Matériels et Méthodes
E. Western blot
Le western-blot a été utilisé pour étudier les taux d’expression des protéines d’intérêt car c’est une technique commune et simple à mettre en œuvre et, de plus, il existe un grand nombre d’anticorps spécifiques.
L’extraction des protéines a été faite selon différentes conditions : l’utilisation d’un kit pour séparer les protéines membranaires des protéines cytosoliques, un tampon pour séparer les protéines cytosoliques des protéines nucléaires, et enfin un dernier tampon pour les protéines totales.
a. Extraction des protéines membranaires
Pour quantifier les NaV et en particulier le pool actif de canaux, c’est à dire ceux qui
sont ancrés dans la membrane, il fallait différencier les protéines membranaires des protéines cytosoliques, contrairement à d’autres études qui quantifient les protéines totales. Nous avons
utilisé le kit « Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction » car il permet d’obtenir un
lysat de protéines membranaires sans passer par une étape d’ultracentrifugation et qu’il est simple d’utilisation. Nous avons suivi les recommandations du kit pour l’extraction des protéines des muscles.
b. Extraction des protéines cytosoliques/nucléaires
Ce protocole a été utilisé initialement afin de séparer les protéines cytosoliques des protéines nucléaires pour déterminer si certaines pouvaient être adressées au noyau, tels que des facteurs de transcription, suite à des conditions particulières comme la chimiothérapie.
Procédure :
Entre 100mg et 200mg de tissu sont broyés à l’Ultra Turrax dans 1,5ml tampon de lyse 1 (Tableau 4), puis placé 15min dans la glace pour une meilleure lyse. L’homogénat est centrifugé 5min à 100g puis 1min à 200g, le tout à 4°C. Le surnageant est aliquoté (protéines cytosoliques) et le culot est remis en suspension avec 750µL de tampon2. Après 15min d’incubation dans la glace les échantillons sont centrifugés 20min à 15000g à 4°C, puis le surnageant est aliquoté également (protéines nucléaires).
85 Tableau 4 : Composition des tampons d’extraction des protéines cytosoliques et nucléaires.
Tampon 1 Tampon 2
HEPES pH 7.9 (KOH) 10 mM HEPES pH 7.9 (KOH) 20 mM
MgCl2 1.5 mM MgCl2 1.5 mM
KCl 10 mM NaCl 420 mM
DTT 0.5 mM DTT 0.5 mM
Igepal 0.5% vol/vol EDTA 0.2 mM
Glycerol 25% vol/vol
c. Extraction des protéines totales
Procédure :
Environ 100mg de muscle sont broyés à l’Ultra Turrax dans 1ml tampon de lyse (Tableau 5). L’homogénat est placé dans la glace pendant 15min puis centrifugé à 12000g pendant 10min à 4°C. Le surnageant contenant les protéines totales est alors aliquoté.
Tableau 5 : Composition du tampon d’extraction des protéines totales.
Tris HCL 20 mM NaCl 150 mM EDTA 2 mM EGTA 2mM Igepal 1% vol/vol pH final : 7,9
La détermination de la concentration protéique des extraits est réalisée grâce au test de Bradford : 4µL d’échantillon (dilué au 1/10) est mélangé à 200µL de réactif de Bradford
(Sigma) en plaque 96 puits, et une gamme étalon de BSA (bovine serum albumine) est
réalisée sur la même plaque (de 1mg/ml à 0mg/ml). La lecture de la DO est faite en une seule lecture à 595nm.
Pour le Western-blot la même procédure a été suivie à chaque fois avec des spécificités pour certaines protéines. Les échantillons ont été mélangés avec du Laemmli contenant du β-mercapthoéthanol (10%). Le volume à déposer est calculé à partir de la concentration protéique des échantillons. Nous sommes ici à quantité constante de protéine. Elle peut dépendre de la protéine elle-même, de son abondance tissulaire et de l’efficacité de l’anticorps
86 primaire (Tableau 8). Le volume à déposer est aliquoté, chauffé à 95°C pendant 4min, sauf
pour les NaV1.4 et NaV1.5.
Nous avons utilisé le système de western blot BIO-RAD Mini-PROTEAN avec le système de 4 gels de 1,5mm d’épaisseur. La composition du gel de séparation est différente en
fonction de la taille de la protéine étudiée (Tableau 6 ; Tableau 7). Pour les NaV1.4 et NaV1.5
nous avons utilisé des gels à 6% d’acrylamide, pour β1/ β3/ β4 des gels à 12% d’acrylamide, et pour les autres protéines des gels à 9% d’acrylamide.
Tableau 6 : Composition des gels d’électrophorèse
4 gels de séparation à 6% 4 gels de séparation à 9%
40% Acrylamide 5,4 ml 40% Acrylamide 8,2 ml Bis-Acrylamide 2,3 ml Bis-Acrylamide 3,3 ml H2O 20 ml H2O 16 ml Séparation 4X 9,3 ml Séparation 4X 9,2 ml APS 10% 200 µl APS 10% 200 µl TEMED 30 µl TEMED 30 µl
4 gels de séparation à 12% 4 gels de concentration
40% Acrylamide 11 ml 40% Acrylamide 4 ml Bis-Acrylamide 4,5 ml Bis-Acrylamide 1,5 ml H2O 12,4 ml H2O 11,8 ml Séparation 4X 9,2 ml Concentration 8X 2,5 ml APS 10% 150 µl APS 10% 100 µl TEMED 20 µl TEMED 20 µl
Tableau 7 : Composition des tampons du Western blot
Tampon de séparation 4X Tampon de concentration 8X
Tris-base 1,5 M Tris-base 1 M
SDS 0,50% SDS 1,00%
Ajuster à pH 8,8 avec HCl Ajuster à pH 6,8 avec HCl
Tampon de migration 10X TBS 10X
Tris-base 0,25 M Tris base 200 mM
Glycine 1,92 M NaCl 1,5 M SDS 1% Ajuster à pH 7,5 avec HCl Tampon de transfert (1 l) TBST (1l) Tampon de migration 10X 100 ml TBS 1X 1 l Ethanol 200 ml Tween 20 500 µl Eau 700 ml
87 Les gels sont déposés dans la cuve avec le tampon de migration 1X. Après le dépôt des
échantillons et du marqueur de taille (Precision plus protein standards dual color de chez
BIO-RAD), la migration est lancée à 70-80V pendant quelques heures. Le temps de migration est ajusté en fonction de la taille de la protéine afin que celle-ci se retrouve vers le tiers inférieur du gel. Ensuite le transfert se fait sur membrane de PVDF (Polyfluorure de vinylidène) (Immobilon, pores de 0,45µm) dans le tampon de transfert, 1h à 110V. Les
membranes sont lavées 10min dans du TBST (Tris Buffered Saline + Tween 20) sur agitation,
ensuite incubées 1heure dans du TBST avec 5% de lait écrémé. Après 2x10min de rinçage dans du TBST les membranes sont incubées dans une solution de TBST+lait 1% avec l’anticorps d’intérêt. La concentration de l’anticorps primaire varie en fonction de la « qualité » de ce même anticorps, déterminée lors de sa mise au point dans les conditions expérimentales (Tableau 8). L’incubation avec l’anticorps primaire se fait durant 12h à 4°C sous agitation douce. Les membranes sont rincées ensuite pendant 3x20min dans du TBST,
puis vient l’incubation avec l’anticorps secondaire couplé au HRP (Horseradish peroxidase)
dilué au 1/2000 dans du TBST+lait 1% à température ambiante 1h.
Tableau 8 : Liste des anticorps et quantité de protéines utilisés pour le Western blot.
Anticorps µg de
protéines Dilution 1/ Référence
Anticorps primaire NaV1.4 80 200 Alomone lab NaV1.5 80 1000 Sigma-Aldrich β1 20 1000 Abcam: ab86931 β3 20 2000 Abcam: ab48552 β4 20 1000 Abcam: ab80539 PKC-α 60 1000 Abcam: ab32376 PKC-ε 60 500 Abcam: ab124806
Calpain 1 50 1000 Abcam: ab155677
Calpain 2 50 1000 Abcam: ab155666
MAFbx 50 1000 Abcam: ab168372
SMAD3 50 5000 Abcam: ab40854
p-SMAD3 50 2000 Abcam: ab52903
GAPDH 50 10000 Abcam: ab9484
Anticorps secondaire
HRP anti-rabbit 2000 Abcam: ab6802
88 Après 3x20min dans du TBST les membranes sont placées dans du TBS. La révélation
se fait par ECL (enhanced Chemiluminescence) après incubation 30sec-1min dans le tampon
ECL (Tableau 9), grâce au système d’acquisition Vilber-Lourmat Fusion SL. Les images sont ensuite analysées avec le logiciel Image Studio Lite (LI-COR, Biosciences).
Tableau 9 : Composition du tampon ECL
Tampon ECL (10 ml)
10 ml tampon Tris-HCl Tris-HCl 100mM ph 8,5 3µl H2O2 30%
50µl luminol 0,886g de luminol dans 20ml DMSO
25µl d'acide p-coumarique 0,148g d'acide p-coumarique dans 10ml DMSO