Cerca de um terço dos medicamentos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) nos últimos 20 anos são baseados em produtos naturais ou seus derivados, e cerca de um quarto de todos os medicamentos aprovados pela FDA e/ou pela Agência Médica Europeia (EMA) são derivados de plantas (THOMFORD et al., 2018). Além de seu papel na descoberta de novos fármacos, as plantas medicinais podem ser a base para o desenvolvimento de fitoterápicos, e são parte integrante dos sistemas médicos tradicionais em todo o mundo (PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015; MOSIHUZZAMAN et al., 2008).
Nesse contexto, a demanda por fitoterápicos tem aumentado constantemente nas últimas duas décadas, também em países industrializados, devido a sua acessibilidade, disponibilidade local e sustentabilidade potencial (PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015; MOSIHUZZAMAN et al., 2008). Isso levou a Organização Mundial da Saúde a criar um documento com estratégias a serem atingidas por seus países membros entre os anos de 2014 e 2023. Assim, os países membros devem desenvolver, melhorar e aplicar políticas, regulamentos e diretrizes que reflitam as suas realidades, entre as quais destaca-se fortalecer a garantia de qualidade, segurança, uso apropriado e efetividade da medicina tradicional através da regulamentação de produtos, práticas e profissionais por meio da educação e treinamento, desenvolvimento de habilidades, serviços e terapias (BURTON; SMITH; FALKENBERG, 2015; WHO, 2013).
Os fitoterápicos são definidos como produtos obtidos de matéria-prima ativa vegetal, exceto substâncias isoladas, com finalidade profilática, curativa ou paliativa, incluindo medicamento fitoterápico (MF) e produto tradicional fitoterápico (PTF) (BRASIL, 2014a). Agências reguladoras no Brasil, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO), bem como a Conferência Internacional de Harmonização (ICH) estabeleceram normas rígidas para garantir a qualidade, segurança e eficácia de plantas medicinais e fitoterápicos. Essas agências determinam os parâmetros que devem ser seguidos ao validar novos métodos analíticos para controle de qualidade (MOTTA; DA COSTA; BASTOS, 2017).
A fim de garantir a qualidade, segurança e eficácia adequadas dos medicamentos à base de plantas, é necessário considerar muitos desafios específicos para estes produtos que podem ocorrer em todas as etapas da produção, incluindo cultivo/coleta, processamento pós-colheita e fabricação. Essas etapas podem alterar o conteúdo de metabólitos secundários, e mantê-los sob controle requer métodos de análise apropriados em todas as etapas da fabricação. Além disso,
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devido às complexas misturas fitoquímicas presentes nas plantas medicinais e fitoterápicos, sua padronização não é uma tarefa fácil (INDRAYANTO, 2018; PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015; KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012).
A padronização de extratos de fitoterápicos é realizada com base no teor de substância marcadora presente no extrato. A RDC 26/2014, legislação que dispõe sobre fitoterápicos no Brasil, determina a caracterização do marcador e sua posterior quantificação no desenvolvimento de um produto fitoterápico, garantindo sua presença desde a matéria-prima (IFAV - insumo farmacêutico ativo vegetal) até o produto acabado (fitoterápico). Nesse contexto, marcador é definido como substância ou classe de substâncias utilizada como referência no controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do fitoterápico, preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico do fitocomplexo, sendo denominado de marcador ativo, mas também como marcador analítico quando não demonstrada, até o momento, sua relação com a atividade terapêutica do fitocomplexo (BRASIL, 2014a, 2014b; SOARES; FERREIRA, 2016). A variação permitida de teor de marcador no produto acabado não pode ser maior que 15%, quando se tem o marcador ativo, ou 20%, quando se tem o marcador analítico (BRASIL, 2014b).
Os marcadores são escolhidos conforme sua indispensabilidade a eficácia dos produtos (marcadores clínicos), na sua importância farmacológica (marcadores ativos) ou apenas na sua finalidade analítica (marcadores analíticos). Nesse âmbito, os extratos vegetais passaram a ser classificados de acordo com o conhecimento sobre seu conteúdo químico em: extratos padronizados, extratos quantificados e outros extratos. No primeiro deles, extratos padronizados são aqueles cujos marcadores são substâncias conhecidas com atividade terapêutica comprovada (marcadores clínicos), em detrimento dos extratos quantificados nos quais não se conhece os efeitos terapêuticos das substâncias no extrato e sua eficácia é atribuída a um intervalo de concentração de substâncias farmacológicas relevantes. Por últimos, os outros extratos são aqueles nos quais a eficácia está relacionada a reprodutibilidade do processo de fabricação e os marcadores analíticos são usados no controle de processo (SOARES; FERREIRA, 2016; EMA, 2011).
Previamente a padronização ou quantificação dos marcadores, o método analítico deve ser validado. A validação do método é aplicada para garantir a confiabilidade, reprodutibilidade e qualidade do método (MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017). Existem diferentes tipos de validação: i. o primeiro é a validação completa e é executado para o novo método bioanalítico desenvolvido; ii. a segunda é a validação parcial e é executada quando são feitas modificações do método bioanalítico já validado (por exemplo: novo sistema de detecção,
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mudança na matriz da amostra ou faixa de calibração); a terceira é a validação cruzada que é uma comparação dos parâmetros de validação quando dois ou mais métodos bioanalíticos são usados para gerar dados dentro do mesmo estudo. Além disso, a validação cruzada é considerada quando os dados são gerados usando técnicas analíticas diferentes ou modificações no método validado. A validação completa pode envolver linearidade (curva padrão), exatidão, precisão intra-dia (repetibilidade) e inter-dia (precisão intermediária), robustez, seletividade (especificidade), reprodutibilidade e sensibilidade (BRASIL, 2017a; MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017). Cada parâmetro da validação será abordado mais adiante neste capítulo, nos tópicos de Metodologia e Resultados de Discussão, seguindo a legislação brasileira atualmente em vigor, a RDC nº 166 de 24 de julho de 2017.
De maneira geral, o uso dos marcadores no controle de qualidade tem mostrado ser inadequado para refletir a complexidade multicomponente das misturas presentes em formulações à base de plantas medicinais. Isso porque, ocorre ação sinérgica da mistura de componentes no extrato vegetal, e associar a atividade de uma preparação a uma suposta entidade química ignora matrizes complexas compostas por centenas ou dezenas de milhares de metabólitos que geralmente resistem à separação física e tentativas de explicar as atividades biológicas observadas. É nesse âmbito que se insere o uso de fingerprints, ou seja, a impressão digital espectroscópica e/ou cromatográfica, que surgiu como ferramenta alternativa para garantir a qualidade dos materiais e preparações à base de plantas. Um fingerprint é um perfil ou padrão característico que representa quimicamente a composição da amostra e que fornece, geralmente, a maior quantidade de informação possível, permitindo tipificar o perfil químico do extrato vegetal (ALLARD et al., 2018; INDRAYANTO, 2018; PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015; CHOI; VERPOORTE, 2014; TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011; ZENG et al., 2008).
O uso de fingerprints é preconizado por agências de regulação sanitária do mundo inteiro como a European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMA), Food and
Drug Administration (FDA) and China Food and Drug Administration (CFDA).
Neste capítulo, utilizaremos apenas a quantificação dos marcadores do extrato de B.
pinnatum, realizada por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada a detector de
arranjo de diodos (CLUE-DAD) para a quantificação dos flavonoides, e a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a quantificação de sarmentosina. Adicionalmente, será estabelecido também os perfis químicos por CLUE-DAD e RMN.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica importante em bioanálise e um dos métodos mais populares em química analítica para análise quali e
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quantitativa. Seu emprego é indispensável em vários laboratórios, devido a sua eficiência, reprodutibilidade, fácil automação, baixo custo e possibilidade de analisar vários constituintes como amostras complexas de plantas medicinais (SAHU et al., 2018; MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017; KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012; LANÇAS, 2009; LIANG; XIE; CHAN, 2004). As colunas utilizadas são de diversos tipos e, por isso, têm uma ampla gama de seletividade sendo, portanto, a CLAE aplicada para a separação de vários fármacos e metabólitos em diferentes matrizes. As colunas de C18 são comumente utilizadas
para separação de compostos de plantas medicinais. Sua eficiência é altamente dependente do tamanho de partícula (atualmente 3 -5 µm), e na medida em que esse tamanho de partícula diminui, a pressão aumenta drasticamente (MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017; TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011; LIANG; XIE; CHAN, 2004).
Uma das principais vantagens da CLAE é a possibilidade de acoplar à técnica a diferentes detectores. O principal tipo de detector usado na análise de plantas medicinais é UV/Vis, para a detecção de substâncias que absorvem na região do ultravioleta, e sua variante, o DAD (detector de arranjo de diodos), que permite uma varredura no espectro de absorção UV da molécula. Outros tipos de detectores comumente utilizados na análise de plantas medicinais são: o detector de espalhamento de luz evaporativa (ELSD) para compostos que não absorvem no UV, Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrômetro de Massas (EM). O detector de UV é econômico, mas pode ser usado somente para alta concentração de analítica (faixa µM), para pequenos volumes de amostra e baixos níveis de concentração (nM, pM) espectrometria é o mais útil detector (MOEIN; EL BEQQALI; ABDEL-REHIM, 2017; TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011; LIANG; XIE; CHAN, 2004).
A CLUE (Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência) oferece alta velocidade de separação mesmo em níveis normais de pressão. Ao maximizar o desempenho da coluna e do sistema, a CLUE minimiza o tempo de análise, sendo até 10 vezes mais rápido que a cromatografia líquida convencional (DATAR, 2015; GANGADASU, 2015). Dessa forma, aumenta a eficiência da análise e conserva o gradiente de solvente, mas contribui com a separação dos componentes, com resultados reprodutíveis e altamente robustos, especialmente usando colunas com tamanho de partícula menores que 2,2 µm (GANGADASU, 2015).
A espectroscopia de RMN (Ressonância Magnética Nuclear) é uma boa ferramenta para análises qualitativas e, também, para determinações quantitativas (RMNq) de produtos naturais e misturas complexas com boa reprodutibilidade e robustez (ROULARD et al., 2017; SIMMLER et al., 2014; BHARTI; ROY, 2012). A RMNq é uma técnica analítica não destrutiva, sensível, precisa e universal, no entanto, ainda pouco utilizada para produtos naturais
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apesar de crescente nos últimos anos (SIMMLER et al., 2014; PAULI; JAKI; LANKIN, 2005). Por isso, tem se tornado valiosa para a análise de misturas complexas e quantificação sem a necessidade de separação cromatográfica (SIMMLER et al., 2014).
É importante ressaltar que o desenvolvimento do método é a etapa que exige mais cuidado, uma vez que a otimização dos parâmetros de aquisição e processamento vão garantir a precisão e reprodutibilidade das análises espectrais baseada na integração dos sinais de interesse. A intensidade da integração é proporcional ao número de núcleos que aquele sinal representa dentro de uma molécula, informação valiosa para RMNq (PAULI; JAKI; LANKIN, 2005; SIMMLER et al., 2014). Recentemente, um método desenvolvido para quantificar prunasina e amigdalina, glicosídeos cianogênios, mostrou que RMN é um método rápido e de alto desempenho para quantificar esse tipo de metabólito secundário (PIMENTA et al., 2014). Para se validar um método por RMNq, um padrão interno (PI) ou externo (PE) é requerido. As características de um padrão interno requeridas são: alta pureza, baixo custo, estável e quimicamente inerte, não volátil e não higroscópico e solúvel nos solventes de RMN usados rotineiramente. Além disso, o sinal do solvente deve ter o mínimo de interferência possível com o sinal que se deseja quantificar (PAULI; JAKI; LANKIN, 2005).
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