Os quatro flavonoides isolados (Bp1, Bp2, Bp3 e Bp4), apresentaram-se como um pó amarelo amorfo, e foram analisados por RMN e EM, e sugerindo-se tratar de dois derivados glicosilados de quercetina e dois derivados glicosilados de canferol. A figura 19 mostra a análise por CCD (condições descritas na tabela 1) dos quatro flavonoides, e a figura 20 mostra o perfil por CLUE-DAD.
Figura 19 -Análise por CCD dos flavonoides isolados e elucidados.
Dados: Fase Móvel – AcOEt: Ácido Fórmico: Água: Metanol (10:1,5:1,6:0,5, v/v/v/v); Adsorvente – gel de sílica 60 F254; Revelador - Vanilina Sulfúrica + aquecimento e visualização no visível. Legenda: F1 – flavonoide Bp4; F2 – flavonoide Bp3; F3 – flavonoide Bp2; F4 – flavonoide Bp1. Fonte: Adaptado de resultados experimentais.
Figura 20 – Cromatograma obtido por CLUE-DAD do EHEL de B. pinnatum.
Legenda: FE: coluna C18 Phenomenex (150 x 4,6 mm, 2,6 µm); FM: gradiente ACN:TFA 0,3%; fluxo: 0,7 mL/min;
detecção: 340 nm (item 3.4). Fonte: Adaptado de resultados experimentais.
Com parte da massa obtida de cada substância pura foram realizadas as análises por ressonância magnética nuclear como RMN de 1H, COSY, HSQC, HMBC e quando necessário
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NOESY, sendo possível atribuir deslocamentos químicos para cada hidrogênio e carbono. O solvente utilizado para obtenção dos espectros foi MeOD. Para a elucidação estrutural foram utilizados os espectros de RMN e comparação com dados da literatura.
A seguir será descrito detalhadamente o flavonoide Bp1, por ser majoritário para a espécie, e posteriormente os outros flavonoides de maneira mais sucinta, seguindo a ordem: flavonoide Bp2, Bp3 e Bp4. Uma vez que a estruturas desses flavonoides estão todas relacionadas ao Bp1 não será necessária uma descrição detalhada, e a elucidação será baseada nas diferenças em relação ao primeiro flavonoide. Além disso, não se trata de compostos inéditos, pois já foram isolados pelo menos uma vez para B. pinnatum, e alguns também já foram descritos para outras espécies.
5.4.1.1 Identificação de Bp1
O primeiro flavonoide identificado foi denominado Bp1, e seus dados de RMN foram comparados com dados da literatura de isolamentos anteriores (JOU et al., 2004; MUZITANO et al., 2006a; NIELSEN; OLSEN, 2005; PAWLOWSKA et al., 2009; ROTH et al., 2011).
O espectro de RMN de 1H apresentou sinais característicos de agliconas de flavonoides entre 7,36 e 6,22 ppm. Nesta região foram observados cinco sinais, cada um com integração para um hidrogênio. O sinal que se encontra no campo mais alto, situado em 6,22 ppm, é do tipo singleto e foi atribuído ao H-6 (anel A). O segundo sinal mais protegido nessa região também é um singleto e está situado em 6,38 ppm, atribuído ao H-8 (anel A). Sinais na região de 6,20-6,40 ppm são compatíveis com os hidrogênios do anel A da aglicona flavonoídica e estão acoplados em posição meta. Em flavonoides 5, 7 di-hidroxilados, o H-6 (anel A) ocorre em campo mais alto (mais blindado), enquanto o H-8 (anel A) é observado em campo mais baixo (mais desblindado) (MABRY; MARKRAM; THOMAS, 1970). Em relação o anel B, em 6,94 ppm é possível observar um dubleto com constante de acoplamento 3J igual a 8,30 Hz.
Esse sinal foi atribuído ao H-5’. Em um campo um pouco mais baixo, 7,32 ppm, observa-se um duplo-dubleto que apresenta 3J de 8,30 Hz, atribuído ao H-6’. O quinto sinal observado, um
singleto situado em 7,38 ppm refere-se ao H-2’. Esses sinais são compatíveis com um acoplamento orto. Dessa forma, o padrão de sinais e multiplicidade observadas são compatíveis com um anel 3’,4’-di-hidroxilado. Assim, com base no espectro RMN de 1H foi possível
identificar a aglicona como sendo o flavonol quercetina (3,5,7,3’,4’-pentaidroxiflavonol) (figura 21).
O espectro de RMN de 1H sugeriu a presença de duas unidades de açúcar para o flavonoide Bp1, devido a presença de dois singletos em 5,40 e 4,24 ppm, característicos de
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hidrogênios anoméricos, respectivamente, H-1” e H-1”’. Além disso, foi possível sugerir que uma dessas unidades de açúcar é a ramnose, uma vez que foi observada a presença de um dubleto em 1,04 ppm (3J = 6,2 Hz) relativo a uma metila. Técnicas de RMN bidimensionais de
HMBC e HMQC comprovaram a presença de uma unidade de α-arabinose.
Essas técnicas bidimensionais são importantes para conseguir se estabelecer correlações entre hidrogênios que estão acoplados 2-3JH-H (COSY); correlação direta entre os núcelos de
carbono e hidrogênio (HMQC) e correlação a longa distância entre os núcleos de carbono e hidrogênio (HMBC). Nas técnicas de HMQC e HMBC, o eixo horizontal corresponde aos δH e
o eixo vertical aos deslocamentos δC (PAVIA et al., 2012; SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2012).
A atribuição dos sinais de todos os hidrogênios dos açúcares foi feita por meio da técnica de COSY (figura 22) pois permitiu encontrar todas as correlações entre os hidrogênios vizinhos, os valores são descritos na tabela 10. Ao final dessa análise, juntamente com os dados obtidos por HSQC, que relaciona C e H ligados, foi possível determinar todos os valores para deslocamentos de carbono da aglicona e dos açúcares que possuíam hidrogênio ligado a eles, sendo possível sugerir que o outro açúcar se trata de uma arabinose (figura 23).
A presença de e uma 3-O-glicosilação no anel C do flavonoide Bp1 pode ser confirmada por meio do espectro de HMBC (figura 24), por meio da correlação entre o C-3 (134,78 ppm) e o H-1” da ramnose (5,40 ppm), uma vez que este espectro permite correlação entre os núcleos de 1H com os núcleos de 13C com duas ou mais ligações de distância, sendo possível definir deslocamentos de alguns carbonos que não possuem hidrogênio ligado. Além disso, concluiu- se que a unidade de arabinose está ligada ao carbono 2 (C-2”) da ramnose (81,79 ppm), devido ao H-2” da ramnose (4,22 ppm) estar correlacionado ao C-1’” da arabinose (105,87 ppm), indicando uma ligação interglicosídica do tipo (1→2) (MUZITANO et al., 2006ª; FLAMINI et al., 2002; MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).
O flavonoide Bp1 apresentou como dados do EM para o modo negativo [M–H]- m/z
579,1 e para o positivo [M+Na]+ m/z 603,1, deduzindo a fórmula molecular de C
26H28O15, a
partir do íon pseudomolecular. Essa massa é condizente com aquela apresenta por Muzitano e cols (2006) e Jou e cols (2004) para esse flavonoide. Diante do exposto, foi possível concluir que Bp1 é a quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-ramnopiranosídeo (figura 25).
A tabela 9 descreve as atribuições para cada hidrogênio de Bp1 e o comparação com os dados encontrados por Muzitano e cols (2006).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 21 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 22 - Espectro de RMN COSY do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 23 - Espectro de RMN HSQC do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 24 - Espectro de RMN HMBC do flavonoide Bp1 (MeOD, 400 MHz e 100 MHz).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Tabela 9 - Dados espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp1 de B. pinnatum em MeOD.
Legenda: QAR: quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo isolado por Muzitano e cols (2006). *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados experimentais em MeOD a 400 MHz e Muzitano e cols
(2006a) em MeOD a 500 MHz.
Figura 25 – Estrutura química de Bp1.
Fonte: Autoria própria.
H Bp1 - δH Mult. (J Hz) QAR - δH Mult. (J Hz)
Aglicona 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - 6 6,21 s 6,19 d (2,00) 7 - - 8 6,37 s 6,37 d (2,00) 9 - - 10 - - 1’ - - 2’ 7,38 d (2,0) 7,36 d (2,07) 3’ - - 4’ - - 5’ 6,94 d (8,3) 6,93 d (8,32) 6’ 7,32 dd (8,3; 2,0) 7,29 dd (2,07; 8,32) Ramnose 1” 5,40 s 5,37 d (0,93) 2” 4,22 m 4,19 m* 3” 3,91 dd (9,7; 3,2) 3,89 dd (3,70; 9,70) 4” 3,38 d (9,6) 3,35 dd* (9,70; 9,70) 5” 3,90 m 3,87 dq* (9,70; 6,20) 6” 1,04 d (6,2) 1,10 d (6,20) Arabinose 1’” 4,24 s 4,20 d (7,10) 2’” 3,53 m 3,54 dd (7,10; 9,28) 3’” 3,50 dd (9,2; 2,9) 3,47 dd (3,25; 9,28) 4’” 3,75 m 3,72 m* 5’” 3,68 m 3,65 dd* (12,45; 2,27) 3,40 (12,3) 3,37 br d* (12,45)
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
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A quercetina 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo foi isolada pela primeira vez para a espécie por Ichikawa e cols, em 1986 (apud MUZITANO et al., 2006), e apesar de ser um derivado de uma aglicona bem comum como a quercetina, a sua ligação 3-
O diglicosídica é bastante peculiar, pois trata-se de um dímero ramnose-arabinose não muito
comum, não tendo sido reportado para folhas de outras espécies do gênero Kalanchoe (NASCIMENTO et al., 2015). A ligação da arabinose não é muito comum, uma vez que a presença de enzimas transportadoras dessa molécula de açúcar (3-O-arabinosil transferase) é menos frequente em relação as 3-O-glicosil transferase e 3-O-ramnosil transferase na glicosilação dos flavonoides em Arabdposis thaliana (YIN et al., 2012). A seguir, é descrita uma sugestão de rota de biossíntese para esse flavonoide (figuras 26 e 27).
Esse flavonoide Bp1, após análise qualitativa e quantitativa por CLUE-DAD (como será visto mais adiante nesse capítulo), é o composto majoritário para B. pinnatum, o que pode torná- lo um marcador específico para diferenciação de outras espécies em análises de controle de qualidade. Estudo realizado por Nascimento e cols (2018), reforçaram que esse flavonoide incomum pode ser usado como marcador para K. pinnata através de um estudo de otimização da metodologia de extração do extrato aquoso para obter um maior teor dessa substância, reduzindo os custos do processo extrativo, provando que esse flavonoide é realmente majoritário e sua obtenção pode ser melhorada aumentando a temperatura do método extrativo para 40 ºC e reduzindo o tempo de extração (NASCIMENTO et al., 2018). Somado a isso, esse componente majoritário tem apresentado atividade anti-inflamatória (DE ARAÚJO et al., 2019; FERREIRA et al., 2014) e leishimanicida (MUZITANO et al., 2006a), apresentando-se como forte candidato a marcador ativo para esta espécie.
Esta molécula foi descrita para poucas espécies de outras famílias botânicas, mas não como substância majoritária (JOU et al., 2004; MUZITANO et al., 2006a; NIELSEN; OLSEN, 2005; PAWLOWSKA et al., 2009; ROTH et al., 2011). No entanto, apesar de ter sua estrutura química bem estabelecida e totalmente elucidada por trabalhos anteriores, nenhum deles aborda o isolamento rápido, eficiente e otimizado dessa molécula a fim de se obter grandes quantidades, principalmente, utilizando uma metodologia que gere pouco resíduos químicos e bons resultados de rendimento de substância pura. Poucos trabalhos trazem a avaliação da atividade desse flavonoide isolado, e muito raro ainda é o uso desse flavonoide em estudos de controle de qualidade para essa espécie. O objetivo de estudar a atividade do comosto isolado, nesse caso, seria a sugestão de mecanismo de ação, para compreender melhor como B. pinnatum age como anti-inflamatório, antiúlcera (DE ARAÚJO et al., 2018, 2019) e antibotrópica
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Júlia Morais Fernandes
(FERNANDES et al., 2016), objetivos de estudo do nosso grupo de pesquisa e que ainda não foram abordados na literatura.
• Biossíntese de Bp1:
A etapa inicial da via consiste na formação do núcleo flavilium, o esqueleto de base de todos os flavonóides, a partir de três moléculas de malonil-CoA, originados da via do acetato/malonato sendo responsáveis pela formação do anel A, e uma de 4-cumaril-CoA, originada via do chiquimato, responsável pela formação do anel B e a ponte de 3 carbonos (que dará origem ao anel C) (DIXON, STEELE, 1999; DEWICK, 2002; PRETUSSA et al., 2013).O cumaril-CoA origina-se a partir da fenilalanina através da via do ácido chiquímico (DEWICK, 2002; FERREYRA et al., 2012) como ilustrado na figura 26.
A chalconasintase (CHS) é a enzima envolvida na condensação das três moléculas de malonil-CoA e uma de 4-cumaril-CoA, produzindo a tetrahidrochalcona, que posteriormente sofre ação da chalconaisomerase (CHI) para transformar-se na flavanona chamada narigenina (LIPINIEC et al., 2006; PETRUSSA et al., 2013). A oxidação na posição 3 desta pela enzima flavanona 3-hidroxilase (F3H) produz o dihidrocanferol, um dihidroflavonol, que é hidroxilado na posição 3' do anel B, pela enzima flavanona 3'-hidroxilase (F3'H) (PETRUSSA et al., 2013). Esta por sua vez se transforma em quercetina por ação da enzima flavonol sintase (FLS) que cataliza a formação da dupla ligação entre os carbono 2 e 3 (WINKEL-SHIRLEY, 2001; SAITO et al., 2012). Por fim, sugere-se que por ação das glicosiltransferases, enzimas que catalizam a transferência de açúcar para uma larga escala de moléculas aceptoras, adicionem unidades de ramnose e arabinose ao núcleo quercetina na posição 3 (CHEYNIER et al., 2013). De acordo com a literatura, em flavonols a 3-O-glicosilação ocorre primeiro, sendo adicionados nessa posição glicose, ramnose ou arabinose (SAITO et al., 2012). A figura 27 ilustra a rota biossintética de Bp1.
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 26 - Esquema da via do ácido chiquímico.
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 27 - Esquema da rota biosintética de Bp1.
Legenda: PAL: fenilalanina amônia-liase; C4H: cinamato-4-hidroxilase; 4CL: 4-cumaril:CoA-ligase; CHS: chalconasintase; CHI:chalconaisomerase; F3H: flavanona 3-hidroxilase; F3’H: flavanona 3’-hidroxilase; FLS: flavonol sintase. Fonte: Autoria própria. Adaptado de Winkel-Shirley, 2001; Dewick, 2002 e Pretussa et al., 2013
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes 5.3.1.2 Identificação do Flavonoide Bp2
O segundo flavonoide identificado foi denominado Bp2 e seus dados de RMN foram comparados com dados da literatura de isolamentos anteriores (MUZITANO et al., 2006a). Como esse composto foi isolado e identificado apenas por Muzitano e cols. (2006), outros artigos que mostram estruturas quimicamente relacionadas foram utilizados para confirmação de sua identidade (XUE et al., 2015; MOK; LEE, 2013; FLAMINI et al., 2002; SLOWING et al., 1994).
O espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp2 apresentou sinais característicos de
agliconas de flavonoides entre 7,79 e 6,21 ppm. Nesta região foram observados quatro sinais, os mais desblindados com integração para dois hidrogênios, e os mais blindados com integração para um hidrogênio. O sinal que se encontra no campo mais alto, situado em 6,21 ppm, é do tipo singleto e foi atribuído ao H-6 (anel A). O segundo sinal mais protegido nessa região também é um singleto e está situado em 6,38 ppm, atribuído ao H-8 (anel A). Em relação o anel B, em 6,96 ppm é possível observar um dubleto com constante de acoplamento 3J igual a 8,80
Hz e integração para dois hidrogênios, sinal atribuído ao H-5’ e H-3’ que possuem a mesma vizinhança química. Em um campo um pouco mais baixo, o sinal em 7,79 ppm apresenta-se um dubleto de 3J igual 8,80 Hz e integração para dois hidrogênios, atribuído aos hidrogênios H-6’
e H-2”. Dessa forma, o padrão de sinais e multiplicidade observadas são compatíveis com um anel 4’-mono-hidroxilado. Assim, com base no espectro RMN de 1H foi possível identificar a aglicona como sendo o flavonol canferol (3,5,7,4’-tetraidroxiflavonol) (figura 28).
O espectro de RMN de 1H sugeriu a presença de duas unidades de açúcar para o flavonoide 3, devido a presença de dois sinais em 5,40 ppm (singleto) e 4,28 ppm (dubleto com
3J = 7,20 Hz), característicos de hidrogênios anoméricos, respectivamente, H-1” e H-1”’. Além
disso, foi possível sugerir que uma dessas unidades de açúcar é a ramnose, uma vez que foi observada a presença de um dubleto em 1,00 ppm (3J = 6,2 Hz) relativo a uma metila. A
atribuição dos sinais de todos os hidrogênios dos açúcares foi feita por meio da técnica de COSY e os valores são descritos na tabela 10. Ao final dessa análise, juntamente com os dados obtidos por HSQC, foi sugerido que o outro açúcar se trata de uma arabinose. A presença de uma 3-O-glicosilação pode ser confirmada por meio da correlação entre o C-3 (134,78 ppm) e o H-1” da ramnose (5,40 ppm) visualizada no espectro de HMBC. Além disso, concluiu-se que a unidade de arabinose está ligada ao carbono 2 (C-2”) da ramnose (80,99 ppm), devido ao H- 2” da ramnose (dubleto em 4,28 ppm com 3J =7,2 Hz) estar correlacionado ao C-1’” da
arabinose (106,63 ppm), indicando uma ligação interglicosídica do tipo (1→2) (MUZITANO et al., 2006ª; FLAMINI et al., 2002; MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).
Capítulo 2 - Estudo Químico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 28 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp2 (MeOD, 400 MHz).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Tabela 10 - Dados espectroscópicos de RMN 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp2 de B. pinnatum em MeOD.
Legenda: CAR: canferol 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-O-α-L-ramnopiranosídeo isolado por Muzitano e cols (2006). *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados experimentais em MeOD a 400 MHz e Muzitano e cols
(2006a) em MeOD a 500 MHz.
Os dados do EM para o modo negativo [M–H]- m/z 563,1 e para o positivo [M+Na]+
m/z 587,1, sugerem a fórmula molecular de C26H28O14. O fragmento de m/z 455,2 confirma a
presença de uma arabinose terminal, pela perda de 132 unidades do íon molecular por meio de uma reação de eliminação. Esses achados corroboram com os dados apresentado por Muzitano e cols. (2006a).
Assim, Bp2 foi caracterizado como canferol 3-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L- ramnopiranosídeo (figura 29) ou kapinatosídeo, sendo descrito até o momento somente em B.
pinnatum (MUZITANO et al., 2006).
Esse flavonoide Bp2, após análise qualitativa por CLUE-DAD não se apresenta como um composto majoritário do extrato hidroetanólico B. pinnatum, no entanto, devido a sua exclusividade para a espécie até o momento, pode vir a se tornar um marcador analítico
H Bp2 - δH Mult. (J Hz) CAR - δH Mult. (J Hz)
Aglicona 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - 6 6,21 d (2,0) 6,20 d (1,87) 7 - - 8 6,38 d (2,0) 6,38 d (1,87) 9 - - 10 - - 1’ - - 2’ 7,79 d (8,8) 7,78 d (8,68) 3’ 6,96 d (8,8) 6,94 d (8,70) 4’ - - 5’ 6,96 d (8,8) 6,94 d (8,70) 6’ 7,79 d (8,8) 7,78 d (8,68) Ramnose 1” 5,50 s 5,47 d (1,37) 2” 4,23 d (1,2) 4,20 m* 3” 3,85 dd (9,7; 3,5) 3,82 dd (3,42; 9,66) 4” 3,36 dd (9,8; 5,0) 3,32 dd* (9,62; 9,62) 5” 3,73 m 3,73 m* 6” 1,00 d (6,2) 0,98 d (6,17) Arabinose 1’” 4,28 d (7,2) 4,25 d (7,15) 2’” 3,57 d (7,3) 3,55 dd (7,38; 9,56) 3’” 3,51 dd (9,3; 3,3) 3,47 dd (3,25; 9,15) 4’” 3,73 m 3,73 m* 5’” 3,66 m 3,68 m* 3,42 d (11,9) 3,42 br d* (12,65)
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específico para diferenciação de outras espécies em análises de controle de qualidade. Além disso, é importante salientar que este flavonoide apresentou atividade leishimanicida moderada contra formas amastigotas de Leishmania amazonensis (MUZITANO et al., 2006a).
Figura 29 – Estrutura química de Bp2.
Fonte: Autoria própria.
5.3.1.3 Identificação do flavonoide Bp3
Para a elucidação desse flavonoide foram utilizados dados da literatura (ZHU et al., 2016; CHEN; CHEN; GAO, 2014; SHEN et al., 2010; MUZITANO et al., 2006b; SLOWING et al., 1994) para comparação com os espectros realizados e atribuição dos sinais, culminando com a elucidação estrutural completa dessa substância.
O flavonoide Bp3 mostrou os mesmos sinais (com ligeiras diferenças) encontrados para Bp1 na região mais desblindada do espectro como mostrado na tabela 11 e figura 30 (espectro de RMN de 1H de Bp3), sugerindo que os flavonoides Bp1 e Bp3 são derivados da mesma aglicona flavonoídica, a quercetina, como é possível visualizar no espectro de RMN de 1H (figura 30). No entanto, com a presença de apenas um H-1” anomérico, um dubleto em 5,37 com 3J igual a 1,4 Hz e integração para um hidrogêncio. Além disso, foi possível sugerir que o
açúcar é a ramnose, uma vez que foi observada a presença de um dubleto em 0,96 ppm (3J =
6,1 Hz) relativo a uma metila no espectro de RMN de 1H. A atribuição dos sinais de todos os hidrogênios da ramnose foi feita por meio da técnica de COSY e os valores são descritos na tabela 11 e os sinais ilustrados na figura 30. Espectros adicionais para interpretação podem ser encontrados no Apêncide 1.
Em relação aos dados por EM, o flavonoide 2 apresentou para o modo negativo [M–H]-
m/z 448,1 e para o positivo [M+Na]+ m/z 471.1, deduzindo a fórmula molecular de C21H20O11.
Esses achados corroboram com os dados apresentado por Muzitano e cols. (2006b) e Mok e Lee (2013).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 30 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp3 (MeOD, 400 MHz).
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A partir desses dados foi possível concluir que o flavonoide 2 é a quercetina 3-O-α-L- ramnopiranosídeo (quercitrina) (figura 31). Como é uma substância extremamente descrita para plantas ricas em flavonoides, há uma ampla gama de referências que podem ser usadas para elucidação e por isso, os dados de RMN de 1H e COSY foram suficientes para comparação e identificação da substância.
Tabela 11 - Dados espectroscópicos de RMN 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp2 de B. pinnatum em MeOD.
Legenda: Quercitrina: quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo. *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados
experimentais em MeOD a 400 MHz, (A) Slowing e cols (1994) em MeOD a 200 MHz e (B) e Zhu e cols (2016) em MeOD a 500 MHz.
Figura 31 – Estrutura química de Bp3.
Fonte: Autoria própria.
H Bp3 - δH [Mult., J (Hz)] (A) Quercitrina - δH Mult. (J Hz) (B) Quercitrina - δH Mult. (J Hz)
Aglicona 2 - - - 3 - - - 4 - - - 5 - - - 6 6,22 d (2,0) 6,28 d (2,1) 6,19 s 7 - - - 8 6,39 d (1,9) 6,45 d (2,1) 6,36 s 9 - - - 10 - - - 1’ - - - 2’ 7,36 d (2,0) 7,41 d (2,1) 7,33 d (2,0) 3’ - - - 4’ - - - 5’ 6,93 d (8,3) 7,0 d (8,1) 6,91 d (8,30) 6’ 7,32 dd (8,3; 2,0) 7,39 dd (8,1;2,1) 7,30 dd (8,30;2,10) Ramnose 1” 5,37 d (1,4) 5,43 d (1,5) 5,34 d (1,40) 2” 4,24 dd (3,2; 1,7) 4,30 dd (3,3; 1,5) 4,22 m 3” 3,77 dd (9,3; 3,3) 3,82 dd (9,0; 3,3) 3,75 dd (9,35; 3,30) 4” 3,37 m 3,45 m* 3,42 m* 5” 3,44 dq (12,2; 6,1) 3,50 m* 3,35 d (2,0) 6” 0,96 d (6,1) 1,03 d (5,9) 0,94 d (6,10)
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes 5.3.1.3 Identificação do flavonoide Bp4
Para a elucidação desse flavonoide foram utilizados dados da literatura (LEE et al., 2014; MOK; LEE, 2013; XUE et al., 2015) para comparação com os espectros realizados e atribuição dos sinais, culminando com a elucidação estrutural completa dessa substância.
O flavonoide Bp4 apresentou os mesmos sinais (com ligeiras diferença) encontrados para Bp2 na região mais desblindada do espectro como mostrado na tabela 12 e figura 32 (espectro de RMN de 1H de Bp3), sugerindo que os flavonoides Bp2 e Bp4 são derivados da
mesma aglicona flavonoídica, o canferol, como é possível visualizar no espectro de RMN de
1H (figura 32). No entanto, com a presença de apenas um H-1” anoméricos, um singleto em
5,39 ppm. A ramnose é o açúcar sugerido devido a presença de um dubleto em 0,94 ppm (3J =
5,6 Hz) relativo a uma metila. Assim como para todos os outros flavonoides, a atribuição dos sinais dos hidrogênios da ramnose foi feita por meio da técnica de COSY e os valores são descritos na tabela 12 e os sinais ilustrados na figura 32. Espectros adicionais para interpretação podem ser encontrados no Apêncide 1.
Os dados do EM para o modo negativo [M–H]- m/z 421,1 e para o positivo [M+Na]+
m/z 455,1 sugerem a fórmula molecular de C21H20O10. Esses achados corroboram com os dados
apresentado por Mok e Lee (2013).
Assim, foi possível concluir que o flavonoide Bp4 é o canferol 3-O-α-L- ramnopiranosídeo (afzelina) (figura 33). Esse flavonoide foi isolado pela primeira vez na espécie, por Tatsimo e cols. (2012), no qual essa substância mostrou moderada atividade antimicrobiana, no entanto, neste artigo não aborda nenhum dado de RMN ou EM. Como é uma substância extremamente descrita para plantas ricas em flavonoides, há uma ampla gama de referências que podem ser usadas para elucidação e por isso, os dados de RMN de 1H e COSY foram suficientes para comparação e identificação da substância.
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 32 - Espectro de RMN de 1H do flavonoide Bp3 (MeOD, 400 MHz).
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Tabela 12 - Dados espectroscópicos de RMN 1H (400 MHz) para o flavonoide Bp4 de B. pinnatum em MeOD.
Legenda: Afzelina: canferol 3-O-α-L-ramnopiranosídeo. *Sinais não bem definidos. Fonte: Resultados
experimentais em MeOD a 400 MHz, (A) Lee e cols (2014) em MeOD a 400 MHz e (B) e Mok e Lee (2013) em DMSO-d6 a 500 MHz.
Figura 33 – Estrutura química de Bp4.