LA VOIE NF κB

La voie NF-κB « Nuclear Factor-κB » joue un rôle clé dans le contrôle de l’immunité innée et adaptative. Elle régule la transcription des gènes cibles tels que les gènes des cytokines, chimiokines, protéines de réponse au stress et des protéines anti-apoptotiques. L'activation de NF-κB a été décrite après stimulation par le LPS et les cytokines proinflammatoires TNF-α et IL-1β. Cette voie met en jeu plusieurs acteurs qui ont chacun un rôle bien précis et essentiel dans sa régulation.

5-1- Les protéines NF-κB

Comme pour toutes les familles de facteurs de transcription, la famille NF-κB compte plusieurs membres chez les mammifères : Rel A (p65), NF-κB1 (p50 ; p105), NF-κB2 (p52 ; p100), c-Rel et Rel B. Ces protéines possèdent toutes une région amino-terminale de 300 aa hautement conservée, dite RHD « N-terminal Rel homology domain » qui permet la liaison à l’ADN, la dimérisation ainsi que l’association à la protéine inhibitrice IκB (Baeuerle and Baltimore, 1996; Ghosh, May, and Kopp, 1998) (Fig. 46). Tous les membres de la famille NF-κB, excepté Rel B peuvent former des homo- ou des hétérodimères. Les protéines c-Rel, Rel B et Rel A possèdent un domaine de transactivation C-terminal, qui permet une forte activation de la transcription des gènes suite à leur fixation sur leur site NF-κB au niveau du promoteur. Les autres protéines Rel, tels que les homodimers p50 et p52, sont dépourvues de ce domaine de transactivation, et leur liaison à la séquence consensus au niveau du promoteur a plutôt un effet répresseur (May and Ghosh, 1997). Les protéines p52 et p50 sont générées suite à une maturation protéolytique de leurs précurseurs respectifs p105 et p100 (Silverman and Maniatis, 2001).

Alors que p50 et p65 sont exprimées dans plusieurs types cellulaires, l’expression de Rel B est restreinte à des régions spécifiques du thymus, des nodules lymphatiques et des plaques de Payer. L’expression de c-Rel est, quant à elle, confinée dans les cellules hématopoïétiques et les lymphocytes.

Les modèles de souris « knock out » pour certains membres de la famille NF-κB indiquent des rôles distincts de ces protéines dans la régulation de l’immunité innée et adaptative, la fonction des lymphocytes et la survie cellulaire. La délétion de la sous-unité p65 est une mutation embryonnaire létale conduisant à une dégénérescence du foie. Par contre, les

Figure 47: Les protéines IKK

Hans Häcker, H. et al., 2006

souris knockout pour les autres protéines sont immunodéficientes mais ont un développement normal (Ghosh, May, and Kopp, 1998).

En aval des signaux membranaires engendrés par des interactions récepteur-ligand ou par des inducteurs exogènes, sont activées des protéines kinases essentielles à l’activation de la voie NF-κB.

5-2- Les protéines IκB Kinases : IKK

Le premier événement dans l’activation de NF-κB est l’activation du complexe protéique IKK appelé « signalosome ». Ce complexe de 700-900 kDa est composé de plusieurs protéines dont trois sous-unités : les protéines kinases IKK1 (IKKα), IKK2 (IKKβ) et la protéine adaptatrice IKKγ (NEMO, IKKAP) (Karin and Ben-Neriah, 2000).

5-2-1- Les protéines kinases IKKα et IKKβ

¾ Définition

IKKα et IKKβ sont des sérines/thréonines kinases de 85 et 87 kDa respectivement. Il s’agit de deux sous-unités catalytiques, ayant 52% d’homologie de séquence et 65% d’homologie au niveau de leur domaine catalytique (DiDonato et al., 1997; Mercurio et al., 1997). Au niveau structural, ces kinases sont composées de (Fig. 47):

- Un domaine kinase, une boucle d'activation de type MAP kinase kinase, comprenant le motif Ser176XXXSer180 pour IKKα et un motif Ser177_XXXSer181 _{pour IKKβ.}

- Un domaine en "leucine zipper" permettant la dimérisation

- Un domaine en "hélice-boucle-hélice", indispensable pour l'activation du complexe.

Bien que les fonctions biochimiques d’IKKα et IKKβ semblent être très similaires in vitro, des analyses génétiques ont montré qu’elles ont des fonctions très différentes in vivo. Comme pour les souris KO p65, les souris KO IKKβ meurent d’une apoptose du foie après 13-14 jours de naissance. En effet l’absence d’IKKβ se traduit par une forte diminution de la dégradation d’IκBα (voir plus loin) et l’activation de NF-κB. Dans les cellules KO IKKα et suite à la stimulation par TNF-α et IL-1, la phosphorylation et la dégradation d’IκBα est

Figure 48: Activation des protéines IKK

Modifiée d’après Hans Häcker, H. et al., 2006

normale, mais NF-κB perd sa capacité de liaison à l’ADN et d’induction d’expression des gènes NF-κB dépendants (Li et al., 1999; Sizemore et al., 2002). Ceci indique que la protéine IKKα joue un rôle dans la transactivation des gènes NF-κB indépendamment de la dégradation d’IκBα. Par ailleurs, l’activité kinase de IKKα est également requise pour la dégradation du précurseur p100 induite par NIK « NF-κB inducing kinase » (voir plus loin), protéine de type MAP3K, mais également par un membre de la famille des MAP kinases JNK : MEKK1.

La formation d'un complexe actif nécessite l'homodimérisation ou l'hétérodimérisation des sous unités catalytiques, via les motifs en leucine zipper. Une mutation au niveau de ce motif abolit l'activité kinase de la protéine. Cependant, in vitro, l'activité kinase des dimères formés est différente. Ainsi, l'homodimère formé de deux sous-unités IKKβ a une activité kinase supérieure à l'homodimère IKKα. De plus, au niveau de l'hétérodimère, la phosphorylation de la sous-unité IKKβ peut être suffisante pour activer le complexe. En effet, un hétérodimère formé d'une sous-unité IKKα mutée, a une activité kinase similaire à celle d'un hétérodimère sauvage. Enfin, l'assemblage des complexes pourrait être différent en fonction du stimulus (Karin and Delhase, 2000).

¾ Activation des dimères IKK

L'activation du complexe dimérique IKK dépend de sa phosphorylation. Comme d’autres protéines kinases, IKKα et IKKβ contiennent des boucles d’activation au niveau de leur domaine kinase. Cette région contient des sites spécifiques dont la phosphorylation induit un changement conformationel permettant l’activation de la kinase (Johnson, Noble, and Owen, 1996). La mutation de la lysine 44 conservée dans ce domaine, génère une forme inactive d’IKKα et IKKβ {Mercurio, 1997 #1415; Woronicz, 1997 #1417; Zandi, 1997 #1416}. Le remplacement des sérines 177 et 187 dans la boucle d’activation d’IKKβ par l’alanine prévient l’activation du complexe (Mercurio et al., 1997). L’activation du dimère IKK a lieu en plusieurs étapes décrites dans la figure suivante (Fig. 48):

Suite à la formation du dimère, le domaine bHLH interagit avec le domaine d’activation. Le complexe est alors prêt à être activé. Suite à l’activation de la cellule, l’une des deux sous-unités IKK est phosphorylée sur leur motifs sérine par une kinase en amont appelée NIK « NF-κB inducing kinase » et s’en suit une trans-phosphorylation de la deuxième sous-unité. Le complexe actif phosphoryle alors la protéine inhibitrice IκB. En

même temps les protéines IKKs auto-phosphorylent leur régions C-terminales. Lorsque 9 sérines ou plus de la région C-terminale sont phosphorylées, l’interaction entre cette région qui contient le motif bHLH et le domaine kinase est altérée, à cause de l’accumulation des charges négatives qui engendrent une répulsion entre les deux domaines. L’activité d’IKK est alors diminuée, et à ce stade IKK devient plus susceptible d’être davantage inhibée par l’action des phosphatases.

5-2-2- La protéine IKKγ

La troisième sous unité IKKγ appelée aussi NEMO « NF-κB Essential Modulator » quant à elle, ne possède pas d’activité kinase intrinsèque mais contient une bHLH et un motif « Leucine Zipper » connus pour leur rôle dans les interactions protéines-protéines (Karin and Ben-Neriah, 2000). NEMO est néanmoins un membre important du complexe IKK. En effet, des mutations de ce gène sont associées à différentes maladies chez l’Homme : Incontinentia Pigmenti (IP) ; Anhidroti Ectodermal Dysplasia whith Immunodeficiency, liées à une perte d’activité NF-κB (Doffinger et al., 2001; Smahi et al., 2000). Jusqu’à présent, les mécanismes de régulation de la voie NF-κB par NEMO restent encore très peu élucidés. Il a été rapporté qu’après interaction avec différentes molécules de transduction en amont du complexe, NEMO subit une oligomérisation et active ensuite le complexe IKK (Inohara et al., 2000). La protéine NEMO est également régulée par phosphorylation, puisqu’une mutation sur les Ser85 et Ser41 induit l’abolition de la phosphorylation d’IKKβ et IκBα en réponse au TNF-α, IL-1 ou LPS (Carter et al., 2001; Tarassishin and Horwitz, 2001).

L'ensemble du complexe capable de phosphoryler IκB in vivo et in vitro est nommé signalosome, son isolement a montré qu'il a une taille de 900 kDa, ce qui suggère la présence d’autres composants. Deux éléments supplémentaires au complexe IKK ont été identifiés : CDC37 « Cell Division Cycle 37 » et HSP90 (Chen, Cao, and Goeddel, 2002). L’importance fonctionnelle de ces protéines a été démontrée par traitement des cellules à la Geldanamycin, un agent anti-tumoral qui interfère avec la fonction de HSP90. Ce traitement réduit la taille du signalosome et inhibe son recrutement au TNFR1. Par ailleurs, il n’est pas encore clair si CDC37 et HSP90 ont un rôle quelconque dans la signalisation en plus de leur rôle dans l’assemblage du signalosome (Kelliher et al., 1998).

Figure 49: Famille des protéines IκκκκB

Modifiée d’après Li, Q. et al., 2002;

Nature reviews Immunology

Récemment de nouvelles protéines ont été identifiées : IKK-i (IKKε) et TBK1 (T2K ou NAK). Bien qu’elles aient une certaine homologie avec IKKβ, ces deux protéines ont des fonctions distinctes et ne sont pas des composants du signalosome (Kishore et al., 2002). IKK-i intervient dans la signalisation induite par le LPS mais pas dans celle du TNF dans les cellules immunitaires. Les souris KO TBK1 meurent d’une apoptose hépatique au 12ème jour de la phase embryonnaire (Bonnard et al., 2000). Il semble par ailleurs que TBK1 régule l’activation de la voie NF-κB indépendamment de la dégradation d’IκBα (Bonnard et al., 2000).

5-3- La protéine NIK

NIK « NF-κB Inducing Kinase », est une kinase qui se place en amont du signalosome. NIK a d’abord été identifiée par son association à TRAF2 (Malinin et al., 1997) et sa capacité à activer potentiellement NF-κB quand elle est surexprimée (Ling, Cao, and Goeddel, 1998; Malinin et al., 1997). L’expression d’une protéine NIK catalytiquement inactive bloque l’activation de NF-κB et de IKK en réponse à une large gamme de stimuli incluant TNF-α. Cependant des études récentes ont montré que NIK agit en réponse aux ligands et pas aux inducteurs tels que leTNF-α (Viatour et al., 2005). NIK peut se lier à IKKα et l’activer par phosphorylation sur la Ser176, facilitant ainsi la phosphorylation de p100 (Ling, Cao, and Goeddel, 1998; Woronicz et al., 1997). L’activation d’IKKα par NIK peut également phosphoyler et activer IKKβ et par conséquent médier la phosphorylation de la protéine IκBα (O'Mahony et al., 2004). Il n’existe pas de preuves convaincantes pour une interaction directe entre NIK et le signalosome dans les conditions physiologiques.

5-4- Les protéines IκB

Les protéines IκB dont les plus communes sont IκBα, IκBβ et IκBε (Ghosh, May, and Kopp, 1998), sont des protéines régulatrices caractérisées par la présence de plusieurs régions ARD « Ankyrin Repeat » de 33 aa qui permettent les interactions protéines-protéines (Fig.

49). D’une manière intéressante, p100 et p105 possèdent également ce domaine ARD qui

peuvent fonctionner comme des protéines IκBs Like, et peuvent ainsi subir une dégradation protéolytique pour générer les protéines p52 et p50 respectivement. Un autre membre non

usuel de la famille IκB est le BcL3 qui, tout en restant spécifiquement lié aux homodimères p50 et p52, induit l’expression des gènes NF-κB dépendant, ce qui contraste complètement avec la fonction inhibitrice des autres protéines IκB.

Le schéma classique admet que la protéine IκBα retient NF-κB dans le cytoplasme en masquant leur signale de localisation nucléaire (NLS). Cependant des études récentes montrent que la localisation cytoplasmique du complexe NF-κB inactif est en effet le résultat d’une navette continue entre le cytoplasme et le noyau (Huxford et al., 1998; Malek et al., 2001). Des études structurales et biochimiques ont montré que seulement un des deux NLS du dimère NF-κB est masqué par IκBα dans un complexe NF-κB/IκBα, ce qui permet au complexe de basculer quand même vers le noyau (Ben-Neriah, 2002; Birbach et al., 2002). En même temps, le signal d’export nucléaire (NES) localisé dans la région N-terminale de la protéine IκBα permet d’expulser le complexe hors du noyau, et puisque le processus d’export est plus efficace que le processus d’import, la localisation nucléaire du complexe NF- κB/IκBα inactif ne peut être détectée que lorsque le NES est bloqué par la leptomycine B. De la même manière, le complexe NF-κB/IκBε est capable de voyager activement entre le cytoplasme et le noyau (Lee and Hannink, 2002). Par contre le complexe NF-κB/IκBβ est toujours retenu dans le cytoplasme car IκBβ masque les NLS des deux sous-unités NF-κB simultanément (Tam and Sen, 2001).

L’implication biologique de la navette permanente du complexe entre le cytoplasme et le noyau n’a pas encore été déterminée. Il a été démontré que IκBα régule l’activation transitoire du facteur de transcription NF-κB, alors que IκBβ maintient une activation permanente (May and Ghosh, 1997). En effet, IκBα est rapidement dégradée en réponse à un stimulus, et grâce à la présence d’un élément de réponse NF-κB sur le promoteur de son gène, elle sera rapidement synthétisée (Silverman and Maniatis, 2001). Les protéines IκBα néo synthétisées peuvent ensuite rentrer dans le noyau grâce à leur séquence NLS intrinsèque, et déplacer NF-κB de son site de liaison à l’ADN et ainsi le transporter vers le cytoplasme. Contrairement à IκBα, IκBβ est moins sensible aux signaux de dégradation. En effet il a été rapporté qu’une interaction sélective entre κB-Ras endogène et IκBβ permet l’inhibition de la dégradation de IκBβ pendant l’activation de NF-κB (Fenwick et al., 2000). Par ailleurs, ne possédant pas de NLS endogène et n’étant pas inductible par NF-κB, IκBβ néo-synthétisée est incapable de déplacer NF-κB de son promoteur ou de le faire sortir du noyau, d’où une activation prolongée de ce facteur de transcription.

Figure 50: Processus d’ubiquitinylation

Modifiée d’après Ciechanover, A. et al., 1998;

Pour la plupart des stimuli, excepté les rayons UV et H2O2, la dégradation d’IκB est

une étape essentielle pour la libération de NF-κB et par conséquent son activation (Karin and Ben-Neriah, 2000). Une étape cruciale dans ce processus est la phosphorylation de la protéine IκB sur les sérines N-terminales (Ser32 et Ser36 pour IκBα), médiée par le signalosome. Une fois phosphorylée, IκBα est ensuite ubiquitynilée sur les Lys21 et Lys22 par la β-TRCP « β- transducing repeat-containing protein », puis dégradée via le protéasome.

¾ L’ubiquitinylation

L’ubiquitinylation est un processus essentiel pour cibler les protéines vers la dégradation via le protéasome. C’est une modification réversible caractérisée par trois étapes enzymatiques (Pickart, 2004) (Fig. 50). D’abord l’ubiquitine est activée par une enzyme E1 « Ubiquitine activating enzyme » dans une réaction ATP dépendante. L’ubiquitine activée est ensuite transferée à une enzyme E2 dite aussi UBC « Ubiquitine conjugating enzyme » formant ainsi une E2-Ub thioester. Finalement, en présence d’une ubiquitine protéine Ligase E3, l’ubiquitine est attachée à la protéine cible via une interaction entre la région C-terminale de l’ubiquitine et le groupe ε-NH2 d’un résidu lysine de la protéine cible. L’ubiquitine contient sept résidus lysine qui peuvent se lier à d’autres ubiquitines et former une chaîne polyubiquitine. Typiquement une chaîne poyubiquitine qui cible les protéines vers une dégradation via le protéasome est liée par les Lys 48 (Chau et al., 1989). Cependant d’autres chaînes liées par les Lys63 sont également retrouvées dans les cellules, et sont connues pour réguler la réparation d’ADN et l’activation des protéines kinases via un mécanisme indépendant de la dégradation (Peng et al., 2003).

L’ubiquitinylation d’IκBα est réalisée par une enzyme E2 de la famille UBC4/5 et l’enzyme SCF-βTrcP E3 Ligase (Jiang and Struhl, 1998; Margottin et al., 1998). Il existe deux protéines βTrcP (1 et 2) chez les mammifères. Ces deux protéines se fixent au complexe SCF via la F-box. Le complexe se lie à l’enzyme E2 qui reconnaît spécifiquement la protéine IκBα phosphorylée au niveau des Ser32 et Ser36 (Chen, Parent, and Maniatis, 1996; Yaron et al., 1998) et permet son l’ubiquitinylation au niveau des deux résidus lysines N-terminal (Lys 21/22). IκBα ubiquitinylée toujours liée à NF-κB, est dégradée sélectivement par le protéasome 26S alors que le complexe NF-κB est épargné (Chen et al., 1995).

Récemment un nouveau mécanisme qui inhibe la dégradation d’IκBα a été identifié. Des petites molécules dites SUMO « Small Ubiquitine Modified » sont capables de se lier à la

Figure 51: Dégradation préférentielle via le protéasome

Zhijian, J.C. 2005;

protéine IκBα au niveau de la Lys21 ce qui empêche son ubiquitinylation et la rend complètement résistante à la dégradation par le protéasome. IκBα dite sumoylée reste liée à NF-κB créant ainsi un complexe NF-κB-IκB-SUMO qui ne répond pas aux signaux d’induction. La cellule peut en effet utiliser ce mécanisme afin de réguler la quantité de NF- κB nécessaire à la transcription. Cette régulation se fait aussi grâce à une enzyme hydrolase qui rompe la liaison SUMO-IκB (Mahajan et al., 1997). L’activité de cette hydrolase est tellement importante que la détection du complexe SUMO-IκB est presque impossible dans des conditions normales.

¾ Dégradation par le protéasome

Un modèle plausible vient d’être proposé (Fig. 51). Selon ce modèle, l’étiquette ubiquitine du substrat recrute le protéasome à une séquence interne flexible (Chen, 2005), telle que la GRR « Glycine-Rich Region » de p100 et p105 (Lin and Ghosh, 1996). Cette région, formerait une boucle en épingle à cheveux qui s’insert dans la chambre protéolytique du protéasome 20S. La protéolyse commence à la boucle et se poursuit dans les deux directions N- et C-terminales de la protéine cible. Dans la plupart des cas, la sous unité 19S du protéasome permet le dépliement des domaines N- et C-terminaux qui passent dans la chambre de protéolyse afin que la cible soit complètement dégradée. Dans le cas des protéines p100 et p105, les domaines RHD sont des structures superenroulées, très difficilement dépliables. Par conséquent, après initialisation à partir de la boucle GRR, la protéolyse se poursuit le long du polypeptide C-terminal jusqu’à atteindre la fin, alors qu’elle s’arrête quand elle arrive à la structure RHD superenroulée, ce qui définit la fin de la protéolyse.

5-5- Les voies de signalisation NF-κB

Trois voies distinctes, mettant en jeu différentes kinases, conduisent à l’activation de NF-κB (Fig. 52). La première voie, dite « classique », est activée par des cytokines pro- inflammatoires telles que le TNF-α. Elle conduit au recrutement de différentes protéines adaptatrices dont TRADD « TNF receptor associated death protéin », TRAF2 « TNF receptor associated factor 2 » et RIP « receptor interacting protein » au niveau de la membrane plasmique. La formation de ce complexe est suivie du recrutement et de l’activation du signalosome, complet constitué essentiellement des kinases IKK. Ce complexe va permettre

Figure 52 : Les trois voies d’activation de NF-κκκκB

Classique Alternative Atypique

Modifiée d’après Viatour, P. et al., 2005;

la phosphorylation de IκBα liée au complexe NF-κB1 (p50/p65), sur les Ser32 et 36 (Karin and Ben-Neriah, 2000) et par conséquent son ubiquitinylation et sa dégradation via le protéasome (Karin and Ben-Neriah, 2000; Viatour et al., 2005), le facteur de transcription p50/p65 ainsi libre est ensuite transloqué dans le noyau où il va pouvoir exercer son activité de transactivation de l’expression des gènes NF-κB dépendants. La seconde voie, dite « alternative », est NIK et IKK-α dépendante. Elle est activée par des ligands tels que la lymphotoxine B, le CD40 ou des virus tels que HTLV1 ou l’EBV (Viatour et al., 2005). Le recrutement membranaire de TRAF 2, 3 et 6, qui à leur tour recrutent et activent la kinase NIK, permet l’activation d’un homodimère IKKα. Cet homodimère va phosphoryler p100, et seule la région homologue d’IκB-α sur la protéine sera clivée par le protéasome pour donner p52 (Amir et al., 2004; Fong and Sun, 2002; Pickart, 2004; Xiao, Harhaj, and Sun, 2001). L’hétérodimère p52/RelB peut alors être transloqué dans le noyau (Viatour et al., 2005). Dans les deux cas la phosphorylation de la molécule inhibitrice est essentielle à l’activation du facteur NF-κB (Brown et al., 1995). La troisième voie est dite « atypique », car elle est indépendante des kinases IKK. Elle est activée suite à l’altération de l’ADN par les UV. Dans ce cas, la phosphorylation de IκBα se fait sur le groupement C-terminal grâce à une Casein kinase 2 (CKII) qui est une serine thréonine kinase elle-même activée par la p38 MAP kinase. Un stress oxydatif peut également conduire à l’activation de NF-κB suite à la phosphrylation de la Tyr42 par la protéine Syk (Viatour et al., 2005).

5-6- Régulation de l’activité transcriptionnelle des protéines NF-κB

5-6-1- Activation par phosphorylation de p65

Cependant plusieurs preuves montrent que l’activité NF-κB peut être également régulée par des modifications directes des protéines NF-κB via leur phosphorylation et acétylation. Plusieurs travaux ont montré la capacité de différentes kinases à induire la phosphorylation et l’activation de la sous unité p65 du complexe NF-κB, dans le cytoplasme ou le noyau et selon la nature du stimulus et du type cellulaire (Fig. 53). En effet, la phosphorylation de p65 sur la Ser276 par la sous unité catalytique de PKA (PKAc) après