E XPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE

La réponse humorale ou réponse « anticorps » peut être étudiée à l’échelle de l’organisme (réponse générale ou systémique) ou à l’échelle de l’organe cible de l’infestation parasitaire (réponse locale) soit, dans notre cas, la caillette (H. contortus) ou le duodénum (T.

colubriformis). Dans le sérum ou le mucus digestif sont ainsi mis en évidence des anticorps, principalement des immunoglobulines (Ig) A ou IgG, spécifiques des antigènes parasitaires, et correspondant à différents stades de développement des vers, par une méthode ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).

5.1. Collecte des prélèvements

La réponse humorale générale est étudiée au niveau sérique. Une prise de sang sur tube sec est réalisée sur l’animal par ponction jugulaire, et le sérum est récupéré puis congelé à –20°C après une centrifugation de 5 minutes à 5000 rpm.

La réponse humorale locale est explorée au niveau du mucus abomasal ou intestinal. Le mucus est récupéré sur des bandelettes de papier filtre de 5 cm de long sur 1 cm de large, imprégnées de PBS, déposées sur la muqueuse digestive pendant 5 minutes. Ces bandelettes sont ensuite placées dans une solution de PBS sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Les surnageants obtenus sont alors congelés à –20°C pour analyse ultérieure.

5.2. Préparation des antigènes

Différentes préparations antigéniques ont été utilisées pour mettre en évidence des anticorps spécifiques :

- produits d’excrétion-sécrétion de vers adultes (PES),

- produits d’excrétion-sécrétion de larves de stade L4 (non disponibles pour H.

contortus en raison de la grande difficulté d’isoler des larves L4 de la paroi de la caillette),

- broyats totaux de larves L3.

L’obtention de vers adultes est réalisée par infestation massive (50 000 larves infestantes) d’un mouton donneur, euthanasié 30 jours après le challenge. Les vers adultes sont isolés du contenu alimentaire abomasal ou duodénal. Après plusieurs lavages dans du PBS contenant

de la pénicilline (100 UI/mL) et de la streptomycine (1 mg/mL), ces vers sont maintenus à 37°C, pendant une nuit environ (H. contortus) ou 48 heures (T. colubriformis), sous 5 % de CO2 dans la même solution de PBS à raison d’une densité maximale de 50 adultes par puits de plaque de culture cellulaire pour H. contortus, et de 200 adultes par puits pour T.

colubriformis. Le surnageant de cette culture (produits d’excrétion-sécrétion) est alors collecté et filtré (0.2 µm).

L’obtention des larves L4 nécessite également une infestation similaire d’un ovin donneur, avec une euthanasie réalisée seulement 4 jours après l’infestation. Les cinq premiers mètres d’intestin grêle sont mis à tremper dans du sérum physiologique à 37°C pendant 2 heures pour faire sortir les larves de la muqueuse. Le contenu intestinal est ensuite filtré sur un appareil de Büchner : brièvement, les larves ainsi que les débris alimentaires sont aspirés et retenus sur un filtre Wathmann par un système de pompe à vide. Une fois tout le contenu absorbé sur le papier, ce dernier est retourné dans une boîte de Pétri contenant une solution de PBS additionnée d’antibiotiques (concentrations identiques à celles décrites pour l’obtention des vers adultes). Les larves L4, mobiles, passent activement dans cette solution et sont ensuite mises en culture à raison de 1000 larves par puits de plaque de culture, pendant environ 48-72 heures. Le surnageant de culture obtenu contient les produits d’excrétion-sécrétion de ces larves.

Les antigènes de larves L3 sont obtenus après trois cycles de congélation / décongélation des larves (-70°C ; 25°C), homogénéisation à 4°C et centrifugation à 30 000g pendant 30 minutes à 4°C.

La concentration en protéines de ces surnageants est déterminée par la méthode de Lowry et al. (1951).

5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA

Les concentrations optimales des réactifs utilisés (anticorps secondaire, conjugué), des préparations antigéniques et les dilutions des échantillons (mucus ou sérum) sont déterminées par séries de test sur des échantillons positifs (mucus ou sérum d’ovins immunisés avec le parasite d’intérêt) et négatifs (mucus ou sérum d’ovins contrôles, non-infestés).

Les paramètres retenus sont présentés dans les tableaux n°11 (H. contortus) et n°12 (T.

colubriformis). Ils permettent d’obtenir un bruit de fond minimal et une distinction maximale entre les échantillons positifs et négatifs.

SERUM MUCUS

ISOTYPE IgG IgA IgG IgA

Type d’antigène ESP

Ad CEL3 ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 Concentration de l’antigène (µg/mL) 2 2 5 2 5 0.5 5 2 Dilution du sérum ou mucus 1:100 1:100 1:5 1:5 1:1 1:1 1:1 1:1 Dilution de l’anticorps secondaire 1:1000 1:1000 1:100 1:100 1:1000 1:1000 1:250 1:250 Dilution du conjugué - - 1:500 1:500 - - 1:500 1:500

Tableau n°11 : Conditions optimales utilisées pour la détection d’IgA et IgG dans le sérum et le mucus, dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes (ESP Ad) ou contre des antigènes de broyat total de larves L3 (CEL3) d’H. contortus, par technique ELISA.

SERUM MUCUS

ISOTYPE IgG IgA IgG IgA

Type d’antigène ESP Ad ESP L4 CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 Concentration de l’antigène (µg/mL) 0.5 0.5 1 1 1 1 1 1 0.5 2 1 1 Dilution du sérum ou mucus 1:200 1:100 1:100 1:200 1:100 1:200 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 Dilution de l’anticorps secondaire 1:2000 1:2000 1:2000 1:250 1:250 1:250 1:1000 1:1000 1:1000 1:250 1:250 1:250 Dilution du conjugué - - - 1:500 1:500 1:500 - - - 1:500 1:500 1:500

Tableau n°12 : Conditions optimales utilisées pour la détection d’IgA et IgG dans le sérum et le mucus, dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes (ESP Ad), de

larves L4 (ESP L4) ou contre des antigènes de broyat total de larves L3 (CEL3) de T.

5.4. Technique ELISA

La méthode employée dans nos travaux est un test ELISA de type indirect. Des plaques à fond plat (Nunclon, VWR International) sont coatées pendant une nuit à 4°C avec 100 µL/puits d’antigène dilué dans un tampon sodium carbonate. Ces plaques sont ensuite lavées deux fois avec du PBS pH=7.2 contenant 0.1% de Tween 20 (PBS-T). Afin de minimiser la fixation non spécifique des anticorps, les plaques sont ensuite incubées pendant une heure à 37°C avec 200 µL/puits de PBS-T contenant 5 % de lait écrémé (PBS-TM). Les plaques sont alors vidées de cette dernière solution, incubées pour une heure à 37°C avec le sérum ou le mucus, pur ou à la dilution optimale préalablement déterminée, puis lavées trois fois avec du PBS-T.

- Mise en évidence des IgG totales : les plaques sont incubées avec 100 µL/puits d’anticorps secondaire directement couplé à HRP (donkey anti-sheep IgG-HRP, SIGMA, référence A3415)

- Mise en évidence des IgA : 100 µL/puits de l’anticorps secondaire (mouse IgG1 anti- IgA bovine/ovine, SEROTEC, référence MCA628) sont incubés pendant une heure avant d’appliquer 100 µL/puits de conjugué couplé à HRP (Goat anti-mouse IgG1-HRP, SEROTEC, référence STAR81P), ces deux étapes étant séparées par trois lavages des plaques.

La révélation est alors réalisée selon une réaction colorimétrique par une incubation des plaques avec 100 µL/puits de 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS) pendant une heure à 37°C. La réaction est stoppée en plaçant les plaques pendant 15 minutes à 4°C.

La densité optique est alors mesurée à la longueur d’onde 405 nm par un lecteur de plaques (Microplate Reader, Dynatech). Le résultat final a été exprimé en densité optique corrigée, c’est à dire la densité optique obtenue par le lecteur à laquelle a été retirée la valeur obtenue pour les puits « blancs » contrôles, ne contenant que du PBS initialement.