Etude de la relation structure/fonction du récepteur du
"Platelet-Activating Factor" humain par mutagénèse dirigée.
par
Jean-Luc Parent
Département d'anatomie et de biologie cellulaire Service d'immunologie
Thèse présentée à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de
Philosophiae Doctor (Ph.D) en biologie cellulaire
1^1
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0-612-21859-7
Par la présente, je permets à Jean-Luc Parent, en tant que co-auteur, d'utiliser les
manuscrits sous-mentionnés comme partie intégrante de sa thèse de doctorat par articles :
"Mutations of two adjacent amino aclds generate inactive and constîtutively
active forms of the human platelet-actlvatlng factor receptor". J. Bio' ^hem.
271, 7949-7955, 1996.
Cjuâsriaa.^ Gpuill Dr. Artur de Brum-Femandes
^7^
MaMarek Rola-PleszczynskiDr. Jana Stankova
"Mutation of an aspartate at position 63 in the human platelet-activating factor receptor augments binding afflnlty but abolishes G-protein-coupling
and inositol phosphate production". Biochem. Biophys, Res. Comm. 219,
968-975, 1996 - ' - '
-fc=-Christian Le Oouill Marek Rola-HeszczynsM—7
-tT
Dr. Jana Stankova
"Identification of transmembrane domain residues déterminant in the
structure/functlon relatlonship of the human platelet-activating factor receptor by slte-dlrected mutagenesis". /. Biol Chem. sous presse.
-é ^
Chris^Srte^Gouill Dr. Emanuel Escher
LISTE DES ABREVIATIONS ii
RESUME iii
CHAPITRE I - INTRODUCTION 1
CHAPITRE n - ARTICLE
Mutations of two adjacent amino acids generate
inactive and constitutively active forms of the
human platelet-activating factor receptor. 21
CHAPITRE m - ARTICLE
Mutation of an aspartate at position 63 in the human platelet-activating factor receptor augments binding affmity but abolishes G-protein-coupling
and inositol phosphate production. 22
CHAPITRE IV - ARTICLE
Identification of transmembrane residues déterminant
in the structure/fiinction relationship of the human
platelet-activating factor receptor by site-directed mutagenesis. 23
CHAPITRE V - DISCUSSION 24
CHAPITRE VI - CONCLUSION 40
REMERCIEMENTS 42
LISTE DES ABREVIATIONS
AA: acide arachidonique.
DTM: Domaine transmembranaire.
GRK: G protein-coupled receptor kinase.
GTP7S: guanosine 5'-0-(3-thio-triphosphate).
IP: inositol phosphate.
MARK; mitogen-activated protein kinase.
PAF: ("platelet-activating factor") facteur d'activation des plaquettes.
PBS: ("phosphate-buffered saline") tampon phosphate salin.
PCR: polymerase chain reaction. PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase. PKA: protéine kinase A.
PKC: protéine kinase G. PLA2; phospholipase A2. PLC: phospholipase C. PLD: phospholipase D.
PTK; protéine tyrosine kinase.
R: conformation inactive du récepteur. R : conformation active du récepteur. RCPG: récepteur couplé à une protéine G.
TMH: ("transmembrane hélix") hélice transmembranaire.
Etude de la relation structure/fonction du récepteur du "Platelet-Activating Factor" humain par mutagénèse dirigée.
par Jean-Luc Parent
Thèse présentée à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en biologie cellulaire,
Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada.
RESUME
Le "platelet-activating factor" (PAF) est un puissant médiateur phospholipidique produisant un large éventail de réponses biologiques. Le récepteur du PAF (PAFR) fait parti de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Ce récepteur lie le PAF avec
haute affinité et est couplé à de multiples voies de signalisation menant à des réponses biologiques pouvant être inhibées par une variété d'antagonistes du PAF structurellement
distincts. L'objectif principal de mes travaux de doctorat consistait à caractériser la relation
structure/fonction du PAFR humain par voie de mutagénèse dirigée. Nous cherchions à
déterminer des acides aminés du PAFR pouvant être impliqués dans le couplage à la protéine G
et dont la mutation pourrait mener à des changements de structure de la protéine, conférant une
activité constitutive au récepteur. Nous avons donc muté deux résidus adjacents, Ala230 et Leu231, de la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire du PAFR en Glu et Arg,
respectivement. La substitution de Leu231 par un Arg (mutant L231R) amena deux
modifications majeures; 1) une activité constitutive accrue du PAFR en termes de production d'inositol phosphates (IPs) et 2) une plus grande affinité du récepteur pour le PAF (agoniste), mais non pouf le WEB2086 (antagoniste). Le mutant L231R semble pouvoir atteindre au moins deux conformations distinctes: (i) un état de haute affinité plus éleyè que le récepteur de type sauvage (WT) dépendant du couplage à la protéine G et (ii) un état découplé du récepteur
un Glu résulta aussi en deux modifications majeures: 1) une perte d'activation du récepteur en
termes de production d'IPs suite à une stimulation au PAF et 2) une baisse d'affinité marquée du récepteur pour le PAF et non pour le WEB2086. Des expériences de liaison utilisant du GTPyS ont démontré que le mutant A230E possède une basse affinité, inhérente à la molécule du récepteur. Les effets de la mutation du résidu Ala230 en Gin suggèrent que le résidu 230 joue un
rôle fondamental dans l'affinité du récepteur et que la charge du résidu à cette position est
déterminante dans le couplage de la protéine G au PAFR. Nous avons également utilisé la
mutagénèse dirigée afin d'étudier le rôle du résidu Asp63 situé dans le 2e domaine
transmembranaire (DTM), des acides aminés Phe97 et Phe98 du 3e DTM, ainsi que des résidus
Asn285 et Asp289 du 7e DTM, dans la liaison des ligands, dans l'activation et la régulation de la
conformation du PAFR. La substitution de rAsp63 par un Asn résulta en l'abolition du couplage à la protéine G et de la production d'IPs suite à une stimulation au PAF, et augmenta l'affinité du
récepteur pour l'agoniste. Le double-mutant FFGG (Phe97 et Phe98 mutés en Gly) montra une
affinité réduite de trois à quatre fois pour le PAF, et non le WEB2086, par comparaison au récepteur WT. Le récepteur FFGG démontrait cependant des caractéristiques d'activation
normales, suggérant que ces deux résidus Phe adjacents maintiennent le récepteur du PAF dans
sa conformation optimale, plutôt que d'interagir directement avec le ligand. D'autre part, les résultats obtenus de la mutation de rAsp289 en Ala et en Asn indiquent que le résidu 289 n'est pas requis pour la liaison du PAF, mais que la formation de ponts hydrogènes impliquant ce résidu pourrait être essentielle à l'activation du récepteur. Lorsque rAsn285 fût mutée en Ala, le récepteur résultant montrait des caractéristiques identiques au récepteur WT. De façon étonnante, la substitution du même résidu par un Ile causa la perte totale de liaison du PAF et du
WEB2086, en dépit d'une expression normale à la surface cellulaire. Il semblerait donc que la
molécule du PAF ne se lierait pas à son récepteur en interagissaht avèc les résidus Asp63, Asn285 et Asp289, contrairement à ce qu'un modèle moléculaire récent du PAFR proposait. Nos résultats suggèrent que les résidus 63, 97, 98, 230, 231, 285 et 289, ainsi que la partie
Le PAF ("platelet-activating factor", l-0-aIkyl-2-acétyl-5n-glycéro-3-phosphochoIine) est un médiateur biologique puissant exerçant ses effets sur une grande variété de cellules et de tissus.
Ce médiateur phospholipidique a été découvert durant des recherches simultanées sur un facteur
dérivé du sang de lapins en anaphylaxie qui activait les plaquettes et sur un lipide polaire endogène du rein abaissant la pression sanguine (Hanahan,1986). Une hétérogénéité moléculaire du PAF a pu être observée à la position ^n-l. Le groupement alkyle 16:0 est prédominant, mais des chaînes
de 18:0, 17:0 et de 18:1 sont aussi retrouvées. La signification biologique de cette hétérogénéité
est inconnue, cependant, la chaîne 16:0 démontre la plus grande activité biologique (Hanahan,
1986). Le PAF est unique dans son rôle de phospholipide fonctionnant comme médiateur
intercellulaire, et de plus, peut agir comme messager intracellulaire.
11 existe deux voies de synthèse du PAF, "The remodeling pathway" et la voie "de novo ".
La première implique le remodelage des phospholipides membranaires de la cellule et semble plus
importante dans les réponses inflammatoires et allergiques (Venable et al., 1993). Cette voie ne
génère que peu de PAF dans les cellules au repos. La synthèse est initiée par une phospholipase
Aj (PLAj) spécifique à l'acide arachidonique (AA). 11 a été proposé que la PLAj hydrolyse le
phospholipide l-(9-alkyl-2-arachidonoyl-^«-glycéro-3-phosphocholine générant le
l-O-alkyl-2-lyso-j/i-glycéro-3-phosphocholine (lyso-PAF) et l'AA. L'AA peut ensuite être convertie en
prostaglandines, thromboxanes et leukotriènes, collectivement nonunés éicosanoides , possédant
aussi diverses actions biologiques puissantes. Le lyso-PAF est acétylé par l'acétyl coenzyme
A:lyso-PAF acétyltransférase pour donner le PAF. Cette voie de synthèse amène donc la
formation de deux classes de lipides biologiquement actifs, reliés dans plusieurs cas par des voies
métaboliques communes et des mécanismes effecteurs similaires.
acétylé par la l-0-alkyl-5/i-gIycéro-3-phosphate:acétyl coenzyme A acétyl transférase. L'enzyme l-0-alkyI-5n-glycéro-3-phosphate phosphohydrolase produit le l-0-alkyl-2-acétyl-5/z-glycérol qui peut être converti en PAF par une CDP-cholinephosphotransférase insensible au dithiothréitol. Les enzymes impliquées dans cette voie de synthèse sont apparamment actives de façon constitutive et semblent être régulées par la disponibilité du substrat (Venable et al., 1993).
Le PAF résultant de ces voies de synthèse est dégradé en un produit inactif par une famille de phospholipases, les PAF acétylhydrolases. Cette activité est retrouvée dans une variété de
cellules et tissus, ne requiert pas de Ca^'^, et catalyse l'hydrolyse des groupements sn-2 acyle courts seulement (Stafforini et al., 1987). Après l'inactivation du PAF par une acétylhydrolase, le lyso-PAF résultant est réacylé par une des trois routes possibles: une acyltransférase CoA-dépendante,
une transacylase dépendante ne requérant pas de Mg^^, ni d'ATP, ou une transacylase
CoA-indépendante. La dernière voie prédomine dans les cellules au repos, cependant, les trois voies semblent participer suite à une stimulation (Robinson et al., 1985).
Le PAF fut découvert comme étant un médiateur soluble retrouvé dans une variété de
liquides physiologiques. Il apparaît donc que certaines cellules sécrètent le PAF après sa synthèse.
Cependant, les cellules endothéliales ne sécrètent que peu, ou pas, du PAF qu'elles synthétisent
(Mcintyre et al., 1985). Il semble que le pourcentage de PAF sécrété varie dramatiquement dans
différentes cellules et sous différentes conditions (Lynch et Henson, 1986). Un des mécanismes par lequel le PAF exerce ses actions après sa synthèse se retrouve chez les cellules endothéliales, et
peut-être d'autres cellules, où le PAF reste associé à la surface cellulaire, se rendant disponible
comme messager intercellulaire (Vercelloti et al., 1989). Chez les cellules endothéliales activées, la
P-sélectine est rapidement exprimée à la surface où elle accroche les leucocytes circulant au
passage. Simultanément, le PAF est transféré de la surface des cellules endothéliales à celle desneutrophiles, activant ces derniers. Un mécanisme similaire a été décrit pour l'adhésion des
plaquettes aux neutrophiles, le PAF à la surface des neutrophiles activant les plaquettes (Zhou et
La localisation intracellulaire de la synthèse du PAF n'a pas encore été clairement déterminée. Cependant, la PLA2 de haut poids moléculaire, initiant probablement la synthèse du PAF, est cytosolique dans les cellules au repos et se déplace vers une membrane intracellulaire
non-identifiée en réponse au calcium. Les autres enzymes imphquées dans la synthèse du PAF sont localisées dans le réticulum endoplasmique et, peut-être, dans d'autres organites intracellulaires (Venable et al., 1993). Lors d'expériences de marquage métabolique, le PAF apparaît d'abord dans la fraction phagolysosomale ou dans le réticulum endoplasmique, tout dépendant du stimulus, pour être ensuite transféré à la membrane plasmique (Venable et al., 1993). Le PAF doit donc être transporté de son heu de synthèse à la membrane plasmique pour sa sécrétion ou pour son expression à la surface cellulaire. Ce transport pourrait s'exécuter selon au moins deux mécanismes possibles. Une protéine de transport spécifique pomrait déplacer le PAF entre les membranes, comme c'est le cas pour d'autres phospholipides. Une fois rendu à la membrane plasmique, le PAF exécuterait un "flip" pour se retrouver à la siuface cellulaire. Ce scénario est appuyé par l'existence d'une protéine de transport sélective au PAF, induite durant la
différenciation (Lumb et al., 1990). De façon altemative, le déplacement du PAF d'un organite
intracellulaire à la membrane plasmique pourrait avoir lieu par fusion de vésicules de lipides. En
effet, le PAF synthétisé par les neutrophiles se retrouve dans des vésicules similaires à ceUes impliquées dans le recyclage des membranes (Riches et al., 1990). Cette dernière altemative est attrayante puisqu'elle constitue le mécanisme de sécrétion et/ou d'expression à la surface ceUulaire
de plusieurs composés.
Le PAF exerce plusieurs actions en plus d'activer les plaquettes. Il agit dans les processus
physiologiques normaux comme l'inflammation, l'hémostase et dans plusieurs aspects de la
reproduction. Cependant, son rôle dans la médiation de réponses pathologiques incluant l'asthme,
1 ischémie, les allergies et le choc septique en ont fait le focus de recherches intenses. In vitro, le
macrophages, et peut aussi stimuler la glycogénolyse dans le foie perfusé (Venable et al., 1993). In vivo, le PAF cause une augmentation de la perméabilité vasculaire, l'hypotension, une diminution
du volume cardiaque, la stimulation de la contraction utérine, des désordres gastrointestinaux, la bronchoconstriction aigu, et l'adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales. Le PAF est retrouvé chez des patients subissant un choc septique, et des antagonistes du récepteur du PAF
amènent une protection significative dans des modèles animaux de septicémie. Plusieurs
symptômes de septicémie peuvent être induits par l'administration de PAF. Ces effets sont médiés
^ 12 9
à de faibles concentrations variant de 10' à 10' M. Le PAF peut aussi être important dans
l'inflammation des poumons puisque son administration induit l'œdème et des symptômes
caractérisitques de l'asthme (Venable et al., 1993). Plusieurs évidences suggèrent l'imphcation du PAF dans les maladies coronariennes et vasculaires (Evangelou, 1994).
Suite à l'identification de la structure du PAF, une grande attention fut dirigée à son récepteur spécificique. Certaines observations suggéraient l'existence d'un récepteur du PAF (PAFR) à la surface cellulaire: des exigences strictes de structure et de stéréospécificité pour l'activité biologique du PAF, la découverte d'antagonistes spécifiques, la liaison spécifique et saturable du PAF et d'antagonistes radiomarqués, ainsi que l'activation de systèmes de messagers
secondaires. Un lien chimique alkyl-éther à la position sn-l de la molécule du PAF est nécessaire
pour son activité biologique, et son remplacement par un hen ester amène la perte de cette activité. Le groupement acétyle montre la plus grande activité à la position sn-2, tandis que plus on allonge cette chaîne acyle, moins grande est l'activité. Un groupement phosphorylcholine à la postion sn-3 est crucial à l'activité de la molécule. Le phosphocholine est actif à cette position, et non le phosphoéthanolamine. La chiralité à la position sn-2 est active, tandis que le stéréoisomère (la formeô) est inactive (Snyder, 1989). Il existe trois classes d'antagonistes du PAFR de structures
et puissances variées, incluant les analogues phospholipidiques, les produits naturels (plus
spécialement ceux isolés de chez les herbes), et les composés chimiques synthétiques (Braquet et
outil expérimental pour les études de liaison à ce récepteur, puisque contrairement au PAF, il est métaboliquement stable et la liaison non-spécifique est faible. Des sites de liaison spécifiques au PAF ont été démontrés sur les plaquettes, les neutrophiles, les éosinophiles, les macrophages, les monocytes, les cellules de Kupffer, les cellules de muscles lisses, les cellules endothéliales
vasculaires, les cellules épithéliales de trachée, et dans différents tissus comme, entre autres, les poumons, le foie, le cerveau, la rétine, l'iris et l'utérus (Chao et Oison, 1993).
Les tentatives de purification du PAFR ont rencontré plusieurs difficultés. Premièrement, le PAF est un phospholipide et s'incorpore facilement dans les micelles, et montre une haute haison
non-spécifique. Le deuxième problème est que les cellules cibles du PAF ne possèdent seulement que quelques centaines à quelques milliers de récepteurs. De plus, aucun antagoniste ne se prête à
la fabrication d'une colonne d'affmité. Quelques essais de purification du récepteur ont été
effectués employant des colonnes de chromatographie conventionnelles. De ces travaux ressortirent des protéines de plusieurs masses moléculaires (52, 160, 180, et 220 kDa) réclamant le titre de
récepteur du PAF (Schukla, 1992). Heureusement, le groupe de Shimizu (Honda et al., 1991) clona le PAFR de cobaye en utihsant le système des oocytes de Xenopus laevis. Les oocytes ont une machine de traduction très efficace et sont capables d'effectuer les modifications post-traductionnelles, et de transporter les protéines nouvellement formées aux compartiments cellulaires appropriés. De plus, le système d'oocytes offrait l'avantage que les récepteurs liés au métabohsme des Pis par une protéine G peuvent être détectés par un courant vers l'intérieur ("inward")
imphquant un canal d'ions Cl dépendant du Ca^^. Les oocytes montrèrent un courant vers
l'intérieur prédominant lorsque stimulés au PAF 10^ M après trois jours d'incubation suite à
l'injection d'ARNm de poumons de cobaye. Une banque de cDNA fractionnée selon la taille fut construite à partir d'ARNm de poumons de cobaye. Des cRNA de dix fractions de 30 000 clones indépendants ont été injectés dans les oocytes et analysés par électrophysiologie. Les fractions
leucocytes (Nakamura et al., 1991; Kunz et al., 1992), de cellules HL-60 (Ye et al., 1991), du
coeur (Sugimoto et al., 1992), de cellules EoL-1 (Izumi et al., 1995) et d'une banque d'ADN génomique (Chase et al., 1993). Tous les cDNAs humains montrent la même séquence dans la
région codante, cependant deux régions 5' non-codantes ont été obtenues (Mutoh et al., 1993).
Un cDNA pour le PAFR de rat a aussi été cloné (Bito et al., 1994). Les PAFR humain et de
cobaye comportent 342 acides aminés, mais les récepteurs du rat et de la souris ont un acide aminé en moins dans la troisième boucle extraceUulaire. Le poids moléculaire calculé est d'environ 39000. Les analyses d'hydrophobicité indiquaient la présence de sept domaines transmembranaires (DTMs) caractéristiques de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs).
Le clonage d'un grand nombre de récepteurs et de canaux ioniques a révélé que plusieurs de ces protéines membranaires critiques peuvent être regroupées en superfamilles de gènes basées sur des similarités de séquence et de structure. Une de ces superfamilles est celle des RCPGs. Même si les mécanismes de transmission de signal ne sont pas connus pour tous les membres de cette famille, dans la plupart des cas la stimulation du récepteur induit l'activation d'une protéine G. En 1982, la séquence d'acides aminés complète de la rhodopsine bovine fut déterminée
(Ovchinnikov et al., 1982). Sa structure prédite, contenant une partie N-terminale et sept hélices a
transmembranaires (Hargrave et al., 1983) était remarquablement similaire à celle précédemment
identifiée par diffraction d'électrons et l'analyse de la séquence de la bactériorhodopsine (Probst et
al., 1992). Le clonage subséquent de quatre opsines humaines (Nathans et Hogness, 1984;
Nathans et al., 1986) et du récepteur p-adrénergique de hamster (Dixon et al., 1986) montrèrent aussi ces caractéristiques stracturales qui devinrent le sceau de cette famille de récepteurs. Plus
d'une centaine de RCPGs ont été clonés, et ce nombre augmente rapidement. Le clonage de ces
récepteurs permit l'expression à haut niveau de leur protéine dans des lignées cellulaires, facilitant
leur caractérisation pharmacologique. L'altération de leur séquence par des techniques de biologie
moléculaire a procuré en grande partie les connaissances actuelles sur le rôle fonctionnel de régions
Les RCPGs sont composés que d'une seule chaîne polypeptidique. La structure prédite de
ces protéines contient sept segments de 20 à 30 acides aminés hydrophobes formant
vraisemblablement des hélices a transmembranaires. Ces héUces sont référées comme étant les
domaines transmembranaires 1 à 7 (DTMl à DTM7). Cette structure prédite, basée sur
l'hydrophobicité, est appuyée par des analyses de diffraction d'électrons de la bactériorhodopsine (Henderson et al., 1990) et des études de digestions protéolytiques de la rhodopsine et du récepteur
pj-adrénergique (Hargrave et al., 1982; Dohlman et al., 1988), ainsi que par l'utilisation d'anticorps contre les différents domaines intra- et extracellulaires du récepteur p-adrénergique (Savarese et Fraser, 1992). Les RCPGs ont une partie N-terminale extracellulaire et une partie
C-terminale cytoplasmique.
Les régions de plus grande homologie parmi les RCPGs se retrouvent dans les DTMs
(Probst et al., 1992). Certains résidus sont présents dans presque tous les RCPGs et pourraient être imphqués dans la structure tertiaire requise pour l'activité du récepteur (Hibert et al., 1991). Plusieurs Pro dans les DTM4,5 ,6 et 7 sont particulièrement bien conservées. Ces acides aminés
introduisent probablement des torsions ("kinks") dans les hélices a et pourraient être importants
dans la formation du site de liaison ("binding pocket") (Hibert et al., 1991). Parmi d'autres acides aminés bien conservés, on retrouve une Gly, une Asn et une Val dans le DTMl; une Leu, deux Ala
et un Asp dans le DTM2; une Ile dans le DTM3; une Trp dans le DTM4; une Phe et une Trp dans le
DTM6; et une Asn et une Tyr dans le DTM7 (Probst et al., 1992). Certains résidus conservés sont
remplacés dans des sous-familles particulières de RCPGs. Par exemple, la Trp du DTM6 est
substituée par une Met dans les récepteurs des hormones glycoprotéiques (Probst et al., 1992).
La plupart des RCPGs ont une Cys conservée dans chacune des deux premières boucles
prononcée la fonction de la rhodopsine et des récepteurs muscariniques et p-adrénergiques (Savarese et Fraser, 1992). La séquence intracellulaire la plus hautement conservée est le tiiplet Asp-Arg-Tyr (DRY) adjacent au DTM3. L'Aig de ce triplet est invariable, tandis que l'Asp et la Tyr sont substituées de façon conservative dans plusieurs RCPGs (Probst et al., 1992). La partie
N-terminale de ces récepteurs varie grandement en termes de taille. Elles vont de 7 acides aminés
chez le récepteur adénosine A2 jusqu'à 300 résidus chez les récepteurs d'hormones glycoprotéiques. Il y a en général peu d'homologie de séquence parmi les RCPGs entre leurs parties N-terminales. On retrouve la séquence consensus de glycosylation N-X-S/T dans ce premier domaine extracellulaire de presque tous les RCPGs. La glycosylation peut contribuer à l'expression adéquate de ces protéines membranaires (Savarese et Fraser, 1992). Certains
récepteurs arborant de courtes parties N-terminales, comme les récepteurs a2B-adrénergiques et adénosine Al et A2, ne contiennent pas de site de glycosylation N-terminal (Probst et al., 1992).
La compréhension de la structure du site de liaison des RCPGs et des acides aminés
interagissant avec les agonistes et les antagonistes évolue rapidement. Les sites de liaison de la rhodopsine et des récepteurs adrénergiques et muscariniques ont été partiellement déterminés par des approches biochimiques et de biologie moléculaire (Savarese et Fraser, 1992). Pour la majorité des RCPGs, sauf pour les récepteurs des hormones glycoprotéiques, le site de liaison
semble être formé par les DTMs. Comme encore aucun RCPG n'a été cristallisé, la modéhsation en trois dimensions de l'arrangement des hélices a est basée sur la structure de la
bactériorhodopsine, qui a été déterminée à haute résolution (Henderson et al., 1990). Cependant, une étude comparative de cartes de projection d'électrons ("projection map") à basse résolution a montré une inclinaison différente des DTMs de la rhodopsine et de la bactériorhodopsine (Schertler
et al., 1993).
liaison a été analysé par le model de roue en hélice ("helical wheel"). Les hélices a contiennent 3.6 acides aminés par tour d'hélice (Probst et al., 1992). La localisation des résidus autour de l'hélice pour plusieurs RCPGs suggère que les DTMs contiennent une prédominance d'acides aminés hydrophobes sur un côté, et hydrophiles sur l'autre côté (Donnelly et al., 1989). Le côté hydrophile de chaque hélice est postulé comme faisant face vers l'intérieur et formerait le site de
liaison polaire pour le hgand ("binding pocket"). Cette disposition semble appuyée par des
modèles informatiques d'interactions ligands-récepteurs (Hibert et al., 1991).
Dans les récepteurs a- et p-adrénergiques, ainsi que pour le récepteur ml muscarinique, la mutagénèse dirigée a montré que l'Asp conservé du DTMS est critique pour la liaison des agonistes et antagonistes (Wang et al., 1991). Les aminés cationiques, incluant l'adrénaline, la
noradrénaline, la dopamine, la sérotonine et l'acétylcholine, contiennent toutes un groupe aminé chargé positivement interagissant vraisemblablement avec l'Asp du DTMS de ces récepteurs. Des
études de mutagénèse ont aussi suggéré que certains résidus conservés dans des sous-classes de
récepteurs peuvent contribuer à la spécificité d'interaction avec l'agoniste. Deux Ser conservées dans le DTMS seraient imphquées dans la formation de ponts hydrogènes entre les récepteurs P-adrénergiques et leurs agonistes. La substitution de chaque Ser par une Ala réduit la liaison de l'agoniste au même point que l'enlèvement du groupe hydroxyle du ligand (Strader et al., 1989a). Le récepteur a2-adrénergique interagirait de façon semblable avec les ligands adrénergiques (Wang et al., 1991). Deux Ser correspondantes sont dans le DTMS de tous les récepteurs de la dopamine et ime seule Ser conservée est retrouvée dans le DTMS des récepteurs de la sérotonine. La
similarité de structure du hgand et de la séquence de ces récepteurs suggèrent que ces Ser
formeraient aussi des liens hydrogènes avec le groupe hydroxyle de leur agoniste respectif (Probst
et al., 1992). Les récepteurs muscariniques contiennent tous une Asn conservée dans le DTM6,
absente de chez d'autres sous-classes de RCPGs, proposée comme interagissant avec le groupe
DTM6 et DTM7 des récepteurs adrénergiques et de la sérotonine pourraient interagir avec les
anneaux aiyles de leurs ligands (Dixon et al., 1988; Hibert et al., 1991).
Les hormones glycoprotéiques, telles que la TSH, la FSH et la LH/CG, sont beaucoup plus grosses que la plupart des ligands des autres RCPGs. Pour cette raison, la sous-classe de RCPGs pour ces hormones auraient évolué vers une structure distincte contenant un premier domaine extracellulaire extrêmement long, comportant le site de liaison de l'hormone. Ce domaine extracellulaire glysosylé est riche en Cys pouvant former des ponts disulfures et ainsi aider dans le
maintien de la structure en trois dimensions de la protéine (Sprengel et al., 1990). La locahsation extracellulaine du site de liaison de ces hormones a été confirmée par l'utihsation de récepteurs
chimériques (Nagayama et al., 1991). Au contraire, la liaison du hgand par les récepteurs
P-adrénergiques ne dépend pas du domaine N-terminal extracellulaire (Dixon et al., 1987).
La liaison et l'activation d'un récepteur mutant de la LH/CG dont la partie N-terminale fut presque totalement délétée montra que la CG peut se her à la composante formée par les 7 DTMs du récepteur (Ji et Ji, 1991). Même si cette liaison est de plus basse affinité en absence du domaine
N-terminal, ces données suggèrent que le récepteur peut contenir un site de Maison extracellulaire
de haute affinité et un site de basse affinité dans les DTMs. La liaison de la CG au récepteur
mutant stimule tout-de-même la production d'AMPc. Il est possible que le site de Maison extraceUulaire de haute affinité serve à capter l'hormone et à la présenter au site de Maison
intramembranaire, pour ensuite induire la transmission de signal (Probst et al., 1992).
Les RCPGs sont couplés à différents enzymes intracellulaires, canaux ioniques et transporteurs par l'entremise de protéMies G (Bimbaumer et al., 1990). Les protéines G, qui
s'associent avec les RCPGs à la face intracellulaire de la membrane plasmique, sont composées de
sous-unités a, p et y (Ga, Gp, Gy). Par un mécanisme encore mal connu, la Maison de l'agoniste
au RCPG catalyse l'échange du GDP pour un GTP sur Ga (activation de la protéine G), résultant
en sa dissociation des Gpy et à la stimulation d'une ou plusieurs voies de signalisation (Bimbaumer
et al., 1990). Les Ga libres ont été initialement montrées comme activant deux enzymes efîectrices, l'adénylate cyclase et la GMPc phosphodiestérase, et il semblait raisonnable à ce moment d'assumer que Ga contrôlait directement l'activité de toutes les enzymes effectrices. Le rôle assigné aux GPy était de mettre fin à l'action des Ga en reformant le complexe hétérotrimérique inactif, et de guider les Ga auprès du récepteur pour la réactivation (Clapham et Neer, 1993). Ce point de vue changea en 1987 par l'observation de la régulation d'une enzyme effectrice par les Gpy (Logothetis et al., 1987). Depuis ce temps, la liste des enzymes régulées par les Gpy ne cesse de s'allonger, et jusqu'à présent, autant d'enzymes effectrices sont connues comme étant régulées par les Gpy que les Ga (Clapham et Neer, 1993).
La spécificité de transmission de signal peut être déterminée par la spécificité de couplage
entre un récepteur et les protéines G. Trois types de travaux, détaillés plus loin, étudiant la relation
entre la structure du récepteur et l'affinité pour la protéine G ont été effectués. La mutagénèse
dirigée et par délétion impliquent certains acides aminés et régions nécessaires pour le couplage à la protéine G. Des études de compétition avec des peptides synthétiques suggèrent les domaines oligopeptidiques pouvant interagir directement avec la protéine G. L'emploi de chimères indiquent les régions des récepteurs déterminant la spécificité de couplage à la protéine G. Certains principes
généraux se dégagent de ces multiples approches. Tous les domaines intracellulaires de divers
récepteurs sont impliqués dans le couplage efficace à la protéine G. De courtes séquences des régions adjacentes à la membrane plasmique de la troisième boucle intracellulaire, et possiblement de la queue carboxyterminale, apparaissent particulièrement critiques pour déterminer la spécificité
de couplage à la protéine G de plusieurs RCPGs (Probst et al., 1992).
La mutation d'acides aminés dans les boucles cytoplasmiques du récepteur p-adrénergique réduit la transmission de signal (Dixon et al., 1988). La mutagénèse dirigée d'une Pro conservée en Thr dans la 2e boucle intracellulaire ne cause aucun changement dans la liaison de l'agoniste au
récepteur, mais amène une réduction d'environ 35% de stimulation de l'adénylate cyclase (O'Dowd et al., 1988). La mutagénèse dirigée a identifié des acides aminés chargés dans les régions adjacents à la membrane plasmique de la 2e et 3e boucles contribuant au couplage efficace à la protéine G. La mutation de l'Asp hautement conservé adjacent au DTM3 dans la 2e boucle intracellulaire du récepteur P-adrénergique (Aspl30) produit un récepteur de haute affinité pour le hgand mais un couplage réduit ou absent à la protéine G (Fraser et al., 1988). Des résultats similaires ont été obtenus pour les récepteurs muscariniques ml et adrénergiques (Savarese et
Fraser, 1992). Le Glu retrouvé à la position correspondante dans la rhodopsine est impliqué de la même façon dans l'interaction avec la transducine (Franke et al., 1990). L'Asp du DTM2, conservé dans presque tous les RCPGs, est déterminante dans l'affinité de liaison du hgand et
l'activation de la protéine G de plusieurs RCPGs (Sealfon et al., 1995). Dans les récepteurs a2-adrénergiques et de la dopamine, cet Asp est essentiel pour la modulation du couplage du récepteur par les ions Na^ et H'^, possiblement dû à la modulation allostérique de la conformation du récepteur (Neve et al., 1991). Une Cys du DTM6, conservée dans la plupart des RCPGs, semble être impliquée dans la transmission de signal par le récepteur p-adrénergique (Savarese et Fraser,
1992).
Des études de mutagénèse par délétion du récepteur P2-adrénergique indiquent que les
régions proximales à la membrane de la 3e boucle intracellulaire sont nécessaires à la transmission
de signai par ce récepteur (Strader et al., 1987). Dans le récepteur al-adrénergique, la délétion de
7 acides aminés de la 3e boucle intracellulaire adjacents à la membrane cause une réduction marquée dans le couplage à la phospholipase C (Cotecchia et al., 1990). Des délétions d'acides aminés de la queue cytoplasmique adjacents au DTM7 produisent des récepteurs mutants ayant une
capacité réduite d'activer la protéine G (Savarese et Fraser., 1992). La mutation d'une Cys
palmitylée de la queue cytoplasmique réduit grandement la stimulation de l'adénylate cyclase par le
récepteur P2-adréndergique (O'Dowd et al., 1989). Cette Cys palmitylée pourrait attachée la queue
cytoplasmique du récepteur à la membrane, produisant une 4e boucle intracellulaire. Cet ancrage à
la membrane placerait possiblement les acides aminés de la queue cytoplasmique pour une interaction optimale avec la protéine G (Ovchinnikov et., 1988). La palmitylation de la Cys
correspondante de certains autres RCPGs peut diminuer le couplage du récepteur à ces voies
effectrices, diminuer la vitesse d'intemalisation du récepteur, ou tout simplement ne pas avoir
d'effet détectable (Bouvier et al., 1994). Les régions de la queue cytoplasmique et de la 3e boucle intracellulaire adjacentes à la membrane pourraient former des hélices a amphipatiques regroupées. Ces hélices, ainsi que les acides aminés chargés de la 2e et 3e boucles intracellulaires, interagiraient de façon coopérative pour lier et activer la protéine G (Palm et al., 1990). L'activation de protéines
G par des hélices a amphipatiques est appuyée par des expériences dans lesquelles les protéines Gj
et Gq ont été directement activées par le mastoparan et d'autres petits peptides formant des hélices a amphipatiques à la surface intracellulaire de la membrane plasmique (Higashijima et al., 1990). De plus, l'activation directe de la Gg fut démontrée par des peptides synthétiques représentant les séquences de la 3e boucle intracellulaire adjacentes aux DTM5 et DTM6 du récepteur
P2-adrénergique (Cheung et al., 1991).
Des expériences de compétition dans lesquelles de courts peptides lient de façon
compétitive les protéines G, sans toutefois les activer, ont été utiles pour déterminer les régions des
RCPGs contactant vraisemblablement les protéines G. Le découplage du récepteur suite à une
mutation ou une délétion d'un segment peut être dû à une perte de contacts avec la protéine G ou à
une altération de la structure tertiaire des récepteurs. L'apport des études de compétition a donc été
d'une grande valeur pour confmner que la perte de transmission de signal observée suite à une
mutation ou à une délétion implique des acides aminés interagissant directement avec la protéine G
(Probst et al., 1992). Les régions de divers récepteurs impliquées dans des études de compétition
par des peptides incluent, entre autres, les régions adjacentes à la membrane des trois boucles
intracellulaires et de la queue cytoplasmique du récepteur p-adrénergique (Munch et al, 1991), la
2e boucle intracellulaire et la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire du récepteur
cc2A-adrenergique (Dahlman et Neubig, 1991), et la 2e et 3e boucles intracellulaires, ainsi que la région
N-terminale de la queue cytoplasmique de la rhodopsine (Konig et al., 1989). Des résultats
similaires sont obtenus par l'emploi de récepteurs chimériques (Probst et al., 1992).
La phosporylation de résidus cytoplasmiques a été identifiée comme un mécanisme
important de la régulation du couplage de la protéine G à certains RC^Gs (Prémont et al., 1995).
La 3e boucle intracellulaire et la queue cytoplasmique sont riches en résidus Ser et Thr constituantdes sites potentiels de phosphorylation. Les kinases des RCPGs (GRKs) forment une famille de
sérine/thréonine kinases qui phosphorylent seulement les RCPGs en conformation active, i.e. dans
la forme hée à l'agoniste (Prémont et al., 1995). Les récepteurs phosphoiylés par une GRK deviennent la cible pour la Maison d'une protéine nonunée "arrestine". L'arrestine hée à un récepteur phosphorylé par une GRK empêche le couplage du récepteur à la protéine G. La spécificité de substrats des GRKs est encore mal connue et a été déterminée surtout par des essais in vitro de phosphorylation de récepteurs purifiés, ou dans des systèmes de surexpression
(Prémont et al., 1995). Ces sites de phosphorylation peuvent être aussi le substrat des protéines
kinases A ou C impliquées dans la désensibilisation homologue et hétérologue des RCPGs
(Prémont et al., 1995).
Plusieurs études ont montré que les signaux induits par le PAF imphquent l'activation de
protéines G. La Maison du PAF à son récepteur stimule l'activité GTPase (Hwang et al., 1986).
Le GTP et ses analogues stables causent des déplacements d'affinité de la Maison du PAF (Hwang
et al., 1986). Le type de protéines G impliqué dans les réponses au PAF peut varier selon le type
ceMulaire et le système effecteur étudiés. Il a été montré que dans les ceUules CHO, le PAFR est
couplé à une Gai ou Gccq (Izumi et al., 1995), ainsi qu'à tme Goo (van Biesen et al., 1996). Le
couplage du PAFR aux Gos, Gail, Gai2 et Goo fut observé dans la Mgnée ceMulaire neurohybride
NCB-20 (Yue et al., 1992).les plaquettes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les lignées de
lymphocytes B, les cellules de muscles lisses, les hépatocytes, les cellules de Kupffer, les kératinocytes, les astrocytes et plusieurs autres types cellulaires (Chao et Oison, 1993). Cette voie
d'activation est médiée par la PLC, et deux produits en sont générés, l'inositol 1,4,5-triphosphate
(IP3) et le diacylglycérol. L'IP3 mobihse le Ca^^ intracellulaire et le diacylglycérol active la PKC. L'augmentation du Ca^^ intracellulaire induite par le PAF est principalement due à l'influx de Ca^^ extracellulaire, plutôt que de la mobilisation intracellulaire du Ca^^ dépendante de riP3. Les
mécanismes de cet influx demeurent à déterminer (Chao et Oison, 1993). Le PAF active la PLC
par le couplage à une protéine G sensible ou insensible à la toxine de pertussis, dépendant du type cellulaire (Izumi et al., 1995). Un autre mécanisme possible de l'activation de la PLC par le PAF est par l'entremise de sa phosphorylation par des protéines tyrosines kinases (PTKs).
L'implication de PTKs dans l'activation de la PLCy par le PAF a été proposée dans les plaquettes et les cellules A431 (Thurston et al., 1993). Des travaux récents ont clairement montré que le PAF induit la phosphorylation de Tyr et l'activation de la PLCy dans une hgnée de lymphocytes B
(Kuruvilla et al., 1994).
Par l'activation de la PLA2, le PAF stimule le relâchement de l'AA et des éicosanoides dans
divers tissus et cellules (Chao et Oison, 1993). Cette production d'éicosanoides semble jouer un rôle important dans la vasoconstriction coronarienne et la contactilité du coeur, la bronchoconstriction, l'aggrégation et l'activation des neutrophiles (Izumi et al., 1995). Le PAF active la PLA2 par un mécanisme dépendant de la PKC, régulé par le niveau intracellulaire de l'AMPc (Chao et al., 1990). Le PAF a été montré comme stimulant la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) dans les neutrophiles (Stephens et al., 1993) et dans une lignée de lymphocytes B (Kuruvilla et al., 1994). Le rôle biologique de la PI3K dans la signalisation du PAF reste à
élucider (Izumi et al., 1995). Le PAF stimule aussi la phospholipase D
(PLD) dans plusieurs types
cellulaires (Chao et Oison, 1993). Le Ca^'^, la PKC et l'activité de PTKs semblent impliqués dans
l'activation de la PLD par le PAF (Izumi et al., 1995).Il était connu que les PTKs jouaient un rôle important dans les voies de signalisation des
récepteurs de facteurs de croissance, mais des travaux récents indiquent qu'elles sont aussi impliquées dans la transmission de signal médiée par les protéines G (Marshall. 1995). Des études
employant des anticorps anti-phosphotyrosines ont montré que le PAF induit la phosphorylation sur Tyr de nombreuses protéines cellulaires des plaquettes, des neutrophiles, des cellules A431,
des cellules de Kupffer et des lymphocytes B (Izumi et al., 1995). Quelques unes des bandes phosphorylées ont été identifiées comme suit: lapp60c-src dans les plaquettes et les cellues A431,
la PLCyl dans les plaquettes et les lymphocytes B, la sous-unité régulatrice p85 de PI3K, Fyn et Lyn aussi dans les lymphocytes B, et la MAPK dans les cellules CHO exprimant le récepteur du
PAF. Des inhibiteurs de PTKs, tels que la génistéine et l'erbstatine, inhibent l'activité de la PLC
stimulée parle PAF (Izumi et al., 1995). Ces inhibiteurs bloquent aussi l'activation de la PLD et de la MAPK induite par le PAF dans les cellules CHO transfectées avec le récepteur du PAF (Liu et
al., 1994).
En plus de son rôle de médiateur pro-inflammatoire, le PAF transmet des signaux de
prolifération et de différentiation dans les cellules non-inflammatoires. Le PAF induit
l'excroissance des cellules pheochromocytomes PC12 (Squinto et al., 1989) et régule à la hausse la prolifération des lymphocytes (Leprince et al., 1991). Le PAF induit aussi l'expression des gènes de réponse primaire comme c-fos, c-jun, et TIS-1 dans plusieurs types cellulaires. Ces gènes de
réponse primaire semblent jouer des rôles importants dans la croissance et la différentiation
cellulaires induites par le PAF. Certains de ces effets peuvent être expUqués par l'activation de la MAPK par le PAF. Le PAF induit l'expression de d'autres gènes comme le CRI (un récepteur du fragment C3b du système de complément) chez les neutrophiles, riL-3 chez les cellules
mononucléaires du cordon ombihcal humain, l'IL-l, l'IL-6, le TNF, et riL-2Ra chez les
monocytes (Izumi et al., 1995). Le PAF semble augmenter l'expression du gène de son propre récepteur (Mutoh et al., 1994). L'expression de ces gènes peut jouer un rôle dans l'inflammation.
les réponses immunitaires et le dommage à la cellule induits par le PAF, mais les mécanismes
impliqués restent à mieux caractériser.
La réponse au PAF montre une désensibilisation homologue à des stinvulations répétées ou prolongées au PAF, entre autres, dans les processus suivant: la sécrétion des aminés vasoactifs des plaquettes de lapin, la contraction des muscles lisses de cobaye, l'exocytose des granules des
neutrophiles, l'aggrégation des plaquettes, et le relâchement de la dopamine par la lignée cellulaire
PC-12 (Izumi et al., 1995). Plusieurs réponses cellulaires au PAF sont désensibilisées, comme l'activité GTPase (Homma et Hanahan, 1988), la production d'IP3 (Morrison et Shukla, 1988), la
mobilisation du Ca^^ (Schwertschlag et Whorton, 1988), et la phosphorylation de protéines
(Schukla et al., 1989). Le récepteur du PAF exprimé dans les oocytes de Xenopus laevis, les cellules CHO et les cellules COS, montre aussi une désensibilisation de la production d'IP3 et de
mobilisation de Ca^^ (Honda et al., 1991; Takano et al., 1994).
Des études de désensibilisation hétérologue ont aussi été menées. La phosphoiylation de
protéines induite par le PAF est désensibilisée dans les plaquettes prétraitées à la thrombine, mais le prétraitement au PAF n'influence pas la phosphorylation résultant d'une stimulation à la thrombine (Shukla et al., 1989). Dans la lignée cellulaire LLC-PKl, les cellules stimulées par le PAF ou le 0N011113 (un analogue du TXA2) montrent une désensibilisation hétérologue à l'autre agoniste
(Ueda et al., 1991). La désensibilisation hétérologue de l'influx de Ca^^ produit par le PAF dans
les cellules prétraitées à la bradykinine fut observée, et l'inverse, le prétraitement des cellules avec le PAF affecte la réponse calcique induite par la bradykinine dans les cellules neurohybrides NG108-15 (Izumi et al., 1995). Le PAF désensibilise de façon hétérologue l'activation de la PLC induite par le récepteur du TXA2 chez les plaquettes, mais n'a aucun de ces effets sur les cellules
de muscles lisses vasculaires (Furci et al., 1991). L'absence de désensibilisation hétérologue de la
♦
mobilisation de Ca^^ fut observée dans les cellules NG108-15 entre le PAF et la bradykinine,
l'endothéline, l'angiotensine n et l'ATP (Yue et al., 1991). L'activaticp de l'activité GTPase et lamobilisation du par le PAF sont inhibées par le prétraitement de leucocytes avec le FMLP, le
C5a et l'IL-8 (Tomhave et al., 1994). Il apparaît donc que la désensibilisation hétérologue est régulée par plusieurs mécanismes avec une sélectivité pour différents types de stimulants pouvant
varier selon le type cellulaire.
La PKC semble impliquée dans la désensibilisation de la réponse au PAF. Le prétraitement
de plusieurs types cellulaires avec des activateurs de PKC, comme le PMA et la téléocidine,
désensibilise les signaux induits par le PAF (Chao et Oison, 1993). L'activation de la PKC n'est pas entièrement responsable de la désensibilisation du récepteur du PAF (Dom et Davis, 1992). Le récepteur du PAF exprimé dans les cellules RBL-2H3 est phosphorylé par l'application du PAF,
du PMA ou de l'AMPc dibutyrique. La staurosporine inhibe complètement la phoshorylation du
récepteur par le PMA, mais partiellement celle induite par le PAF. La phosphorylation du récepteur
induite par le PAF et le PMA, mais pas celle causée par l'AMPc dibutyrique, corrèle avec la
désensibilisation du récepteur (Ali et al., 1994). Donc, le récepteur du PAF peut être phosphorylé
par trois types de kinases, la PKA, la PKC et d'autres kinases, probablement du type GRK. Le
PAF fut montré comme activant la PKC et provocant sa translocation à la membrane plasmique
dans divers types cellulaires (Chao et Oison, 1993). Dans les leucocytes humains, le PAF induit la translocation d'une GRK du cytoplasme à la membrane plasmique, et stimule son activité à un plus haut niveau que l'isoprotérénol (Chuang et al., 1992). Puisque l'induction de la translocation
d'une GRK est considérée comme la première étape de la désensibilisation homologue par une GRK (Lefkowitz, 1993), une GRK joue possiblement un rôle dans l'arrêt de la signahsation par le récepteur du PAF. Un récepteur du PAF dont la queue cytoplasmique fut tronquée peut induire
des élévations soutenues d'IP3 et de Ca^^. Des résultats similaires sont obtenus avec un mutant où
les résidus Ser et Thr distaux de la queue cytoplasmique sont mutés en Ala. Ces deux mutants
activent à de plus haut degrés la MAPK, le relâchement d'AA et l'inhibition de l'adénylate cyclase que le récepteur WT. Tandis que la queue cytoplasmique du PAFR n'est pas requise pour
induit par l'agoniste. H a aussi été noté qu'un peptide synthétique de la queue cytoplasmique du
récepteur du PAF est phosphorylé par la GRK2, suggérant qu'une des GRKs peut être impliquée dans la phosphorylation et la désensibilisation homologue de ce récepteur (Takano et al., 1994).
L'ahgnement du récepteur du PAF avec d'autres membres de la famille des RCPGs a montré que plusieurs de ses acides aminés sont hautement conservés (Kajihara et al., 1994).
Parmi ces résidus conservés, on retrouve la Gly28 et l'AlaSS dans le DTMl; la Leu59, l'AlaôZ et l'AspôS du DTM2; la Trp83 et la Cys90 de la première boucle extracellulaire; la Serl04, la Leul08
et l'Ilel 11 du DTM3; l'Aigl 15 de la 2e boucle intracellulaire; la Trpl42 du DTM4; la Cysl73 de la
2e boucle extracellulaire; la Phel95 et rile209 du DTM5; la Glu225 de la 3e boucle intracellulaire;
la Phe241 et la Pro247 du DTM6; l'Asn285, la Pro290 et la Tyr293 du DTM7; et, la Phe308 et la Cys317 de la queue cytoplasmique. Les résidus conservés Cys90 et Cysl73 pourraient former un pont disulfure comme pour d'autres RCPGs (voir plus haut dans cette thèse). Un rôle potentiel des Pro conservées des DTM6 et DTM7 seraient de participer à la formation du site de liaison ("binding pocket"). Même si le PAF contient un groupe choline chargé positivement, l'Asp du DTM3, un présumé "counter ion" pour les ligands cationiques (les catécholamines et
l'acétylcholine), est absent du PAFR.
Le PAFR humain contient un seul site consensus de glycosylation sur Asn (Asnl69) dans la 2e boucle extracellulaire, contrairement au récepteur de cobaye et de rat qui en montrent un de
plus dans l'extrémité N-terminale de la protéine. D a récemment été montré que Streptococcus
pneumoniae utilisait le PAFR pour adhérer et pénétrer les cellules hôtes endothéliales, épithéhales
ou COS transfectées exprimant le récepteur. La progression de l'infection chez le lapin est
diminuée de 90% par le traitement avec un antagoniste du PAFR (Cundell et al., 1995). Le site de
glycosylation sur rAsnl69 augmente l'attachement de la bactérie au PAFR mais n'est pas requis
pour cet interaction (Rodriguez et al., 1995). Ce site de glyeosylation est cependant nécessaire
et l'activation du récepteur (Rodriguez et al., 1995).
Très peu d'information existe sur les déterminants de la fonction et de la structure du
PAFR. Mon projet de doctorat consistait donc à déterminer des résidus pouvant influencer l'affinité du PAFR pour son ligand ainsi qu'à identifier des acides aminés pouvant participer au
couplage de ce récepteur à la protéine G, ou à la transition du récepteur vers un état de conformation active suite à la liaison de l'agoniste. Dans un premier temps, nous avons donc cherché à muter des résidus de la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire du récepteur dans le but éventuel d'intervenir dans le couplage du récepteur à la protéine G et/ou d'obtenir un mutant
constitutivement actif. Les résultats de ces travaux sont retrouvés dans le premier article présenté dans cette thèse (Chapitre II). D'autre part, nous voulions étudier le rôle du résidu Asp63 du 2e DTM de ce récepteur, qui constitue un acide aminé conservé dans 98 % des RCPGs à cette position
(Probst et al., 1992) (Chapitre III). Nous étions également intéressés à connaître le rôle des
résidus Phe97, Phe98, Asn285 et Asp289; ces points se retrouvent dans le Chapitre IV où l'on
discute de ces données en relation avec un modèle moléculaire en trois dimensions du site de
n. ARTICLE
Mutations of two adjacent amino acids generate inactive and constitutively active forms of the human platelet-activating factor receptor.
(Parent, J.L., G. Le Gouill, A.J. de Brum-Femandes, M. Rola-Pleszczynski et J.
M USjL
Mutations of Two Adjacent Amino Acids Generate Inactive and
Constitutively Active Forms of the Human Platelet-activating
Factor Receptor*
(Received for publication, November 6, 1995, and in revised form, January 24 1996)
Jcm-Luc Parent, Christian Le GouiUt, Artur J. de Brum-Femandes§, Marek Rola-Pleszczynski
and Jana Stankovàl
From the Immunology Division, Department of Pediatrics and the hRheumatic Diseases UnU, Department of Medicine
Facuity ofMedicine. Unioersity of Sherbrooke, Sherbrooke. Québec. JIH 5N4 CanadaWe have mutated two residues, Ala*^ and Leu^', in
the C-terminal portion of the third intracellular loop of the h^an platelet-activating factor (PAF) receptor into
Glu"® and Arg"\ respectively. The Leu"' — sub
stitution led to two major modifications: 1) increased
consUtutive activity of the PAF receptor resulting in agonist-independent production of inositol phosphates
and 2) increased afîinity of the receptor for binding PAF
(agonist) but not WEB2086 (antagonist). The L231R mu tant was able to adopt at least two conformations; (i) a
higher affinity state than the corresponding state of the wBd-type receptor (WT), dépendent on G protein
cou-pling, and (ii) a low afïïnity state, higher than the one for the uncoupled WT receptor. The Ala"® — Glu"® substi tution also resulted in two major modifications: 1)
unre-sponsiveness in terms of phosphatidylinositol
hydroly-sis in response to PAF and 2) a marked decrease in afïïnity of the receptor for binding the agonist but not the antagonist. Compétition binding studies of transient receptor expression in COS-7 cells and the inability of
guanosine 5'-0-(3-thiotriphosphate) to modulate the de
crease in affinity of a stable A230E mutant in Chinese
hamster ovary cells suggest an inhérent low affinity '^®'^^'™ation for this mutant. Altematively, mutation of
Ala to Gin"® suggested that the residue 230 has a
fondamental effect on receptor affinity and its charge is determnant in G protein coupling of the PAF receptor.
In this report, we show that substitution of two
imine-diately adjacent residues of the PAF receptor, Ala"® and
Leu"', surprisingly leads to an inactive and a constitu
tively active phenotype, respectively. These results
fur-ther support the concept of constitutively active G
pro-tein-coupled receptors as adoptîng "active" state conformations similar to those induced by agonist bind
ing to WT receptors.
Platelet-activating factor (PAF),' identified as
1-O-alkyl-sn-* This work was supported in part by the Médical Research Councfl of
Canada. The costs of publication of this article were defrayed in part by the paymcnt of page charges. This article must therefore be hereby marked 'advertisement" in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
î Supported by a studentship from Fonds pour la Formation de Cher
cheurs et l'Aide à la Recherche.
1 To whom correspondence should be addressed: Immunology Div., Facuity of Medicine. University of Sherbrooke, 3001 North 12th Ave.,
Sherbrooke, Québec, Canada. JlH 5N4. Tel: 819-564-5268- Fax:
819-564-5215.
' The abbreviations used arc: PAF. platelet-activating factor, G pro-tem, GTP-binding regulatoiy protein; GTP-yS, guanosine 5'-0-j(3-thio-triphosphate); IP. inositol phosphate; R, inactive receptor conformation; R . active receptor conformation; WT. wild-type.
glycero-3-phosphocholine, is a phospholipid released from
stim-ulated basophils. platelets, macrophages, polymorphonuclear
neutrophils, and other cell types (1). PAF is a potent mediator with numerous biological activities related to inflammatoiy
and immime responses, as well as cardiovascular, reproduc tive, respiratoiy, and nervous System physiology (1, 2). PAF
exerts its action by binding to a spedfic, high affinity receptor
on the target cell surface. This receptor is stereosi)edfic and
PAF -dépendent cellular responses can be inhibited by a variety
of structurally distinct PAF antagonists (2). PAF binding has been found on several cell types and cDNA cloning from varions sources revealed that the PAF receptor belongs to the G pro-tein-coupled receptor superfamily (3-7). The PAF receptor cou ples with varions second mcssenger Systems, including
phoe-pholipases A, C, and D activation (8-10) and activation of the
mitogen-activated protein kinase cascade (9, 11-13).
For the majority of the G protein-coupled receptors studied
so far, the Ugand-binding pocket appears to be formed by the
transmembrane domains of the peptide chain, whereas the
coupling to spécifie G proteins seems to be mediated by the
intracellular loops, predominantly by the third intraceDular
loop, and especially those régions io close proximity to the
inner surface of the plasma membrane (Hefr. 14-16, and
ref-erences therein). Recently, it has been reported that
site-di-rected mutagenesis of spécifie residues in the C-terminal por tion of the third intracellular loop of the a,, a^, and adrenergic receptors constitutively activate these receptors
(14-16). We were interested in defining a région involved in G protein interaction with the PAF receptor. In addition, we
wished to ascertain whether the constitutively active receptor forms induced by mutations in the third intracellular loop of
the adrenergic receptor family could also be generated in a G protein-coupled receptor for a lipid ligand. Finally, the oîm of
this work was to develop a tool for screening inverse agonists for this receptor as potentiel therapeutic agents in PAF
patho-physiology. We report that the Ala"® -► Glu"® and Leu"' -► Arg"' substitutions resuit, respiectively, in an inactive and a constitutively active PAF receptor.
MATERIALS AND METHODS
Construction of Mutant Receptor cDNAs and Expression Vectors—
Tbe PAF receptor cDNA derived from Kpl32 (a generous gift from Dr.
Richard Ye. The Scripps Research Institute, La JoUa, CA) (6) was subcloned into the pRc/CMV expression vector (Invitrogen). Mutated receptors were constructed by poljmaerase chain reaction (17) using Kpl32 as template. To create the Arg substitution for Leu^', we made the ohgonucleotide 5 -GCCGGGCGCGGTGGATGGTG-3' and its re verse complément, which changes CTG (Leu) to CGG (Arg). Similaily, to mutate the Aia^* to Glu and Gin, we generated the oligonucleotides 5'-GCGCCGGGAGCTGTGGATG-3' and
5-GCGCCGGCAGCTGTG-GATG-3 and theu reverse compléments, respectively. changing GCG (Ala) to GAG (Glu) and GAG (Gin). Polymerase chain reaction products 7949
were digested A/scï-5s/EII and the resuJting 398-base pair fragment was subcloned into pRc/CMV containing the WT receptor cDNA also digested A/scl-fisiEII. The région corresponding to the 398-base pair fragment was sequenced on both strands by dideoxy sequendng of double-stranded DNA with Sequenase (U. S. Biochemical Corp.).
Cell Culture and Transfections—COS-7 and CHO cells were grown in Dulbecco's modiiied Eagle's médium (high glucose) and Dulbecco's mod-ified Eagle's médium F-12 (Ham's médium, high glucose), respectively, supplemented with 10% fetal bovine sérum. COS-7 cells were plated in
30-mm dishes (1.5 x 10® cells/dish), transiently transfected with con
structions encoding the WT and the différent mutant receptors using 5 fil of Lipofectamine (Life Technologies, Inc.) and 2 ;ig of DNA per dish
and harvested 48 h after transfection. Stable CHO transfectants were
generated in the same way and seeded into one 100-mm dish 24 h after transfection. Clones résistant to Geneticin (1 mg/ml) were isolated and
tested for their ability to bind the radiolabeled PAF receptor-specific
antagonist ®H-WEB2086 (DuPont N'EN). TYansient transfection condi tions of COS-7 and CHO cells were adjusted to obtain low levels of
expression; cells were plated in 100-mm dishes (3 x 10® cells/dish). transfected with constructions encoding the WT and the mutant recep
tors using 30 ;tl of Lipofectamine and 4 /ig of DNA per dish and
harvested 48 h after transfection.
Radioligand Binding Assay—Compétition binding curves were done
on COS-7 and CHO cell membranes expressing the wild-type and
mu-tated receptor species. Cells were harvested and washed twice in
Hepes-Tyrode's buffer (140 mM NaCl, 2.7 msi KCl, 1 mM CaCl^, 12 mM NaHCOj, 5.6 mM D-glucose, 0.49 m\i MgCl,. 0.37 mil NaHjPO,, 25 mM
Hepes, pH 7.4) containing 0.1% (w/v) bovine sérum albumin (11). The
cells were then submitted to three freezc-thav cj'cles and homogenized in a Teflon-glass homogenizer. Following centriftigation at 11,000 x g
for 10 min, membranes were resuspended in the same buffer at a concentration of 3 mg/ral. Binding reactions were carried out on 30 pg
of membranes in a total volume of 0.25 ml in the same buffer with 10 nil
®H-WEB2086 and increasing concentrations of nonradioactive WEB2086 or PAF for 90 min at 25 'C. For some experiments, binding
reactions were carried out on whole cells using the same conditions with
5 X lO'' cells/point. Reactions were stopped by centriftigation. The membrane- or cell-associated radioactivity was measured by liquid scintillation. Binding studies for the experiments involving GTPyS
(Sigma) were performed on membranes of CHO transfectants. AU
points were in duplicate.
Inositol Phosphate Détermination—COS-7 cells were transfected as
described above with the wild-type and mutant receptors and labeled the followdng day for 18—24 h writh myo-pHJinositol (Amersham) at 5 ;iCi/ml in Dulbecco's modifted Eagle's médium (high glucose, without inositol) (Life Technologies, Inc.). After labeling, cells were washed once
in buffered saline and preincubated 5 min in phosphate-buffered saline at 37 *C. At. the end cf this preincubation period, the phosphate-buffered saline was removed and cells were incubated in
prewarmed Dulbecco's modifted Eagle's médium (high glucose, without inositol) containing 20 mM LiCl for 5 min. Cells were then stimulated
for 30 s with the indicated concentrations of PAF. The reactions were
terminated with the addition of perchloric add foUowed by a 30-min incubation on ice. In some experiments, cells were treated for 24 h with 100 ng/ml pertussis toxin (Sigma) (13) or with 200 pii of the tyrosine kinase inhibitor Tyrphostin A51 (Calbiochem) for 45 min prior to PAF stimulation. Inositol phosphates were extracted (18) and separated on Dowex AG1-X8 (Bio-Rad) columns (19). Total labeled inositol phos phates were then counted by liquid scintillation.
RESULTS
We were interested in defining a région in the third intra-cellular loop of the PAF receptor that was involved in G protein interaction or whose modification might lead to the constitutive activation of the receptor. Substitutions of amino acids were made with residues which had a high probabihty of causing a change in the structure-function of the PAF receptor, based on the work of Kjelsberg and co-workers (15). This group repxirted the constitutive activation of the ajB-adrenergic receptor by ail amino acid substitutions at the Ala^ position (the residues with the most pronounced effects being Arg, Lys, and Glu)
which is positioned similarly to Ala^° and Leu^^' of the PAF
receptor with respect to the inner surface of the plasma mem brane. Fig. 1 shows a représentation of the putative seven
membrane-spanning domain topog^aphy of the PAF receptor
NHi
231
230
COOH
Fig. 1. Putative seven-transmembrane segment topography of
the PAF receptor. Solid circles indicate the amino acids of the PAF
receptor that were mutated; the amino acids replaced in the mutant PAF receptors are indicated on the right.
and indicates the two amino acids which were replaced in the mutant receptors.
We first examined the agonist-independent IP production and agonist-sfiecific increase of binding affinity in these mu tants. For these initial experiments, COS-7 cells were chosen for their high expression levels, which raaximized bas2il activ-ity, and for determining hgand binding properties indépendant of G protein coupling (16).
Inositol Phosphate Accumulation in the Mutant Receptor-transfected Cells—Expression levels in the COS-7 cells ranged from 1 to 1.4 pmol/mg of membrane protein for the WT and the
mutant receptors (Table I). IP accumulation was insensitive to
pertussis toxin and to the tyrosine kinase inhibitor Tyrphostin A51 (data not shown). Thus, in our System, the PAF receptor seems to stimulate IP production by a piertussis toxin-insensi-tive G protein and not to involve a tyrosine kinase signaUng pathway for PI metabolism. Basai levels of IP accumulation were measured in COS-7 cells transiently transfected either with the expression vector alone or with the vector containing the WT or the mutant receptors. As shown in Fig. 2A, basai IP levels were higher in cells transfected with the WT PAF recep tor than in those transfected with the vector alone. Expression of the L231R mutant receptor resulted in basai levels of EP accinniilation which were about 10 times higher than in ceUs expressing the WT receptor. The substitution of the immédiate adjacent residue, in the A230E mutant, resulted in basai IP production barely above that of the ceUs transfected with the
vector alone and about one-fourth of the WT basai level in terms of totîil BPs. Cells transfected with the différent construc
tions were then stimulated with 10"^ m PAF and the resulting IP accumulation was measured (Fig. 28). The stimulation of the L231R mutant induced a 3-fold higher acctunulation of IPs than the WT receptor. Unexpectedly, the A230E mutant showed no response at ail in terms of IP production following PAF stimulation. Given the dramatic effects on IP production
of the A230E mutation, we were interested in further charac-terizing this position. To verify if it was the position 230 of the PAF receptor which was critdcal or if the effects observed were due to the charge of the Glu^ substituting residue, the Ala^ was mutated to the Glu isoster, Gln^. Fig. 2A shows that the
A230Q mutation had no significant effect on the basai DP ac cumulation in COS-7 cells. Following a PAF 10"^ M stimula
tion, the A230Q mutant receptor produced only one-fifth of the WT total IP production (Fig. 28). The resjxinse of the mutant
receptors was further studied by stimulation with PAF over a
wide range of concentrations. Fig. 3 illustrâtes the concentra-tion-response curves of IP accumulation for the wild-type and
the three mutant receptors in response to PAF concentrations
from 0 to 10 ® m. PAF concentrations higher than 10'® .m were
