CYCLE VIRAL

Comme tous les rétrovirus, le VIH a un cycle de réplication complexe comprenant les étapes suivantes (Fig.12) :

- Fixation de la particule virale au récepteur cellulaire.

- Internalisation après fusion des membranes virales et cellulaires.

- Transcription inverse de l’ARN viral pour former un ADN double brin linéaire. - Transport du complexe de pré-intégration (PIC) vers le noyau.

- Décapsidation et intégration de l’ADN linéaire dans le génome cellulaire pour former le provirus.

- Transcription du provirus par l’ARN polymérase II pour former les différents ARN messager (ARNm) viraux y compris l’ARN génomique.

- Epissage et export nucléaire des ARN.

- Traduction des ARN pour former des précurseurs de protéines virales. - Assemblage de la particule virale et empaquetage du génome viral (ARN) - Structuration et libération du virion.

- Maturation du virion pour générer une particule virale infectieuse.

3-2- Fixation et internalisation

3-2-1- Récepteurs viraux

La nature des récepteurs du VIH-1 définit non seulement la population des cellules susceptibles d’être infectées par le virus, mais régule aussi la réplication du virus depuis l’étape d’entrée (Fig. 13).

a- Le récepteur CD4

En 1986, Maddon et al. ont montré que l’expression de CD4 dans les cellules humaines les rend sensibles à l’infection par le VIH-1 (Maddon et al., 1986). Il s’agit d’une glycoprotéine monomérique, de la superfamille des immunoglobulines, exprimée par les thymocytes et les lymphocytes T CD4+ et à plus faible taux par les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques.

Figure 13: Récepteurs du VIH

Modifiée d’après Bukrinsky, M., et a., 2001;

cytoplasmique (Fig. 13). Le VIH utilise principalement les récepteurs CCR5 et CXCR4. La liaison ligand-récepteur est accompagnée par un réarrangement des sept domaines transmembranaires, suivi d’un changement conformationnel impliquant les ICLs. Cette forme activée du récepteur stimule l’activation de l’hétérotrimère de protéines G (sous-unités α, β et γ), induisant ainsi l’initiation d’une cascade de signalisation. Une fois initiés, ces signaux de transduction activent entre autre, le réarrangement des filaments d’actine et la polarisation cellulaire caractéristiques d’une réponse chimiotactique.

Tout comme le CD4, ces récepteurs aux chimiokines semblent localisés dans les radeaux membranaires « lipid rafts » (Kozak, Heard, and Kabat, 2002; Raulin, 2002). Ces microdomaines enrichis en cholestérol et sphingolipides de la membrane plasmique reflètent la bicouche lipidique optimale du virus, fournissant ainsi l’environnement idéal pour la fusion des membranes (Liao, Graham, and Hildreth, 2003).

c- Autres récepteurs cellulaires du VIH-1

Outre les lymphocytes T CD4+, la pathogenèse du VIH-1 implique divers types cellulaires, qui n’expriment pas ou très peu de CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 (Clapham and McKnight, 2002). Dans ce cas, le VIH-1 peut interagir directement via ses glycoprotéines de surface avec d’autres type de récepteurs cellulaires (tels que DC-SIGN) (Tableau). Pour élargir son tropisme, le virus peut aussi utiliser des molécules de l’hôte (tels que CMH-I, CMHII, ICAM-1..etc) acquises lors de son bourgeonnement, pour interagir avec leurs ligands naturels à la surface de différents types cellulaires (Tremblay, Fortin, and Cantin, 1998).

Récepteur Expression Rôle dans l’attachement et l’infection Référence

Gal-C DC-SIGN DC-SIGNR Rcp d’endocytose à mannose Héparanes LFA-1/ICAM-1

Neurones et cellules gliales Cellules Dendritiques Cellules endothéliales Macrophages

Plusieurs types cellulaires

LFA-1 : cellules

hématopoïétiques, ICAM-1 : différents types cellulaires

- Infection inefficace, aide à l’attachement - Se lie à la gp120, présentation du VIH aux cellules CD4

- Se lie à la gp120

- Attache le virus à la surface cellulaire via une interaction avec la boucle V3 et augmente l’interaction avec CD4 et CXCR4.

- ICAM-1 incorporé dans le virion permet l’attachement et l’infections des cellules LFA- 1+

(Harouse et al., 1991) (Pohlmann et al., 2001) (Larkin et al., 1989)

(Mondor, Ugolini, and Sattentau, 1998)

(Fortin et al., 1999; Paquette et al., 1998)

La protéine CD4 est composée de 4 domaines extracellulaires « Immunoglobulin- related extracellular domains » (D1-D4), un domaine transmembranaire et une courte queue cytoplasmique (Fig. 13). Le site de liaison du VIH-1 a été localisé dans l’ectodomaine distal D1 du CD4. Le peptide CD4M33, qui mime le récepteur CD4 de l’hôte, est capable d’inhiber l’interaction CD4-gp120 en se liant à la cavité interne de la gp120. De cette manière ce peptide bloque aussi l’entrée du virus dans la cellule hôte (Stricher et al., 2005). Dans les lymphocytes TCD4+, le CD4 interagit avec le complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II), lors de la présentation antigénique par les cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Cette interaction active les cellules T via la tyrosine kinase p56LCK, associée à l’extrémité cytoplasmique de CD4. Il est donc possible que la liaison du VIH-1du CD4, via gp120, interfère avec la reconnaissance du CMH-II des CPA (Kwong et al., 1998), ce qui pourrait contribuer à la dérégulation du système immunitaire chez les patients infectés.

Nous avions vu plus haut que le VIH-1 a élaboré deux stratégies indépendantes impliquant trois protéines virales (gp160, Nef et Vpu) pour diminuer l’expression membranaire de CD4 dans les cellules infectées. Cette stratégie préviendrait la capture des virions bourgeonnant dans la cellule productrice via leur liaison au CD4 exprimé en surface. Ce mécanisme contribue à faciliter la dissémination du virus aux cellules avoisinantes.

Le cycle réplicatif du VIH commence par l’adsorption des particules virales aux molécules CD4 présentes à la surface des cellules cibles (principalement lymphocytes T CD4+, monocytes et macrophages). Cette interaction de haute affinité (Kd=10-9M) est réalisée par des complexes trimériques de glycoprotéine gp120 présents dans l’enveloppe virale. Alors que la fixation des virions aux molécules CD4 est essentielle, leur interaction avec un corécepteur, notamment les récepteurs aux chimiokines CXCR4 ou CCR5, est indispensable à l’entrée dans la cellule hôte.

b- Récepteurs des Chimiokines

Les chimiokines sont de petites protéines (8-14 kDa), classées en deux sous familles selon l’arrangement de leurs deux cystéines en position N-terminale (CC ou CXC) (Fig. 13). Les chimiokines RANTES « Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted », MIP « Macrophage Inflammatory Protein » 1-α et 1-β interagissent avec CCR5 (Baggiolini, Dewald, and Moser, 1994), et SDF « Stromal Cell-Derived factor »-1α est le ligand naturel de CXCR4 (Kim and Broxmeyer, 1999).

Les récepteurs aux chimiokines, appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G, un domaine extracellulaire N-terminal, trois boucles extracellulaires (ECL-1-3), trois boucles intracellulaires (ICL-1-3) et une queue

Figure 14: Etapes de fusion entre VIH-1 et cellule cible

Modifiée d’après Chan, DC. et al., 1998

3-2-2- Entrée du virus

L’entrée du virus se fait essentiellement par fusion entre les membranes virale et cellulaire. Cette fusion se passe généralement au niveau des microdomaines membranaires rafts (Kozak, Heard, and Kabat, 2002; Raulin, 2002) (Ono and Freed, 2005). Le processus d’entrée se déroule en plusieurs étapes (Fig. 14) : la liaison de la protéine virale gp120 au CD4 induit un changement de conformation qui permet à la gp120 de se lier au corécepteur (CCR5 ou CXCR4). Suite à cette liaison, la gp41 change de conformation, conduisant à l’accessibilité de la région N-terminale hydrophobe, qui correspond au domaine de fusion. Cette région s’insère alors dans la membrane de la cellule hôte. Commence alors un phénomène dynamique médié par l’interaction entre les trimères HR1 (ou N36) et HR2 (ou C34), formant une structure en épingle à cheveux. Grâce à l’interaction entre les domaines N et C-terminaux de la gp41, une structure à 6 hélices se forme et permet de rapprocher les membranes virale et cellulaire qui fusionnent. La nucléocapside virale peut alors être libérée dans le cytoplasme de la cellule hôte pour initier les premières étapes de la transcription inverse. Toutefois, le contact des virions avec les lymphocytes T CD4+ provoque, de façon simultanée l’endocytose des particules virales. Seule l’entrée par fusion des virions semble mener à une infection productive dans les lymphocytes T CD4+. L’entrée des virions par endocytose semble une voie sans issue qui conduit à leur dégradation (Marechal et al., 1998; Schaeffer, Soros, and Greene, 2004). Cependant, une étude récente a montré que les virus qui rentrent par endocytose ne sont pas nécessairement dégradés et que cette voie d’entrée pourrait aussi contribuer à la dissémination du virus in vivo (Blanco et al., 2004).

3-3- Transcription inverse du génome viral et intégration dans le génome de

la cellule hôte

3-3-1- Transcription inverse

La transcription inverse de l’ARN viral en ADN double brin est la caractéristique principale des rétrovirus. C’est un processus complexe et ordonné, qui commence immédiatement après l’entrée du core du virion dans le cytoplasme de la cellule infectée. La réaction a lieu au sein d’un grand complexe contenant les protéines MA, NC, RT, IN, Vpr, l’ARN viral et plusieurs protéines de la cellule hôte comme la cyclophiline A (Bowerman et

Figure 15: Etapes de transcription inverse

al., 1989). Plusieurs arguments semblent montrer que la transcription inverse a lieu dans la capside virale à proximité immédiate de la membrane nucléaire en association avec les filaments d’actine (Arhel et al., 2007). En effet, la capside semble rester associée au génome viral jusqu’à ce que le complexe atteigne les pores nucléaires (Arhel et al., 2007; McDonald et al., 2002).

La reverse transcription peut être divisée en plusieurs étapes successives (Fig. 15):

1- Formation du petit brin négatif d’ADN « strong stop DNA »

Cette étape est initiée grâce à l’ARNtlysine portant un groupement 3’OH utilisé comme

amorce pour la synthèse de l’ADN. Cet ARNt se fixe d’abord sur l’ARN viral au niveau du site pbs « primer binding site ». La RT reconnait le complexe ARNt/ARN et initie la transcription inverse en procédant à l’élongation de l’extrémité 3’ de l’amorce, synthétisant ainsi le brin négatif d’ADN jusqu’à l’extrémité 5’ de l’ARN viral. L’ADN formé à cette étape s’appelle brin négatif d’ADN « strong stop » contenant les séquences U5 et R. L’ARNt reste attaché à l’extrémité 5’ de ce brin.

2- Premier transfert

Afin de continuer la synthèse du brin négatif, l’ADN formé « strong stop » doit être transféré à l’extrémité 3’ de l’ARN génomique. Ce saut ou transfert, a lieu suite à la dégradation du brin d’ARN rétrotranscrit (U5R) du complexe ARN : ADN par l’action de l’activité RNase H. Cette étape expose le brin négatif d’ADN et facilite son hybridation à la séquence R du côté 3’OH du génome viral (Chen et al., 2003). Les protéines NC semblent faciliter cette étape de transfert (Topping et al., 1998).

3- Synthèse du long brin négatif d’ADN

L’hybridation du petit brin négatif d’ADN « strong stop » à la séquence R crée une amorce d’initiation d’ADN et la RT peut alors continuer l’élongation du brin négatif pour former un long brin négatif d’ADN. La synthèse s’arrête à proximité de la séquence pbs en 5’ terminal de l’ARN. Pendant la synthèse du long brin négatif, la RNase H procède à la dégradation de l’ARN du complexe hybride ARN : ADN. Cependant, deux séquences d’ARN, résistantes à la RNase H, sont épargnées. Il s’agit des séquences ppt « polypurin tract». L’une à côté du U3 du LTR 3’ et l’autre au centre du génome nommée cppt (Charneau, Alizon, and Clavel, 1992).

4- Initiation de la synthèse du brin positif d’ADN

Ces séquences d’oligonucléotides (ppt et cppt) restent liées au brin négatif d’ADN et servent d’amorces pour la synthèse du brin positif d’ADN avant d’être éliminées. La synthèse progresse vers l’extrémité 5’ du brin négatif, en commençant par copier les séquences U3, R

et U5 et continue pour copier la portion d’ARNt encore présente en 5’. L’élongation s’arrête au niveau des bases modifiées qui se trouvent normalement en position 19 de l’ARNt. Le brin d’ADN naissant s’appelle brin positif d’ADN formé des segments amont (D+) et aval (U+).

5- Suppression de l’ARNt

L’arrêt de l’élongation du brin positif est marqué par la dégradation de l’ARNt en 5’ par la RNase H. Cette suppression peut se dérouler en deux étapes : un premier clivage près de la jonction ARN : ADN, et un second dans l’ARNt. Un seul ribonuléotide (la base A) est laissé à l’extrémité 5’ du brin négatif (Pullen, Ishimoto, and Champoux, 1992; Smith, Kim, and Roth, 1990; Whitcomb, Kumar, and Hughes, 1990), sans affecter les étapes suivantes. La séquence de bases près de la jonction, peut affecter significativement l’action de la RNAse H (Smith et al., 1998).

6- Deuxième transfert et achèvement de l’élongation

L’élimination de l’ARNt expose l’extrémité 3’ du brin positif d’ADN, pour permettre son appariement avec l’extrémité 3’ du brin négatif. Cet appariement est réalisé grâce à la complémentarité des deux séquences pbs pour former un intermédiaire circulaire, avec les deux extrémités 3’ dans une structure appropriée à l’élongation. La synthèse du brin D+ continue jusqu’à la fin du brin négatif en U5. La synthèse du brin U+ continue jusqu’à ce qu’il rencontre la séquence CTS « Central Termination Sequence » localisée au centre du génome (Charneau et al., 1994). La séquence cppt en amont du CTS initie la synthèse d’un court fragment d’ADN et provoque le déplacement d’environ 100 nt du brin positif d’ADN (D+), créant un chevauchement de brins en triplex nommé « Central DNA Flap». La conséquence clé des deux translocations qui ont lieu durant la transcription inverse est la duplication des séquences : U5 durant la translocation du brin négatif et U3 durant la translocation du positif. L’ADN résultant contient deux LTR. Chacun est constitué des séquences U3-R-U5. A la fin de cette élongation, le cercle s’ouvre pour donner un intermédiaire linéaire.

3-3-2- Intégration de l’ADN proviral

1- Entrée dans le noyau

Avant de pouvoir s’intégrer, le génome viral doit d’abord traverser la membrane nucléaire. La structure « Central DNA Flap », que comporte l’ADN rétrotranscrit grâce à la région cppt, semble jouer un rôle majeur dans l’import nucléaire du génome viral. La

Figure 16: Transport intracellulaire du VIH

Modèle du transport intracellulaire du VIH-1 et de l’import nucléaire de l’ADN viral

Flap-dépendant: 1) après la fusion, le virus a besoin d’interagir avec le cortex d’actine sous jacent

la membrane plasmique (Campbell et al., 2004). A ce stade la décapsidation n’a pas encore lieu. 2) le core la particule renfermant le complexe de RT, est dirigé par les microtubules vers le compartiment nucléaire (Mc Donald et al., 2002; Arhel et al., 2006). 3) le complexe RT transite des microtubules vers les filaments d’actine à proximité immédiate du compartiment nucléaire et 4) ces filaments permettent un mouvement lent vers la membrane nucléaire (Arhel et al. 2006). 5) la nucléocapside renfermant le génome virale s’arrête au

complexe du pore nucléaire NPC. 6) on suppose que la majorité de la transcription inverse a lieu à proximité du NPC. 7) le complexe de préintégration PIC, dépourvu du Flap s’accumule dans la NC intacte qui ne pourra pas traverser le pore nucléaire. 8) le Flap permet de traverser le pore nucléaire. 9) transport intranucléaire

diffusif (Arhel et al., 2006). 10) l’ADN viral s’intègre dans la chromatine de l’hôte ou reste sous forme circulaire à 1 ou 2 LTR.

Arhel, N. et al., 2007;

Figure 17: Intégration du génome viral

mutation de cppt engendre un génome linéaire dépourvu de la région « Central DNA Flap », et inhibe la réplication virale (Arhel et al., 2006; Zennou et al., 2000). De plus l’ADN linéaire dépourvu du ‘Flap’, s’accumule à proximité des membranes nucléaires indiquant une déficience de l’import nucléaire (Zennou et al., 2000). Contrairement à ce qui a été avancé, il semblerait que la décapsidation n’aurait pas lieu immédiatement après la fusion, mais à proximité des pores nucléaires du coté cytoplasmique, une fois la transcription inverse terminée et au moment de la maturation du PIC (ADN proviral, IN, MA, Vpr, et RT) essentiel pour l’import nucléaire (Arhel et al., 2007) (Fig. 16). Le complexe PIC étant deux fois plus grand que le diamètre maximal du pore nucléaire (9 à 29 nm), plusieurs mécanismes doivent être mis en jeu pour faciliter sa pénétration dans le noyau : i) la séquence consensus de localisation nucléaire (NLS) de la matrice est reconnue notamment par les importines-α et -

β cellulaires impliquées dans la translocation nucléaire; ii) Vpr se lie aux importines et aux nucléoporines (Fouchier et al., 1998; Popov et al., 1998); iii) de plus, la séquence « Central DNA Flap » aurait un rôle dans l’adressage de PIC au noyau; iv) enfin, le PIC pourrait aussi utiliser les microtubules pour pénétrer dans le noyau (McDonald et al., 2002). Le PIC accède ainsi au noyau et permet l’intégration de l’ADN viral dans le génome de l’hôte grâce à l’action de l’intégrase.

2- Intégration

L’intégrase clive les deux derniers nucléotides 3’ de chacun de deux brins d’ADN viral, puis clive aussi l’ADN cellulaire en formant des extrémités cohésives 5’ sortantes de 4 nucléotides (Fig. 17). Une ligase cellulaire intervient pour joindre l’ADN cellulaire et viral. L’intégration au génome de la cellule hôte est définitive, ce qui confère au virus la capacité de persister dans les cellules infectées.

En plus de cet ADN linéaire qui sert pour l’intégration, deux types d’ADN viraux circulaires peuvent se trouver dans le noyau des cellules infectées : un ADN circulaire à un LTR, généré par recombinaison homologue entre les deux LTR de l’ADN linéaire, et un autre ADN à deux LTR générés par la ligation des deux extrémités du précurseur linéaire, ou dans lequel les LTR sont distribués de façon aléatoire sur la molécule circulaire, suite à une auto- intégration de l’ADN viral sur lui-même, médiée par l’intégrase virale (Li et al., 2001). Aucune des ces formes d’ADN circulaires n’est infectieuse bien que certaines soient transcriptionnellement actives (Wu and Marsh, 2001).

Le provirus peut persister pendant des années dans des cellules quiescentes, pouvant à tout moment se réactiver en réponse à une stimulation et ainsi induire la réplication du

Figure 19: Transcription du génome viral

Modifiée d’après Peterlin, S. et al., 2003

provirus intégré. Ces phénomènes constituent une limitation pour les traitements rétroviraux actuels qui ne sont actifs que sur les virus en réplication (Pomerantz, 2002).

3-4- Expression du provirus et bourgeonnement de nouveaux virions

3-4-1- Transcription

Dans la cellule hôte, le LTR 5’ contient des éléments promoteurs qui vont permettre au génome viral de s’exprimer (Fig. 18). On compte un centre « core promoter », constitué d’un élément initiateur de la transcription (Inr) et d’une TATA box. Du côté 5’ se trouvent trois sites Sp1 (Taube et al., 1999) et des éléments promoteurs permettant de fixer les facteurs de transcription NF-κB, NF-AT et les membres de la famille Ets (Jones and Peterlin, 1994). Du coté 3’ l’autre, des séquences activatrices « enhancers ».

Un complexe co-activateur se fixe sur Sp1 et ensemble, recrutent et positionnent l’ARN polymérase II au site d’initiation de la transcription pour former le complexe de préinitiation (Fig. 19). La transcription commence, mais la polymérase seule ne permet pas l’élongation du transcrit naissant. En effet, l’ARN pol II initie la transcription de l’ARN viral, mais la transcription est rapidement bloquée par le facteur N-TEF « Negative Transcriptional Elongation Factor ». Ceci résulte en l’accumulation de transcrits courts (Kao et al., 1987; Wada et al., 1998; Yamaguchi et al., 1999). Le N-TEF est un complexe constitué du DSIF « DRB-Sensitivity-Inducing Factor » et du NELF « Negative ELongation Factor ». Afin de remédier à ce blocage, le virus met en jeu un activateur transcriptionnel : la protéine Tat. Contrairement à la majorité des activateurs transcriptionnels, Tat ne se fixe pas directement à l’ADN cible, mais interagit avec une structure en tige-boucle, localisée à l’extrémité 5’de l’ARN naissant, appelée TAR « Trans-Activating Response element » (Kao et al., 1987).

La protéine Tat du VIH, se lie à la protéine PCAF « p300/CBP-associated factor » qui induit son acétylation sur la lysine K28 générant Ac28Tat (Fig. 20). Cette dernière a une grande affinité pour le complexe P-TEFb « positive elongation factor b » constitué de la Cycline T1 et CDK9 (cyclin-dependent kinase 9). Le complexe Ac28Tat-PTEFb a une forte affinité pour la séquence TAR de l’ARN naissant (Wei et al., 1998) qui recrute la Cdk9 cellulaire. Tat recrute p300/CBP et hGCN5 ce qui provoque son acétylation sur les lysines K50 et K51 (Col et al., 2001; Deng et al., 2000; Kiernan et al., 1999). Ac50Tat ayant une plus

Figure 20: Transcription du génome viral médié par Tat

Gatignol, A. et al., 2007;

Figure 21: Rôle de la protéine Rev dans l’export nucléaire

des transcrits viraux

Rôle de Rev dans l’export nucléaire

L’ARNm multi-épissé des protéines (Tat, Rev et Nef) du VIH-1 utilise une voie indépendante de Rev pour sortir du noyau (1). Grâce à son signal NLS, la protéine Rev néosynthétisée se lie à l’importineβ (2) formant un hétérodimère (3), qui est transloqué via le pore nucléaire. Dans le noyau, Ran (GTP) permet la dissociation Rev/importine (4) et Rev libre (5) se lie à l’élément RRE (Rev-responsive element) sur l’ARNm (6). Le complexe Rev-RRE ARNm est convertie en une structure d’export fonctionnelle après l’addition de CRM1 et Ran (GTP) (7). Le complexe sort par le pore nucléaire (8). Dans le cytoplasme, Ran (GTP) est convertie en Ran (GDP) grâce à RanBP1/RanGAP (9) et se détache de l’ARN viral (10). Ce transcrit peut être encapsidé dans le virion ou traduit en protéines virales lorsqu’il est partiellement épissé (11).

faible affinité pour TAR, le complexe p300/CBP-Ac50Tat-PTEFb est alors dissocié de TAR et transféré à une autre région du promoteur (Bres et al., 2002; Kaehlcke et al., 2003). La cdk9 phosphoryle le DSIF (Fig. 19) et la queue C-terminale de l’ARN polymerase II (CTD), ce qui marque la transition de l’étape d’initiation vers l’étape d’élongation de la transcription (Price, 2000). La phosphorylation de la queue CTD de l’ARNpol II sur les sérines 2 et 5 ne sert pas