E TUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE

La réponse cellulaire locale (dans la muqueuse abomasale lors d’infestation par H. contortus, et dans la muqueuse du duodénum proximal lors d’infestation par T. colubriformis) a été étudiée par un dénombrement des différentes populations cellulaires présentes dans la muqueuse. Ont été ainsi dénombrées :

(i) des cellules inflammatoires ou cellules effectrices de l’immunité : polynucléaires éosinophiles, globule leucocytes et mastocytes ; ces cellules ont été comptées sur des lames traitées par histologie conventionnelle (colorations classiques Hémalun-éosine ou Giemsa)

(ii) des cellules impliquées dans la réponse immunitaire non spécifique (macrophages) ou spécifique (lymphocytes T, ainsi que les deux sous-types lymphocytaires T CD4+ et CD8+, et les lymphocytes B). La différenciation de ces types cellulaires fait appel à des marquages immunohistochimiques, sur coupes en paraffine ou en congélation.

Pour chaque type cellulaire, les comptages ont été effectués sur 5 champs sélectionnés de manière aléatoire sur la lame, au grossissement 400. Les résultats ont été exprimés par la somme du nombre de cellules d’intérêt des 5 champs microscopiques examinés.

6.1. Histologie conventionnelle et immunohistochimie sur coupes en paraffine

6.1.1. Collecte des prélèvements

A l’autopsie, des fragments de tube digestif (paroi de la caillette en régions fundique, antrale et pylorique pour les études sur H. contortus ; paroi duodénale pour T. colubriformis) sont immédiatement plongés dans une solution de formaldéhyde à 10% jusqu’à fixation complète de l’échantillon.

6.1.2. Technique histologique

Après déshydratation dans des bains successifs d’alcool de degrés croissants et de toluène (cycle automatisé complet de 18 heures), les échantillons sont inclus en paraffine. Des coupes de 3 µm d’épaisseur sont réalisées à partir des blocs à l’aide d’un microtome (Microm, France) et récupérées sur des lames prétraitées (lames Superfrost Plus, Labonord, France).

6.1.3. Colorations à l’Hémalun/Eosine et au Giemsa

Pour le dénombrement des polynucléaires éosinophiles et des globule leucocytes, les lames sont colorées selon un protocole classique d’Hémalun-éosine. Les polynucléaires éosinophiles sont aisément reconnaissables grâce à leur noyau généralement bilobé et leur cytoplasme hébergeant de nombreuses granulations éosinophiles de petite taille (Figure n°15A). Les globule leucocytes, stade ultime de la différentiation des mastocytes, sont en général situés en position intra-épithéliale (épithélium superficiel ou épithélium glandulaire) (Figure n°15B).

Ces cellules possèdent un noyau arrondi central et de nombreuses et volumineuses granulations arrondies, éosinophiles nettes. En revanche, les lames destinées au comptage des mastocytes ont été traitées selon une coloration de Giemsa, qui permet de mieux visualiser les granulations mastocytaires, qui prennent ainsi une teinte violet-pourpre vive (Figure n°15C).

Figure n°15 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en évidence des polynucléaires éosinophiles (A, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400),

des globule leucocytes (B, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400) et des mastocytes (C, coloration Giemsa, grossissement 400).

6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine

Le protocole utilisé pour l’immunohistochimie est celui décrit par Andréoletti et al. (2002). Les lames sont chauffées à 56°C pendant une nuit avant d’être déparaffinées et réhydratées (différents bains de 5 minutes : toluène, éthanol absolu, éthanol 95° puis rinçage à l’eau courante). Les sections tissulaires sont alors autoclavées pendant 10 minutes à 121°C dans une solution de tampon citrate 10mM (pH 6.15) afin de démasquer les épitopes antigéniques, la fixation au formaldéhyde pouvant créer des ponts méthylènes sur les protéines et ainsi « cacher » certains antigènes d’intérêt. Les peroxydases endogènes sont inhibées par incubation des lames dans une solution de peroxyde d’hydrogène 30% dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. Une incubation ultérieure de 20 minutes dans une solution de PBS contenant 20% de sérum normal de chèvre permet de bloquer les sites non spécifiques d’attache des anticorps primaires.

L’incubation de l’anticorps primaire se fait à température ambiante pendant 1 heure. Elle est suivie d’une incubation de 30 minutes d’un anticorps secondaire de chèvre dirigé contre les chaînes lourdes d’immunoglobulines de souris et de lapin, dilué au 1/100ème. Un complexe streptavidine-peroxydase dilué également au 1/100ème est ensuite appliqué pendant 30 minutes. La révélation est réalisée avec de la 3,3’-diaminobenzidine (DAB) (ChemMate Detection Kit Peroxydase/DAB, DAKO, référence K5001). Les sections tissulaires sont finalement contre-colorées à l’Hématoxyline de Mayer.

Dans notre travail, les anticorps primaires utilisés ont été :

- un anticorps spécifique des macrophages / monocytes : mouse anti-human CD68, clone Ki-M6 (SEROTEC), dilution 1/150ème,

- un anticorps spécifique des lymphocytes B : mouse anti-human CD20-like, clone BLA-36 (NOVOCASTRA), dilution 1/50ème,

- un anticorps spécifique des lymphocytes T : rabbit anti-human CD3, A0542 (DAKO), dilution 1/100ème,

La réactivité de ces différents anticorps contre les antigènes ovins avait été préalablement vérifiée (Ramos-Vara et al., 1994 ; Andréoletti et al., 2002 ; Tabouret et al., 2003 ; Valentine et McDonough, 2003).

Figure n°16 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en évidence des macrophages (A, marquage immunohistochimique sur coupes en paraffine,

anticorps Ki-M6, grossissement 400) et des lymphocytes B (B, marquage immunohistochimique sur coupes en paraffine, anticorps BLA-36, grossissement 400).

6.2. Immunohistochimie sur coupes en congélation

6.2.1. Collecte et technique des prélèvements

Des fragments de muqueuse digestive, identiques à ceux prélevés pour histologie conventionnelle, ont été immédiatement congelés lors de l’autopsie dans de l’azote liquide, après avoir été placés sur des bouchons de liège préalablement imprégnés de Tissue-Tek (Labonord). Le support de liège permet de conserver une orientation correcte des prélèvements pour leur utilisation ultérieure (dans le cas particulier de la muqueuse digestive, conservation d’une orientation transversale nécessaire à l’observation microscopique des différentes couches de la paroi). Les échantillons sont alors conservés à –70°C jusqu’à la coupe. Celle-ci est effectuée à l’aide d’un cryomicrotome (Leika). Les sections de 5 µm d’épaisseur ainsi obtenues sont montées sur des lames prétraitées (Superfrost Plus, Labonord) et fixées pendant 20 minutes dans un bain d’acétone.

6.2.2. Immunohistochimie

Le protocole utilisé sur des coupes obtenues en congélation est identique à celui décrit pour les coupes en paraffine, à la seule différence qu’il n’existe évidemment pas d’étapes de déparaffinage ni de démasquage antigénique. Cette technique est nécessaire pour la mise en

évidence d’antigènes qui seraient détruits par une fixation préalable des échantillons, ce qui est le cas pour les marqueurs membranaires qui nous intéressaient : CD4+ et CD8+.

Les anticorps primaires utilisés dans ces deux cas sont :

- un anticorps spécifique des lymphocytes T CD4+ : mouse anti-ovine CD4, MCA2213 (SEROTEC), dilution 1/2000ème,

- un anticorps spécifique des lymphocytes T CD8+ : mouse anti-bovine CD8, MCA837G (SEROTEC), dilution 1/800ème.

Là encore, la réactivité de ces anticorps dans l’espèce ovine est connue et précisée par le fabricant.

Figure n°17 : Coupe histologique de caillette d’ovin infesté par H. contortus mettant en évidence des lymphocytes CD4+ (marquage immunohistochimique sur coupe en congélation,

anticorps anti-CD4, grossissement 1000).