (apoliprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide like 3G) (Sheehy et al., 2002). APOBEC3G est un facteur antiviral. 19.

(32) Figure 9: Rôle de la protéine Vpr A). B). A) Régulation putative du cycle cellulaire par Vpr: arrêt du cycle en phase G2/M. x indique que Vpr peut se lier à d’autres protéines avant que le complexe résultant ne se lie et régule l’holloenzyme PP2A. B) Transport nucléaire du complexe PIC du VIH par Vpr: Vpr se lie à l’importine a et active son interaction avec les protéines PIC contenant le NLS, stimulant ainsi l’import nucléaire via la voie classique importine α/β dépendante. D’autres molécules du complexe peuvent interagir directement avec la nucléoporine et causent la destructuration dynamique de l’enveloppe nucléaire qui sert de site d’entrée du PIC. Vpr reste liée à la membrane nucléaire par les nucléoporines.. Zhao, R. et al., 2007; Advances in pharmacology. 20.

(33) membre de la famille des « DNA cytosine deaminases », impliqué dans l’édition d’ARNm et la diversification des gènes d’immunoglobulines (Petito and Cash, 1992). En absence de Vif, APOBEC3G est incorporé dans les virions du VIH dans les cellules productrices. APOBEC3G associée au virion convertit les cytosines en uraciles durant la synthèse du brin d’ADN (Harris et al., 2003; Lecossier et al., 2003; Mangeat et al., 2003). La déamination des cytosines durant la transcription inverse induit une hyper-mutation GÆA du génome viral et par conséquent à la dégradation de l’ADN viral nouvellement synthétisé par l’uracil ADN glycosidase cellulaire. En présence de Vif, APOBEC3G est dégradée via la voie ubiquitineprotéasome (Conticello, Harris, and Neuberger, 2003; Mehle et al., 2004; Sheehy, Gaddis, and Malim, 2003; Yu et al., 2003). - Vpr (Protéine Virale R) est une protéine de 14 kDa (96 aa) qui confère un avantage de réplication significatif pour le virus (Fig. 9). Différentes fonctions ont été attribuées à Vpr incluant : a) La stimulation de l’expression génique à partir du LTR (Cohen et al., 1990). Cette activation est médiée par des interactions entre Vpr, Sp1 (Sawaya et al., 1998; Wang et al., 1995), TFIIB (Kino et al., 1999) et TFIID (Kino et al., 1999). Vpr permet aussi l’expression des gènes à partir des promoteurs cellulaires en activant les récepteurs aux glucocorticoïdes (Kino et al., 1999). La liaison Vpr/CBP « p300/CREB binding protein » pourrait jouer un rôle dans l’activation du LTR et des promoteurs cellulaires (Kino et al., 2002). b) La facilitation du transport nucléaire du complexe de préintégration (PIC) via l’interaction directe de Vpr avec les importines (Popov et al., 1998) et les nucléoporines (Fouchier et al., 1998) c) L’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 favorable à la réplication virale et l’activation du LTR. Cet effet serait médié par l’interaction de Vpr avec de nombreux facteurs de régulation du cycle cellulaire (Wang et al., 1995) et d’endommagement d’ADN (Roshal et al., 2003). La déstructuration de l’architecture de l’enveloppe nucléaire et la perte de compartimentation des protéines de régulation, induites par Vpr, seraient aussi à l’origine de l’arrêt du cycle en phase G2. d) L’induction de l’apoptose via deux voies, dépendantes et indépendantes des caspases (Muthumani et al., 2005b). Bien que ce mécanisme reste à élucider, il semblerait que l’induction de la perméabilité mitochondriale y joue un rôle important (Deniaud, Brenner, and Kroemer, 2004; Yedavalli et al., 2005). Notons que Nef, Vpr et Vif seraient aussi présentes dans la particule virale (Kao et al., 2003; Kotov et al., 1999; Wilk et al., 2001; Wu and Marsh, 2001).. 21.

(34) Figure 10: Rôle de la protéine Vpu. Modèle représentant la dégradation du récepteur CD4 induite par Vpu. Vpu agit comme un adaptateur pour connecter le domaine cytoplasmique de CD4 au complexe SCFTrcp (SKp1 de l’ubiquitine ligase + bTrcp). CD4 est ubiquitynilé puisdégradéevia le protéasome.. Zhao, R. et al., 2007; Advances in pharmacology. 22.

(35) - Vpu (Protéine Virale U) est une phosphoprotéine multimérique de 16 kDa (81 aa), intégrée à la membrane grâce à une séquence d’ancrage transmembranaire N-terminale et un domaine cytoplasmique d’environ 50 aa. Vpu est présente uniquement dans le VIH-1. Dans le VIH-2 elle est remplacée par la protéine Vpx. Deux fonctions principales sont associées à Vpu (Fig. 10): a) au niveau du bourgeonnement des particules virales en augmentant la vitesse de libération des particules virales de la membrane cellulaire (Schubert et al., 1996). Cette propriété pourrait expliquer l’implication de Vpu dans la réduction de la formation de syncytia. L’absence de Vpu, bien qu’elle ne soit pas associée à la particule virale, se traduit par la production de virus d’architecture anormale et par le bourgeonnement de virions dans des vacuoles intracellulaires. b) au niveau de la dégradation du récepteur CD4. Dans le réticulum endopasmique, Vpu s’associe simultanément avec CD4 et β-TrCP « beta Transducin-repeat Containing Protein ». Cette interaction évite la formation du complexe gp160-CD4 qui séquestre le précurseur des protéines d’enveloppes gp160 dans le cytoplasme. Le complexe ternaire Vpu-CD4- β-TrCP ainsi formé, est ubiquitinylé puis dégradé via le protéasome suite à l’interaction de Skp1 avec le domaine F-box de β-TRCP (Margottin et al., 1998). Grâce à ce mécanisme, le précurseur gp160 se trouve libre et les protéines d’enveloppe peuvent ainsi continuer leur transport vers la surface cellulaire (Willey et al., 1992a; Willey et al., 1992b).. 2-5- Génome viral Constitué de deux copies linéaires d'ARN simple brin (9,3 kb) de polarité positive, associées à deux molécules de transcriptase inverse et à l’intégrase (Fig. 11). En partant de l’extrémité 5’ à 3’ le long de l’ARN on retrouve : une coiffe ou « Cap » (m7G5’ppp5’Gmp) à l’extrémité 5’-terminale ; une courte région R « repeat » qui se répète deux fois sur l’ARN, appelée aussi « short terminal repeat » ; une séquence U5 « Unique 5’ » ; une région pbs « primer binding site » de 18 nucléotides qui s’associe à l’extrémité 3’OH de l’ARNtlysine et sert d’amorce pour l’initiation de la synthèse du petit brin d’ADN; « Ψ element » un site majeur de reconnaissance pour l’empaquetage de l’ARN viral dans le virion ; les gènes gag, pol et env ; une séquence polypurine ppt « polypurine tract » qui est le site d’initiation de la synthèse du brin positif d’ADN ; une séquence U3 « Unique 3’ » ; une seconde copie de la région R et enfin une séquence poly A à l’extrémité 3’. Durant la transcription inverse,. 23.

(36) Figure 11: Structure du génome viral A). B). C). A) Organisation du génome rétroviral ARN simple brin (Field’s Virology, 2007) B) Organisation du génome viral ADN pendant les différentes étapes de transcription (Field’s Virology, 2007) C) Le génome viral ADN code pour des protéines de structure (Gag, Pol, Env), des protéines enzymatiques et des protéines de régulation et accessoires (Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu et Tat) (Kuby, J., 2003; Immunology). 24.

(37) comme on le verra plus loin, les séquences U3 et U5 se dupliquent, formant ainsi une région plus longue LTR « Long Terminal Repeat », constituée des séquences U3, R et U5, aux deux extrémités de l’ADN double brin résultant. A partir de ce LTR en 5’ aura lieu l’initiation de la transcription et les transcrits seront ensuite maturés et polyadénylés au niveau du LTR3’ pour créer la structure exacte de l’ARN de départ. Il est important de noter que le génome du VIH1 contient une deuxième séquence ppt centrale (CPPT) suivie plus loin d’une séquence de transcription stop (CTS). Cette séquence est responsable de la structure FLAP structure en triple hélice du complexe de pré-intégration (PIC) (Voir partie cycle viral).. 25.

(38) Figure 12: Cycle de réplication du VIH-1. CCR5 CXCR4. Rambaut, A., et al., 2004; Nature reviews. 26.

(39) 3- CYCLE VIRAL 3-1- Vue générale du cycle viral Comme tous les rétrovirus, le VIH a un cycle de réplication complexe comprenant les étapes suivantes (Fig.12) : - Fixation de la particule virale au récepteur cellulaire. - Internalisation après fusion des membranes virales et cellulaires. - Transcription inverse de l’ARN viral pour former un ADN double brin linéaire. - Transport du complexe de pré-intégration (PIC) vers le noyau. - Décapsidation et intégration de l’ADN linéaire dans le génome cellulaire pour former le provirus. - Transcription du provirus par l’ARN polymérase II pour former les différents ARN messager (ARNm) viraux y compris l’ARN génomique. - Epissage et export nucléaire des ARN. - Traduction des ARN pour former des précurseurs de protéines virales. - Assemblage de la particule virale et empaquetage du génome viral (ARN) - Structuration et libération du virion. - Maturation du virion pour générer une particule virale infectieuse.. 3-2- Fixation et internalisation. 3-2-1- Récepteurs viraux La nature des récepteurs du VIH-1 définit non seulement la population des cellules susceptibles d’être infectées par le virus, mais régule aussi la réplication du virus depuis l’étape d’entrée (Fig. 13). a- Le récepteur CD4 En 1986, Maddon et al. ont montré que l’expression de CD4 dans les cellules humaines les rend sensibles à l’infection par le VIH-1 (Maddon et al., 1986). Il s’agit d’une glycoprotéine monomérique, de la superfamille des immunoglobulines, exprimée par les thymocytes et les lymphocytes T CD4+ et à plus faible taux par les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques.. 27.

(40) Figure 13: Récepteurs du VIH. Modifiée d’après Bukrinsky, M., et a., 2001; Hiv life cycle and coreceptors. 28.

(41) cytoplasmique (Fig. 13). Le VIH utilise principalement les récepteurs CCR5 et CXCR4. La liaison ligand-récepteur est accompagnée par un réarrangement des sept domaines transmembranaires, suivi d’un changement conformationnel impliquant les ICLs. Cette forme activée du récepteur stimule l’activation de l’hétérotrimère de protéines G (sous-unités α, β et γ), induisant ainsi l’initiation d’une cascade de signalisation. Une fois initiés, ces signaux de transduction activent entre autre, le réarrangement des filaments d’actine et la polarisation cellulaire caractéristiques d’une réponse chimiotactique. Tout comme le CD4, ces récepteurs aux chimiokines semblent localisés dans les radeaux membranaires « lipid rafts » (Kozak, Heard, and Kabat, 2002; Raulin, 2002). Ces microdomaines enrichis en cholestérol et sphingolipides de la membrane plasmique reflètent la bicouche lipidique optimale du virus, fournissant ainsi l’environnement idéal pour la fusion des membranes (Liao, Graham, and Hildreth, 2003). c- Autres récepteurs cellulaires du VIH-1 Outre les lymphocytes T CD4+, la pathogenèse du VIH-1 implique divers types cellulaires, qui n’expriment pas ou très peu de CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 (Clapham and McKnight, 2002). Dans ce cas, le VIH-1 peut interagir directement via ses glycoprotéines de surface avec d’autres type de récepteurs cellulaires (tels que DC-SIGN) (Tableau). Pour élargir son tropisme, le virus peut aussi utiliser des molécules de l’hôte (tels que CMH-I, CMHII, ICAM-1..etc) acquises lors de son bourgeonnement, pour interagir avec leurs ligands naturels à la surface de différents types cellulaires (Tremblay, Fortin, and Cantin, 1998).. Récepteur. Expression. Rôle dans l’attachement et l’infection. Référence. Gal-C. Neurones et cellules gliales. - Infection inefficace, aide à l’attachement. (Harouse et al., 1991). DC-SIGN. Cellules Dendritiques. - Se lie à la gp120, présentation du VIH aux. (Pohlmann et al., 2001). DC-SIGNR. Cellules endothéliales. cellules CD4. (Larkin et al., 1989). Rcp d’endocytose. Macrophages. - Se lie à la gp120. à mannose. (Mondor, Ugolini, and. Héparanes. Plusieurs types cellulaires. - Attache le virus à la surface cellulaire via. Sattentau, 1998). une interaction avec la boucle V3 et augmente l’interaction avec CD4 et CXCR4. LFA-1/ICAM-1. LFA-1 : cellules. - ICAM-1 incorporé dans le virion permet. (Fortin et al., 1999;. hématopoïétiques, ICAM-1 :. l’attachement et l’infections des cellules LFA-. Paquette et al., 1998). différents types cellulaires. 1. +. .. 29.