A partir das CCDs do EHEL reveladas com vanilina sulfúrica (figura 12) e por meio de comparação com a literatura (WAGNER; BLADT, 1996), é possível notar a presença marcante de flavonoides devido a coloração amarelada das bandas cromatográficas, considerados metabólitos majoritários na espécie. Além disso, é possível sugerir a presença de outros tipos metabólitos como esteroides, devido a coloração violácea de algumas bandas cromatográficas, e de taninos, devido a coloração rosa que é possível visualizar no ponto de aplicação. Essa análise foi realizada para caracterização do perfil químico, realizada previamente ao fracionamento e isolamento de compostos, e serviu como base para a escolha dos métodos de purificação.
Figura 12 - CCDs dos extratos hidroetanólicos de B. pinnatum.
Legenda: Fase móvel: (A) acetato de etila: ácido fórmico: MeOH: H2O (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v); (B) acetato de etila:
ácido fórmico: MeOH: H2O (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v); Adsorvente: gel de sílica 60 F254; Revelador: (a) vanilina
sulfúrica + aquecimento e (b) UV 254 nm. BP – B. pinnatum. Fonte: Resultados Experimentais.
O EHEL também foi analisado por CLUE-DAD para investigação do perfil químico e foi possível observar a presença de compostos fenólicos, sobretudo flavonoides a partir das informações dos espectros UV dos picos e comparação com a literatura (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970), como ilustrado na figura 13 e tabela 8. Nessa técnica, a identificação dos flavonoides foi realizada com base na comparação do tempo de retenção, por espectro de UV dos picos majoritários e co-injeção das substâncias isoladas e/ou padrão + extrato, pela observação de aumento da área do pico. Os cromatogramas foram visualizados
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sob dois comprimentos de onda: 254 nm e 340 nm (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970; SANTOS et. al, 2005; MATSUBARA; RODRIGUEZ-AMAYA, 2006).
Em relação aos flavonoides, o espectro UV apresenta duas bandas de absorção máxima. A primeira delas, a banda II, encontra-se entre 240 e 285 nm, correspondendo à absorção do grupo benzoíla, relacionada ao anel A. A banda I, possui absorção 300 e 400 nm, correspondente ao grupo cinamoil e relacionada aos anéis B e C (MABRY; MARKHAM; THOMAS,1970). O tipo de flavonoide e o esquema de oxigenação da sua estrutura ocasionam alterações na posição e intensidade relativa de cada um dos máximos de absorção. Substituintes simples, tais como metil, metoxila e grupo hidroxila não-dissociados, geralmente efetuam apenas pequenas alterações na posição da absorção máxima. Sabe-se que, na maioria das vezes, um aumento da oxigenação na estrutura química provoca um desvio das bandas para maiores comprimentos de onda (MABRY; MARKHAM; THOMAS,1970).
Em relação a constituição química, diversos flavonoides já foram descritos para B.
pinnatum, a maioria deles derivados da quercetina e do canferol (AFZAL et al., 2012; CHIBLI
et al., 2014; DE ARAÚJO et al., 2018; FERNANDES et al., 2016b; MUZITANO et al., 2006a).
Figura 13 - Cromatograma CLUE-DAD do EHEL de B. pinnatum (A) 254 nm e (B) 340 nm.
Legenda: FE: coluna C18 Phenomenex (150 x 4,6 mm, 2,6 µm); FM: gradiente ACN:TFA 0,3%; fluxo: 0,7 mL/min;
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Júlia Morais Fernandes Tabela 8 – Dados de máximos de UV dos compostos encontrados no EHEL de B. pinnatum.
Composto Espectro Ultravioleta Núcleo Sugestivo
1 353 Ácido fenólico 2 310 e 365 nm Flavonoides derivados de quercetina e canferol 3 256 e 344 nm 4 257 e 344 nm 5 251 e 348 nm 6 264 e 344 nm 7 251 e 342 nm 8 259 e 350 nm 9 266 e 343 nm
Fonte: Resultados experimentais.
Na análise por CLUE-EM/EM (figura 14) foi possível confirmar a presença dos flavonoides. No fragmentograma, todas as substâncias que apresentaram tempo de retenção superior a 8 min foram identificadas como fenóis, com destaque aos flavonoides do tipo O- glicosídicos, como descrito por Fernandes e cols (2016). As agliconas encontradas foram a flavona eupafolina (316 m/z) e os flavonóis patuletina (332 m/z), quercetina (302 m/z) e canferol (286 m/z). Os açúcares conjugados com essas estruturas são hexoses (como a glicose), pentose (como arabinose) e desóxi-hexoses (como a ramnose). Os compostos foram identificados com base no espectros de massas dos íons precursores e íons produtos nos modos MS1, MS2 e MS3.
Figura 14 - Cromatograma CLUE-EM/EM do EHEL de B. pinnatum (A) modo negativo e (B) modo positivo.
Legenda: FE: coluna C18 Hypersil Gold UPLC (100 x 1,9 mm, 2,1 µm); FM: gradiente ACN: ácido fórmico 0,1%;
fluxo: 0,22 mL/min; eluição acompanhada nos modos negativo (A) e positivo (B) (item 3.4). Fonte: Resultados experimentais.
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É possível observar um pico intenso no perfil CLUE-EM/EM no EHEL de B. pinnatum, correspondente a um flavonoide majoritário de MM = 580 ([M-H]- = 579 e [M-H]+ = 581), com tempo de retenção de 10,29 e 10,28 min, respectivamente, modos negativo e positivo. Após análise dos fragmentos e comparação com a literatura, foi possível confirmar a presença de quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-ramnopiranosídeo, a partir da massa da quercetina (302 m/z), e de perdas de unidades m/z do íon molecular que sugerem a presença de uma ramnose e um pentose.
Nesse fragmentograma, tanto no modo positivo quando no negativo, foram observados dois picos com tempo de retenção de 2,37 e 1,83 min. Para esses dois picos a massa do íon molecular é 320.0989 [M-H]- para o modo negativo, sugerindo uma fórmula molecular de C12H18O8N, e 276.1079 [M+H]+para o modo positivo, o que sugere uma fórmula molecular de
C11H18O7N. A regra do nitrogênio indica que são cerca de duas moléculas que contêm um
número ímpar de átomos de nitrogênio. A partir da fragmentação MS/MS (figura 15) para o modo negativo é possível que fragmento o m/z seja um aduto com ácido fórmico, que é muito comum em tais sistemas cromatográficos, assim, pode ser concluído que a fórmula molecular confirmada é C11H17O7N, para ambas as substâncias eluídas a 1,84 e 2,37 min. É a primeira vez
na literatura que substâncias nitrogenados são descritos para o gênero Kalanchoe (ou
Bryophyllum), no entanto, já foram descritos para a família Crassulaceae (BJARNHOLT et al.,
2012; NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982; NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT, 1994). Alguns desses metabólitos, especialmente aqueles com baixa ou nenhuma absorção de UV, não são facilmente detectados e, consequentemente, não relatados, mesmo que possam estar presentes em grande quantidade. Experimentos EM/EM confirmam a estrutura e mostram que ambos os compostos eluídos a tR de 1.87 e 2.37 min são glicosídeos hidroxinitrilas (isômeros), como ilustrado na figura 15. A estrutura foi confirmada em mais detalhes pela perda da unidade de açúcar em ambos modos originando, para o modo positivo, o principal íon EM/EM é 114,0549, que representa a aglicona nitrílica após a remoção da porção glicose (162) e para o modo negativo o principal íon EM/EM é 94,0273, que representa a aglicona nitrílica após a remoção de toda a porção de glicose (182 m/z) (figuras 15 e 16).
Após compreensão do mecanismo de fragmentação (figura 16) e comparação com dados da literatura, sugere-se tratar-se da sarmentosina (figura 17) (BJARNHOLT et al., 2012; NAHRSTEDT; WALTHER; WRAY, 1982; NISHIDA; ROTHSCHILD; MUMMERYT, 1994). Esse fato, levou ao interesse no seu isolamento, e processos cromatográficos foram conduzidos para obtenção desse composto e análise por RMN.
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Em estudos prévios realizado por nosso grupo de pesquisa, alguns flavonoides já haviam sido isolados em pequenas quantidades, por técnicas cromatográficas clássicas, o que dificultou a completa elucidação estrutural e impossibilitou caracterizar os compostos ativos, o mecanismo de ação e realizar a avaliação do teor nos extratos. Dessa forma, uma marcha de isolamento foi desenvolvida para obter quantidades suficientes de compostos, especialmente, que pudessem ser caracterizados e utilizados como marcadores das espécies, e, também para obter quantidade suficiente para testar atividade biológica, a fim de caracterizar o marcador ativo, ou seja, um dos compostos responsável pela atividade biológica no extrato.
Figura 15 – Fragmentação EM/EM do composto nitrogenado sarmentosina no modo positivo (superior) e no modo negativo (inferior).
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Júlia Morais Fernandes Figura 16 - Mecanismo de fragmentação da sarmentosina.
Fonte: Autoria própria.
Figura 17 - Estrutura química da sarmentosina identificada.
Fonte: Autoria própria.